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(分析化学专业论文)生物化学信号物质的研究.pdf.pdf 免费下载
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文档简介
摘要 生物个体之间和生物体内部的化学联系是一个普遍规律。经研究发现,植物 之间能够通过挥发性的化合物传递抗病信息。当植物受到病毒或昆虫侵害时,会 产生一系列次生代谢物质以抵抗病毒或昆虫侵袭,与此同时,植物还会产生挥发 性的化学物质,通过空气传播到临近的植株并诱导它们产生系统抗性;另一方面, 植物还能探测到入侵昆虫的类型,并释放出特定的气味的化合物吸引昆虫天敌。 研究植物之间传递的挥发性化学物质为开发全新的生态制剂、防治植物的病虫开 辟新的途径。 不仅是植物,人体内部也时刻通过生物化学信号物质进行联系。当人体发生 疾病时,血液、尿液以及呼吸中会相应出现疾病标志性化合物。分析这些疾病相 关的生物化学信号物质已经成为临床诊断疾病的一种重要的手段。生物医学研究 结合分析化学、生命科学、医学等学科进行人类重大疾病的诊断、治疗已成为当 前研究的热点。发展色谱质谱技术分析人体生物化学信号物质对重大疾病进行筛 查和预警已经成为其重要的方向之一。糖尿病和肺癌是目前人类目前两类重大的 疾病,通过血液分析和呼吸分析发现糖尿病和肺癌的标志物分子,然后建立简单、 快速的疾病标志物的分析方法,这对于糖尿病和癌症早期诊断和预警有十分重大 的意义。 无论植物之间的传播的挥发性信号化合物还是人类呼吸气体中的疾病相关 的疾病标志分子,这些生物化学信号物质的分析通常是采用气相色谱来进行分 离。但传统的气相色谱仪体积大、分析速度慢,不能满足生物化学信号物质现场、 快速分析的需要。生物化学信号物质的研究迫切要求研制出一种能够进行快速、 现场分析的仪器微型便携式气相色谱仪。 本论文研究了番茄对烟草花叶病毒的防御反应中的生物化学信号物质,发展 了一系列的分析植物化学信号物质( 水杨酸和水杨酸甲酯) 的方法,并应用这些 方法研究了番茄植物抗病化学信号物质,首次发现了水杨酸甲酯是番茄植物在防 御烟草花叶病毒过程中的化学信号物质,并且采用化学诱导和基因表达的实验方 法进行了论证;在人体生物信号物质研究方面,发展了准确、快速分析糖尿病的 标志物分子丙酮的新方法,论证了呼吸分析诊断糖尿病的可行性;我们还发展了 顶空萃取血液中挥发物以及醛类化合物衍生化的分析方法,通过比较分析,我们 第一次在肺癌的血液中发现肺癌的两个疾病标志物分子。由于生物化学信号物质 现场、快速分析的需要,我们发明了色谱柱柱上直接加热和微型f i d 检测器,在 其基础上成功研制了具有自主产权的微型便携式气相色谱仪。应用微型便携式气 相色灌仪我们对番茄植物的化学信号物质和人类呼吸气体进行了现场、快速分 析。研究的结果表明使用微型便携式气相色谱仪具有现场、快速分析的优点,非 常适合用于生物化学信号物质的研究。 本论文共分五章。主要内容摘要如下: 第一章论述了生物之间化学联系的普遍性及研究植物之间传递的挥发性化 学物质对开发全新的生态制剂、防治植物的瘸虫的重要性;并阐述了发展发展分 子诊断技术对重大疾病早期诊断和预警的重大意义。此外还综述了生物化学信号 物质的分析方法,指出了研制微型气相色谱仪的重要性和必要性。 第二章所述的论文工作中,首先发展了一系列的植物化学信号物质( 水杨酸 和水杨酸甲酯) 的分析研究方法:( 1 ) 硅烷化气相色谱一质谱测定植物叶片中水 杨酸。该方法具有分析速度快、灵敏度高等优点,适合于植物信号化合物水杨酸 的快速分析。( 2 ) 直接样品引进热脱附气相色谱一质谱技术分析植物叶片中的信 号化合物水杨酸甲酯。该方法的最大优点就是样品量少、无需样品准备且灵敏度 高。它非常适合研究同一棵苗不同部位叶片对病毒或昆虫的防御反应差异。( 3 ) 固相微萃取气相色谱一质谱分析植物叶片中的信号化合物水杨酸甲酯。由于采用 固相微萃取技术,该方法简单、方便、不需要有机溶剂。( 4 ) 固相微萃取气相色 谱一质谱分析植物之间传递的信号化合物。利用该技术能够有效地富集植物释放 的挥发物,与文献报导的其他方法相比,该方法更为简单。使用固相微萃取技术 的最大的优点就是它可以和我们研制的微型色谱仪连用,在野外现场进行植物信 号物质的研究。使用这些方法,我们研究了番茄感染烟草花叶病毒后对其的防御 反应,发现番茄感染烟草花叶病毒后,在植物叶片中产生大量的水杨酸,然后迅 速地转化为水杨酸甲酯,通过叶片组织释放出来。通过诱导实验和基因表达实验 我们认证了水杨酸甲酯是通过空气传播诱导邻近的植物产生抗性的化学信号物 质。 第三章所涉及的论文工作主要研究发展了色谱质谱技术分析了糖尿病和肺 癌的生物标志分子,初步建立了诊断糖尿病和肺癌的简单、可靠的方法。我们发 展了准确定量分析人类血液和呼吸中丙酮的浓度的方法:衍生化固相微萃取气相 色谱质谱。这些方法具有简单、迅速、无需有机溶剂、检测限低且灵敏度高等优 点。研究结果表明使用该方法能够快速准确地定量分析呼吸中丙酮浓度,从而诊 断是否患有糖尿病。 本章论文工作还应用了顶空固相微萃取g c m s 方法分析血液中的挥发性化 合物,通过比较肺癌患者和正常人的血液中的挥发性化合物,我们初步发现了两 个肺癌的标记分子一己醛、庚醛。紧接着我们进一步发展了定量分析低分子量的 醛的衍生化固相微萃取g c m s 方法,得到的结果进一步证实一己醛、庚醛是癌症 相关的标志化合物。 第四章首先综述了微型便携式气相色谱仪的研究进展。为了满足环境分析和 生物化学信号物质分析的需要,我们采用了全新的设计原理,研制出了微型便携 式气相色谱仪。在微型便携式气相色谱仪的研究中,我们发明了两个关键技术: 和微型氢火焰离子检测器。首先,色谱柱柱上直接加热系统具有高效、低热容、 紧凑等优点,而且制作简单。柱上直接加热系统的加热装置由电热丝、绝缘保温 层组成。通过给一个电流使用温控程序,色谱柱可以从环境温度以l 1 0 0 c s 的 速度升温到2 5 0 0 c 。此外。该加热装置的降温速率也较快,约为5 6o c s ;若使 用强制性降温措施,降温速率可达到1 0 3 0o c s ,能够满足快速分析的需要。其 次,氢火焰离子化检测器f i d 具有如下几个特点:通用性强,灵敏度高,对各类 有机物都有响应,非常适合于分析轻烃气体和各种挥发性及半挥发性有机物,且 检测器的线性范围宽。根据f i d 的基本原理,我们发明了一个体积小、只需要两 路气源( 空气和氢气) ,积木式结构的微型火焰离子化检测器。在掌握这两个关 键技术的基础上,结合控制气路的微型阀件和其它技术,我们加工制造了具有自 主产权的便携式微型气相色谱仪。测试表明该微型色谱仪有线性范围宽( 1 0 5 ) , 检测限低,分析速度快等优点,尤其适合现场快速分析,能够广泛应用于环境分 析、食品分析、生物分析以及生物医学中的疾病诊断等领域。该研究项目已通过 上海市科委的鉴定,鉴定结果为:该便携式微型气相色谱仪达到了国际上同类产 品的先进水平,其中色谱柱程序升温系统、微型火焰离子化检测器等核心部件在 国际同类产品中处领先水平。 第五章我们使用微型便携式气相色谱仪快速分析了人体呼吸中的糖尿病标 志物丙酮含量。应用微型色谱仪来分析呼吸气体中的疾病标志物,可以对重大疾 病如糖尿病和肺癌作出有效的初步诊断及预警。我们还以固相微萃为富集技术, 微型便携式气相色谱仪为分析手段,对番茄在防御烟草花叶病毒时产生的信号化 合物进行了快速分析。结果表明微型便携式气相色谱仪是野外进行植物抗病化学 信号研究的一个重要工具。 本论文围绕生物化学信号物质这个主题,研制了具国际领先水平的微型便携 式气相色谱仪,并以气相色谱质谱和微型便携式气相色谱仪为分析工具,对植 物之间传播的化学信号物质和人体疾病信号标志分子分别进行了研究:在植物化 学信号物质研究方面,发展了植物化学信号物质的分析方法,发现了水杨酸甲酯 是番茄防御烟草花叶病毒侵害的抗病信号物质;在人体化学信号研究方面,我们 建立了准确分析疾病标志物的方法,发现了肺癌的两个标志分子。研究还表明微 型气相色谱仪能够快速分析呼吸气体中的疾病标志物,对重大疾病如糖尿病和肺 癌的初步诊断及预警有着巨大的潜力:另外微型气相色谱仪也是野外植物抗病信 号物质的研究的必要的工具。 关键词:生物化学信号化合物:番茄;肺癌;糖尿病;便携式微型气相色谱仪 a b s t r a e t o r g a n i s m sa r er e l a t e db ys i g n a l i n gc h e m i c a l s i ti sd e m o n s t r a t e dt h a tv o l a t i l e c o m p o u n d sr e l e a s e db yp l a n t sa r ea c t e da ss i g n a l i n gt r a n s f e r r i n g p l a n ti n f e s t e db y h e r b i v o r e sa n dv i r u sc o u l dp r o d u c e s i g n a l c h e m i c a l s r e c e n tr e s e a r c hw o r k d e m o n s t r a t e dt h a tt h e s ea i r b o r n es i g n a l i n gc o m p o u n d sc o u l dt r a n s f e ra m o n gp l a n t st o i n d u c es y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e m o r e o v e r , p l a n tc o u l da l s oi d e n t i f yt h et y p eo f i n f e c t i o n sa n dc o u l dr e l e a s ed i f f e r e n tc h e m i c a l sa ss i g n a l i n g e v e nt h e yw e r ea b l et o a t t r a c te n e m i e so ft h eh e r b i v o r e st oe l i m i n a t et h ei n f e c t i o n t h e r e f o r e ,i ti ss i g n i f i c a n t t oi s o l a t ea n di d e n t i f yt h e s es i g n a l i n gc o m p o u n d s i tw i l lb ev e r yi m p o r t a n tt od e v e l o p n e wt y p eo f p e s t i c i d e st h a ta r eb e t t e rf o re n v i r o n m e n ta n de c o l o g y s y s t e m , b i o - c h e m i c a lr e l a t i o ne x i s t si nn o to n l yp l a n t sb u ta l s oh u m a nb o d y h a m a nd i s e a s e i sr e l a t e dt ot h eb i o m a r k e r si nb l o o d ,u r i n ea n db r e a t h d i a g n o s i so fd i s e a s ec o u l db e p e r f o r m e db ya n a l y s i so ft h e s eb i o - c h e m i c a ls i g n a l s b i o m e d i c i n ei sb e i n gd e v e l o p e d a s ak e yp o t , i nw h i c ha n a l y t i c a lc h e m i s t r y 1 i f es c i e n c ea n dm e d i c i n ee t c a r e c o m b i n e d d e v e l o p m e n to fc h r o m a t o g r a p h ya n dm a s ss p e c t r o m e t r yt e c h n i q u ef o r d i a g n o s i so f s e v e r ed i s e a s e si sa l li m p o r t a n tb r a n c ho f b i o m e d i c i n e d i a b e t e sa n dl u n g c a n c e ra r et w os e v e r ed i s e a s e s ,i ti ss i g n i f i c a n tt od e v e l o pn e wm e t h o d ss u c ha sb l o o d a n db r e a t ha n a l y s i sf o rf i n d i n gb i o m a r k e r sa n da p p l i c a t i o nt oe a r l yd i a g n o s i so f d i a b e t e sa n dl u n gc a r l c e r i g a sc h r o m a t o g r a p h yh a sb e e nu s e df o ra n a l y s i so fa i r b o m es i g n a l i n gc o m p o u n d s a m o n gp l a n t sa n db i o m a r k e r si nb r e a t h h o w e v e r ,g a sc h r o m a t o g r a p hh a sl a r g e v o l u m ea n dn e e d sm u c ha n a l y s i st i m e ,i tc o u l dn o tm e e tw i t hf i e l da n dh i 曲s p e e d a n a l y s i so fb i o c h e m i c a ls i g n a l s t h e r e f o r e ,m a n u f a c t u r eo fp o r t a b l ea n dm i c r og ci s p r e s s i n g i nt h i st h e s i s ,t o m a t od e f e n s er e s p o n s et ot m vw a ss t u d i e d a tf i r s t ,w ed e v e l o p e d as e r i e so fn o v e lm e t h o d sf o rd e t e r m i n a t i o no fp l a n t s i g n a l l i n gc o m p o u n d ss u c ha s s a l i c y l i ca c i da n dm e t h y ls a l i c y l a t e a n dt h e n ,w ea p p l i e dt h e s em e t h o d st ot o m a t o d e f e n s er e s p o n s et ot m v f o rt h ef i r s tt i m e ,w ef o u n dt h a tm e s ai sa na i r b o r n e s i g n a l i n gc o m p o u n di nt o m a t od e f e n s er e s p o n s et ot m v i nt h i st h e s i s n o v e lm e t h o d s w e r ed e v e l o p e df o ra c c u r a t ea n a l y s i so fa c e t o n ei nb r e a t ha n db l o o d w ed e m o n s t r a t e d t h a ti ti sf e a s i b l et od i a g n o s ed i a b e t e sb yb r e a t ha n a l y s i s i n v e s t i g a t i o no fb i o m a r k e r s r e l a t e dt od i a b e t e sa n dl u n gc a n c e rw a sc a r r i e do u tb yb l o o da n db r e a t ha n a l y s i s w e a l s o d e v e l o p e d n e wm e t h o do f s o l i d - 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f i b e rd e r i v a t i z a t i o n t e c h n i q u ew a sa p p l i e dt oa n a l y s i s o fa c e t o n ei nb r e a t h t h em i c r og cw i t h s o l i d p h a s em i c r o e x t r a c t i o nt e c h n i q u ew a sa l s ou s e df o ra n a l y s i so fp l a n ts i g n a l i n g c o m p o u n d si nt o m a t op l a n tr e s p o n s et ot m v , t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm i c r og ci s s u i t a b l ef o rf i e l da n a l y s i so fp l a n t - s i g n a l i n gc o m p o u n d s i tw a sa l s od e m o n s t r a t e dt h a t m i c r og ch a sg r e a tp o t e n t i a lt ow a r n i n go fg r e a td i s e a s e sb yf i e l da n df a s ta n a l y s i so f b i o m a r k e r si nh u m a nb r e a t h k e y w o r d s :b i o c h e m i c a ls i g n a l i n gm o l e c u l e ;t o m a t op l a n t ;l u n gc a n c e r ;d i a b e t e s ; m i c r op o r t a b l eg c 复旦大学博士学位论文 第一章生物化学信号物质的研究背景和选题意义 1 1 生物体的化学联系 生物个体之间的化学联系是一种普遍规律。蝴蝶在花丛间飞舞采蜜;蚂蚁 和蜜蜂形成社会性群体,其识别路径的本领令人惊异;法布尔注意到,雄蚕蛾甚 至能从几公里外准确无误地找到同种雌虫并与之交配;植食性的昆虫有不同的食 性,有的取食上百种植物,有的取食一种植物 1 】。 人类对生物间化学关系的认识的时间和人类本身的历史一样悠久,这主要出 于人类自身生存和发展的需要。我国古代劳动人民早就知道利用蒿草的气味驱避 蚊虫,贾思鲡的齐民要术中就已经抗虫品种的选择,三千多年前人们就开始 利用植物性的杀虫剂。菌毒( m y c o t o x i n ) 对人和家禽的毒性已经人所共知。人 类早就认识了蜂毒、蝎毒和蜘蛛毒的性质,并在医药开发、疾病防治中加以应用。 从沙蚕、除虫菊中分离和提取有杀虫性的化学物质,并改造成杀虫剂,是农药研 究历史上的典型是率例。1 9 3 1 年t h o m a sm a n n 在他的书魔山( m a g i c m o u n t a i n ) 中告诉我们旅游者可能会在a n i t a r i st o x i c a r i a 的树阴下休息时不经意 沉睡去。因为这种大树的叶子能分泌可形成毒雾的细小液粒。液粒中含有强心碱 ( c a r d i a cg l y c o s i d e ) ,能使人昏迷 2 】。 植物可以通过化学物质影响周围的其他植物,这种作用叫植物他感作用 ( a l l e l o p a t h y l ) f 3 1 。他感作用与农林生产密切相关。胡桃树之所以可以毒害其树冠 下的植物,是由于胡桃醌的缘故。这种化学物质附在叶子上,降雨将其冲杀在地 面上。它对禾科植物、西红柿、苹果树等有毒性。也发现对小动物有毒性。它可 以显著地抑制真菌和细菌的生长,但这种物质在胡桃书体内却以糖苷( 5 - 糖基 - 1 , 4 ,5 三羟基萘) 的形式存在。这种形式并不稳定,可水解出三羟基萘,并容易 氧化成胡桃醌。大多数情况下,普通的植物成分就可以抑制其它植物的生长,一 般情况下,这些化合物对产生它们的植物没有毒性,它们可以以糖苷的形式存在 或在细胞中贮存。 在植物和动物的关系中,化学联系也广泛存在。也是生物化学信号研究较多 的方面。植物的防御系统原始的形式一般是运用毛、刺等物理方式,继而合成生 物碱等化合物。化学防御的初级水平是使植物不可口、有苦涩味或难于消化;植 物可以合成昆虫的激素物质( 如保幼激素) ,昆虫取食后生长发育会受到影响: 植物在花期吸引昆虫产卵,而在其它时期则拒斥昆虫,这是由于植物在不同时期 合成的吸引剂己烯醇( h e x e n 0 1 ) 和拒斥剂己烯醛( h e x e n a l ) 的比例不同的缘故。植 物与植食性动物( 尤其是昆虫) 的关系,许多是化学上的协同进化关系,昆虫的 复旦大学博士学位论文 取食促进了植物的防御化学物质的发展和分化,而植物的有毒成份也促使昆虫发 展解毒和适应机制 4 。 在遭到昆虫为害或病原菌侵染后,植物可以增加原有防御物质的浓度或合成 新的化学物质,这种现象叫做诱导抗性。诱导抗性是比常规抗性更有效和节省的 防御方式。植物遭受为害后,可释放出特有的挥发性气体,用以吸引害虫的天敌。 最新的研究发现,烟草在烟草花叶病毒受到侵染后,产生一种叫水杨酸甲酯的挥 发性化合物,这个化合物能够导邻近的烟草使其产生抗性。 昆虫之间的化学联系是目前研究最为详尽的。昆虫可以通过微量的化学物 质,招引异性、告警、标记路径和巢穴,并能影响其它同种个体的发育和行为。 有相当一部分水生生物利用化学物质进行防御或互相联系。有些海洋动物利 用毒物麻醉或毒杀猎物,而更多的水生生物则利用化学信息寻找猎物、躲避敌害 等。 高等动物( 包括人) 也不例外,利用唾液、尿液、汗液或其它分泌物的气味 相互影响。 从低等的微生物到高等植物,从无脊动物到高等动物,从水平环境的生物到 陆生生态系统生物中的生物。可以这样认为,生物间的化学关系是自然界的普遍 规律。 生物体内的化学联系就更加普遍,生物的体内代谢就是无数个化学反应的组 成的。研究已经发现当植物某一部分受到侵害时,植物会通过体内的化学物质作 为信号使得整个植物产生系统抗性。动物体内的生物化学联系更加丰富,这一点 为大家所公认。生物体之间或生物体内的用于生物联系的化学物质,我们称之为 生物化学信号物质。主要包括:植物化学信号物质、植物与昆虫之间
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