（植物病理学专业论文）樟芝菌生物学特性研究.pdf

樟芝菌( a t r o d i ac a m p h o r a t az a n g & s u ) 生物学特性研究 摘要 本研究以樟芝菌丝体( a t r o d i ac a m p h o r a t az a n g & s u ) 为材料，从环境条件、营 养条件和菌丝体及分生孢子形态显微观察三个方面对其生物学特性进行了初步研究。 试验结果表明： 1 、环境条件对樟芝菌丝体生长的影响 樟芝菌丝体的萌发温度范围为6 3 4 ，菌丝体生长的适宜温度范围为2 4 。c 3 2 。c ，生长最适温度为3 0 。c ；3 。c 5 。c 是樟芝菌种保藏的适宜温度：3 5 c 是樟芝菌 丝体能够耐受的最高温度。 樟芝菌丝体固体发酵培养基质的适宜含水量范围是：4 0 6 0 ，最适含水量在 5 5 左右。 在樟芝菌丝体生长过程中，适量的给予光照，能够加速菌丝体的生长，但当光照 强度大于6 0 0 l x 时，能够抑制菌丝体的生长：蓝光对樟芝菌丝体的生长有一定的抑制 作用；光照对于樟芝菌丝体密度及颜色的影响非常显著，黑暗条件下，菌丝体呈深橘 红色，生长浓密；光照强度小于8 2 l x 时，菌丝体颜色略浅，但当光照强度超过1 6 0 l x 时，菌丝体颜色明显变浅，菌落稀疏。 适宜樟芝菌丝体生长的p h 范围是p h 5 p h 7 ，最适酸碱度是p h 6 ；在培养基中添 加k h 。p o 。后，由于其对培养基p h 的缓冲作用，有利于樟芝菌丝体的生长。 液体深层培养条件下，合适的装瓶量是5 0 0 m l 摇瓶装液量l o o m l ；适宜的接种 量是7 5 。 2 、营养条件对樟芝菌丝体生长的影响 樟芝菌丝体生| 吏的最适碳源是葡萄糖和马铃薯淀粉；最适氮源是酵母膏；液体深 层培养条件下，最佳碳氮比( 摩尔比) 是3 0 ：l 4 8 ：l ：k h ! p o ，和m g s o 。7 h z 0 是促进樟 芝菌丝体生长的两种无机盐，适宜添加量分别为0 1 和0 0 5 ；微量生长因子对樟芝 菌丝体的生长有明显的促进作川，肌醇和v b l 效果比较明显：大麦和谷子是适宜樟芝 阎体发酵的两种培养基质。 通过对初步筛选出的营养因子进i j ：正交试验，筛选山适均：樟芝菌丝体生氏的培养 基培方是：马铃薯淀粉1 ，葡萄糖2 ，酵母膏0 1 ，蛋白胨0 1 ，麸皮1 ， k h z p o 一0 1 ，m g s 0 4 7 i i ：00 0 5 ，( 琼月旨2 ) 。 通过对樟芝菌丝体液体培养生长曲线的测定发现，樟芝菌丝体在培养2 d 以内处 在停滞期，2 6 d 为快速生长的对数生长期，菌丝体于重快速提高，到达第7 d 后进 入稳定期，培养l o d 后逐步进入衰亡期。 3 、樟芝菌丝体及分生孢予形态显微观察 通过对樟芝菌丝体及分生孢子进行e s e m 观察，发现其有初生菌丝和次生菌丝存 在，初生菌丝壁薄，透明，胞径2 5 p _ m 4 5 t m ；次生菌丝薄壁、透明微黄，具锁状 联合，有分枝，胞径2 1 6 9 m 3 5 5 9 m 。 樟芝菌丝体在平板培养阶段能够产生分生孢子。分生孢子淡橘红色，椭圆形，外 壁光滑，胞径1 9 1 t m 3 5 9 m x4 o l a m 6 0 u m 。 另外，在e s e m 图片中还发现形态与典型的担子及担孢子形态相似的结构。 关键词：樟芝菌丝体生物学特性 s t u d i e so l lt h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f a n t r o d i ac a m p h o r a t az a n g & s u a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f a n t r o d i ac a m p h o r a t aw e r es t u d i e di nt h r e e f a c e t ss u c ha se n v i r o m e n t ，n u t r i t i o na n dt h em i c r o s c o p i ce x a m i n a t i o no fm y c e l i u ma n d c o n i d i u m t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 、t h ee f f e c t so f t h ee n v i r o m e n tt ot h em y c e l i u mg r o w t ho f a n t r o d i ae a m p h o r a t a h lt h es c o p eo f6 c 3 4 。c ，t h em y c e l i ao f a n t r o d i ac a m p h o r a t ac o u l ds p r o u t t h e f i g h ts c o p eo f t e m p e r a t u r ew a s2 46 c 3 2 。c ，t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s3 0 。c t h es c o p e o f3 5 w a st h e f i t t i n gt e m p e r a t u r ef o rc u l t u r ec o l l e c t i o n t h eh i g h t e s tt o l e r a t e t e m p e r a t u r ew a s3 5 t h er i g h ts c o p eo fw a t e rc o n t e n to fs u b s t r a t ew a s4 0 6 0 ，t h ef i t t i n gw a t e r c o n t e n tw a s5 5 a na m o u n to fi l l u m i n a t i o nc o u l da c c e l e r a t et h em y c e l i ag r o w t h b u tw h e nt h e i l l u m i n a t i o ni n t e n s i t yw a sh i 曲t e rt h a n6 0 0 l x ，i tw o u l ds l o w e rt h es p e e do ft h em y c e l i a g r o w t h b l u el i g h tc o u l dr e s t r a i nt h em y c e i ag r o w t h t h ee f f e c to ft h ei l l u m i n a t i o nt ot h e m y c e l i ao nt h ed e n s i t ya n dc o l o rw a sp r o m i n e n t t h em y c e l i aw e r ed a r kj a c i n t ha n db u s h y i nb l a c k w h e nt h ei l l u m i n a t i o ni n t e n s i t yw a sl e s st h a n8 2 l x ，t h ec o l o u ro f t h em y c e l i aw a s at i t t l ew e a k w h e nt h ei l l u m i n a t i o ni n t e n s i t yw a sm o r et h a n1 6 0 l x ，t h em y c e l i ab e c a m e w e a k l yc o l o r e da n ds p a r s eo b v i o u s l y p h 5 p h 7w a st h ep r o p e ra c i d i t yf o rt h em y c e l i a t h eo p t i m a lo n ew a sp h 6 t h e a p p e n do f t h ek h 2 p 0 4w a sf a v o ro f t h em y c e l i ab e c a u s eo f t h eb u f f e ra c t i o no i lt h ep h t h ef i t t i n gb o t t l i n gq u a n t i t yw a slo o m l 5 0 0m l t h ea p p r o p r i a t ei n o c u h m ls i z ew a s7 5 2 、t h ee f f e c t so f n u t r i t i o nt ot h em y c e l i ag r o w t ho f a n t r o d i ac a m p h o r a t a n u t r i t i o nt e s t so fa n t r o d i ac a m p h o r a t as u g g e s t e dt h a tt h eo p t i m a lc a r b o ns o u r c e s ， n i t r o g e ns o u r c e ，c a r b o n n i t r o g e nr a t i o ，m i n e r a ls a l t ，g r o w t hf a c t o rw e r eg l u c o s es t a r c h ， y e a s tc r e a m ，3 0 ：1 4 8 ：1 ，k h 2 p 0 4 ( o ，0 1 ) a n dm g s 0 4 7 h 2 0 ( o 0 5 ) ，i n o s i t o ta n dv b i r e s p e c t i v e l y b a r l e ya n dm i l l e tw e r eo p t i m a ls u b s t m t ef o rt h es o l i d ef e r m e n t t h r o u g ho r t h o g o n a lt e s t ，t h eo p t i m a lm e d i u mw a ss e l e c t e da n di tc o n t a i n e d ：p o t a t o s t a r c h 1 ，g l u c o s e2 ，y e a s tc r e a mo 1 ，p e p t o n eo 1 ，b r a n1 ，k h 2 p 0 40 1 ， ， m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 ，( a g a r2 ) s t u d i e so nt h ec u r v eo fm y c e l i ag r o w t hi nl i q u i ds u b m e r d g e dc u l t u r es u g g e s t e dt h a t t h ef o r e g o i n gt w od a y sw a st h el a gp e r i o d t h ep e r i o df r o mt h es e c o n dd a yt ot h es i x t hd a y w a st h el o g a r i t h m i cp h a s e t h es t a b i l i z e dp h a s ew e r ef r o mt h es e v e n t ht ot h et e n t hd a y s a f t e rt h et e n t hd a y , i te n t e r e dt h ed e c l i n ep h a s eg r a d u a l l y 3 、t h em i c r o s c o p i ce x a m i n a t i o no nt h em y c e l i aa n dc o n i d i ao f a n t r o d i ac a m p h o r a t a u s 甜t h el i g h tm i c r o s c o pa n de s e m t h em i c r o s c o p i ce x a m i n a t i o no f t h em y c e l i aa n d c o n i d i aw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew e r ep r i m a r ym y c e l i u ma n ds e c o n d m y c e l i u me x i s t e d t h ep r i m a r ym y c e l i u mt h i n - w a l l e d ，t r a n s p a r e n t ，2 5 9 m 4 5 9 mi n w i d t h ；t h es e c o n dm y c e l i u mt h i n - w a l l e d ，t r a n s p a r e n t ，黼n ty e l l o w , 2 1 6 9 m 3 5 5 9 i ni n s i z e ，w i t hc l a m pc o n n e c t i o na n db r a n c h c o n i d i u mc o u l do c c u r e di nt h ep e r i o do fp l a t ec u l t u r e t h ec o n i d i af a i n tj a c i n t h ， e l i p s e s h a p e d ，s l i p p e r y e k t e x i n e d ，1 9 9 m 3 5 9 mx4 o g m 6 o g r ei ns i z e i na d d i t i o n ，as t r u c t u r ew h i c hw a ss i m i l a rt ob a s i d i u ma n db a s i d i o s p o r ew a sf o u n dh a t h ep i c t u r eo f e s e m k e yw o r d s ：a n t r o d i ac o m p h o r a t am y c e l i u mb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学1 立论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。如不实，本人负全部责任。 学位论文作者签名：闽雪乖孬 签字日期：汐楫y 月弓一日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定。学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件或电子文档。本人授权学校可以将 学位论文的全部或部分内容编八有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文，允许沦文被查阅和借阅。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 。 学位论文作者签名：，司、雾椽 签字日期：弘砧年r 月；d i = | 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 聊粹撅荔 签字日期：，m j 年b 月7 日 电话 邮编 第一章文献综述 1 研究的目的和意义 中国国土辽阔，自然条件私生态环境十分复杂，菌物资源极为丰富，被公认为是 世界上生物多样性最丰富的国家之。真菌是菌物中种类最多、形态差异最大的一类， 全世界已知真菌有2 0 万多种，我困至少有1 0 万余种，已报道8 0 0 0 种左右1 翻。许多 真菌与我们的日常生活关系密切，而药用真菌则是指能治疗疾病、具有药用价值的一 类真菌旧3 。目前已知我国传统的药用真菌达5 1 科3 8 7 种，主要分属于担子菌和子囊 菌两大类，其中担子菌纲4 4 科3 4 5 种：子囊菌纲7 科2 8 种 4 - 7 o 其中不乏有许多我 们通常将其看作是病原菌的一些真菌，比如：子囊菌纲中的麦角菌、玉米黑粉菌、谷 子黑粉菌、小麦散黑粉菌、稻曲菌、高梁黑粉菌以及担子菌纲多孔菌属中的许多木腐 菌等。 近2 0 年来中外学者发现了很多原来仅知可以食用或简单药用价值的真菌，除我 国对药用真菌进行大量研究外，日本、美国、德国、匈牙利、意大利、韩国等都设立 了专门的真菌药物筛选试验中i i , ，进行真菌新剂型药物的研制，以便药用真菌的推广 与应用 8 - 1 3 。 目前药用真菌的生产大体上有3 种方式o ” 1 5 】： ( 1 ) 应用于实体、菌核体。这在目前仍占多数，大多足采集野生品种或进行人工 培育，多为直接药用，例如银耳、虫草等，也可用以提取成分后制剂如树舌等，更多 的适用于复方中药配伍、如茯苓。这方面存在的问题是不少品种野生资源稀缺，人工 栽培困难例如槐耳、樟芝，并且不同的培育方式会影口向产品质量。 ( 2 ) 固体发酵应用“菌质”。由6 0 年代中期起曾用固体发酵生产1 0 多种药用真 菌药物，取得了较好的效果。但固体发酵长期存在的问题是概念上与固体培养相混淆， 工艺上多用经验指标，缺乏科学的发酵终点与质量控制指标及台理的产品后处理工艺 等。由9 0 年代起又开展药用真菌新型固体发酵的研究。 ( 3 ) 液体发酵。这是借鉴抗生索的生产工艺，其产品包括菌丝体乞箩酵液。这种 生产： i 艺的生产规模巨大，但药用菌1 i 同丁1 抗生素，本身不具有抗菌能j ，较耪污染 杂菌，工艺需进一步提高。 目前，人陆和台湾已外展r螳关f 俺芝形态、! l i 冬、有效活性成分药理弘i 【= 、 安全性评价等方面的研究，但对其菌丝体生物学特性的研究较少。从应用和开发的需 要出发，本研究对樟芝菌的生物学特性从环境因子、营养条件等方面进行予研究，为 工业化发酵生产菌丝体和获取发酵产物，提供必要的理论基础。 2 国内外研究进展 樟芝( a n t r o d i nc a h h o r a t a )亦名牛樟菇，是近年来在台湾首先发现的一种药 用多孔菌，据说仅生丁名贵树木牛樟树( c j n n a m o m u m m i c r a n t h u m ) ( 福建植物志 注名为沈水樟) 上。樟芝对一些危急病症如癌症、食物中毒等具有神奇的疗效：在市 场上每公斤售价高达十万元新台币以上，但仍供不应求【l ”。 由于樟芝目前仅在我国台湾发现，过去使用者也秘而不宣，所以投入心力研究者 很少，相对的，文献上的资料也几乎没有，传统医药典籍更不可能出现，可以说是研 究方面的一个崭新领域。 自从台湾研究樟芝的学者林业试验所的张东柱博士发现丌始，到1 9 9 0 年才有苏 庆华与国内学者臧穆共同发表的“我国台湾产灵芝属新种樟芝”( 形态定名) 一 文；1 9 9 0 年，台湾大学药物研究所杨书威的硕士论文“中药樟菇活性成分研究”；1 9 9 2 年，台北医学院天然药物学研究所高晓薇的硕士论文“台湾灵芝属新种樟芝之三萜类 成分研究”；1 9 9 4 年，台湾师范大学化学研究所程一华的硕士论文“樟芝之成分研究”； 1 9 9 5 年，国立台湾师范大学化学研究所吴德鹏的硕士论文“樟芝微量成分的研究”； 1 9 9 7 年，台湾师范大学生物研究所简秋源等发表“牛樟菇培养性状及其三萜类成分 分析之研究”论文集；1 9 9 9 年，静宜大学应用化学研究所黄帷敏的硕士论文“樟芝 微量成分的研究”；2 0 0 0 年，国立中兴大学食品科学研究所黄铃娟的硕士论文“棒芝 和姬松茸之组成分析及构型鉴定” 17 - 2 5 1 。 2 0 0 0 年台湾今朝实业有限公司总经理徐茂辉先生将台湾樟芝野生分离种引进国 内。由莱阳农学院药用真菌研究所、福建农科院植保所、福建轻工业研究所、无锡轻 工业学院共同承担樟芝研究，其中福建轻工业学院采用液体深层培养的方法获得了樟 芝菌丝体，但未获得理想的菌丝体颜色；福建农科院进行了樟芝生物学特性的初步测 试；莱阳农学院药用真菌研究所现已成功地进行了樟芝液体发酵和发酵全液有效活性 成分提取，并进行了初步的药理试验，樟芝菌丝体培养条件的优化研究正在进行之中。 由于樟芝e l 前仅在台湾发现，并控制菌种的外流，所以国外研究尚未见报道。 2 1 樟芝的分类地位 1 9 9 0 年，臧穆( 中科院云南植物所) 与苏庆华博士( 台北医学院) 共同属名发 表“我国台湾产灵芝属一新种樟芝”。出于当时标本误沾上了灵芝的孢子，因而 在描述时将灵芝孢子误作为樟芝的孢予并将它当作灵芝科真菌中的新种6 a n o d e r m a c a t g l g h o r ar u m 。 1 9 9 5 年，张东柱博士j 台湾省林业试验所) 等人【2 叫对樟芝种名进行了订正，将 其归入多孔菌科薄孔菌属，命名为a n t r o d i ac i n n a m o m e a ( z a n g s u ，1 9 9 0 ) ，对樟 芝子实体的外观、气味、生长速度、孢子显微结构等，均有详细记载。 t 1 9 9 7 年，吴声新 2 7 1 ( 台湾自然科学博物馆) 等人经整合前两次文献中的一致内 容后，再次订正樟芝种名，将樟芝重新命名为a n t r o d i ac a m p h o r a t az a n g s u 。属 担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，薄孔菌属。 2 2 樟芝生物学特性的研究 2 2 1 分布与寄主 目前，樟芝仅在我国台湾发现，主要分布在台湾桃园复兴乡、角板山，苗栗南庄 乡、三湾乡，南投竹山镇、水里乡，屏东县六龟乡，高雄旗山等4 个区域；生长期在 每年的6 1 0 月t 2 8 1 。 野生的樟芝一般生长在台湾山区( 海拔4 5 0 2 0 0 0 米之间) 特有的保育类树种牛 樟树树于的巾空内壁上，因为这个特征造成许多牛樟树倒伏，文献记载，樟芝是目 前在牛樟树上发现的唯一的木腐菌，病状为褐色腐生1 2 9 1 。牛樟树与樟树类都有浓烈的 精油香气，樟脑油可用于防蛀、驱虫、防腐，这早以为大众熟知，牛樟树更是不易腐 烂。五十年前r 本人砍伐牛樟树，剩下的树墩即使在潮湿的森林中也未腐烂，可见其 抗腐能力之强。然而樟芝却有能力生长在牛樟树上，这在生物学上有其特殊的意义1 3 0 】。 2 2 2 形态特征 樟芝子实体具有强烈的樟树香气，外彤板状、钟状、马蹄形或塔形，一般以板状 较多。子实体多年生，无柄，小栓质至木质，菌盖半圆形，表面褐色至黑褐色，具不 明显的皱，有光泽，边缘平而钝，腹面勾橘红色，局部黄色，有许多细孔，味极苦。 其生长极为缓慢，大小变化檄人，小奄一层薄片，犬至2 0c r l l 3 00 1 1 3 、重达5k g 以 一1 - ，老熟时成钟状，黄褐色皮壳，向明显n 勺环状构造，质地坚硬。 担孢子卵圆形或椭圆形，淡黄褐色，有双层壁，外壁光滑透明，内壁金褐色，具 分离或连接的棘状突起，胞径2 4 3 7pm 。分生孢子淡红色，椭圆形，外壁光滑，一 胞径1 5 2 * 3 4 “m 。 樟芝生殖菌丝透明微黄，壁薄，胞径1 5 2 5um ，骨架菌丝淡黄色，壁厚，胞径 2 5 - - 4 5 1 1m ，缠绕菌丝淡黄色，分枝，壁厚，胞径o 1 o 2um 川。 2 2 3 环境因子及营养条件 ， 樟芝固液态培养文献首见于台湾师大简秋源等( 1 9 9 7 ) 的研究，培养温度介于 2 6 3 2 之间，培养2 1 d 后可得0 2 8 干重菌丝，添加0 1 及0 3 樟脑结晶可 帮助菌丝体生长。 廖英明( 1 9 9 8 ) 研究指出，菌丝体在1 2 以下及3 6 以上无法生长，黑暗时生 长优于光照，添加d l - 天门冬氨酸( o l a s p a r t i ca c i d ) 后，有助于菌丝生长，1 0 樟木屑水萃取液以0 0 2 加入可有最好的生长。 许胜杰等( 2 0 0 0 ) 发现，樟树精油中常见成分如松油醇( t e r p i n e 0 1 ) 、黄樟素 ( s a f r o l e ) 、樟脑( c a m p h o r ) 等皆有助于樟芝菌丝体的生长。 黄大斌等( 2 0 0 1 ) 通过研究发现，樟芝菌丝体生长的最适温度为2 8 。c ，木屑培 养基的最适含水量为5 8 5 ，最适碳源为2 葡萄糖，最适氮源为0 2 柠檬酸铵。 宋爱荣3 2 1 ( 2 0 0 2 ) 通过研究发现，樟芝液体深层培养中，樟芝菌丝体对供试的六 种碳源均可利用，其中以麦芽糖利用效果最佳，对乳糖的利用较差。通过对发酵液 p h 测定发现，不同碳源组成的培养基终【ep h 表现不同，以麦芽糖、葡萄糖、果糖、 蔗糖为碳源的培养基终止发酵p h 为4 5 5 0 左右。甘露醇为碳源的培养基终止发酵 p h 为3 ，5 4 0 ，而乳糖则为5 5 以上。试验表明，樟芝菌丝体生长极其缓慢，在液 体深层培养过程中，若培养基配方不合理，菌球就生长很差，甚至不生长。 2 3 樟芝的生理活性成分研究 樟芝有许多的生理活性成份，如多糖( p o l y s a c e h a r i d e s ) ( 如b 一葡聚糖) 、三 萜类化合物( t r i t e r p e n o i d s ) 、超氧歧化酶( s u p e f o x i d ed i s m u t a s e ：s o d ) 、腺苷 ( a d e n o s i n e ) 、蛋白质( 含免疫蛋自) 、维生素( 如v i t b 、烟碱酸、麦角固醇 ( e r g o s t e r 0 1 ) ) 、微量元素( 如钙、磷、锗) 、核酸、凝集素、氨基酸、固醇类、木 质荣、血压稳定物质( 如a n t r o d i aa c id ) 等。其具备的生理活性功能有：抗肿瘤、 增加免疫能力、抗病毒、抗过敏、抗高血压、抑制血小板凝集、降血糖、降胆固醇、 抗细菌、保护肝脏等1 3 3 - 3 6 1 。 三萜类化合物( t r i t e r p e n o i d s ) ：c h e r n g 等人f 3 7 l ( 1 9 9 5 年) 发现樟芝子实体萃 取物中含有三种新的以麦角甾醇( e r g o s t a n e ) 为骨架的三萜类化合物：a n t c i na 、 a n t c i nb 、a n t c i nc 。n t1 9 9 6 年，c h e r n g 等人【3 8 1 以同样分析方法再度发现四种新 的 二萜类化合物：a n t c i ne 、a n t c i nf 、m e t h y la n t c i n a t eg 、m e t h y la n t c i h a t eh 。 而y a n g 等人j 3 9 1 ( 1 9 9 6 年) 则发现了二种以麦角甾醇( e r g o s t a n e ) 为骨架的新化合 物z h a n k u i ca c i dd 、z h a n k u i ca c i de ，和三种以羊毛甾烷( 1 a n o s t a n e ) 为骨架的 新化合物：1 5 一a c e t y l d e h y d r o s u l p h u r e n i ca c i d 、d e h y d r o e b u r i c o i ca c i d 、 d e h y d r a s u l p h u r e n i ca c i d 。三萜类是樟芝的主要化学成份之一，经试验证实三萜类 化台物有抑制肝癌细胞增殖作用并能有效地抑制血管紧张素转换酶( a c e ) 的活性， 进而降低血压。 多糖( p 0 1 y s a c c h a r i d e s ) ：药用菌中( 预防及抑制肿瘤) 免疫生理活性的多糖， 主要含有b d - g l u c a n ( b d - 葡聚糖) ，这些0 一d - g l u c a n 能通过刺激巨噬细胞、t 淋巴细胞、b 淋巴细胞以及自然杀伤细胞等，增强免疫功能进而达到抗肿瘤的效果“。 因此，樟芝具有免疫生理活性且防癌抗癌的主要原因也是其多糖中含有0 一d - g l u c a n 的成份。而樟芝所含b d - g l u c a n 其抗癌活性的强弱与其水溶性、分子量大小、支 链分支度、形状、0 一( 卜3 ) 或b 一( 1 - 6 ) 与主键结合方式、以及与其结合的蛋白 质等均有关。以x - r a y 绕射分析得知，以b 一1 ，3 键结合的d - g l u c a n 骨架呈现螺旋型 结构，这种螺旋型结构是引发抗肿瘤作用的重要成因。 2 4 樟芝的药理作用研究 樟芝疗效流传甚久，据少数研究者及使用较普遍的中药师的经验，樟芝具有保肝 解毒、清血、止痒、清凉解毒、活化细胞、抗肿瘤、抗老化、抗癌等功效4 1 1 。目前樟 芝活性成分分析及其药理作用的研究愈来愈多，台湾弘光技术学院乔长诚教授指出； 樟芝具有特殊的芳香气味，并具有抗菌和抗氧化的功能，町运用于芳香疗法 ( a r o m a t h e r a p y ) 上。此香味物质成分经鉴定结果为萜烯醇( t e r p e n ea l c o h o l s ) 类化 合物及乙基一卜六烷酯( e t h y lh e x a d e c a n o a t e ) 等。 中兴大学毛j r 伦教授，针对樟芝的抗氧化能力进行研究结果显示，樟芝抗氧化能 力可媲美b h a 。 国立台湾师范大学程一华( 1 9 9 4 年) ，从樟芝子实体分离出三萜类c o m p o u n db 具有降低以四氯化碳诱发急性肝障碍小鼠的血中g p t 值的作用。另外，从樟芝子实体 所得到的类三萜成份中，均具有支链上2 4 ( 2 8 ) 一e n 的架构，显示樟芝的类三萜代谢 途径，与其它种类的灵芝有很大的不同，这种支链架构可作为樟芝的特征成分。程 华经试验还发现：樟芝的甲醇萃取量高达3 0 ，远超过一般灵芝3 的萃取量。而且 樟芝的苦味比灵芝大，可能是樟芝的多氧化型类三萜及固醇类含量丰富的原因。 另外，根据国立台湾大学杨书威( 1 9 9 0 年) 的研究结果显示，萃取成份以乙酸 乙酯和水分配萃取后，乙酸乙酯层的抗胆碱及抗脑激胺活性最强，确有疗效。 据台湾大学医学院生化研究所的研究人员经细胞试验证实：樟芝除具有抗氧化 性，还能够抑制肝癌细胞生长，其中以菌丝体甲醇萃取部分最强，而红色菌丝又比白 色菌丝效果好。 台湾师范大学生物研究所简秋源教授等( 1 9 9 7 年) 研究发现：樟芝甲醇提取物 对金黄色葡萄球菌及发疮小芽癣菌生长有抑制作用，也有肠道弛缓运动及血小板凝集 作用。其中第三种化合物a n t i c i n ( 3 ) 具有抗肝炎作用。 2 5 樟芝产品的开发 1 9 9 9 年，台湾葡萄王公司取得了台湾经济部的科专计划，研究以发酵的方法， 大量培养樟芝菌丝体，目前已具备5 0 吨槽量的生产能力，同时还进行了安全性试验 和功能性试验。另外，台湾今朝实业有限公司与欣普泰等公司合作研发，目前已有少 量液体发酵生产，并采用樟芝菌丝体干粉制成“樟芝胶囊”，但没有安全性试验和功 能性试验资料发表。莱阳农学院药用真菌研究所自2 0 0 0 年获得樟芝菌种后，便积极 开展研究工作，2 0 0 2 年获得省重大科技攻关课题“樟芝发酵全液活性物质及其提取 的研究”。目前，已通过液体发酵的方法获得发酵全液，继而提取发酵全液有效活性 成分，制成“樟芝胶囊”中试产品，并已完成部分药理试验。樟芝菌丝体培养条件的 优化研究正在进行中。 第二章环境条件对樟芝菌丝体生长的影响 前言 真菌生长除了需要一定的营养物质外，还需要一定的环境条件，例如，一定的温 度、湿度、p h 、光照和氧气等。每种环境因子对生长都有最适点、最高限和最低限， 超过高限，低丁二地限，真菌都升i 能生长。 研究坏境条件对樟芝菌丝体生长的影响剥、f 樟芝菌丝体液体、固体发酵生产以及 樟芝子实体的人i - 驯i l 化栽培技术突破等，都具有重要的意义。目前，关于环境条件对 樟芝菌丝体生长影口向的研究，只有关于温度和含水量的初步研究报道。本研究综合采 用平板培养、液体深层培养和固体发酵的方法，对于影响樟芝菌丝体生长的环境条件 条件：温度、含水量、光照、p i 、装瓶量及接种量进行了系统的研究，现将试验结果 报告如卜： 1 材料与方法 1 1 供试菌株 樟芝a c 0 0 i 菌株，由台湾今朝实业有限公司提供，莱阳农学院药用真菌研究所分 离保减。 1 2 培养基配方 1 2 1 斜面母种培养基：p d a 培养基。 1 2 。2 活化半板菌种培养基：玉米淀粉 m g s 0 ，7 h ：00 0 5 ，琼脂2 ，p l l 自然。 1 2 3 活化液体菌种培养基：玉米淀粉 m g s 0 。7 h z 00 0 5 9 6 ，p h 自然。 1 ，葡萄糖2 ，蛋白胨0 5 ，k h ：p 0 ，0 1 ， 1 ，葡萄糖2 ，蛋白胨0 5 ，k i t ：p 0 。0 19 6 1 2 4 基础培养基：景米淀粉1 ，葡萄糖2 ，蛋白腺0 2 ，k h 。p 0 。0 1 ，m g s 0 。7 1 t ：0 0 0 5 s ，( 固体培养基再添加琼脂2 ) 。 1 3 主要仪器 b d 9 3 d 型海尔冷藏箱h h b1 1 一b s 一1 1 型电热恒温培养箱f a 2 1 0 4 上呲电子大平 z n d 一1 0 f 一2 d 型数字照度计h z b 一8 l 蚓转式振荡器k f r 一7 1 l w 型空调 y x q ，s g 4 1 2 8 0 型高压消毒器p h s 3 c 型精密p h 计s w c j 一2 f d 型医用净化工作台 7 1 4 培养及观测方法 1 4 1 平板培养 用子弹头打取直径为8 m m ，生长一致的边缘菌块，无菌操作h 引，接种于供试平板 中央。置3 00 | c 恒温培养箱( 温度试验除外) ，避光、静置培养。 从接种块萌发开始记录，萌发完全后，隔天测定菌落直径，培养1 5 一1 6 d 后，结 束培养，观察、记录培养性状并拍照。 1 4 ，2 液体深层培养 采用5 0 0 m l 三角瓶，装液量2 0 0 m l ；移液枪定量接种，接种量5 ( 接种量试验 及装瓶量试验除外) ；置3 04 c ，1 1 0 一1 2 0 r p m 条件下，振荡培养。 各处理随机取一瓶，定瓶取样，每天测定发酵液p h 变化情况，l o d 后，终止发 酵，观察培养性状并测定菌丝二重。 1 4 3 平板培养性状观测 培养结束后，观察菌落密度、颜色、轮纹、边缘整齐度等培养性状并拍照。计算 菌丝生长速度，并对各处理菌丝体平均纯生长量进行差异显著性分析f 4 3 】。 1 4 4 发酵液p h 测定 采用p h s 一3 c 糖密p h 计，测定发酵滚渊。 1 4 5 菌丝体干重测定 取发酵全液1 0 0 0 m 。，经2 0 0 目纱网过滤得菌丝体，用适量蒸馏水清洗菌丝体三 次，置5 0 。c 烘箱r 卜，烘至恒重，用f a 2 1 0 4 电子天平称重并记录。 1 4 6 液体深层培养性状观察 培养结束后，在过滤前观测菌球直径、颜色、均匀度、表面分技情况及发酵液澄 清度、颜色、气味等项目，并做记录。 1 5 试验设置 1 5 1 温度对樟芝菌丝体生长的影响 采用平板培养的方法，将接种后的平板随机分成2 2 组，每组7 个重复，分别放 置在3 、4 、5 、6 。c 、8 、l o 。c 、1 2 、1 4 、1 6 。c 、1 8 、2 0 、2 2 、2 4 、2 6 、2 8 、3 0 、3 2 、3 4 、3 5 、3 6 、： 8 、4 0 近似恒温条件f ，避 光静置培养。试验分三个部分，适宜菌种保藏温度试验、菌丝体适宜生氏温度试验和 菌丝体删热温度试验。 1 5 2 培养基质含水量对樟芝菌丝体生长的影响 1 5 2 1 试验所用培养基质及制作 谷子浸泡2 4 h 后，煮至熟而不烂，添加麸皮1 0 ，c a c o 。l ，蔗糖1 ，再依 所需含水量添加或减少水分。 1 5 2 2 试验方法 试验设9 个处理，含水量分别为；3 0 ，3 5 ，4 0 ，4 5 ，5 0 ，5 5 ，6 0 ， 6 5 ，7 0 。每个处理设l o 个重复 4 5j 。 选用大消化管，装至2 3 处，装量约1 7 0 9 管。1 5 m p a 条件下，高压灭菌2 5 h 。 移液枪定量接种，接种量5 m l 管。置恒温3 0 。c 条件下，避光、静置培养。 培养4 0 d 后，观察记录各处理菌丝体培养性状。并拍照。 1 5 3 光照对樟芝菌丝体生长的影响 试验分为两部分，不同光质试验发7 个处理，分别为红光( 8 l x ) 、橙光( 8 2 l x ) 、 黄光( 1 6 0 l x ) 、绿光( 1 4 l x ) 、青光( 7 0 l x ) 、监光( 1 4 l x ) 、紫光( 1 5 l x ) ；( 注：所 用灯皆为1 5w ，光通过不同颜色的镀膜玻璃后，光照强度发生了变化) 不同光量试 验设6 个处理，分别为：1 2 小时黑暗1 2 小时自然光( 1 8 0 l x ) 、黑暗、5 w ( 3 8 0 l x ) 、 l o w ( 6 0 0 l x ) 、1 5 w ( 8 5 0 l x ) 、2 0 w ( 1 1 5 0 l x ) 。每个处理设7 个重复 4 6 1 。 1 5 4 起始p h 对樟芝菌丝体生长的影响 1 5 4 1 平板培养 在基础培养基中刁i 添加k h ：p o 。，用0 1 h c l 和0 1 n a o h 将试验所用培养基分 别调节至p t t 4 ，p h 5 ，o h 6 ，p h 7 ，o h 8 ，p h 9 ，p h l 0 ，p h il ，p i - 1 1 2 ，以未经p h 调节的组 设为c k 。( 斟p t t 3 时，培养基不凝固，故不设此处理) 。共1 0 个处理，每个处理设7 个重复。 1 5 4 2 液体深层培养 在基础培养基中不添加k h 。p o ，用0 i i i c l 和0 i n a o h 将试验所用培养基分 别调节至p h 3 ，p h 4 ，p h 5 ，p h 6 ，p 1 1 7 ，p h 8 ，p h 9 ，p h i o ，p h i1 ，p h l 2 ，以未经p h 调 节的组设为c k 。艿1 1 个处理，每个处理设7 个重复。 1 5 5k h 。p o , 对不同起始p h 条件下樟芝菌丝体生长的影响 l 5 5 】平板培养 用0 1 c l 和0 1 n a o h 将基础培养基分别调节至p h 4 ，p h 5 ，p h 6 ，p h 7 ，p h 8 ， p 1 1 9 ，p h l 0 ，p h l l ，p h l 2 ，共1 0 个处理，以p h 6 为c k ( 因未经调节的培养基p h = 6 0 4 ) ， 共9 个处理，每个处理设7 个重复1 4 7 , 4 b 】。 1 5 5 2 液体深层培养 用0 1 h c l 和0 1 n a o h 将基础培养基分别调节至p h 3 ，p h 4 ，p h 5 ，p h 6 ，p h 7 ， p h 8 ，p h 9 ，p h l o ，p h l l ，p h l 2 ，以p h 6 为c k ( 因未经调节的培养基p h = 6 0 4 ) 。共 l o 个处理，每个处理设7 个重复。 1 5 6 装瓶量对樟芝菌丝体液体深层培养的影响 采用5 0 0 m l 三角瓶，分别装入5 0 m l 、7 5 m l 、1 0 0 m l 、1 2 5 m l 、1 5 0 m l 、1 7 5 m l 、 2 0 0 m l 的基础培养基，共7 个处理，每个处理设l o 个重复。 l 5 7 接种量对樟芝菌丝体液体深层培养的影响 采用液体深层培养的方法，用移液枪定量接种，接种量分别为：2 5 ，5 ，7 5 ，1 0 ，1 2 5 ，1 5 ，共6 个处理，每个处理设7 个重复。 2 结果与分析 2 1 温度对樟芝菌丝体生长的影响 2 1 。1 菌种适宜保藏温度试验 经研究发现：在3 。c 、4 。c j f l5 。c 条件下，培养1 6 d 后的菌块虽未见萌发，但将其 转到3 0 。c 恒温培养，仍然能够正常萌发、生长；将在3 0 。c 条件下已经萌发的菌块转 到3 。c 、4 、5 。c 温度下培养1 6 d ，也未见生长。 试验结果表明，在39 c 、4 、5 条件下，菌丝不会死亡，但不能萌发，生长处 于休眠状态。在陔温度范围内保藏后，不影响其在适宜温度条件下的正常萌发和生长。 这说明3 。c 5 是樟芝菌种保藏的适宜温度范围。 2 1 2 菌丝体耐热温度试验