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浙江人学博上学位论文大熊猫i i 类m h c 功能基因的分离及适应性进化研究 摘要 主要组织相容性复合体( m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ，m h c ) 是脊椎动 物所特有的多基因家族，能编码种类丰富的细胞表面糖蛋白，具有呈递抗原、启动 免疫应答的功能，是动物适应性免疫系统的重要组成部分。哺乳动物i i 类m h c 包 括d r a 、d r b 、d q a 和d q b 等多个经典基因，编码呈递细菌类外源性抗原分子； i i 类m h c 基因的e x o n 2 编码抗原结合部位，具有高度的多态性，与物种抵抗病原 体的能力及对复杂环境的适应性直接相关。本研究以大熊猫指名亚种的“卧龙种 群”、“成都种群”和秦岭亚种的“佛坪楼观台种群”共1 2 1 只个体为对象，通过对 功能性i i 类m h c 经典座位的分离和遗传变异分析，揭示了大熊猫u 类m h c 基因 多样性的维持机制及其与免疫相关的适应性进化特性。主要的研究结果如下： 1 ) 首创了磁珠富集杂交e d n a 分离m h c 基因的方法。该方法简单、快速、高效。 本文运用这一方法分离获得了7 个i i 类m h c 基因，共1 0 条全长c d n a 。该结 果不仅重复获得了文献所报道的“大熊猫i i 类m h c 基因组计划”已确认的6 个表达的经典座位，还新发现和克隆了一个新的座位d r b 3 ，从而表明了所建 方法的有效性。 2 ) 本文分离获得的l o 条大熊猫i i 类m h c 基因的全长c d n a ( d r a1 条，d r b l2 条，d r b 31 条，d q a l2 条，d q a 21 条，d q b l2 条，d q b 21 条) 均可以编 码完整的蛋白质序列。因此，目前已发现的大熊猫具有功能的经典i i 类m h c 基因，包括d r a 、d r b l 、d r b 3 、d q a l 、d q a 2 、d q b l 和d q b 2 等7 个。 3 ) 在以大熊猫“卧龙种群”、“成都种群”和“佛坪楼观台种群”的1 2 1 只个体为 对象，并利用座位特异性的p c r s s c p 基因分型和测序方法进行6 个i i 类m h c 功能基因的遗传变异检测中，共克隆了2 5 条等位基因。其结果，发现d r a 和 d q b 2 均为单态，而其余4 个座位则是中度多态的( 6 条d r b 3 等位基因、7 条 d q a l 等位基因、4 条d q a 2 等位基因、6 条d q b l 等位基因) 与其他濒危的 哺乳动物相比，大熊猫的适应性免疫系统( i i 类m h c ) 具有更丰富的基因多样 性。 4 ) 在大熊猫的人工圈养种群中，“卧龙种群”和“成都种群”具有相同的等位基因 数目，但其分布频率差别明显。进一步的分析发现，“卧龙种群”存在着明显的 奠基者效应，其种群中的优势等位基因被主要奠基者携带的等位基因所统治。 u 浙江大学博士学位论文大熊猫i i 类m h c 功能基因的分离及适应性进化研究 鉴此，基于维持圈养大熊猫的遗传多样性及提高大熊猫的疾病抵抗能力的必要 性，本文建议应加强该种群携带稀有等位基因之大熊猫个体的繁殖成功率 5 ) 大熊猫指名亚种和秦岭亚种在多态的i i 类m h c 基因中，具有明显的等位基因 丰度差异。其中，指名亚种在d q 区比秦岭亚种具有更多的等位基因( 1 6 ：1 0 ) ， 但秦岭亚种在d r 区的等位基因数又多于指名亚种( 1 1 ：9 ) 。与此同时，在d q 区和d r 区，指名亚种和秦岭亚种分别具有9 条和5 条各自所特有的等位基因。 上述结果，充分表明了大熊猫指名亚种和秦岭亚种在其亚种分化之后，各自经 历了独立的进化历史，并进化产生了适应不同环境的亚种特异性i i 类m h c 基 因。 6 ) 在大熊猫i i 类m h c 基因中，存在着多个方面的平衡选择证据：a 基因的观察 杂合度明显高于期望杂合度；b 各基因抗原结合位点的氨基酸杂合度显著地高 于非抗原结合位点( p o 0 1 ) ；c 抗原结合位点的选择参数值( d n 魂，即非 同义置换率与同义置换率之比) 显著地高于非抗原结合位点值( 尸 o 0 1 ) ； d 5 个多态性的座位共存在4 4 个受正选择压力的氨基酸位点，其中9 5 4 5 位于 抗原结合位点及其附近。这些平衡选择证据，充分表明了i i 类m h c 基因在大 熊猫的适应性进化过程中，发挥了重要作用。 7 ) 大熊猫指名亚种在d r b l 和d q a 2 座位上的选择参数值均小于1 ，属于净化 选择模式，表明了净化选择在指名亚种的d r b l 和d q a 2 基因中，是处于统治 地位的。相反地，秦岭亚种的选择参数值在7 个表达的i i 类m h c 基因中均 大于1 ，属于正选择模式，表明了正选择广泛地存在于秦岭亚种的i i 类m h c 基因中。该结果，明晰地揭示了大熊猫指名亚种和秦岭亚种在i i 类m h c 基因 的进化机制上，存在着驱动因素的差异。 8 ) 无论是大熊猫的指名亚种还是秦岭亚种，在新发现的d r b 3 座位上，都具有极 大的值( 抗原结合位点的值均大于9 2 7 ；非抗原结合位点的值均大于 4 3 9 ) ，表明了d r b 3 新座位的抗原呈递结构域在其漫长的进化过程中，经历了 有别于其它哺乳动物之极强的正选择作用。此外，两亚种的d r a 和d q b 2 基 因均为单态，表明了大熊猫的d r a 和d q b 2 基因在其进化过程中，历经的进 化选择模式，为极强的净化选择作用。而两亚种在d r b l 、d q a l 和d q b l 三 个座位中，出现了基因内的重组现象，表明了重组事件是大熊猫i i 类m h c 等 i i i 浙江人学博士学位论文大熊猫i i 类m h c 功能雉凶的分离及适应性进化研究 位基因多样性的产生机制之一 综上所述，大熊猫i i 类m h c 基因的多样性，是由自然选择和基因内重组等动 力因素共同驱动来维持的，也就是说“平衡选择、正选择、净化选择和基因内重组， 是大熊猫在适应性进化过程中维持其i i 类m h c 基因组多态性的主要进化动力”。 关键词：大熊猫，抗原结合位点，m h c ，平衡选择，正选择，净化选择，重组 i v 浙江大学博士学位论文大熊猫i i 类m h c 功能基因的分离及适应性进化研究 a b s t r a c t t h em a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ( m h c ) p l a y sac e n t r a lr o l e i nt h ea d a p t i v e i m m u n es y s t e mo fv e r t e b r a t e sf o ri t sf u n c t i o no fp r e s e n t i n gp a t h o g e np e p t i d e st otc e l l s t h ee x o n 2o fm h cc l a s si ic l a s s c i c a ld ra n dd qg e n e se n c o d e sa n t i g e nb i n d i n gs i t e s a n dd i s p l a y se x t r e m ep o l y m o r p h i s m ，w h i c hi sb e l i e v e dt ob ee s s e n t i a lf o rv e r t e b r a t e st o r e s i s tp a t h o g e ni n f e c t i o n t h u st h i ss t u d ya i m st o ：1 ) i s o l a t ea l lf u n c t i o n a lc l a s s i c a lm h c c l a s si il o c if o rt h eg i a n tp a n d a ；2 ) i n v e s t i g a t ev a r i a t i o n so fa n t i g e n - b i n d i n ge x o n 2o fa l l f u n c t i o n a lc l a s s i c a lm h cc l a s si ig e n e si nt h eg i a n tp a n d a ；2 ) e x p l o r i n gt h ee v o l u t i o n a r y h i s t o r yo fi m m u n i t y - r e l a t e dg e n e si nt w os u b s p e c i e so ft h eg i a n tp a n d a ；a n d3 ) r e v e a lt h e m a i n t a i n i n gm e c h a n i s mo fm h cd i v e r s i t yi nt h eg i a n tp a n d a t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 ) t h i ss t u d yd e v e l o p e dan o v e lm a g n e t i cb e a dh y b d d i z a t i o nm e t h o dt oi s o l a t ec d n a s e q u e n c e so fm h cg e n e s i nt h eg i a n tp a n d a ，at o t a lo f10f u l l - l e n g t hm h ce d n a s e q u e n c e sw e r ei s o l a t e d ，n i n eo fw h i c hw e r ea s s i g n e dt o6k n o w nc l a s s i c a lm h c c l a s si ig e n e si d e n t i f i e df r o mt h eg i a n tp a n d am h cg e n o m ep r o j e c t t h u s ，t h eo t h e o n ed r bc d n as e q u e n c er e p r e s e n t san o v e ll o c u s ，w h i c hw a sd e s i g n a t e dd r b 3 t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h en o v e lm a g n e t i cb e a dh y b r i d i z a t i o nm e t h o di se f f i c i e n t a n dr e l i a b l ea n dt h u sc o u l db ea p p l i e dt oo t h e rm a m m a l s 2 ) t h ec o m p l e t ec o d i n gr e g i o n si n9o u to ft h e10f u l l l e n g t ha i m e m h cc d n a s e q u e n c e sr e v e a l e dn of r a m e s h i f tm u t a t i o n s ，s t o pc o d o n so ri n d e l ，w h i c hw e r ei n g o o da g r e e m e n tw i t hf u n c t i o n a lg e n e s h o w e v e r , t h ed q a 2w a st r u n c a t e di nb o t h t h el e a d e rp e p t i d ea n dt h ec y t o p l a s m i ct a i la sc o m p a r e dt oa i m e d q a la n d h o m o l o g si n o t h e rm a m m a l s ，w h i c hi m p l i e sl o s so ff u n c t i o no ra l le v o l v i n g p s e u d o g e n e 3 ) g e n e t i cv a r i a t i o n sa n de v o l u t i o n a r yp a t t e r n so fa l l7f u n c t i o n a lm h c c l a s si ig e n e s ( 1d r a ，2d r b ，2d q a a n d2d q b ) w e r ei n v e s t i g a t e df o r121g i a n tp a n d a s ，u s i n g l o c u s - s p e c i f i cs i n g l e s t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s mg e n o t y p i n ga n ds e q u e n c i n g t e c h n i q u e s t h er e s u l t sr e v e a l e dt h ep r e s e n c eo f2m o n o m o r p h i cl o c i ( d r aa n d d q b 2 ) a n d5p o l y m o r p h i cl o c iw i t hd i f f e r e n tn u m b e r so fa l l e l e s ( 7a td r b 1 ，6a t d r b 3 ，7a td q a l ，4a td q a 2 ，6a td q b l ) c o m p a r e dt oo t h e re n d a n g e r e da n i m a l s v 浙江大学博十学位论文火熊猫i i 类m h c 功能基因的分离及适心性进化研究 a n ds p e c i e se x p e r i e n c i n gs e v e r eb o t t l e n e c k s ，t h eg i a n tp a n d ae x h i b i t e da m p l e v a r i a t i o n si nt h ea d a p t i v ei m m u n es y s t e m s 4 ) d e s p i t es h a r i n gt h ei d e n t i c a l a l l e l e sa c r o s sa l lm h cl o c i ，t h ew o l o n ga n dt h e c h e n g d uc a p t i v ep o p u l a t i o n so f t h es i c h u a n ( i e n o m i n a l ) s u b s p e c i e se x h i b i t e dl a r g e d i f f e r e n c e si nt h ed i s t r i b u t i o no fa l l e l i cf r e q u e n c i e s ，r e f l e c t i n gr e s p e c t i v ef o u n d e r e f f e c t s t h em a i nf o u n d e r sa l l e l e sw e r ed i s t r i b u t e dw i d e l yi n t h ec a p t i v ep o p u l a t i o n ， w h i l er a r e ra l l e l e sn o th a r b o r e di nt h ef o u n d e rm a yh a v ed r i f t e do u t f o rs u s t a i n a b l e d e v e l o p m e n to ft h eg i a n tp a n d a , i tw i l lb en e c e s s a r yt oi n c r e a s et h em a t i n gs u c c e s s o fg i a n tp a n d a sc a r r y i n gr a r ea l l e l e s ，i no r d e rt oe n h a n c ep a t h o g e nr e s i s t a n c ei n c a p t i v ep o p u l a t i o n s 5 ) t h et w og i a n tp a n d as u b s p e c i e s ，t h es i c h u a n ( i e n o m i n a l ) a n dt h eq i n l i n g s u b s p e c i e s ，e x h i b i t e ds u b s t a n t i a ld i f f e r e n c e si na l l e l ed i s t r i b u t i o na n da l l e l er i c h n e s s t h ef o r m e rh a sm o r ea l l e l e si nd qg e n e st h a nt h el a t t e r ( 16 ：10 ) ，a n db yc o n t r a s t ，t h e l a t t e rh a sm o r ea l l e l e si nd rg e n e st h a nt h ef o r m e r ( 11 ：9 ) i nt o t a l ，t h es i c h u a n s h a p e d9s p e c i f i ca l l e l e s ，a n dt h eq i i l l i n gs u b s p e c i e s5 t h e s ed i f f e r e n c e si na l l e l i e d i s t r i b u t i o na n dt h ep r e s e n c eo fs u b s p e c i e s - s p e c i f i ca l l e l e si m p l i e st h a tt h et w og i a n t p a n d as u b s p e c i e sh a v ee x p e r i e n c e dd i f f e r e n te v o l u t i o n a r yh i s t o r i e ss i n c et h e i r d i v i s i o n ，a n dh a v ee v o l v e dt h e i ro w nf u n c t i o n a lm h cm o l e c u l e st or e s i s td i f f e r e n t h a b i t a t s p e c i f i cp a t h o g e n s 6 ) b a l a n c i n gs e l e c t i o ni nt h eg i a n tp a n d aw a ss u p p o r t e db yt h ef o l l o w i n gp i e c e so f e v i d e n c e ：( a ) t h eo b s e r v e dh e t e r o z y g o s i t yw a sh i g h e rt h a ne x p e c t e d ( b ) a m i n oa c i d h e t e r o z y g o s i t yw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e ra ta n t i g e nb i n d i n gs i t e s ( a b s ) c o m p a r e dt o n o n a b ss e q u e n c e s ( p 0 0 1 ) ( c ) t h es e l e c t i o np a r a m e t e rf o ( d s l d s ) w a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e ra ta b sc o m p a r e dt on o n - a b ss e q u e n c e s 俨 0 9 5 ) w e r el o c a t e da t o ra d j a c e n tt oa na b s 7 ) t h e s i c h u a ns u b s p e c i e sd i s p l a y e dl o w v a l u e sa td r b 1 ( 9 2 7 ) a n dn o n a b s ( 3 4 9 ) f o rt h ed r a a n dd q b 2 ，b o t hs u b s p e c i e se x h i b i t e dm o n o m o r p h i s m ，s h o w i n g s t r o n gp u r i f y i n gs e l e c t i o n o nt h eo t h e rh a n d ，i n t r a g e n i cr e c o m b i n a t i o nw a sd e t e c t e d i nd r b 1 ，d q a 1a n dd q b 1 ，p r o v i d i n ge v i d e n c eo fr e c o m b i n a t i o ns e r v i n ga so n e i m p o r t a n td i v e r s i f i c a t i o nm e c h a n i s m 1 1 1s u m ，o u rp r e s e n tr e s u l t ss u g g e s tt h a tb a l a n c i n g ，p o s i t i v ea n dp u r i f y i n gs e l e c t i o n a c c o m p a n i e db yr e c o m b i n a t i o nd r i v et h ec o n t r a s t i n gd i v e r s i t yp a t t e r n so ft h em h c c l a s s i ig e n e sb e t w e e n2g i a n tp a n d a s u b s p e c i e s k e yw o r d s ：g i a n tp a n d a ；a n t i g e nb i n d i n gs i t e s ( a b s ) ；m h c ；b a l a n c i n gs e l e c t i o n ； p o s i t i v es e l e c t i o n ；p u r i f y i n gs e l e c t i o n ；r e c o m b i n a t i o n v i i 浙江大学博上学位论文人熊猫i i 类m h c 功能基因的分离及适应性进化研究 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得浙婆太堂或其他教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者张i i 鲁么岛签字日期1 年月f 钿 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解澎塑太堂有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江太堂可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：f 多当 签字日期：。叼年g 月r 日 导师签名： 锣杉闺 签字日期：勿呷年厶月l ， 浙江人学博士学位论文大熊猫i i 类m h c 功能基冈的分离及适应性进化研究 致谢 自从三年前进入这个实验室以来，不管是在治学还是为人方面，我都得到了 导师方盛国教授和万秋红副教授的亲切关怀和悉心指导。学位论文的选题、实验设 计、数据分析及论文撰写等多个环节的完成都离不开导师对我倾注的无尽心血。导 师高瞻远瞩的学术眼光、富于创造性的求是思维、严谨的治学精神均使我受到了良 好熏陶! 导师在治学上对学生要求严谨，但是在实践中对学生的管理却富有弹性， 给了学生很大的发挥空间，因而培养了我严谨科研态度的同时，也锻炼了我独立的 科研能力，在此非常感谢导师对我的信任和大力栽培! 在实验过程中，导师关注着 实验的进展，并不断地跟我交流，使我的实验得以前进；在论文撰写过程中，导师 日以继夜地给我修改论文，同时提出了许多宝贵而启发心智的意见，让我受益匪浅! 对于两位导师三年来至今给予我的关心和帮助，学生将毕生难忘! 非常感谢葛云法老师，若非他辛勤外出采样，我的论文不可能得以顺利完成! 同时，作为德育导师，葛老师在学习和生活上给我提供了不少帮助和建议，在此表 示由衷的感谢! 非常感谢吴海龙副教授在实验方面给我带来了不少闪光的理念! 感 谢曾长军博士以及朱亮博士在有关大熊猫m h c 研究方面做了大量的工作，使我得 以延续下去完成我的博士学位论文! 本论文实验的完成有赖于章鹦鹦同学的积极配 合与辛勤劳作，在此谨表深深的谢意与感激! 感谢在这个实验室里相处过的每一位兄弟姐妹们：已经毕业的博士生何陆平、 潘慧娟，硕士生陈轩、龚少斌、郭洋、类延乐、吴建会、荆伟、王晓亮以及来自华 东师大的韩军和来自中科院水生所的连灏，本科生焦阳、蒋静聆，以及在读的博士 生赵莎莎、叶青、张培、何珂、鹿博、陈礼诚，在读的硕士生朱英、连虹、龚杰、 常真、匡叶叶、李灵、曾倩倩以及来自安徽师大的倪小伟和虞健。兄弟姐妹们共同 营造了团结、互助的气氛，让我度过了三年愉快而充实的难忘时光! 最后，我要特别感谢我可敬的爸爸妈妈和可爱的七个兄弟姐妹，感谢他们多年 来对我的无私关爱、理解和支持! 从呱呱坠地、到长大成人到修完博士学位，是他 们给了我追逐人生理想的动力! 同时特别感谢我的先生，不管是在琐碎的日常生活 中还是彷徨的人生路口，是他给了我依靠和信赖! 祈江大学博士学位论文大熊猫1 1 类m h c 功能基因的分离丑适应性进化研究 第一部分绪论 第1 章大熊猫研究综述 i i 大熊猫的分类、分布及生存现状 太熊猫( a d u 掣d a 榭h o k 脚) 是我国特有的珍稀物种，被世界白然保护联盟 ( 简称i u c n ) 列为濒危等级，被顿危野生动植物种国际贸易公约( 简称c i t e s 公约) 列为附录1 物种世界自然基金会( w w f ) 早在1 9 6 1 年成立之初，就将大熊 猫围案作为其会旗和会微的标识。因此，大熊猫己成为全球野生动植物保护领域的旗 舰物种。另一方面，大熊猫具有肉食动物特有的简单消化道，但却以竹子为食；作为 生物进化历史上成功的特化者，大熊猫是当夸科学研究难得的珍贵材料 图1i 大熊猫剑齿象动物群( 引自赵学敏，2 0 0 6 ) 我国古代以来就有关于大熊猫的文献记载，但直到1 8 6 9 年法国传教士d a v i d 根 据在四川宝兴获得的标本正式命名为u r s u s m e l a n o l e u c a d a v i d ，意为“黑白熊”不久， m i l n e - e d w a r d s 对大熊猫骨骼标本再行研究后另立大籀猫新属a i l u r o p o d a ，之后大熊猫 的学名虽有过变动，但是a i l u r o p o d am e l a n o l e u c a ( d a f i d ) 得到了大多数学者的接受 和使用；然而对于大熊猫属于浣熊科、熊科还是独立为大熊猫科曾经存在有较多的争 议( 马逸清等，1 9 9 4 ) 。通过形态学、分子生物学等方面的研究，目前国际上大多数 学者都接受大晦猫隶属于熊科的观点( 胡锦矗，2 0 0 0 ；l a n w a n g ，1 9 9 8 ；p e n g e ta l ， 2 0 0 7 ；p a 豳e t a l ，2 0 0 8 ) 。据化石记录大熊猫有一属二种：早更新世出现的小型大熊 猫am i c r o t a p e i 和巴氏大熊猫亚种am e l a n o l e u c ab a c o n i ( w o o d w a r d ) ，而全新世以 来的大熊猫为现生种am e l a n o l e u c a ( 黄万波，1 9 8 4 ；魏辅文等，2 0 0 6 ) 。 浙江大学博上学位论文大熊猫i i 类m h c 功能基因的分离及适应性进化研究 大熊猫是我国南方“大熊猫一剑齿象”动物群的一个主要成员( 图1 1 ) ，从人类诞 生至旧石器时代起几乎遍布南方诸省份，随着新石器时代人类的发展和扩张，大熊猫在 个体大小、数量和分布范围上大大减少或缩小，逐渐走向衰亡，如今退居到小气候颇 多的深山峡谷带( 四川省珍贵动物资源调查队，1 9 7 7 ) 。化石记录表明大熊猫曾经广 泛分布于中国东部、南部，乃至缅甸北部和越南北部( 胡锦矗，2 0 0 1 ) ，然而频繁的 人类活动致使大熊猫栖息地呈严重片段化，目前大熊猫仅分布于四川盆地西北缘向青 藏高原过渡的山岳地带。大熊猫的整个分布区域较狭长，仅包括秦岭、岷山、邛崃山、 大相岭、小相岭和凉山等6 个彼此隔离的山系( 图1 2 ) 。截至2 0 0 3 年底，野生大熊 猫种群数量仅存1 5 9 6 只( 四川1 2 0 6 只，陕西2 7 3 只，甘肃1 1 7 只) ( 国家林业局， 2 0 0 6 ) ，而人工 在大熊猫分布的山系中，秦岭大熊猫化石纪录可以追溯到距今7 0 多万年前的中 更新世初期( 潘文石等，2 0 0 1 ) ，但是大熊猫在秦岭山系的分布直到1 9 6 4 年才被确认 并予以公布( 郑光美，徐平宁，1 9 6 4 ) ，这比四川大熊猫的发现公布晚了近一百年。 近年来学者根据大熊猫秦岭种群与其他种群在形态学和分子遗传水平上的显著性分 化，确定了大熊猫秦岭亚种( a 研q i n l i n g e n s i s ) ，- 9 分布于四川和甘肃的大熊猫指名 亚种( a 朋m e l a n o l e u c a ) 相区分( w a ne ta 1 ，2 0 0 3 、2 0 0 5 ；方盛国等，2 0 0 8 ) 。在骨 骼形态上指名亚种头骨较大，臼齿较小，而秦岭亚种则头骨较小、臼齿较大。两个亚 2 浙江大学博十学位论文大熊猫i l 类m h c 功能基因的分离及适应性进化研究 种在毛色方面的差异也很明显，指名亚种胸部为深黑色，腹部为白色，下腹部毛尖黑 色、毛干白色；秦岭亚种胸部呈深棕色，腹部为棕色，下腹部毛尖棕色、毛干白色( 万 秋红等，2 0 0 7 ) 。 作为濒危物种，大熊猫的生存和发展主要受到栖息地破坏、因竹子开花导致的食 物短缺、人类的猎杀和疾病等因素的影响( 四川省珍贵动物资源调查队，1 9 7 7 ；s c h a l l c r e ta 1 ，1 9 8 5 ；s c h a l l e r ，1 9 9 3 ；杨光友，1 9 9 8 ) 。自从2 0 世纪5 0 年代国家开始重视大 熊猫的保护以来，国内外对大熊猫的栖息地保护以及人工繁育投入了大量的人力物 力，目前取得了一定的效果。但是高疾病感染率和死亡率仍然严重威胁着这个物种的 生存( 四川省珍贵动物资源调查队，1 9 7 7 ；叶志勇，1 9 9 1 ；z h a n gc ta 1 ，2 0 0 8 ) 。因此， 为了更好地保护大熊猫这个珍贵的物种，很有必要从保护遗传学的角度对大熊猫与疾 病抗性相关的适应性进化基因进行研究。 1 2 大熊猫保护遗传学的研究现状 1 2 1 保护遗传学的概念 保护生物学是一门多学科交叉的综合性学科，它是运用遗传学、种群生物学生 理学、兽医学、社会科学等诸多学科的理论基础和技术方法，来阐明遭受到人类活 动破坏的生物群落和生态系统的生物学问题，从而从根本上解决生物多样性保护的 相关问题( 方盛国等，2 0 0 8 ) 生物多样性包括生态系统多样性、物种多样性、种群 多样性和遗传多样性等四个不同的水平保护一个物种，最重要的是需维持足够大 的种群，使物种具有足够大的基因多样性才能保证它们适应环境的变化，从而免受 随机灭绝因素的影响( 潘文石等，2 0 0 3 ) 学、分类学、分子生物学、种群遗传学、 因此，应运而生的保护遗传学一结合生态 进化生物学和数学模型等多学科的特点， 用遗传学相关研究手段促进生物保护的新学科就成了保护生物学的重要分支学科 ( 方盛国等，2 0 0 8 ) 。 保护遗传学所关注的对象，是环境胁迫中的小种群；保护遗传学研究内容包括 分类地位的确定、保护与管理单元的界定、对小种群的遗传管理、个体鉴定、遗传 多样性分析等。保护遗传学这个新生学科诞生至今已有近二十年，国际上在动物保 护遗传学研究已经发展到较高水平，而国内在相同领域的发展尽管与之存在一定的 距离，但是大熊猫保护遗传学的研究成果已经取得了具有世界先进水平的局部性突 破( 方盛国等，2 0 0 8 ) 。 浙江大学博士学位论文大熊猫i i 类m h c 功能基因的分离及适应性进化研究 1 2 2 大熊猫的非损伤取样和d n a 提取 野外的1 5 9 6 只大熊猫分布于秦岭等六个相互隔离的山系中，其中大相岭和小相 岭山系分别仅分别分布有2 9 只和3 2 只，且没有圈养的个体( 国家林业局，2 0 0 6 ；x i e g i p p s ，2 0 0 7 ) ，加之野外的大熊猫生活独居，形迹难觅( s c h a l l e re ta 1 ，1 9 8 5 ) ，因 而要想从高山峡谷的野生种群中取得大样本血液或者组织器官样品来开展保护遗传 学研究是不现实的。对于圈养种群，从动物保护的角度出发，进行血液、器官组织等 样品采集也是不科学的。因此，样品的采集成了大熊猫保护遗传学研究的瓶颈。 二十世纪七十年代，由于竹子大面积开花引起的食物紧缺导致上百只大熊猫死亡， 在此期间有关单位收集的样品是采用福尔马林固定的。为了研究这些福尔马林固定的 样品，方盛国等利用“3 0 1 0 0 乙醇梯度脱水一醋酸异戊酯浸泡置换乙醇一临界点 干燥去甲醛”的三重处理法处理福尔马林固定的组织样品，成功地从福尔马林标本中 提取了高质量的d n a ，从而建立了一个可靠的大熊猫非损伤性取样方法( f a n ge ta 1 ， 2 0 0 2 ；w a ne ta 1 ，2 0 0 6 a ) 。 在对数量稀少而踪迹难觅的濒危动物开展保护遗传学研究过程中，通过采集粪便 来提取动物的d n a 已经成为非损伤取样进行遗传分析的重要策略( k o h n & w a y n e ， 1 9 9 7 ) 。在动物的粪便之中，包含有消化道脱落的上皮细胞，可用来进行基因组d n a 的提取。大熊猫喜食竹子，食量大，其消化道又简单如其他食肉目动物的消化系统， 因此大熊猫有边吃边拉的习惯，其粪便就成为野生大熊猫种群遗传学研究的最佳非损 伤性材料。w a n 等从大熊猫新鲜粪便中提取到高质量的基因组d n a ，并首先应用于 不同种群d r b 基因的遗传多样性研究中( w a ne ta 1 ，2 0 0 6 b ) 。因此，从福尔马林固 定的样品以及新鲜粪便样品中提取高质量d n a 的技术方法，解决了大熊猫保护遗传 学研究中的非损伤性取样和大样本d n a 的提取问题，从而为大规模地开展大熊猫野 生种群的遗传检测奠定了基础。 1 2 3 大熊猫保护遗传学研究 大熊猫遗传多样性研究已进行了许多工作。宿兵等通过蛋白电泳技术，分析了1 2 只人工圈养大熊猫的3 6 种同功酶及蛋白质共4 0 个遗传座位，发现只有一个座位存在 多态性，并由此认为大熊猫遗传多样性极度贫乏( 宿兵等，1 9 9 4 ) 。方盛国等用d n a 指纹图谱对岷山、邛崃山、小相岭、凉山等多个大熊猫野生种群研究，发现现存大熊 猫的遗传多样性很低，而在不同种群间多样性水平差别也较大，大相岭、小相岭和凉 山等规模较小的种群要比秦岭、岷山、邛崃等大种群明显低得多，他们认为小种群遗 4 浙江大学博士学位论文大熊猫h 类m h c 功能摹阏的分离及适应性进化研究 传多样性的降低容易导致物种的灭绝( 方盛国等，1 9 9 6 、1 9 9 7 ；f a n ge ta 1 ，2 0 0 2 、2 0 0 3 ) 张亚平等则通过研究来源于马边、美姑等地4 0 只大熊猫个体间的线粒体t r n a 基因 和d 环区序列的变异，从2 1 个创立者中检出9 种线粒体单倍型，认为大熊猫间存在 广泛的个体间遗传差异，但是大熊猫种群多样性及遗传分化程度很低，大熊猫种群内 和种群间的遗传多样性水平趋近( 张亚平等，1 9 9 7 ) 。 然而l u 等通过用线粒体d n a 限制性酶切片段长度多态性( r f l p ) 、线粒体d n a 控制区序列、核d n a 指纹图谱及微卫星d n a 等4 种遗传学指标对秦岭、岷山、邛 崃山等三个大熊猫种群共4 3 只个体进行遗传多样性进行研究，认为大熊猫整体上种 群遗传多样性水平呈中等，而种群规模较小的秦岭种群遗传多样性水平相对于其他种 群较略低，而且与其他山系间出现明显的分化。他们推测大熊猫在进化历史上可能发 生过瓶颈效应，到后来遗传多样性得到一定的恢复，现今大熊猫种群的明显缩减是由 于近期栖息地丧失所导致的( l ue ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 z h a n g 等( 2 0 0 7 ) 利用线粒体控制区序列和l o 个微卫星标记研究了秦岭、岷山、 邛崃山、凉山和小相岭等5 个山系现存大熊猫种群的遗传多样性，发现大熊猫比其他 熊类的多样性水平还高，种群之间尤其是秦岭种群与其他种群间的遗传分化很显著； 近几千年来大熊猫种群的缩减很大程度上受到人类活动的影响，大熊猫这个物种本身 并没有走到“进化的死胡同”。2 0 0 8 年，z h a n g 等利用1 6 对大熊猫微卫星引物并用来 检测了2 7 个圈养大熊猫个体的变异水平，发现这个圈养种群多态性水平比较高，不 同座位的观察杂合度在o 1 8 5 0 9 2 6 之间( 平均值为0 6 8 9 ) ( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 8 ) 。同 年，w u 等利用3 3 个微卫星标记研究了6 0 只大熊猫的多态性，发现大熊猫的等位基 因从2 1 3 不等，而平均观察杂合度为o 1 6 8 0 8 0 0 不等( w ue ta 1 ，2 0 0 8 ) h e 等 ( 2 0 0 8 ) 利用1 3 个微卫星标记对王朗和宝兴自然保护区的6 3 只大熊猫进行多样性调 查，发现王朗保护区的平均观察杂合度为0 4 8 8 ，而宝兴保护区的为0 5 5 3 s h e n 等 ( 2 0 0 9 ) 以王朗和宝兴两个自然保护区野生大熊猫种群作对照，利用1 1 个微卫星标 记研究了成都大熊猫繁育基地和中国保护大熊猫研究中心等两个圈养种群的遗传变 异，认为圈养种群在等位基因多样性和杂合度方面都低于野生种群，并提出要把野生 种群引入到圈养种群中进行繁殖。 综上所述，近十几年来关于大熊猫的遗传多样性研究，从整体上反映出大熊猫这 个濒危物种比较低的遗传多样性以及一定程度的种群分化；但是以上对大熊猫圈养种 浙江大学博士学位论文大熊猫i i 类m h c 功能基因的分离及适戍性进化研究 群以及部分野生种群分析的大部分研究都是基于个体数量比较少的取样，相对于野外 大熊猫( 近1 6 0 0 只) 和圈养种群( 近2 4 0 只) 的数量少很多( 国家林业局，2 0 0 3 ； x i e & g