（微生物学专业论文）bt+9816c杀虫机理初步研究.pdf

南开大学硕上研究生毕业( 学位) 论文 摘要 b t9 8 1 6 c 是一株野生b a c i l l u st h u r i n g i e n s & 菌株，从中检测至0 的杀虫晶体蛋 白基因有：c r y l a a , c r y l a c , c r y l lc r y 2 v i p 3 a 。9 8 1 6 c 的孢晶复合物对棉铃虫和甜 菜夜蛾具有很高的杀虫活力，其l c 5 0 分别为3 0 5 v l l 和5 0 1 0 l l 。9 8 1 6 c 表达 的v i p 3 a 蛋白存在于发酵上清液中，9 8 1 6 c 发酵上清液对槔铃虫和甜菜夜蛾具有 较好的杀虫活力，其l c s o 分别为：6 9 0n g c m 2 和5 7 0n g c m 2 。而除去v i p 3 a 的 9 8 1 6 c 晶体蛋白也对棉铃虫和甜菜夜蛾具有很高的杀虫活力，其l c 5 0 分别为1 3 6 n g e m 2 和3 3 7n g c m 2 。 b t 标准株h d 一7 3 仅含有c r y l a c 基因，其晶体蛋白对棉铃虫具有毒力，l c 5 0 为2 4 8n g c m 2 ；对甜菜夜蛾没有毒力。将克隆自9 8 1 6 c 的c r y l a c 基因转化无晶 体b t 受体菌b t 9 8 1 6 c - n p ，得到转化子t 一2 。t 一2 晶体蛋白对棉铃虫和甜菜夜 蛾都没有毒力。t 一2 毒素与棉铃虫和甜菜夜蛾b b m v 的配体印记图谱也不同于 h d 一7 3 。这表明9 8 1 6 c 的c r y l a c 基因不同于标准株h d 一7 3 中的c r y l a c 基因。 棉铃虫和甜菜夜蛾幼虫中肠液的p h 值为1 0 0 左右，有利于b t 晶体蛋白的 溶解。9 8 1 6 c 、t - 2 和h d 一7 3 晶体蛋白在体外用胰蛋白酶处理和用昆虫( 棉铃虫， 甜菜夜蛾) 中肠液处理的效果没有明显区别，表明它们的毒力差异并非由棉铃虫， 甜莱夜蛾中肠液的差异造成。 通过配体印迹法研究发现，9 8 1 6 c ，t 2 和i h d 一7 3 都能与棉铃虫和甜菜夜蛾中 肠b b m v 结合。9 8 1 6 c s n h d 一7 3 与棉铃虫b b m v 的结合图谱完全相同，而与甜菜 夜蛾b b m v 的结合图谱有明显区别：9 8 1 6 c 与甜菜夜蛾b b m v 有十分清晰两条结 合带，其分子量大小约为2 1 0k d 左右。该特异性结合位点的存在正是9 8 1 6 c 对 甜菜夜蛾具有高毒力的原因。 。用表涂法和光散射分析法检测了晶体蛋白的杀虫效果。两种方法的测定结果 有很好的一致性。光散射分析的方法可以作为常规生物测定方法的一个补充。 关键字：苏云金芽孢杆菌，b t9 8 1 6 c ，杀虫机理，配体印迹，光散射分析 南开火学硕士列f 究生毕业( 学位) 论空 a b s t r a c t b t9 81 6 cw a sab a c i l l u st h u r i n g i e n s i sw i l ds t r a i n ，w h i c hc o n t a i n e dc w l a a , c r y l a c ，c r y l f , c r y 2a n dv i p 3 ai n s e c t i c i d a lp r o t e i ng e n e s t h ef o r m u l a t i o no f 9 8 1 6 c h a dh i g hi n s e c t i c i d a la c t i v i t i e sa g a i n s th e l i c o v e r p aa r m i g e r aa n ds p o d o p t e r ae x 辔u a i t sl c 5 0w e r e3 0 5 9 l la n d5 0 1 b l lr e s p e c t i v e l y t h ev i p 3 ap r o t e i np r o d u c e db y 9 9 t 6 ce x i s t e di nt h es u p e r n a t a n t ，t h es u p e r n a t a n to f9 8 1 6 ch a dh i g ht o x i c i t yt o h a r m i g e r aa n dxe x i g u a ，t h el c s 0 w e r e6 9 0 n c m 。a n d5 7 0n g c m 2r e s p e c t i v e l y a n d t h ei n s e c t i c i d a l c r y s t a lp r o t e i n so f9 8 16 c ，e l i m i n a t e dv i p 3 a ，h a dh i g ht o x i c i t yt o h a r m i g e r a a n dxe x i g u at o o ，t h el c s ow e r e1 3 6n g c m 2a n d3 3 7n g c m 2r e s p e c t i v e l y h d 一7 3 ，ab a c i l l u st h u r i n g i e n s i ss t a n d a r ds t r a i n ，c o n t a i n e do n l yc r y l a cg e n ea n d t h ep r o t e i nh a dh i g ht o x i c i t ya g a i n s th a r m i g e r a ，i t sl c s ow a s2 4 8n g c m 2 b u ti tn o t s h o w e dt o x i c i t yt o & e x 辔u a t - 2w a so b t a i n e db yt r a n s l a t i n gc r y l a cg e n ef r o m 9 8 1 6 ct ob t 9 8 1 6 c - n p , w h i c hh a dn o ta n yi n s e c t i c i d a lp r o t e i ng e n e h o w e v e r , t - 2d i d n o tp o s s e s st o x i c i t yt ob o t hh a r m i g e r aa n dx e x i g u a ，f u r t h e r m o r e ，t h er e s u l t so f l i g a n db l o ti n d i c a t e dt h a tt - 2a n d h d - 7 3t o x i nb o u n dt od i f f e r e n tr e c e p t o r so fb b m v f r o mh a r m i g e r aa n d e x 辔u a i tw a ss u g g e s t e dt h a tt h ec 秒l a cg e n eo f9 8 1 6 cw a s d i f b r e n tf r o mt h a to f h d 7 3 t h e p ho f m i d g u t s o l u t i o n so f h a r m i g e r aa n ds e x i g u al a r v aw a sa b o u t1 0 0 ，s o i tw a so fa v a i lf o rb tp r o t e i nt od i s s o l v e t h ep r o t e i n so f9 8 16 c 、t - 2a n dh d 7 3h a d b e e nt r e a t e dw i t ht r y p s i na n di n s e c t ( h a r m i g e r aa n d e x i g u a ) m i d g u t j u i c ei nv i t r o ， a n dn oo v e r td i f f e r e n c ew a so b s e r v e d s ot h ed i f f e r e n c eo f t o x i c i t yo f t h e mw a sn o t d u et ot h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h em i d g u ts o l u t i o no f h a r m i g e r aa n dt h a to f s e x i g u a b yl i g a n db l o t t i n gm e t h o d ，i tw a sf o u n dt h a t9 8 16 c 、t - 2a n dh d 一7 3c o u l da l l b i n dt ob b m vo fh a r m i g e r aa n ds e x i g u a t h e p a t t e r no f9 8 1 6 cb o u n dt ot h e b b m v o f h a r m i g e r a w a s s a m e t o t h a t o f h d 7 3 b u t t h ep a t t e r no f 9 8 1 6 cb o u n d t o t h eb b m vo fs e x i g u aw a so b v i o u s l yd i f f e r e n tf r o mt h a to f h d 一7 3 ：t w od i s t i n c t s t r i p s w e r ef o u n di nt h eb l o t t i n go f9 8 1 6 c ，i t sm o l e c u l a rm a s sw e i g h tw a sa b o u t 2 1 0 k d i tw a s s u g g e s t e d t h a tt h eh i g ht o x i c i t yo f9 8 1 6 c a g a i n s tse x i g u aw a s d u et o e x i s t i n gs p e c i f i cb i n d i n gr e c e p t o r so nse x i g u ab b m v 南开大学硕上研究生毕业( 学位) 论文 t h e e f f i c a c i t y o ft o x i n sw e r et e s t e d b y t h ed i e t s u r f a c e b i o a s s a y a n d l i g h t s c a t t e r i n ga s s a y , t h er e s u l t s w e r ec o n s i s t e n tw i t he a c ho t h e r i t i m p l i e dt h a t l i g h t - s c a t t e r i n ga s s a yc o u l d b ea s u p p l e m e n t o f t h et r a d i t i o n a lb i o a s s a ym e t h o d k e y w o r d ：b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，b t9 81 6 c ，i n s e c t i c i d a lm e c h a n i s m ，l i g a n db l o t l i g h t s c a t t e r i n ga s s a y 南开大学硕十研究生毕业( 学位) 论文 第一部分：前言 一、苏云金芽孢杆菌简介 苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，简称b t ) ，是目前世界上研究最深入、 应用最广泛的一类的昆虫病原性细菌。b t 是由日本学者i s h i w a t a s 于1 9 0 1 年首 次从罹病的家蚕( b o m b y xm o r i ) 中分离到一种秆状细菌，当时将其命名为猝倒 芽孢杆菌( b a c i l l u ss o t t o ) 。10 年后，b e r l i n e r 在德国苏云金( t h f i r i n g e n ) 省面粉 厂的罹病地中海粉螟( a n a g a s t ak u h n i e l l a ) 中再次分离到这种杆菌，并将其命名 为苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i sb e r l i n e r ) 1 1 o 由于b t 对一些重大的农 林害虫高毒而对人畜无害的特性，使得它迅速成为科学家研究的前沿，尤其是对 于昆虫及无脊椎病理学家而言，b t 成为其研究领域的模型菌株。随着1 9 3 8 年第 一个b t 商品制剂s p o r e i n e 在法国问世，b t 成为第一个应用于工业生产的生物杀 虫剂。2 0 世纪5 0 年代在欧洲和美国，b t 的商业生产进入了一个快速发展时期， 大量的b t 菌株被分离并不断有新的高毒力菌株被开发为商品制剂而得到广泛应 用。1 9 7 0 年科学家h o w a r dd u l m a g e 分离筛选到比当时商品株毒力高2 0 2 0 0 倍 的h i ) 一1 菌株，很快取代了其它生产菌株成为b t 实用化的里程碑f 2 】o 特别是对双 翅目高效的以色列亚种( s u b s p i s r a e l e n s i s ，简称b t i ) 1 3 以及对鞘翅目高效的拟 步甲亚种( s u b s p t e n e b r i o n i s ) h 与圣地亚哥亚种( s u b s p s a nd i e g o ) 1 5 1 的发现， 打破了长期以来人们认为b t 只对鳞翅目害虫具有毒力的固有观念，使得科学家 对苏云金芽孢杆菌的研究进入了一个更广泛与深入的阶段。到目前为止，分离自 几十个国家的昆虫、土壤、储库、植物叶片以及水域等不同样品的b t 菌株超过 了5 0 ，0 0 0 株1 6 j 。迄今人们已发现b t 杀虫蛋白对许多重要的农作物害虫，不仅 是对鳞翅目( l e p i d o p t e r a ) 、鞘翅目( c o l e o p t e r a ) 、双翅目( d i p t e r a ) 的害虫， 还包括膜翅目( h y m e n o p t e r a ) 、同翅目( h o m o p t e r a ) 、直翅目( o r t h o p t e r a ) 、虱 目( p h t h i r a p t e r a ) 或食毛目( m a l l o p h a g a ) 、蚤目( s i p h o n a p t e r a ) 和螨类( a c a r i ) 等九个目的害虫都具有毒杀作用。另外，扁形动物门中的吸虫和绦虫，线形动物 门中的动植物线虫，原生动物门的鞭毛虫、变形虫和草履虫等【7 】也对某些b t 敏 感，而b t 杀虫剂对人、畜、哺乳动物和天敌无害。在过去的5 0 多年里，b t 已 经发展成为目前世界上应用最成功的微生物杀虫剂，广泛用于农业、林业、贮藏 以及卫生等多种害虫的防治【8 】。 南开大学硕十研究生毕业( 学位) 论文 b t 是一种在自然界广泛分布的革兰氏阳性内生芽孢杆菌，在其芽孢形成期 会产生一种或多种杀虫晶体蛋( i n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n s ) 简称i c p s 或6 一内毒 素( d e l t a - e n d o t o x i n ) 。b t 毒性蛋白在伴孢晶体内是以原毒素( p r o t o x i n ) 的形式存在， 当被鳞翅目等敏感昆虫摄食之后，在昆虫幼虫的肠道内经蛋白酶水解，转变成为 具有杀虫活性的毒性多肽分子。活性毒蛋白分子可以与分布在昆虫中肠细胞的细 胞膜上的受体特异结合，并插入到中肠上皮细胞膜中。毒素分子插入细胞膜的部 分形成一个允许离予自由通过的孔道。由毒蛋白形成的孔洞会破坏细胞膜两侧原 有离子浓度的非平衡态( 这种破坏相当严重，因为许多鳞翅目幼虫中肠的p h 值 大约为1 0 5 1 1 ) 并导致肠细胞的裂解与死亡。在适宜的环境下，虫体可以作为 b t 生长的培养基使得该菌可以增殖，在土壤中释放新的孢子与晶体蛋白，从而 开始新一轮的循环( 图1 1 ) 。 图1 1 ：苏云金芽孢杆菌毒性机理 苏云金芽孢杆菌潜在的巨大经济利益引起了广大科研人员和开发商的极大 兴趣。到目前为止，科学家已经对其遗传机制，质粒谱，基因结构与功能，基因 的表达调控，杀虫活性及其在环境保护应用等方面进行了大量的研究，其生物活 性成分也由刚开始的杀虫晶体蛋白发展到多种成分。这些成分根据在细胞中的位 置可以分为两大类，其中分泌到胞外发挥作用的活性成分称为胞外因子；而滞留 在胞内的活性成分或包含体统称为胞内因子【9 】( 表1 1 ) 。 2 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 表1 - - 1 ：苏云金芽孢杆菌生物活性成分 胞内因子 蛋白质 杀虫晶体蛋白，免疫抑制因子a ，肠毒素，辅助蛋白，自身诱导物抑制蛋白 芽孢 活芽孢，死芽孢和芽孢衣 二、b t 杀虫晶体蛋白 2 1 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的特异性 杀虫晶体蛋白的杀虫毒力具有很高的特异性，一种杀虫晶体蛋白仅对少数几 种已知昆虫有效，有时蛋白上几个氨基酸的差异就表现为不同的杀虫活性。一般 而言，c r y l ，c r y 2 和c r y 9 等毒蛋白对鳞翅目害虫有效；c r y l 、c r y 9 a 和c r y 9 c 几类蛋白是对鳞翅目昆虫有高毒力的杀虫晶体蛋白，其中研究的最多的是c r y l 蛋白，这类蛋白分子量约为 3 0 1 4 0 k d a ，构成菱形晶体，不同亚类的杀虫谱有 较大差异 10 】。c r y 9 c 对夜蛾科的甜菜夜蛾( se x i g u a ) 和海灰翅夜蛾( sl i t t o r a l i s ) 具有较高活性。c r y 2 、c r y 4 、c r y l 0 、c r y ll 、c r y l 6 、c r y l 7 、c r y l 9 、c r y 2 1 及c y t 类蛋白对双翅目具有特异活性t o , 1 2 1 ；其中c y t 类蛋白具有溶细胞性，对某 些c r y 蛋白具有增效作用i ”j ；c r y 2 a a 对鳞翅目和双翅目昆虫具有广谱活性， c r y 2 a b 和c r y 2 a c 只对鳞翅目昆虫有活性。大多数c r y 3 、c r y 7 与c r y 8 类蛋白 对鞘翅目昆虫如马铃薯甲虫( l e p t i n o t a r s a d e c e m l i n e a t a ) 具有毒力；而有些i c p s 具有广谱杀虫活性，如c r y l b 和c r y l i 蛋白对鳞翅目和鞘翅目昆虫均具有活性。 而c r y 5 、c r y 6 、c r y l 2 、c r y l 3 及c r y l 4 等毒蛋白对线虫有效。另外有些b t 菌株 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 在其生跃营养期能够在胞外分泌对鳞翅目昆虫具有广谱活性的蛋白，被称为营养 期杀虫蛋白( v e g e t a t i v ei n s e c t i d a lp r o t e i n s ，v i p s ) ，对菌株的整体杀虫毒力起着重 要的作用 14 1 。 2 2 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的结构与功能 2 2 1 杀虫晶体蛋白结构与功能的关系 杀虫晶体蛋白的特异性是与其结构相关的。通过x 光晶体衍射法，已经获 得了四种杀虫晶体蛋白一c r y l a a 、c r y 2 a a 、c r y 3 a 、c y t 2 a 及c r y 3 8 1 1 5 1 的三维结 构( 图1 2 ) 。 图1 2 杀虫晶体蛋白c r y l a a 和c r y 3 a 的三维结构 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 c r y l a a 和c r y 3 a 蛋白的氨基酸序列同源性约为3 6 ，这种相似性反映在三 维结构中：两种蛋白相应的结构域( d o m a i n ) 是重叠的。c r y 2 a a 与它们的结构 也基本相似，都由3 个结构域组成。c r y l a a 与c r y 3 a a 的d o m a i ni 由7 个反向 平行的q 一螺旋组成，c r y 2 a a 由8 个。一螺旋组成，其中位于中心的一个疏水螺旋 被其它的6 个或7 个两亲性的螺旋所包围。d o m a i ni 具有长= 的疏水和亲水脂螺 旋结构，这一结构域可能与靶昆虫中肠上皮孔洞的形成有关。目前有两种膜穿孔 分子机制的模型：h o d g m a n 等提出的“铅笔刀”模型及l i 等提出的“伞”模型 7 1 。d o m a i ni 与其他几种细菌毒素，如大肠杆菌素a 等的膜转位结构域有很多相 似性。c r y 3 a a 的d o m a i ni i 由3 个反向平行的0 一折叠连接而成，形成0 棱柱 ( b p r i s m ) 折叠的结构。该结构域的3 个b 链暴露于顶端表面的环与免疫球蛋 白抗原结合位点相似，因此被认为在受体结合中起重要作用。c r y l a c 蛋白b 一折 叠顶端暴露的环可以识别受体中的糖链。c r y 3 a a 的d o m a i ni i i 由2 个缠绕的反 向平行的0 一折叠形成b 一夹心结构。研究显示b 折叠结构与受体结合、膜插入以 及离子通道的形成有关，因此有人认为结构域i i i 在这些方面都有可能起作用1 7 j 。 毒蛋白的这个结构域还具有重要的生物化学性质。有科学家认为它在保持毒素分 子的完整性，保护毒紊免受靶昆虫中肠蛋白酶水解起重要作用【l 。 伴孢晶体被敏感昆虫取食后，首先在昆虫中肠特殊的p h 条件下溶解并释放 出原毒素，经蛋白酶的剪切作用将其激活为活性毒素( t o x i n ) 片段。其中蛋白 酶的剪切作用对于大分子量( 1 3 0 1 4 0 k d a ) 的原毒素，如c r y l 、c r y 4 a 及c r y 4 b 等，是切去富含半胱氨酸的c 半端和n 端的2 9 个氨基酸残基形成6 5 k d a 的活性 毒素；小分子量的原毒索，如c r y 2 、c r y 3 及c r y l l a 等不具有大分子原毒素c 端，但与其n 端具有同源性，c r y 2 的c 端、c r y 3 的n 端被酶切后形成6 0 7 0 k d a 的活性毒素，而c r y li a 则由7 2 k d a 降解为3 0 k d a 的活性片段【1 7 】。接着活性片段 与昆虫中肠上皮细胞刷状缘膜的特异受体结合。对于具有三个结构域的c r y l 、 c r y 2 及c r y 3 类等杀虫蛋白来说，活性毒蛋白最初与幼虫中肠细胞受体的可逆结 合过程很大程度上是依赖于结构域i i 和结构域i i i 。而后的步骤包括了毒素的部 分片段插入并聚合在细胞膜内，形成孔洞或离子选择通道，进而破坏细胞的通透 性，使整个细胞代谢失去平衡最终导致昆虫的死亡。其中离子通道是由结构域i 中的特定两性分子构成，但三个结构域在插入、聚合和功能通道形成的整个过程 中都起到了一1 定的作用 1 8 1 具鞘翅目活性的6 一内毒素c r y 3 b b 对于黄瓜十一星叶甲食根亚种昆虫具有 特异活性，同时保持对马铃薯甲虫的活性。在溶液中c r y 3 b b 与c r y 3 a 蛋白都可 形成低聚体。c r y 3 b b 蛋白结构域i 和结构域i i i 之间可以相互作用在低聚体中形 成孔道。结构域i 和结构域i i i 之问的相互作用与其生物活性相关。与c r y 3 a 相 南开入学硕士研究生毕业( 学位) 论文 比较，c r y 3 b b 多出7 个氨基酸残基：一个在结构域i 中，两个在结构域i i 中， 四个在结构域i i i 中。这些变化不仅表现在这二者构象间的巨大差异，同时也是 这两种毒素生物活性差异的原因所在”“。 2 2 2 杀虫晶体蛋白的结构域与保守区 比较不同杀虫晶体蛋白的氨基酸序列，大多数都存在5 个保守区，一些大 分子量的毒素( c r y l 、c r y 4 等) 在c 端的非毒性区还存在另外3 个保守区；另 一些小分子毒素( c r y 2 、c r y 3 1 等) 则只有两个保守区( 图1 3 ) ；而有些毒素( c r y 6 、 c r y l 5 等) 则不含有保守区i l “。 图1 3 杀虫晶体蛋白的保守区 保守区的存在表明不同杀虫晶体蛋白三维结构的相似性。保守区1 含有结构 域l 中的n5 螺旋，该部位的高度保守说明n5 螺旋对于维持结构域i 的完整性及 对昆虫中肠上皮细胞的穿孔具有重要作用，但有研究表明当毒素片断仅含有结构 域i 的第六个d 螺旋与第七个n 螺旋以及结构域i i 和结构域i i i 时，c r y l g 和 c r y 4 b6 内毒素片断仍具有杀虫活性0 9 1 。保守区2 含有结构域i 的7 螺旋和结 构域i i 第一条1 3 链，构成两个结构域之间的连接，该保守区内的三对盐桥对于 维持蛋白分子在溶解和激活过程的球状结构，及结构域i 与膜结合时的方向可变 性都起到重要作用。除了c r y 6 ，c r y l 5 ，c r y 2 2 及c r y 2 3 蛋白外，所有的c r y 蛋 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论立 白都含有保守区1 和2 ，这两个区域的高度保守性充分证明它们在昆虫膜穿孔中 作用的重要性。保守区3 、4 、5 分别位于结构域i i i 内3 条隐藏的链上。保守区 3 含有结构域i i 的最后一条p 链，保守区4 含有结构域i i i 的一条b 链，该区四 个精氨酸参与分子间盐桥的形成，划晶体或毒性肽在膜穿孔的聚合起作用。保守 区5 含有肽链的c 端，包埋于结构域i i i 的d 链中，与保护毒性肽防止蛋白酶的 降解有关1 7 j 。 三、b t 杀虫晶体蛋白的作用机理 3 , 1 昆虫对b t 杀虫晶体蛋白的抗性 以b t 杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有5 0 多年的历史，最初一直没 有检测到昆虫对b t 的抗性。但是，8 0 年代中期开始，抗性问题不断在实验室和 田问试验中得到证实 2 0 ，原因主要是持续使用单品种及亚致死剂量的b t 制剂以 及b t 转基因抗虫植物的应用，造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。第一 个完整的抗性选掸实验是研究印度谷螟对b t 产生的抗性。谷仓中获得的印度谷 螟，在实验室中用d i p e ( b ts u b s p 。k u r s t a k ih d 1 的商品制剂) 选择饲养1 5 代， 发现对d i p e l 的抗性增加了1 0 0 倍口0 1 。用d i p e l 选择饲养3 6 代后，其抗性增加 到了2 5 0 倍2 ”。在夏威夷地区，用高剂量的d i p e l 治理过的小菜蛾种群，其敏感 性要低于用低剂量治理过的种群，最高的抗性水平提高了3 0 倍田i 。9 0 年代以来， 在我国应用b t 制剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现b t 制剂对小菜蛾防 治效果明显下降，意味着抗性已经形成1 2 ”。目前在实验室和田问至少发现有十 几种昆虫对b t 及其杀虫晶体蛋白产生了抗性。用选择压力数学模型预测到，在 b t 转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性【2 4 1 。研究人员普遍认 为如果不慎重使用b t 制剂和转基因植物，昆虫对b t 大规模的抗性将会形成，导 致b t 杀虫晶体蛋白的作用下降甚至完全丧失。 3 2 杀虫机理 一般认为，6 一内毒素的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体结合、插入和 孔洞或离子通道形成以及细胞裂解等环节 2 5 1 。昆虫对b t 产生抗性的机制十分复 杂，从杀虫晶体蛋白溶解、激活、毒蛋白与中肠上皮受体的结合到孔洞的形成， 任n - 。个环节发生变化都可能影响昆虫对b t 的敏感性。 南开大学硬l _ 研究生毕业( 学位) 论文 3 2 1 溶解与酶解活化 3 2 1 1 昆虫中肠液的酸碱度和蛋白酶组成 不同目昆虫幼虫的中肠液性质差异很大。如鳞翅目幼虫中肠液呈碱性( p h 8 o 1 0 5 ) ，其主要蛋白酶是以胰蛋白酶为主的丝氨酸蛋白酶【2 “。许多鳞翅目幼 虫中肠液中皆含有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶a 、羧肽酶b 和亮氨酸氨肽酶27 1 。在多食性和食果性幼虫中肠液中弹性蛋白酶的活性最高 【3 9 】。电有报道烟芽夜蛾中肠液中有较高的胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活性，而弹性 蛋白酶的活性较低2 8 1 。在茎蛀夜蛾中肠内，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白 酶和羧肽酶b 主要分布在中肠前段围食膜与肠壁的间隙内；而氨肽酶和羧肽酶a 则主要分布在围食膜外部空间内 2 9 o 大多数鞘翅目幼虫中肠液为中性或略偏酸性( p h6 ，5 7 o ) ，其主要蛋白酶 是半胱氨酸蛋白酶。例如两星瓢虫幼虫和成虫中肠液的p h 分别为6 0 和5 5 ，幼 虫中肠液的主要蛋白酶为半胱氨酸蛋白酶【3 0 1 。也有少数鞘翅日幼虫中肠液略偏碱 性( 7 o 7 5 ) ，其主要蛋白酶为胰蛋白酶( 如褐新西兰肋翅鳃角幼虫) 口”。双翅目幼 虫中肠液呈弱碱性也是以胰蛋白酶为主。 3 2 1 2 中肠液酸碱度对杀虫晶体蛋白毒力的影响 中肠液酸碱度不仅影响到伴孢晶体在消化道的溶解速度，而且还影响到原 毒素的活化效率、乃至杀虫专一性。沙槎云和白成( 1 9 9 4 ) 报道了在p h 6 4 、 7 4 、8 , 4 、9 4 的缓冲液中粘虫和黄粉虫中肠液对几个b t 菌株伴孢晶体的降解过 程和毒力变化。随着p h 值的升高，两种幼虫中肠液对苏云金亚种的4 5 7 菌株、 多窝亚种的1 0 4 1 3 菌株及库斯塔克亚种的h d 一1 菌株的伴孢晶体的溶解或降解能 力都有较大提高。而在p h9 4 时，这3 个菌株的伴孢晶体经黄粉虫中肠液活化后 其上清液对黄粉虫的毒性丧失，而对粘虫毒性较高【3 引。这说明改变中肠液p h 导 致t b t 杀虫特异性的改变。另有报道，菜粉蝶幼虫对h d 1 等菌株的敏感性较低， 其主要原因是该幼虫中肠液不能快速地将伴孢晶体活化成毒性肽；但当提高中肠 液p h 值后( 从p h9 7 盈j p h1 0 5 ) ，活化能力和敏感性都明显提高【3 3 】。通过研究 不同p h 值对c r y l a a ，c r y l a c 年l l c r y 3 a 三种杀虫晶体蛋白毒性肽构象变化的诱 导，发现无论是对鞘翅目有毒的c r y 3 a ，还是对鳞翅目有毒的c r y l a a 和c r y l a c 发生构象变化时的p h 即为该毒素发挥最大毒力时的p h 【3 4 。也就是说，各种毒索 蛋白只有在目标昆虫中肠液的p h 下才能保持一种“优势”的构象。实际上，各类杀 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 虫晶体蛋白的杀虫专一性与其溶解特性是相对应的，鳞翅目和双翅目幼虫中肠 液一般呈碱性，这种条件恰好适合c r y l 、o y 4 等大分子毒素伴孢晶体在目标昆 虫中肠液中溶解；而鞘翅目幼虫中肠液为弱酸性，这种条件恰好适合于杀鞘翅且 幼虫的c r y 3 晶体的溶解和维持毒性肽的工f 确构象。 3 2 1 3 肠道蛋白酶对杀虫晶体蛋白的活化作用 在体外，杀虫晶体蛋白能被多种碱性蛋白酶( 如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、 弹性蛋白酶) 以及巯基蛋白酶( 如木瓜蛋白酶) 活化成5 5 7 0 k d 的毒性肽。在 鳞翅目幼虫中肠液中，胰蛋白酶是主要的蛋白酶，在原毒素的活化过程中起着重 要作用，它专门水解由碱性氨基酸( l y s 、h i s 、a r g ) 的羧基组成的肽键 5 l 口6 1 。 例如，c r y l a c 原毒素( 1 3 3k d ) 经家蚕、小菜蛾和茶小卷叶蛾等鳞翅目幼虫中肠 液活化后，形成的毒性肽的n 一末端氨基酸顺序是n - - i e t h y t p i d i s l s l t ，其切 点均为由第2 8 个精氨酸的羧基和相邻的异亮氨酸组成的肽链。双翅目幼虫家蝇肠 道蛋白酶在c r y l a c 分子的n 一末端上的切点同上述鳞翅目幼虫，说明在双翅目 幼虫的中肠液中同样是胰蛋白酶发挥了作用【3 5 i 。一般大分子毒素的碳端都含有大 量的碱性氨基酸，由它们形成的肽键都是胰蛋白酶的潜在切点。在毒性肽分子中 虽然也含有个别碱性氨基酸，但由于肽链折叠造成的空间位阻使蛋白酶不能接 近其潜在酶切点。 c r y 4 类的杀虫晶体蛋白在蚊幼虫中肠液中往往被活化成两个相互作用的小 分子毒性肽。例如，在埃及伊蚊、冈比亚按蚊或五带淡色库蚊中肠液中，来自以 色列皿种的杀蚊1 3 0 k d 蛋白c r y 4 a 可被活化成4 8k d 的毒性片段，而1 3 0k d 的 c r y 4 b 则被活化成4 6 4 8k d 和1 6 l 8 k d 的两个片段【3 7 j 。有进一步报道说， 在尖音库蚊中肠液中，c r y 4 a 被活化成相互连在一起的2 0k d 和4 5k d 的两个片 段，而c r y 4 b 则被活化成1 8k d 和4 6k d 的两个片段。c r y 4 a 形成的两个片段可 能一起作用方具活性，c r y 4 b 形成的两个片段也可能是相互连在一起的，但其杀 虫活性经体外处理后很快下降并几乎丧失f 3 8 】。 以前认为c r y 2 和c r y 3 等中分子量毒素( 6 5 7 5k d ) 为天然毒性肽，溶解后 不需活化即具毒性1 3 9 l ，现在看来并非如此。 例如拟步行甲亚种产生的c r y 3 a ( 7 3 k d ) 在菌体内合成后即被胞内蛋白酶迅速活化成6 7k d 的毒性肽，由它形成 的伴孢晶体可溶于碱性和酸性缓冲液中，但是溶解后的毒素在回到中性环境时 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 会发生沉淀。然而，目标甲虫的中肠p h 即为中性到微酸性，这是c r y 3 a 体外不 溶解的p h 环境。为解开此谜，c a r r o l l 等对经各种蛋白酶处理后的c r y 3 a 毒素进 行了研究。发现该毒素在大多数情况下被进一步切成多个多肽片段，它们在非变 性条件下仍保持相互联系1 4 0 。有意思的是，胰擞乳蛋白酶的c r y 3 a 处理产物在中 性p h 条件下变得可溶，并全部保留了对敏感甲虫的毒性，且与马铃薯叶甲中肠 上皮细胞膜呈专一性结合。在体内，参与c r y 3 a 活化的蛋白酶也是胰凝乳蛋白酶 4 1 1 。 3 2 1 4 肠道蛋白酶对杀虫晶体蛋白杀虫专一性的影响 幼虫肠道蛋白酶对原毒素水解处理上的差异对杀虫晶体蛋白的杀虫专一性 有影响 4 2 1 4 3 1 。考莫立亚种的1 3 0k d 的c r y l c 原毒素经埃及伊蚊中肠液活化后， 所得产物仅对蚊虫细胞系有毒，而对大多数鳞翅目细胞系无毒；相反，经大菜粉 蝶幼虫中肠液或胰蛋白酶活化后，所得产物仅对鳞翅目细胞系有毒。进一步研究 揭示，1 3 0k d 原毒素经大菜粉蝶中肠液或胰蛋白酶活化后形成5 5k d 的毒性肽； 而经埃及伊蚊中肠液活化形成5 2k d 的毒性肽，前者可进一步被埃及伊蚊中肠 液活化形成后者。即使都是鳞翅目幼虫也有类似现象。据报道，1 3 0k d 原毒素经 斜纹夜蛾肠道蛋白酶作用后形成了较大分子量的毒性肽( 7 2 k d 左右) ；经家蚕肠 道蛋白酶作用则形成了较小分子量的毒性肽( 6 3k d 左右) 。前者对这2 种昆虫 都有毒性，并可进一步活化成后者，而后者却丧失了对斜纹夜蛾的毒性。这些结 果表明，肠道蛋白酶组成影响到毒性肽的大小及其在原毒素上的酶切位置，从而 影响到毒素的杀虫专一性。 3 2 1 5 昆虫中肠液对杀虫晶体蛋白的过度降解与沉淀作用 同一目不同科、甚至同一科不同种的昆虫对同种杀虫晶体蛋白的敏感性表 现不同 4 4 1 1 3 3 心1 。例如鳞翅日夜蛾科的幼虫对c r y l a c 较为敏感而蚕蛾科的家蚕对 它却极不敏感，而同是夜蛾科的棉铃虫和甜菜夜蛾的幼虫却分别对c r v l a c 和 c r y l c 有较高的敏感性。影响杀虫晶体蛋白杀虫活性的因素是多方面的，除了与 毒素和受体的特性有关外，中肠蛋白酶的种类及活性高低也对杀虫晶体蛋白的 杀虫活性有重要影响。研究发现在海灰翅夜蛾的老龄幼虫( 3 5 龄) 中肠液中 有较高的蛋白酶活性，经s d s p a g e 检查发现c r y l c 原毒素在海灰翅夜蛾的老 龄幼虫( 3 5 龄) 中肠液中可被彻底降解而失去毒性，并推测这可能是由一种 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 对丝氨酸蛋白酶抑制剂p m s f 敏感的蛋白酶降解引起的 在棉铃虫中肠液中，也发现有类似的过度降解现象，并通过多种专一性蛋白 酶抑制剂研究分析了多种中肠蛋自酶在这一降解过程的作用h 7 1 。结果发现所有丝 氨酸蛋白酶抑制剂，如大豆蛋白酶抑制剂( s b t i ) 、苯甲磺酰氟( p m s f ) 以及 胰凝乳蛋白酶抑制齐e j t p c k 等对c r y l a 原毒素的过度降解都有抑制作用，其中 t p c k 等胰凝乳蛋白酶抑制剂的抑制作用最强。说明多种丝氨酸蛋白酶共同参与 了这一降解过程，其中胰凝乳蛋白酶起了主要作用。同时，在体外，蛋白质变性 剂s d s 可引起c r y l a 原毒素在棉铃虫中肠液中彻底降解，这可能是s d s 对原毒 素蛋白的变性作用引起的。生物测定结果表明，马铃薯蛋白酶抑制剂等多种丝氨 酸蛋白酶抑制剂都能提高c r y l a 原毒素对棉铃虫的毒力。由此我们推测，在体内 由毒素与受体的结合引起的毒素分子空间构象的转换可能会导致毒素分子内部 酶切点暴露，进而被蛋白酶彻底降解。这可能是老龄夜蛾科害虫对杀虫晶体蛋白 低度敏感的原因之一1 4 ”。 在枞色卷蛾和粘虫也发现类似现象。p a n g 年n g r i n g o r t e n ( 】9 9 8 ) 报道来自库 斯塔克亚种的h d l 菌株和猝倒亚种的原毒素经5 0 浓度的中肠液活化形成的 6 0 6 5 k d 的毒性肽要远远比1 中肠液活化得到的少，对家蚕的毒力也较低 4 8 】。夜蛾科的粘虫与棉铃虫对伴孢晶体和溶解状态原毒素的降解结果非常相似， 进一步证明中肠液蛋白水解能力过高是原毒素在夜蛾科幼虫中肠液中过度降解 的主要原因 4 9 1 。 此外，在某些昆虫，中肠液的沉淀作用可能电是影响原毒素毒力的因素之 一。枞色卷蛾中肠液中活化原毒素的是一种类胰蛋白酶【5 0 】。但是，其中肠液中还 有一种类弹性蛋白酶( 7 5k d ) 能引起猝倒亚种原毒素的沉淀，并因此导致原毒 素活化受阻、毒性丧失。在舞毒蛾、森林天幕毛虫和白斑天幕毛虫也有类似沉淀 作用。 昆虫对b t 的抗性形成是多因子作用结果，其中包括中肠液性质的改变。例 如，烟芽夜蛾抗性的产生并没有伴随着毒素与受体亲和力的改变【5 1 【5 2 l 。而且，在 c v l a b 、c r y l a c 及c r y 2 a 之间有交互抗性，这是难以单纯从毒素和受体的结合 方面来解释的。通过进一步研究，发现抗性品系烟芽夜蛾的中肠蛋白酶活性发生 了改变p 。敏感品系和抗性品系幼虫的中肠液蛋白水解图谱有差别，也就是说抗 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 性品系幼虫肠道蛋白酶组成发生了细微的变化。另外，两种昆虫对原毒素和毒性 肽降解结果也不同，抗性品系幼虫的中肠液对c r y i a b 原毒索的激活速度比敏感 幼虫慢，而对毒性肽的降解速度则比敏感品系的幼虫快。这样，食入同样量的杀 虫晶体蛋白，抗性品系所产生的毒性肽要比敏感品系少，因此毒性也就低。这一 发现有助于解释经c r y i a c 诱导出的抗性品系为什么也对其它的杀虫晶体蛋白如 c r y l a b 和c r y 2 a 有抗性。印度谷螟抗性品系中肠蛋白酶活性比易感亲本系降低了 3 5 倍，对杀虫亚种原毒素的活化能力也明显下降。它不能将c r y l a c 原毒素( 1 3 3 k d l 快速地转化成6 2k d 的毒性肽，而只能形成大量的大分子量中间产物，从而 形成抗性【5 4 l 。 总之，昆虫中肠液的生理生化特性是影n l j j b t 杀虫晶体蛋白杀虫活性的一个 重要方面。昆虫肠道酸碱度不仅影响到伴孢晶体的溶解速度，还影响到各种蛋白 酶的活性高低：而肠道蛋白酶更是影响杀虫晶体蛋白毒力的一个重要因素，并与 昆虫对b t 抗性的产生有关。 3 2 2 与受体的结合 3 2 2 1 受体蛋白的种类 目前已经发现的昆虫中肠b t 毒素受体蛋白主要为氨肽酶n ( a p n ) 。氨肽酶 足一组肽链端解酶，它催化许多蛋白氨基末端残基的分裂，广泛存在于动物和植 物中。一些鳞翅目昆虫的a p n 已被确认是b t 的主要结合蛋自。但a p n 并不是 唯一的一类昆虫b t 毒素受体蛋白。f r a n c i s 和b u l l a ( 1 9 9 7 ) 部分纯化了烟草天蛾 中肠b b m v 上c r y l a b 毒素的受体b t r 1 ，证明它是一种类钙粘蛋白 ( c a d h e r i n 1 i k e ) 1 5 5 。c r y l a a 和c w l a c 与b t r 1 在分级凝胶过滤柱上的结合 与c r y l a b 相似，这表明b t ，r 1 可能是c r y l a 毒素的高度亲合性受体。 3 2 2 2 受体蛋