（动物学专业论文）朱鹮种群谱系构建及遗传多样性研究.pdf

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尊带来了瀚滩；筑嚣j 掰褥建翡谮蕊凝鬻弑程逢程麇主瘦瘸戮 嚣j 大攀鞭士学技论文 朱鹃保护的实际工作中，为合理地制定繁殖计划提供参考。根据谱系而在繁殖配对时尽 霹鏊穗避免遥交，稳增避令薅阉豹基因交流，後种释豹遗传多样魏褥装维持，荠有珂糍 提高其生存能力与进化潜力，最终达到鼹好地保护这一稀世珍禽的目的。 关键词：朱鹎，r 廿d ，谱系，遗传多样性 i i 西北大学硕士学位论文 a b s t r a c t c r e s t e di b i s 叫咖砌m 印d 哟，ak h l do fp e c u h a r 旧d i n gb i r di i ie a s ta s i a ，i s 缸i n gb e ) ( 1 m 砸o nh 船m s eo fh u r n a n b e i l l g s e c o n o r l l i ca c 小，谁e s s e v 饥c r e s 矧蛳s e sf i o l da ty b l 唱 u n t ys h a a i 】) ( i p r o v i n c e i n l 9 8 1 w e r em ea l l 砌d 砌i 啊d u a 】s l e f i i l l 也c 啪r l d l h e n t op f 0 删 m i sr a r eb 硼，s c h o l a r sh a r ec a r r i e do ma g 犯a td e a lo f i e s e a r c _ h 器o ni tm m a r l ya r e a s h o w e v 鹄m 1 n o w ，s c u d i e si sm a i l l i yc o n m l e dt os o m ea r e a ss u c ha se c o l o g ya n dm o i p b o l o 母，l i m ew a sd o n e i 1 1m ea r e ao fm o l e c u l a rb i 0 1 哪p 瑚l o i l l i ms u c ha sd i s d b l ei n d i v i d u a l si r l c d e 粥i i 培a n da d d 心 p r o d i l c i n ga b i l i t yd e c r e a s 访go c c u r r e dm o r e 丘i 羽阳1 ti 1 1r e c e n ty r s t h e s eb a d l ya f f a 抽。d l e e ) 【i s c e n c ea n dd e v e l o p m 哪o f1 1 1 i s s p e c i e s s o ，g e t d l 玛t h ei 墒衄a 垃o nd b 0 呲c 艇；c e di b i s g e n e a r l dg e n t 蛙cd i v e r s i t yt 1 1 i d u g h 咖d i e s 砒m 0 1 e c i 】l a rl e v e la i l d 辩t c i i l gu ps c i 枷丘cp m d u c i n g 姐d p r 0 1 d l 唱p r 嘲e c d o i l s a r eb e c 伽 1 i 1 1 9u r g e n tt a s k s r a n d o m l y 锄p l i 丘e dp o l y m o 珥蚰cd n a a p d ) i sac o r n 1 0 n m e m o dt o 锄a l y z e d n a ，a n di sb a s e do np c ru 她as e d e s o fp 血娜m a d e 坤0 f 眦1 d o r n l y 锄a r 删 b a s e s a i 廿1 0 u g ht h es i l e sd e t e c t e db ya 咖百ep r 如旧a r el i l n i t e d ，m ee 倒h l e 薛n o m ec a nb e i i l s p e c 矧w k m m a n y 曲e r s w e r e u s e d b e c a u s eo f m e 删i s 删e n ta n d i 毡a n d n o m 0 1 e c u l a ri 1 1 】b n n 撕o na 胁c t 1 1 e 印e c i e s t ob es h 】d i e di si l c e d o d r a p di s 、v i d e l yu s e di i lr r l a r l y a r e a ss u c ha ss c u d y o f p h y l o g e n e t i c n a n d g e n e t i cd i v e 商够 w es f u d i c d3 2c r e s t c d i b i s c s 丘d m y o n gc o u n t y a n d5 s c 甜i b i s e s 舶m b e u 魄z o ob y r a p d s 砌撕t yc o e m c i e ma n dg e n 曲cd i s c a n c e sb e m e e nt w oa r b i 缸a 巧i n d i v i d u a l sw e r e c a c u l a t e d a c c o r d m g t ot l l ed a t ao f e x p e r i 【1 1 e n t s 曲e p e d i g r e ew a s c o n s 呲t e d b y 咖m e a l l s ( r h e y w e r eu p g m aa 1 1 dp a r s i r n o n y ) ，a n dg e n e t i cd i v e r s 时w a sd i s 邮s e d b a s e do n s e l e m n g t l 忙b e s t c o 删吐0 1 1 so fp c r 州m0 p ga n do p a p d m e r s 的m0 阿d n 倒掣咀y ，w e o b c a i n e d1 6 3b a n d s u s 啦2 4 r a 】m o mp 血n e r s 血o m e rw 0 l d s ，1 6 3s i t e sh c r e s c 甜i b i s g e n o m ew e r ed 嗽t e d 1 1 1 e b a n d s 鼬n2 3p 血n e r ss h o w e d p 0 1 y m o i p l l i s m m l i l l l 啪o f p o l y f n o 舢i c 碰o w a s o ，m a ) 【i r n u l l l w a s 8 5 7 l ，a 1 1 da v e r a g ew a s4 8 9 9 j nm ep 叩u l 撕0 n 计d c hw a s 唧s e db y3 7 砌v i d u a l s ， m o s to fg e n e t i cd i s t a n c e sb e t 、 ，e e nt w oa r b i t r a d ，m i v i d u a l sw e r e1 e s s 吐m0 1 t h er e s u h s s h o 删岫tt 1 1 ed e g r e eo f s i 砌a i j t y 锄o n gc r e s t e di b i s e sw a s 1 1 i 曲w 1 1 i l eg c n e d cd i v e r s 时洫t 1 1 e i i 西北大学硕士学位论文 p o p u l 越o n w a sl 口w8 c c 。f d 迅拟w et l i n kt 1 1 i ss i 锨8 垃o n 渊b e 删哇t ob o t l e n k 盛e t 鞠d ar 8 融e r 蠹。q p 懿e yo fi 西r e e 越n g hi sn e c e s s a 搿b ra l e c i e s 巅b 嘻拄酝o na n de v o l 穗o n 蝌 p o t e n 廿a l t 0k e e p 舻n 。d cv a r i e l ya tar e l 撕v e1 e v e l g e 加d cd i v e f s 埘狐l l l e p d p u l a t i o n m u s cn o t b el o s 矗卫也既m o r e 鲫dg e n ee x c h a n g e 锄o n g 濂b 遗越s 斑1 0 啦b e 铋h 嬲o e da s 魏l c h8 s 删b i e t 。8 v o 谴秭击n c 垃o no f c f e 昧狐i k s a t 也es a f n e 畦r 豫，c i o s ch 嘲i n gs h o u l db e 蹦c i l y a v o i d o d 如o b o c a l 黼c a l l 如梳d s i a d n o t b e m a r k 耐诟l l l 血g s m 吐l e 昀d y p c i i o d o f 胛0 i e 蜘0 n ， 畦摊则辨嘲c o 捌。s o 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慧泰漫等，2 o ) 。l 懿1 年s 昃，经过长麓考察，谯勰蓬陕嚣套潜獒凌蠹 煎掰发现了7 只野生朱鹩( 2 对成岛和3 只雏璃) ( 刘荫增，1 9 8 1 ) ，这是当时已 知的畿弊上仅存的野生朱鹃个体。由于朱鹦已濒临灭绝，多年来受到众多举者和 中萤、黼零、赣瑟等露竣鸯匏高度关注。i 9 5 2 年器本将寒鹣捂迩巍特爨天然荛 念物；1 9 6 8 年韩国将朱鹃指定为1 9 8 号天然纪念物；在第十二次国际鸟类保护 会上，朱鹳捩定为潮际保轳鸟( 史末仇等，2 0 瀚) 。 寒鹦在我国为瓣家一缀重点缀护动鐾( 刘斌等，2 0 ) 。l 鳃i 年寒鹋熬霆教 发袋馁貔霆藏为磊蘸邀嚣土难一糖裔野生朱鹣黥瓣家。j c 雪诧，串瀚各缀政瓣释辣 业主管部门给予了高度羹视，先厝采取了一系列保护措施，以拯救这一濒临灭绝 懿物毒孛，镀萁霉戳生存零发聂装大。经遗二卡佘年豹努力，寒蕤耱餮窭壤了较为 稳定的增长，由最视仅霄7 只个体的弱小群体缴鼹为洋县瓣生释群、洋娶人工萃孛 群、北京人工种群与周至人工种群等四个种群，截至2 0 0 3 年初，我国搠肖的朱 鹣蕊数已突破4 只。 1 1 2 朱鹏的保护工作 嚣北太擘磺壹学使论文 l 鳃1 年在寒鹬貔发现蟪陕嚣省浮蔡成立了寒鹦绦梦小终，琵合串露疆学浚 动携纂署究掰姨攀生态鬣察与磺究。 9 8 3 年3 玛残立洋蔡寒鹃绦护躐察涟，1 9 弱 年5 月成立陕鼯朱鹃保护鼹察麓，1 9 粥年戒立陕西采鹣救护镛养中心对架鹃 进行全方位豹保护翻管理。迄今为止已l 采取的裸护撩藏主要商璐下凡方面： 繁酸地盼环媾保护鬃区环境圊朱鹣的繁殖密切相关，为确僳繁殖成功，将来鹃 固定熬罄巢礴遮行缡号，缝为嚣有；爨廷秘本蘩止砍伐；傈辍一部分冬承羽，严 禁藏援拢鼹农翡，戳绦障寒鹩蠢夷好的受食场驻；开鼹攘撼溪动，邋辫还辏，4 骧 复楗藏。 夏歉攀繁象鹦游荡嚣靛繇凌傺势祆1 9 8 8 拳越霹来鹣游荡粼豹稳窥攫蜜逮滏纾 重点傈护，主要箨敞树拣解建襁：严禁在蕊函农田施用农蓊，并设专入遥行巡护。 人工投食在繁殖期帮食物缺乏静冬季a 工没食漉馘。 监护繁碴期在各巢区设立观察监护点，由专人负爨，井通过在巢树下设置尼藏 弼等接麓，瓣业天敖秘人为鞭豢对卷鹦熬镄害戳及蕤意不安全每故发黛。 戴铃，必准确掌握野生鬟乏鹞静群熬数餐动态、年龄续橡、性魄、聚对波每 躅滋动壤德等袅态攀褥援，歇l 鼹7 冬开始，每年均越密飞麓懿全部缀遵遴霉努 恚轹谈，势给少数辩生个露虢戴发饕雪爨，遽行无线电鼹踪，戳了解英溪动藏霆。 与藏嗣辩，在洋县及冀蠲霞缝嚣开蕊7 环凌涟测和狩猿管毽( 受东饶等，2 0 0 0 ) 。 缀过长麓豹艰酱努力，朱鹞静保护工佟取得了令入瞩鞫羽或矮，裙多建立 起了朱鹃保护体系，种群数慧不断增长。更为纛要的怒，在瞄零等黼人工繁疆朱 鹩的尝试灸效以螽，我国在这一方灏取缛了穰大的成功。i 9 8 6 年憩察动物园成 立“寒鹃饲券繁殪中心”，开始了对朱鹎遴褥人工繁麓的课髓研究，1 9 8 9 年首次 久王繁建出2 更寒鹅爨鸟。篓2 0 0 年瘸，残陡霆寒鹣救护镄棼中心人工饲葵瓣 l 只个舔中，有8 0 多只是掰年采人工繁蕊裁活鹣孑l 代、孑2 代寒鹩。予2 代懿滋现标悫簧朱鹩瓣久工繁蘸萋秀究菝褥了突酸整遴震。2 0 0 2 年，洋叠野生寒 鹣辩群这1 4 5 个个钵，久工释释达1 4 3 令个体，j t 索动物园入工饲莽静来鹬灌凝 到2 8 只。( 零斌等，2 0 0 2 ) 2 0 0 3 年伊始，秀魔传来豢镪，我豳拥有的寒鹃总数已 突被4 只，野生朱鹬的分布范围幽涕县地扩震楚洋县、城嗣、僻坪、戆县、 南郑、汉中和蹶乡罄七个区县约3 0 0 0 平方公里的广大区域。在此麓破上，这一 舔擞珍禽可逮受遭灭缝的毽运。 西北大学颂士学位论文 嘲际社会也对朱鹩十分关注。1 9 8 6 1 9 9 7 年，日本、德国、英国、美国、瑞 典、意大裁季器浚大剩鬣等卡余个国家静专家、学者先螽瓣朱鹃酌栖息逸进彳亍考察， 并与我国科学工作者合作，对遮一稀僦珍禽开展多方位的研究。1 9 8 5 年1 0 月， 裉据林业部与豳本环境厅签署的挤议，我国将1 只雄性朱鹩“华华”鞋j 借日本， 与其雌性朱鹞“阿金”配对；随后日本将雄性朱鹦“隧绿”送到北京动物园和中 国的1 只雌性朱鹃配对。遗憾的是上述人工繁殖的努力均未获成功。1 9 9 4 年我 国将l 鼹有繁蘧力蠹辱寒鹦矮绘瑟本，在佐渡寒鹣键募中心进行繁蓬磅究，毽雄健 个体意外死亡。1 9 9 9 年中国将l 对人工繁殖的子一代朱鹃“发友”( 雌性) 和“洋 洋”( 雄性) 筝为藐貔糟送绘秘本，这瓣瘸受中嚣友谊使者重锓熬朱鹃不受众黧， 在到达日本的当年即繁殖出后代。2 0 0 0 年我国再次向日本提供了1 只雌性朱鹩。 在中外学者的筵同努力下，朱鹞的保护与研究得蓟了蓬勃的发展( 史东仇等， 2 0 0 0 ) 。 1 1 3 朱鹩的研究概况 捩长远寒说，缣护一个物狰，馥着重予绦护其黛存环境与遗转多样牲，蕊 这首先要求人们对该物种本身及其栖息繁衍的环境有深刻的认识，因此，在对朱 鹃遂彳亍保护的简时，我国科学工作者从生态学、解翻学等方面对这一物种展开了 较为深入的研究。 野生朱鹤的活动区域主要在陕谢省洋县境内。洋县位子秦岭南麓，属暖温 豢自l 亚热豢过渡区，气候瀑暖湿润，毽被叛落时藏咛揍、零绿溺时棱每落畸爨 叶混交林为主，河流较多( 马志军等，2 0 0 0 ) 。朱鹎为留鸟( 正中裕等，2 0 0 0 ) 英活麓买有季萤洼，2 6 嚣为繁殖期，活动嚣域为海拔7 0 0 一1 2 0 0 m 豹低由窝中由 地区；7 - 1 1 月为游荡期，活动区域为海拔7 0 0 m 以下的低山丘陵与平川地区；1 1 月至次年2 月为越冬期，活动区域从汉江两席至海拔1 3 0 0 m 的中山地区( 丁长 青等，2 0 0 2 ) 。朱鹃多赞巢于山坡中部较高大的乔木( 例如栓皮栎、马尾松等) 上，其巢址选择受水豳面积、营巢树高度、海拔高度及人类活动的干扰程度等因 素影响，数繁皴期重点保护敬逸域应在海拔8 9 4 1 7 6 琳载地区( 孪豉海等，2 l 。 朱鹩冬季的主要觅食地为冬水田，其次是河滩和水库；朱鹗觅食场所的选择亦受 海拔麓凄、人类活葫戆干撬磴度、开润度、冬承墨承深、檀祓篷度激及冬承受覆 积等生态因子的影响( 马志军等，2 0 0 0 ) ，且觅食地与筑巢地之间有密切的相关 西北大学硕士学位论文 性，筑巢地的质量与其同觅食地的距离成正比( 翟天庆等，2 0 0 0 ) 。朱鹅在繁赡 过程中稼鹳影嚣中绝大多数耱类一襻基窍一系歹蔷模式傀毒亍尧，象鸟懿酝对关系i 常重要，双亲共同参与营巢、孵卵、育幼和防御天敌( 李欣海等，2 0 0 0 ) 。雌雄 经的年龄差异影响朱鹣鼯对关系酾形藏，一觳稳言缩，j 、年龄差瓣可提高繁殖能力 ( 王中裕等，2 0 0 l a ) ；繁殖成功率的高低则与卵重、繁殖年龄、日照、气温、降 水量、巢距觅食她距离和食物等因素均有十分密切的关系，通常情况下随着产卵 数量的增加，寒鸟弯终压力增大，导致雉鸟成活率有联下降( 餐天庆等，2 0 0 0 ) 。 根据野外环志观察，发现繁殖期间朱鹩有回避i 曛亲配对的本能，种群这一自我调 节瓣投铡对于撵离嚣 弋生活力以及耱嚣鹣繁愆堙大喜饕重要瓣袅耱学意义( 鼹塞 忠等，2 0 0 0 ) 。朱鹘雏岛的孵化为异步孵出，部分小龄雒鸟被淘汰，这是种群的 一耱遥斑经行为( 张歌暖等，2 0 ) ，这一租稍将雏鸟数薰减少到与豢岛食物供 应量相平衡的数量，食物供应量充足时可全部成活，不怒时则先孵出的皱鸟幸存， 以防止巢内所有雏鸟全部死亡( 王开锋等，2 o ) 。朱鹳雏鸟的死因主簧有疾病、 天敌危害、营器不良、人为因索及不嶷环境条传，时间在每冬蛉繁殖期( 4 6 月) ；渡成体和成鸟死亡主要是由于人为猎杀、疾病、灭敌等，时间多为每年的 秋冬季( 张跃骥等，2 0 0 ) 。1 9 年以嚣基于羧护力度魉大，爨生朱翳延亡率骥 显降低，种群具有稳定增长的趋势，营巢范围不断扩展。从种群的年龄结构着， 年龄链体摹蒸宽溷，意睬着静群数量将迅速增长；静群豹毪滋务合理 辫宝惠等， 2 0 0 0 ) 。1 9 8 1 年至2 0 0 0 年朱鹩种群数餐增加了3 0 9 倍，自然增长率y = 0 9 1 1 9 ( 只a ) ，周限增长率x = 1 2 2 0 ，a ( 王中裕等，2 0 0 l b ) 。 农鳃割学方蕊，对朱鹦的消化管邀( 肖方等，2 0 0 0 a ：澎方等，2 0 0 0 b ) 、气 管、卵巢( 陈谊等，1 9 9 9 ) 、肉分泌器留( 范光丽等，2 0 0 0 a ) 、免疫器官( 范光 瑟等，2 0 0 0 b ) 筹送行了形态构造磅究。在病瑗学方嚣，分提了多铡燹亡朱鹦， 其死因主要是感染和中毒( 晏培松等，2 0 0 0 ；周宏超等，2 0 0 l ；刘世修等，2 0 0 0 ) 。 戴井，自予朱鹃菇潍雄辩色鸟类，为准确签定箕往裂，利霜聚合酶链式及 应( p c r ) 对朱鹦雌性个体的性别相关基因进行了扩增，并获得了其性别相关揍 因的一段d n a 序列( 李疆等，2 0 0 1 ) 。 l 。l 。4 本文的礤究髫标 随着朱鹩数量的增加，出现了诸如残疾幼鸟增多、成年来鹎繁魑力下降、 4 西北大学硕士学位论文 薄壳卵增多且卵的受精率降低( 刘斌等，2 0 0 0 ) 等一系列问题。这些现象表明朱 鹦的濒危状态仍十分严峻，保护工作决不可掉以轻心。迄今为止，对朱鹩的研究 主要限于生态学、形态学、病理学等方面，而在分子生物学领域的研究十分缺乏。 众所周知残疾幼鸟等现象的出现与近亲繁殖密切相关，近交衰退将对种群的长期 存活产生极大的负面影响，特别是对于隔离小种群和濒危物种而言，遗传结构与 繁殖极为重要，近交衰退是其种群数量下降乃至灭绝的主要原因( 杨玉慧等， 2 0 0 1 ) 。目前我国的朱鹩数量仍极为有限，且均为1 9 8 1 年发现的两对野生朱鹦的 直系后裔，基因来源单一。小群体内的频繁近交将使纯合子个体数量增加，导致 朱鹃后代生活力和生殖潜力下降，以及遗传多样性的大量丧失( 刘斌等，2 0 0 0 ) ； 而遗传多样性的降低又将反过来影响个体的适应性与种群的进化潜力。有研究表 明，自交系数每增加l o ，繁殖适应性即降低2 5 ( 昝启杰等，2 0 0 0 ) 。遗传多 样性的维持对于濒危物种尤为重要，已成为目前国内外学者所公认的生物保护工 作的首要目标。根据研究结果，5 0 0 个个体是维持种群不断进化的最小单位，在 此数量上，遗传变异的丢失与基因突变的获得接近平衡( 昝启杰等，2 0 0 0 ) 。由 此可见，在数量极为有限的朱鸦的保护工作中，必须合理制定繁殖计划，尽可能 避免其种群的近交衰退与遗传多样性的进一步丧失。在朱鹩保护的初期阶段未能 对各巢区的离巢幼鸟进行环志，故现有朱鹃间的谱系关系较为混乱( 刘斌等， 2 0 0 0 ) ，通过d n a 分析确定其个体亲缘关系已成当务之急。我们应用随机扩增 多态性d n a f r a p d ) 技术，对洋县人工饲养与野生种群和北京动物园人工种群中 的部分个体进行d n a 分析，构建其谱系关系，并探讨其遗传多样性。本研究的 结果将提供朱鹃在分子水平上的有关资料，并且可在一定程度上应用于朱鹘保护 的实际工作。根据谱系关系，可以选择亲缘关系较远的朱鹃个体进行配对，从而 避免近交，维持群体基因杂合度：还可有计划地将人工繁殖的雏鸟与野生雏鸟进 行交换，使朱鹃种群基因得以交流，进一步提高其生存力与进化潜力，最终更好 地保护这一美丽的稀世珍禽。 1 2 遗传多样性简介 1 2 1 遗传多样性的含义 遗传多样性( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 在广义上是指种内或种间表现在分子、细胞和 个体三个水平上的遗传变异度，狭义则是指种内不同群体与个体间的遗传多态性 鞭j 丈举疆壹学搜论文 程度( 旋立瞬等，1 9 9 9 ) 。遗传多样性珂援采攒述秘辫遗传交羚帮维持变吴鹣钒 到( 敏癌杰等，2 0 ) 。现代遗传学硪究认为，除了孤雌生殖、蛾隳双耋蔓予和充隆 叟貔律辍努，没有任撂耀令个 奉夔基毽缀( g e n 。瓣e ) 竞全鞠嗣；大爨躲秘其存壤茭 车嘉懿遗转交雾，卺含诲多不麓豹遗铬爽壁。在逮镄多样毪磷究孛，较受重褫懿 是稀蠹藏稚疆下，鄯旺荦辛闯袋甄嵇肉、群体阉或褥体肉静遗传交蓐( 释内遗传多 样强又称为多态往) 。遗传多襻往麓表现是多层次、多水平的，它可戳袭现旋豁 部形态上，例如果蝇其肖长翅、残翅等不同的翅型：袭现在艇理代谢上，铡如穰 兹的光会终翔褒强瘦上囊一定豹差辩；瞧可以表现在染色体水平秘d n a 永乎上 ( m o 牲e l l ，1 9 8 1 ) 。 溅a 分子在复铡j 窭程审稿零会发叟错谡，罨致予缨耀裁爱钱烈a 麴碱基露 残岛鸯纲貔戏塞零露_ l 嚣不圆。遗传多群牲豹涤添之一楚这耱缡尔发黧弱镶谡，帮 遽蒋物瑷静改变突变( a y a l a 等，1 9 8 4 ) 。查穗在有僚生麓过程审，萋嚣溅不 同筠豢本之闷会进雩予掰的缀合两便予代产生耨鹣基粼羹，困烧，重缀楚遗传嶷雾 的赫一个来源。 l 。2 。2 掰究遗传多样性的意义 辩遗传多样褴熬礴究蕻蠢熏娶翡溪论徐蕊帮安黼意义。蓄先，物糖或瓣镲 盼遗传多祥经稷度怒长期避纯鹣结浆，是萁生存与笈袋瓣蓊捷( s o l t i s 等，1 9 9 1 ) 。 一个锯稃或群体筑遴传变异越丰富，遗传多样挂越离，对予环境交识麓适应能力 就熬强。理论推导帮实验结果均表明，生物遗传变异度的大小与其进化道率成氟 比( a y a l 8 等，1 9 7 9 ) ，瓣臧，对遗传多撵幢豹磷突砸以攥示物季申或群钵的避纯历史， 从穗为遴一步分析蒸进化潜力与兹爨掇供重要魄资料。其7 突，遗传移撑性是保护 生貔学熬主簧磁突内容之一。夔羞人类经滚活动热裁耧天日戆挟这壤长，人类羧 戮生存戆蒸溅生物多群瞧受到了严重的藏耪，缀多物秘溅 褒灭缝。基因楚携 释静遗传物矮，穗荨串多样性来蠢予滋纯时闻肉麓逶健多释镁，物耱避纯髓力鹃缭 持叛遗传多样瞧的存在为前提，垂然静群在经历簸籁效应嚣，会幽予遗传多样淫 的丧失而难以恢复( 杨玉慧等，2 0 0 1 ) ，因此，遗传多样性成为其它一切多样憔 的慕磷襄重簧戏分，对物张帮瓣落多爨性越藿决定瞧瓣接髑f 蛰癌杰等；2 0 ) 。 不了勰遗传多样性，就难以采取秘举、合理麴撼旋窳保护秘刹耀生物资源：对予 濒筑掳穗兹僳拶剩受燕套鼓予我雷强 葵遗传多嚣蛙豹认识。褥次，疆突遗赞多撵 6 觏北大学硕士学位论文 性有助于了解生物多样性的起源与进化，为动植物的分类、进化研究提供背景资 辩，遗褥为动禳耪育释帮遗传教良羹惫基穑。 1 2 3 遗传多样性的凳子生物学研究方法 人们对遗传多样性的研究最初是从形态学开始的，但形态学性状不能准确 逢反获遮傣交舅情瑟；髓若粢魏体夔发现及箕终穆萃鞋翡辘豹确定，夫稍又将骚寇 重点转到了染甑体上o d e r r e l l ，1 9 8 1 ) 。自2 0 世纪6 0 年代起，酶电泳技术与特异 往组织纯学染色法酶应用使辩学家们襻以献分予水平客璐速揭示遗传多样性。遴 入8 0 年代，在分子生物学和分子克隆技术迅速发展的基础上，产生了一系列爨 为灵敏、有效的研究遗传多样憔的方法，即真彼测定遗传物质d n a 序列的 变异。强翦，在分子东乎上检测遗传多样蛙的手段很多，除本研究蹶采用的r a p 转 技术以外，具有代表性的方法主要有以下几种。 蔽篱l 链篾紧长发多态蛙 艇l p ) 分接r 要卫楚缮鬟羧潮性内翡薅窝蘩不同令傣 的基因组d n a 以后，含有同源序列的酶切片断在长度上的差异( 杜立新，1 9 9 5 ) 。 通常醚籁往内镯酶酌 掰序列为4 6 个核营酸，疆静墓溺被特定的限裁 耋内韬酶 消化后，断裂为一定大小和数量的片断。如果限制性内切酶的识别序列发生突变， 则将失去原有的切点：而d n a 的任何突变也可能产生新的切点，从而使酶切片 断的长度和数爨发生变化，并通过电泳将其分辨出来。r f l p 技术多应用于线糠 体d n a 和核糖体d n a 研究。 扩增冀叛长度多态牲( 矗寥l p ) 分撰a f p ( 驯i 曩e df 豫g m e 矬lk 廷g 漱 p o i y m o 即h j s m ) 分析是z c b e a u 等发明的一项技术，其基本原理怒将d n a 用可产 生糖往末端豹袋翻往蠹甥酶消纯，产生大，j 、不黼的酶韬靖赣，与含有共满精往来 端的人工接头连接，作为进一步扩增的模板。a f l p 实际上是r f l p 和p c r 相结 合的一种方法，所需d n a 量少，无需作s o u t h e m 杂交，实验络果稳定，但费用 较为昂贵，对操作人员素质及d n a 的质量要求较高。 d n a 序列分析1 9 7 7 年s a n g e r 发明了链终止法测定d n a 一级序列。聚合酶链 式爱应( p e r ) 熬遗琥菠测彦避程中鬏为繁琰熬步骤d k a 模叛敬巷餐大大 简化，从而使测序技术在珍稀动物遗传多样性的研究中有了更为广泛的应用。 d n a 一级序列是最为赢接的遗传信惑，邀是遗传多群往静禳本体现，含有最大 的遗传信息量，例如，人的单储体d n a 有多达1 0 9 个碱基对，某些生物则更商。 鞠北大学硕士学位论文 然而与矮它检测d n a 的技术相比，这方法所需的费用较为昂贵。 p n 轰摆绞强谱( 脒a 瓢鬈e rp 蛀娃l i 毽葑分毒蓐d n a 撵绞嚣港是黻簦毽缍中貔较鬣 重复序列，即小卫星d n a ( m i n i 8 a t e l l i t e ) 作为标记检测遗传变异的一种方法。小卫 蓬d n a 的重复单位为l i 6 0 个核营酸，全长数百至数予藏基 ；3 r a 黪产肇麓多态往是德巍翡，不麓单独嚣l 予对没 有标记的生物进行遗传阉谱分掇；4 。糯进行大懿的引物筛选工作( 王学峰等， 2 0 0 2 ) 。 然蕊，这些缺点可以通过下烈途经加以改蛰：l 。援越操作，反应体系鳃维娥 成分力求一致，尽可能使反应标准化( 张丕燕簿，2 0 0 0 ) ：2 袋用聚丙烯酰胺凝 狡毫泳、交洼淡骏臻囊电溶或湛度蕊爨凝黢电泳取找豫黯糖藤胶毫濠，疆褰扩增 片断的分辨率；3 对r a p d 标记进行回收、克隆和纯化，将标记中的混合片断转 忱为等经褥彝拣慈r ( a s 一跫r ) 标记，壤将荬中豹单拷爱痔列转证秀裟f 谤标记 的一个探针或s t s 标记( s e q u e n e et a g e ds i t e ) ( 王学峰等，2 0 0 2 ) 。 1 3 3r a p d 反应的基本过程与影响因素 一个耩礁翳嚣a p 0 一p r 爱鑫龟搔i q 撼霉r i s 一挺c i ，s 魏灏翳i ，2 穗藜西l b0 。l 链 明胶，4 种抓t p 各1 0 0 “m ，引物o 2 u 模板d n a 2 5 n g ，t a q 酶1 2 u ：反应条件为 9 4 交往1 m i n ，3 笺注i m i 如? 2 惩 牵2 越n ，3 5 4 5 次循环( 剃愚渡簿，i 鹩7 ) 。 上述祭传可缀掇具体的实验情 兄藤作适当调整。 鳗北大学硕士学位论文 影响i 乙气p d 反应的因素主要有以下几点。 模援d n ar a p d 反应建模扳的缝度要求不塞，模板霹从缝织、全盘或罨襻中 提取( 李学斌等，1 9 9 7 ) ，模板中含有r n a 或爨白质均不影响扩增，但若残留 氯仿、乙醇等对矗q 酶其有变惶 乍霜静耱覆时，到会影响实验缡莱。模蔽d n a 的浓度对扩增产物的量有一定影响，浓度过低时分子碰撞几率低，扩增产物没有 或不稳定i 浓度过高会耦应增勰非特异扩增产物，若褥环次数控涮不好，引物过 早消耗完毕，扩增产物37 端将和原模板及第一次循环的产物邋火，造成不等长 度的延伸，形成弥散型条带，在极端情况下，d n t p 消耗完毕，无延伸反应，扩 增产物单链化，瞧泳居染色强度低，出竣扩增效果差鲮锻象( 涯小全等，1 9 9 6 ) 。 但总的米说模板的适宜浓度有一个较大的范围。 孳| 耪凇p d 反应黪毒；物为蘧穰痔列蕈链，1 0 - 2 酾p ，逶嚣力l e 印，无瓣文结褥 ( 刘恩岐等，1 9 9 7 ) ，且c g 比例不低于4 0 ，以保证遐火时双链的稳定性。反 应过程中g | 物的鬟及其长短均影响到扩增结果，弓| 物浓度过商会出现弥散状背 景。引物常形成二聚体、四聚体甚至八聚体，因此扩增前混合试剂应保持低温。 ( 李学斌等，1 9 9 7 ) 退火湿度与常艇p c r 楣毙，致a p d 反应鲍退火温度较低，一般在3 6 屯左右， 以保证短链引物与模板d n a 的稳定结合并允许适当的错配，从而扩大配对的随 祝性，撬高分氍效率 挂立毅， 9 粥) 。毽峦予逡炎湛发影嫡扩溪魏特舅往，赦 不宜太低，以兔扩增出大量的非特异谱带。 m g “缓冲液中的m 酽+ 可便雩| 秘与模叛的结合趋于稳宠，m 9 2 + 浓度较离时，扩 增出的谱带数目与亮带数目均较多，一般认为使用2 5 m mm 孑+ 时有较好的扩增 效果( 陈永久等，1 9 9 7 ) 。 d n a 聚会酶姒p d 反应逶豢使用t a 酶，酶的浓度较大时扩增出的谗带数露 较多，鼠不同厂家生产的t a q 酶扩增结果有一定差异，淡现为片断分子赞大小不 露蕺片簸数嚣不蠢( 陈永久等，1 9 9 7 ) 。蠢粟强q 酶在缝纯过罄申受戮污染，露 会对扩增结果产生较大的影响( 汪小全等，1 9 9 6 ) 。 循繇次数r a p d 实验中p c r 的循环次数多为4 0 4 5 次。当循环少于3 0 次时可 能会丢失一部分条带：5 0 次以上则会因t a q 酶发生差错( t a q 酶出错率约为两万 分之一，循环越多则出错的可能性越大) 而使扩增结巢出现误藏。 掰北大学硕士学位论文 此外，反应过程中d n t p 的魅以及缓冲液的成分均可在一定程度上影响扩增 结果，d n 王p 浓度太裹竣太低垮无扩增产物( 李学斌等，1 9 9 7 ) 使爱不同厂家 生产的p c r 扩增仪，也会使反成结果有所不同，主要表现为一些弱带的增减( 陈 永久等，1 9 9 7 ) 。 1 3 4r a p d 技术的威用 品种( 系) 鉴寇和遗传多样性研究为了在保护濒危物种时制定出一系列科学、 金理载对策，蓥先要了瓣鐾j 孛懿送簧多样瞧承乎。r a p 转霹放耪n a 承平捡 鬟| | 遗 传变异和群体分化，其标记具有高度变界性和多位点性，是品种签定与遗传多样 往检溺翡有效手段。溉 s h 等( 1 盼1 ) 掰3 条季| 物构建了8 个晶系小鬣的特异筏 r a p d 图谱。王剑伟等( 2 0 0 0 ) 用r a p d 技术研究了稀有婀鲫的近交l o 代及3 个野生群体的遗传多样性，发现近交系的遗传多样性极低，野生群体则保持了较 丰富的遗传多样性，群体闻遗传差异十分明显。h a i g 等( 1 9 9 4 ) 硬究了美国濒 危鸟类啄木鸟，发现其群体间遗传距离很近，建议将大群体中的一些个体迁入小 嚣谑送行繁殖。兰宏等( 1 9 9 6 ) 对6 只笼葬滚众丝猴避行了r a p d 分糖，结豢 显示该群体遗传多样性很低，据此提出让遗传距离较远的个体进行交配的笼养繁 蔟诗翊。上述磷究表明r a p d 技术对予遽簧多样往静研究是一静较荮躺方法， 尤其在分析遗传衰退物种的种群结构上很有用处。 物种分类和系统演化r a p d 投术可用予研究邋缘种间或种内的系统进化关系， 从d n a 水平精确地分搴斤物秘的进化速度，并计冀遗传距离( 自索英等，2 0 0 1 ) 。 何舜平等( 1 9 9 7 ) 探讨了稀有鲷鲫的系统地位，认为稀有嗣鲫与中华细鲫和唐鱼 匏亲缘荧系最运。王义投等( 1 9 ) 磁究了5 耪游蛇帮l 葶孛蝰秘舵戆亲缘关系与 进化，麒结果和传统的分类系统一致。陈永久落( 1 9 9 8 ) 对来自不同地区的8 只中莺貉进行了r a p 矜分辑，认为不瓣缝瑾群体阔存在遗传分纯。 基因定位与分子连锁图谱构建对于濒危动物和重要的经济动物，基因图谱的构 建其有匣大的理论意义和潜在瀚经济效益，可用于寻找掰的基戳、开发优良性状、 进行疾病诊断，乃至延缓物种衰退。通常列用r f l p 构建基因图谱。健r f l p 标 记主要分布于染色体端部，而r a p d 标记的分布则较为均匀，因此对慕因定位 与建立分子连锬图谱缀骞应用份蠖。r a p d 技术可姨遮寻找嚣缀d n a 撵晶阙懿 多态性差异，进而得到与此差异相连锁的d n a 标记，这对于缺少其它遗传标记 嚣恕大学礤士拳谴论文 戆锡季孛瓣基嚣黪灌擒建= 乏走毒鼹。丰富数r a p 转经点霹鸯蒌在形态学逡转图谱、 同工酶图谱或r f l p 图谱的间隔区，形成高密度的遗传谶锁图，使基因定位更加 准确。李奎等( 1 盼3 ) 认为r a p d 标澄可瘸子猪豹d n a 多态毪褥究及箕基因凿 谱的构建。 辅助标识选择将d n a 标记与幢状表现型的遗传规律栩结合，确定基因与性状 的连锁关系，并借助这魑标记对蛮禽进弦辅助育葺中，即标记辅助选择，融成为动 物遗传育种研究的热点之一。这一方法可提高选种的准确性，提高选择藏和选择 疆度，绞短世代阙蹑，垮弯出缝合多秘饯良性状予一体浆叛饕体。撵毡诗，在家 系内对用于后裔测定的个体先使用标记预选再进行后裔测定，可使选择反应提高 1 0 5 0 ，在家系润痘瑶综合多个标记粼谣提高5 0 ，2 0 0 。i t a p d 标记豹优点主要 是可利用显性效应和上位效应。谢新民等( 1 9 9 8 ) 采用r a p d 技术对猪的平均 j 增瘦肉薰分子标记避行了探讨，筛选高2 条与强增瘦岗萋显著相关的多态性谱 带。 潦权鉴定与个体识别祭权鉴定主要用于濒危动物的繁殖管理和人工饲养经济 动物的蠢耱。r a p d 扩壤谱豢雩孥合孟德尔遗传怒槔，霹瘸子亲投鉴定。x o n g 等 ( 1 9 9 2 ) 应用r a p d 对6 窝1 雌多雄交配繁殖的水貂进行了父权鉴定。 蒺嚣渗入翡分子检测s t r e i 等( 1 9 9 4 ) 溺r a p d 结合嗣工酶帮线粒钵猃n a ，分 析了淡水动物在自然种群中的种间杂交和基因渗入现象。 榷剐鉴定对两性同形豹物种，从形态签定其性潮较为湖难，应粥r a p d 技术w 对动物及其胚胎进行性别鉴定。w 抽d e l l 等( 1 9 9 3 ) 筛选燃了9 个小家鼠的y 造 锁r a p d 标记。 遗传质爨监测应廷lr a p d 技术可怼近交系大藏等实验动物遴行遗传鼷量监测 ( 刘恩岐等，1 9 9 7 ) 。 1 3 5 展望 r a p d 技术问世瞄履，仅十余年便广泛应用于分子生物学研究的众多领域。 这一技术所具有的简便、快捷、实验成本低、多态性丰富等优点是诸如r f l p 、 微卫星渊a 、鼹王酶拣记等其它d n a 多态检测方法蹶不能比攘熬；瑟该技术鏊 前存在的重复性差等问题可以通过规范操作、分析标准化的途径而逐步加以辫 决。霾诧，r a p d 技术獒有分广溺兹应雳前景，可以予英觅在不久豹将漆，这一 西北大学硕士学位论文 技术将受勰完善，从丽檄大恁推动系统发育研究、遗传多样性分析、基因图谱构 建等众多学科的发展，狂生物学前沿领域发挥其难以替代的巨大作用。 强托大学硕士学位论戈 第二章材料与方法 2 1 实验材料 材料来源为北京动物园朱鹳人工种群的5 个个体、陕西洋县朱鸦人工种群的 l 碡令令谤与洋装鹭生秘群夔1 8 个令体( 在本文中，j 裘毒孛群缡淹l - 5 芍，洋县 人工种群编为6 1 9 号，洋县野生种群编为2 0 3 7 号) 。使用伤害性较小的肱静脉 莱盘法，获褥上述个薄麴盘样。 2 。2 朱鹦基因缎d n a 的提取及检测 2 2 1 提取 双来鹨血样中提取d n a ，瑟体步骤如下： ( 1