（植物病理学专业论文）TcLr35小麦抗病相关基因的克隆及分析.pdf

摘要 植物抗病基因克隆研究对于抗病育种和抗病机制的理解具有重要意义。而小麦不 仅基因组庞大( 1 6 x 1 0 1 砩) ，相当于水稻基因组的近4 0 倍，且重复序列含量丰富， 这些特点使寻找小麦抗病基因区段两侧的分子标记比较困难，增加了染色体步移或重 叠克隆群构建的难度。抗病基因同源片段的克隆，定位及其与已知抗瘸基因的连锁分 析，为克隆小麦抗病基因提供了新的思路。本论文根据已克隆的植物抗病基因保守结 构域设计引物，采用同源克隆技术，并结合c d l q a 末端快速扩增( r a p i d 锄p l i f i c a t i o n c d n ae n d ，r a c e ) 和热不对称交错p c r ( n l e r m a l 船y n 瑚e 雠ci n l e d a c e dp c r ， 1 a i l p c r ) 技术对小麦抗病基因同源序列进行了研究。同时，利用r t _ p c r ( r e v e r s e 仃a i l s c r i p t i o np c r ) 和r a c e 技术筛选t c l r 3 5 小麦病程相关蛋白基因c d n a 全长。主 要研究结果如下： ( 1 ) 根据抗病基因核苷酸结合位点( n u c l e 甜d eb i n d i n gs 沁，n b s ) 、富含亮氨酸重 复( k u c i n e - r i c h 嘲e a t s ，l r r ) 保守结构域设计引物，从携带小麦抗叶锈病基因d 3 j 的回交6 代近等基因系t c l r 3 5 中获得了4 个通读的小麦抗病基因同源片段删3 、 p l s j 3 2 、删2 和三r r j 。其中3 个片段含有n b a r c 保守结构域，与己知抗病基因 妇c - j ，上6 ，尼p 船等相应区域相一致，具有抗病基因n b s 特征结构域( p 环、激酶 2 a 、激酶3 a 等) 。三且r 含有3 个完整的l r r 重复单元，与水稻抗白叶枯病基因勋? 基因具有较高同源性。 ( 2 ) 以跚2 为靶序列，利用r a c e 技术获得了c d n a 全长2 6 9 3 b p 的t c l r 3 5 小麦 抗病相关基因，该基因包含1 8 8 7 b p 的开放阅读框，2 3 0 b p 的5 q # 翻译区( u n t r a i l s l a t e d r e g i o n ，u t r ) ，5 3 3 b p 的3 非翻译区和2 l b p 的多聚腺苷酸尾。在2 3 3 b p 处有a t g 起 始密码予，2 1 1 7 b p 处有1 a g 终止密码子，编码6 2 8 个通读的蛋白质氨基酸序列，基 因编码产物具有n b s 、l r r 等抗病基因保守结构域。初步认为黝2 基因为 c c n b s l r r 类抗病相关基因。在( k n b a i l l ( 获得的登录号为d q 2 0 5 3 5 1 。利用半定量 r t p c r 技术对该基因的表达情况研究表明，删2 基因为低丰度组成型表达，其表达 不受病原菌接种的诱导。 ( 3 ) 利用热不对称交错p c r 技术获得了2 个厶 相关基因组d n a 片断r g a l 的侧 翼序列，长度分别为5 1 l b p 和6 1 4 b p ，与r g a l 重叠区分别为2 9 3b p 和5 0 9 b p ，分别 向3 端和5 端延长了2 0 8 b p 和1 0 0 b p ，拼接后序列为9 1 5b p 。经b l a s t n 同源性比较， 与小麦抗叶锈病基因三，2 j 同源性为9 3 ( s c o r e 值为6 7 4 ，e 值为0 0 ) ，与含有厶0 基因的4 5 0 k b 大片断重叠群同源性为9 0 ( s c o r e 值为2 6 0 ，e 值为7 e 一6 6 ) 。 ( 4 ) 根据已发表的植物病程相关蛋白l 基因和b ( 1 ，3 ；l ，4 ) 葡聚糖苷酶基因设计引物， 利用r r _ p c r 和r a c e 技术，从被小麦叶锈菌诱导的小麦抗叶锈病近等基因系材料 t c l r 3 5 中获得2 个病程相关蛋白基因c d n a 全长。其中，7 5 6 b p 的小麦病程相关蛋白 l 基因p 五2 包含4 9 5 b p 的开放读码框，1 4 7 b p 的5 非翻译区( u n t r a l l s l a t e d r e g i o n ，u t r ) ， 1 5 5 b p 的3 非翻译区和2 l b p 的多聚腺营酸尾。编码1 6 4 个通读的蛋白质氨基酸序列， 基因产物具有植物防御体系中病程相关蛋白s c p 保守结构域，与g e n b a i l k 中多个植 物病程相关蛋白1 基因具有较高的同源性。s o u t h e m 杂交显示，该基因在t c l r 3 5 小 麦基因组中为单拷贝。p r 鲥c d n a 全长序列为1 3 4 0 b p ，具有一个编码3 0 3 个氨基酸 的开放阅读框( o r f ) ，其起始密码子a t g 位于7 7 b p 处，终止密码子t a g 位于9 8 8 b p 处，3 末端有2 9 b p 的p o l y ( a ) 尾，3 2 3 b p 的3 非翻译区。与g e n b 孤k 中小麦、大麦 等多个葡聚糖苷酶基因具有较高同源性；对其推断的氨基酸序列进行分析，含有 g l y c oh y d r o1 7 保守结构域，为葡聚糖苷酶基因蛋白结构域。s o u 吐l e m 杂交显示，该 基因在t c l r 3 5 小麦基因组中为多拷贝。 关键词：小麦抗叶锈病基因：同源序列：病程相关蛋白：b ( 1 ，3 ；l ，4 ) 葡聚糖苷酶 基因；c d n a 末端快速扩增：热不对称交错p c r n c l o n i n ga n dc h a n c t e 出a t i o no ft h ew h e 丑tr e s i s t a n c e r e h t e dg e n 龆 f n mt 扭f - 3 5 p h dc 矗n d m a 把：w 魂h a i - y a n m a j o r ：p l 缸tp 8 m o i o 斟 s u p e r v j s o r ：p f o 亿fl i ud 邺u n a b s 拄a c t c l o n i n go fp l a n tr e s i 衄1 c eg e n ei s 缈a t l yh e l p “t oc r o pr e s i s t a n c eb r e e d i n ga n dt h e i n s i g h t o fr e s i s c a n c em e c h a n i s m t h ew h e a tg e n o m ei s e x 蜘m l e l y1 a 唱ec o n t a i n i n g a p p r o x i m a t e l y1 6 ，0 0 0 m bo fd n a ，4 0t i m e gl a r g e rt l l a nd c e ，a n dc o m a i l l s8 0 r e p e t i t i v e d n a s e q u e n c e s t h a tm d k e si t e m i i l g l yla _ b o r i o u st ou s eam a p - b 觞e da p p r o a c ht oc l o n e t h eg e n e si fm e ya r ed i s t r i b u t e dr a n d o m l y 也r o u g h o u t 也e g e n o m e c l o l l i l 玛o ft 1 1 e h o m o i o g o u s 行a 舒n e m s ，l o c a 血ga n dl i i 】：k a g c8 n a l y s i sw i t l l 也ec l o n e do i 墟sp m v i d e dan e w i d e af o r 、h e a tr e s i s t a n c eg e n ei s o l a t i o n i nm i ss t u d y ，m ep f i m e r sw e r ed e s i 掣l e db a s e do n m ec o n s e r v e dd o m a i n so f t i l ec l o n e dr e s i s t a n c eg e n e sb e f o r e t h eh o m o l o g y - b a s e dc l o l l i n g f 打t h ec 锄d i d a t er c s i s 掘n c eg 胁e s 妇nw h t 、v a s 倒e dd u tc o m b i 丑i n g 谢t hf 印j d a r n p l i f i c a t i o nc d n a 吼da n d 恤r n l a la s y m m 稍cn e r i a c e dp c r i na d d i d o n ，w h e a t p a m o g e n e s i s r e l a t e dp r o t e i ng e m s w e r es c r e e n e db yr t - p c ra n dr a c e t h em a i nr e s u l t s a sf o l l o w s ： ( 1 ) t h ep r i m e r sw e r ed e s i g n 酣a c c o r d i n gt ot h ea m i n oa c i dc o n s e r v e dr e g i o n so fm e r 印o r t e dp l a r 】td i s e 豁er e s i s t a n c eg e n e se n c o d i n gp f o t e i n sc o n t a i n i n g 也en 1 i c l e o t i d e - b i n d i n g s i t e s 州b s ) a j l dl e u c i n e - r i c hr e p e a 乜q r r ) f o u rc o d i n gs e q u e n c e sn 锄e d 鹅p s j 3 一j ， 删，一2 ，配4 2 ，a n d r r w e r eo b 诅妇dr e s p e c t i v e l y 矗d mt h er n a o f t c l r 3 5c 锄了i n gt h e 工订5g e n ec o 刚钿血gr e s i s t a i l c ca g a i n s tw h c a ti e a fm s tb yr e v e 船e 仃a 艄c r i p t i o n - p 0 1 y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n 畔p c r ) 1 h er g a s 、 7 e r ei s o l a t e dc o n t a i n i n gm cc o i l s e e dm o t i f so f n b a r cs u c l l 嬲p 1 0 0 p ，k i n a s e 2 ，k i l l 豁e 3 aa d 也e 心a l l s m e n l b 啪c ed o m a j n 职矗 c o n t a i n e dt h r e el r rr 印e a tu i l i t s ，a n dh a d1 1 i g l lh o 1 0 l o g y 丽m 肋2 j ( 2 ) t h eg e n es p e c i f 沁p r i m e r sw e r ed e s i 母1 e db a 8 e do nt h es e q u e n c eo f 也er e s i s t a n c eg e n e h o m o l o g u e s 船爿2 ，t h e n ( h ec o m p l e t es e q u e n c eo fw h e 砒r e s i s t a n c e r e l a t e dg e n e 舳，哇2 、e r e o b t a i n e d 血m u 幽t l l e5 r a c ea 1 1 d3 r a c em e 协o d s t h ei e 耻肚o f 刚2w 鹅2 6 9 3 b p m c l u d i n ga1 8 8 7 b pc o i n p l e t eo p e nr c a d i n g 硒m ee n c o d i 】唱黝2p r o t e l no f6 2 8 姗i n o a c i d s ，a2 3 0 b p5 u n 扛a n s l a t i 甜r e 西o n ( 5 u r r ) ，a5 3 3 b p3 恤t r a n s l t c dr e g i o n ( 3 u t r ) a 1 1 d 2 l b pp o i y ( a ) 扭妇t h ei n i t i a t i o nc o d o na n dt l es t o pc o d o nw e r ef 0 i l l l di n2 3 3 b pa n d 2 1 1 7 b p1 0 c a t i n 窖r c s p e c t i v e ly 1 1 l ed c d u c e da m - m o i d so f & 舵p r o t e i i lc o n s i s t c do f ac c d o m a i n ，a u c l e 娟d eb i n d i n gs i 钯( n b s ) d o m a i n ，al e u c i n e r i c hr e p e a t s r r ) d o m a i n ， w l l i c hw c r et l ec o n s e r v c dd o n l a i l l so fp l 孤tr c s i s t a n c eg e n e s i tw 鼬s l l g g c s t e dt h a tt 1 1 e 跚2g e n eb eam e m b e ro fac l 船sc c _ n b s - l r rt ) ，p er e s i s t a l l c eg e n e 1 1 1 eg e eh 鹊b e e n s u b i n i t t e dt o 也eg c n b 柚kd a 协b 踮e ，w i 出嵋a c c e s s i o nn u 玎1 b e r0 fd q 2 0 5 3 5 1 1 1 嵋。铭h 2 g e n ea p p e a r e dn o tt 0b e 协山王c e db yp “c c j 玎扭打f f 耙跏口船dw a 8ac o n s t i t u t i v eg e n e 谢n l1 0 w a b u n d 班n c e 抽t h eg e l i o m eb ys e m i q l l 龃d t a 虹v e r t - p c r ( 3 ) t w o 舳g m e n t s 、v i t h5 1 1 b pa n d6 1 4 b p i n l e n g t hw e r e 锄p l i f i e d 舶mt c l r 3 5b y t h e 衄a 1 咖删ci n t 耐a c e dp c r ( r a i l - p c r ) ，1 1 1 e 触g m e n t so v e r l 印p e dw i 也t l ek n o w n r g a ls e q u e n c e s 谢t h2 9 3 b pa i l d5 0 9 b pr e s p e c t i v e l y _ a9 1 5 b ps e q u e n c ew 觞o b t a i n e d t l 啪u g he x l e n s i o nr o a lb y2 0 8 b pa t3 e n da n dl o o b pa t5 e n d b l a s t na n a l y s i s ，i t s h o w e d 也a f9 3 i d e 而c a lt 0w h e a tl e a f m s tr e s i s t 龃c eg e 工，2 锄d9 0 i d e n t i c a lt o 珩 c o n l i gw d c hc o k 曲e dd j d ( 4 ) t w op a i r so f p r i m e r 、e r ed e s i g l 屺db a s e do n 也ep 劬o g e n e s i 争r e l a t e dp r o t e i n1a n db ( 1 ， 3 ；1 ，4 ) b e t ag l u c a l l 懿e ，t w o 削l l e n g mc d n as eq _ 睇n c ew e r eo b t 如e d & mt c l r 3 5 i n d u c e db yt l ep “c c 加如f r f f f c 拥口b yr t - p c ra l l dr a c e af h l ll e n g t l lw h e a t 州h o 辨n c s i s r e l a t e dp r o t e i nlg 黜n 黜e d 艄门w 船7 5 6 b pi nl e n g t i l ，i n c l u d i n ga4 9 5 b pc o m p l e t co p e n r e a d i n g 矗锄ee n c o d i n g1 6 4 锄i n o i d s ，a1 4 7 b p5 l l l l 昀n s i a t e dr e g i o n ( 5 u r r ) ，a1 5 5 b p 3 u n 们n s l a t e dr c g i o n ( 3 u i r ) 锄d2 l b pp o l y ( a ) t a i l s 1 h ed e d u c e d 吼i n oa c i d s c o m a i n e ds c pc o n s e r v e dd o m a i l l sw l l i c h 、a sr e l 删t op l a n td e f e n s es y s t e m s t h e d e d u c e d 锄i n oa c i ds e q u e n c es h o w e dc l o s eh o i n o l o g yt op r 一1 l i k ep r o t e i 强w 1 1 i c hh a v e b e e ni s o l a t e df r o mm a n yp l a n t s s o u m e mb l o t 础c a t e dt h a t 廿l ew h e a tg e n o m ec o n t a i n e d s i 喇ec o p yo f 艘j 2g e n e ；a 蛐il e n g c l lw h e a tb ( 1 ，3 ；1 ，4 ) b e 协g l u c a n a s eg e n en 锄e d 尸r 弭w a s1 3 4 0 b pi nl e n g 氓w h j c hi n c l u d e do n ec o m p l e t eo p e nr e a d i r i g 舶眦ee n c o d i n g 3 0 3 锄i n oa c i d s ，a3 2 3 b p3 硼昀n s l a t e dr e 垂0 n ( 3 u 1 同a n d2 9 - b pp o l y ( a ) t a i l s t h e i 1 1 i t i a t i o nc o d o na n ds t 叩c o d o n 嗍f o u n di n7 7 b pl o c t 王sa 1 1 d9 8 8 b p1 0 c l l s 麟i p e c t i v e l y t h ed e d u c e d 姗i 肿a c i ds e q u e n c es h o 、v e dc l o s eh o m o l o g yt ob e 协酉u c 8 i l a s ep r o t e i n s w h i c h1 1 a v cb e i s 0 1 a t c d 舶mw h e 砖b a d e y ，姐dm a n yo t h e rp l a l l t s t h ed e d u c e da i i l i o a c i d sc o n t a i n e dg l y c 0 h ) d r o1 7c o n s e e dd o m a 证sw b j c hw 硒r e l a t c dt ob e t a 斟u c a n 必e s o 酣1 锄b l o ti n d i c a t e d 也a t 也et c id 5g e n o m ec o n t a i ds e v e r a lc o p i e so f 徘纠g e n c k e yw o r d s ：w h e a tl e a fr i l s tr e s i s t a r 嗽g e 雎；h o m o l o g u es e q u e n c e ；p a l o g c n e s i s r e l a t e d p m t e i n ；b ( 1 ，3 ；l ，4 ) b e t ag l u c 粗鹊e ；r a p i d 出n p l i f i 翻融o nc d n ae n d ；t l l e m 戚觞舯e t r i c i n t e d a c e dp c r 棼j e y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得基些盔些盘燮或其他 教育机构的学位或证书面使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明井表示谢意。 学位论文作者签名：玉幽敷签字日期：西年荔月w 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑韭壅些蠢茎有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借澜。本入授权亟兰堡壅些叁茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学雠文储繇王尚教 导师躲厶叫 签字日期：谢年6 月加目签字目期：硼年5 月询目 学位论文作者毕业后去向； 工作单位： 通讯地址： 电话； 邮编： t c l r 3 5 小麦抗病相关基因的克隆及分析 引言 小麦是我国主要的粮食作物，小麦病害是影响农业生产持续、稳定发展的主要因素。由小麦 叶锈菌( 尸“c c 棚白揪f 曲) 引起的小麦叶锈病是影响世界小麦稳产高产的重要病害之一，也是影 响我国小麦生产的重要因素。该病害在世界各产麦区均有发生【1 1 2 】，严重时可造成4 0 的产量损失 9 】。长期以来，小麦叶锈病的控制主要依赖于抗病品种的培育和推广。然而，小麦叶锈病菌毒性 基因的产生及劣势小种上升为优势小种，经常导致品种抗叶锈性的丧失，因此，持续筛选抗病基 因和培育抗病品种是今后主要的任务。耍充分利用对叶锈菌的遗传抗性，则必须首先了解和鉴定 常用种植品种和推广品种中的抗性基因，并将不同的抗性基因组成抗性基因库，从而避免含有单 一抗原品种的大面积推广。抗性基因的表达依赖于寄主和病原茵互作的遗传学、温度条件、植株 发育阶段及抗性基因和小麦基因组中的抑制因子或与其它抗性基因间的互作。由于叶锈菌造成抗 病基因抗性不断“丧失”，所以持续不断地研究、发现和利用抗叶锈病基因是今后植物病理和植 物育种工作的一项长期而且重要的内容。 1 植物抗病基因同源序列研究进展 目前，利用图位克隆法、转座子标签技术和同源序列法在拟南芥、番茄、水稻、玉米、烟草、 小麦、亚麻、大麦等l o 多种植物中已克隆了6 0 多个抗病基因1 4 j 。研究发现，这些r 基因氮基酸 序列之间存在相同的保守区域，如亮氨酸拉链( k u c i n ez i p p e r ，l z ) 、核苷酸结合位点( n u c l e o t i d e b i n d i n gs i t c ，n b s ) 、富含亮氨酸重复( l “c i n e - r i c hr e p e a t s ，l r r ) 、以及与果蝇t o l l 蛋白及哺乳 动物白细胞介素。l 受体( t o l l 柚d i n t e r i e u l ( i n 1r e c e p t o r ，t i r ) 的细胞外的相似区域等( 图1 ) 。根 据抗病基因编码蛋白质结构特征可将抗瘸基因分为六类： 第一类，抗病基因产物为含有富亮氨酸重复的跨膜受体蛋白。即属l r r t m 型抗瘸基因。包 括蕃茄的( 2 ，呼4 ，够5 哥9 和胁r 9 _ 4 e 、苹果的胁啪及甜菜抗线虫基因h 秽”。l r r 结构域 可能与激发子识别有关，跨膜结构域将蛋白锚定在膜上，可将识别信号传递给胞内其它的信号传 导蛋白。 第二类，抗病基因产物均含有核苷酸结合位点和l r r 的胞内受体蛋白：即为u 汛- n b s 型抗 病基因，也是抗病基因最大的一类，依据其氨基和羧基端的结构又可分为五亚类： 第一亚类t m n b s l r r 。以拟南芥基因兄p 乃、亚麻抗锈病基因和三6 为例，其中氨基端 类似果蝇t o 受体和哺乳动物白细胞介素- l 受体的胞外域i n t e r l e u l ( i nr e c e p t o r 的结构( t i r ) 类占 n b s l r r 总数的7 5 ，拟南芥基因组中t m n b s - l r r 占n b s - l r r 类基因的6 0 ，而禾本科几 乎没有这一类结构p 1 ； 第二亚类c c n b s u 浪。以拟南芥抗痛基因删和艘船为例，水稻基因组c c - n b s - l r r 基因有5 9 5 个，而仅有5 个1 1 r 栅s l r r 弱同源的序列： 第三亚类n b s u 讯氨基端没有特殊结构，以辣椒脚和莴苣d 卅，为例； 第四亚类为t i r - n b s u 佩- n l s w r k y 代表是拟南芥兄醛，求有核定位信号序列和结合抗 病反应基因启动子w 盒t g a c 的w r k y 结构1 6 j ： 河北农业大学博士学位论文 第五亚类是n b l r d 以水稻稻瘟病抗性基因胙以为代表，其羧基端是亮氨酸富集区，但不 是u l r 结构”j 。 第三类，抗病基因产物为丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶( s e r i n e - t h r e o r i n ek i n 8 s e ，s t k ) ，这类基因 中最具代表性的是著茄尸幻基因。其编码s t k 在细胞质内直接与病原“r p t 0 基因产物相互作用。 s t k 可能参与蛋白质的磷酸化作用。因此在细胞间的信号传递过程中起作用。 第四类，抗病基因编码跨膜受体激酶，主要是五以j 基因。其产物即具有胞外受体结构域 ( l r r ) 又具有蛋白激酶( s t k ) 结构域，二者之间通过跨膜结构域( t m ) 相连。 第五类，抗病基因编码一个依赖于n a d p h 的h c 毒索还原酶，能解除病原菌形成的h c 毒 紊而表现抗性包括玉米中的胁f j ，岛n 2 基因，是己克隆的抗病基因中唯一不符合基因对基因 学说的抗病基因。 第六类，抗痛基因在结构上与以往克隆到的抗病基因无同源性，如大麦m 上d 基因，其含有6 个跨膜螺旋j 。 图1 根据d 序列推测的几种抗精基因产物结构示意图m f i 量lt h c 唧o f t h c 咖c t u o f s e v c r a l 瑚i 咖g e n cp m d u c td e d u c e da c c o r d i n g t 0 恤ed n a s e q u c n c c s - 总之，通过对克隆的抗病基因的结构分析，可看出除砌f ，胁以和埘7 0 外，其它抗病基因均 存在保守结构，说明不同植物抗病基因对不同病原有相似的信号。根据植物抗病基因保守序列结 构特点设计引物来扩增基因组d n a 或c d 悄a 可获得抗病基因类似序列( r e s i s t a n c eg e n ea 1 1 a l o g y s ， r g a s ) 。r g a 既可作为一种基于特异引物p c r 的d n a 标记，其本身又可能是潜在的抗病基因， 用这种扩增技术可以在未知的植物基因组d 1 q a 或c d n a 中扩增和分离抗病基因同源序列，为筛 选抗病基因或抗病相关基因提供了一种有效手段。同源序列法是基于p c r 的一种方法，是一种 非常理想化的方法。也是基因克隆非常便捷的选择。许多i 将a 的获得加快了克隆全长功能基因 t c l r 3 5 小麦抗病相关基因的克隆及分析 的进程a 目前利用同源序列法或以同源序列法结合图位克隆法已成功克隆多个抗病基因。 d o d d s 甜口f ( 2 0 们) i l w 利用同源序列法从总d n a 中扩增抗病基因的保守结构来研究亚麻的 抗病基因家族的进化机制许多与抗病信号传导途径有关的基因的分离克隆也用到同源序列 法。目前利用同源序列法已成功克隆了大麦的埘口加彻o “、埘融2 1 、肘7 口j 基因、玉米 的母0 _ d “”、马铃薯的r 妇“”、亚麻的1 等抗病基因。另外，番茄的胄j 、兄日1 基因以 及d ，0 “基因是以同源序列法结合图位克隆法获得成功克隆的。 目前，利用已知抗病基因的保守序列设计引物进行p c r 扩增，已经在大豆【1 9 】、马铃薯8 “、 小麦、玉米口”、番茄【2 2 】、莴苣【2 3 l 、拟南芥1 2 4 】、水稻【2 5 】、大麦8 ”、甘蓝型油菜1 2 6 1 、甘蓝、葡 萄【2 8 l 、甜瓜口”、鹰嘴豆【3 0 】、苹果p ”、甜菜f 3 2 1 、陆地棉吲、玫瑰等不同植物中，分离到了许多 与已知r 基因同源的d n a 序列。其中小麦抗叶锈病基因上r d 的分离，是利用同源序列法进行抗 病基因克隆的首次报道【1 8 】。自2 0 0 3 年以来，仅在国内已经在水稻、大豆、黑子南瓜1 、 蔟毛麦、桃、甘蓝4 0 3 和柚等植物中分离到了许多抗病基因同源片段。 d e n ga 1 1 do m i t c e r ( 2 0 0 3 ) 1 利用受体激酶的保守结构从柑橘中克隆受体激酶结构的基因， 他们依据水稻白叶枯病抗性基因觞2 j 和番茄青枯病抗性基因尸船激酶的保守序列，在保守的亚 结构i 和i 的保守氨基酸序列设计引物，克隆2 9 个受体激酶的同源基因，再利用p r i m e r - w a l k j n g 的方法从b a c 克隆中获得全长的基因。还可以利用已知基因的序列扩增同源片段，使用p c r 扩 增法，马铃薯删的克隆即是将臌j 的同源序列同马铃薯病毒x 衣蛋白( r 妇的激发子) 共转化 来观察过敏反应的发生从而确定候选基因“。 2c d n a 末端快速扩增技术 获得已知序列的两侧序列，进而获得该基因的全长最常用的方法主要有两种：一种是常规方 法，即利用已知序列制备的探针筛选基因组文库或c d n a 文库，通过染色体步行获得该片段的两 侧未知序列，这种方法首先要制各基因组文库或c d n a 文库，再进行杂交，然后克隆、测序，需 要时闻长、花费大，所以目前比较普遍采用p c r 的方法一j ，如反向p c r ( r e v e r s e p c r ) 、热不对 称交错p c r ( n 他玎n a la s y m m e 矾ci n t e r dp c r 。t a i lp c r ) 、c d n a 末端快速扩增( r a p i d a m p l i f i c a t i o no f c d n ae n 出，i u c e ) 等。 r a c e 技术是一种从低丰度的转录本中快速扩增c d n a5 和3 味端的简单有效的方法广泛 用于已知功能基因片段的进一步延伸和全长c d n 的克隆m “、构建富含全长c d n a 的高质量 的文库，以及利用生物信息学资源快速钓取多个候选同源基因【4 7 1 等。3 - r a c e 的原理是利用绝 大部分m r n a 的3 味端具p 0 1 “a ) 尾以o l i g o ( d t ) a d a p t o r 反转录总r n a ，然后用待分离基 因特异引物g s p l 和接头引物，与g s p 2 和接头引物进行巢式p c r 扩增该基因的3 端。5 r a c e 原理：经典5 r a c e 是用待分离基因的反向特异引物g s p 反转录总r n a ，在未知的c d n a 的5 ，端加上一个接头，然后再用o s p 和接头引物经p c r 扩增出待分离基因的5 端。 另一种新型5 r a c e c r a c e ，其原理是设计待分离基因5 磷酸化的反向特异引物g s p o ， 并在其远端和近端分别设计两条反向特异引物g s p l 和g s p 2 与两条正向特异引物g s p 3 和 g s p 4 。用g s p o 反转录总r n a ，然后通过t 4r n a 连接酶环化c d n a ，并以此为模板用g s p l 和g s p 4 与g s p 2 和g s p 3 进行巢式p c r 扩增出待分离基因的5 端m i 。用该法克隆异源基因的 河北农业大学博士学位论文 一般步骤是( j ) 从g e n b a n k 等公共数据库中，比较分析待克隆基因的保守序列区段；( 2 ) 以 此保守序列设计特异或简并引物，从待测植物组织的c d n a 中进行p c r 扩增；( 3 ) 通过r a c e 技术获得e d n a 的5 。和3 端，并与己知基因序列进行同源性比较最后经转化鉴定是否为待 分离的基因。肖月华等( 2 0 0 2 ) h 9 】从棉花胚珠的c d n a - a f l p 片段中选取一个与拟南芥类l r r 抗病蛋白( l r r r l ) 序列相似的片段。用f 法c e 方法延伸其3 端和5 。端未知序列，得到一个棉 花类l r r 抗病蛋白的全长c d l q a 序列。 自f r o h m a n 发明出r a c e 技术以来，r a c e 已成功地应用于许多基因的分离，具有快速、 简便、经济、实用性强等许多优点，它可在短期内获得全长的c d n a 。尤其c r a c e 无须去帽 或加锚等烦琐步骤，且全部使用特异引物，因而几乎不存在产生非特异产物的可能，这些优 点使得c r a c e 成为获取57 端全长序列更为有效的手段。但该方法对反转录成的c d n a 要求较 高，而且由于5 。端不全和易产生大量扩增背景，为全长c d n a 的获得造成困难，需进行较多 单克隆的测序。但随着r a c e 的不断改进和完善，优化条件下p c r 扩增效率和忠实性的提高， 及p c r 产物克隆技术的迅速发展，相信r a c e 必将在植物基因克隆及基因表达研究中发挥越 来越大的作用。 近年来r a c e 己被成功地应用于植物基因克隆中，其主要用途具体表现在以下几方面：( 1 ) 获取全长c d n a 【“州；( 2 ) 制备筛选c d n a 文库的探针；( 3 ) 克隆己知片段的旁侧序列【s 4 】： ( 4 ) 分离调控元件或选择性剪接等特殊转录物p ”。 3t a i l p c r 研究进展 常规的p c r 只能扩增出两引物之间的d n a 区域，难以对已知d n a 序列侧翼未知序列进行 扩增。热不对称交错p c r ( m e 咖a l 拈y m m e t r i ci n t e 订a c e dp c r ，简称1 a i l 。p c r ) 1 5 6 】是一种分离与 已知序列邻近的未知d n a 序列的分子生物学技术，由l u 和w h i t e r 首先研究并报道。最初用于 分离p 1 与y a c 末端。1 a i l p c r 技术能够快速分离到目标序列，其技术简单易行反应灵敏， 重复性好，能够在较短的时间内获得目标片段，已经在分予生物学研究中得到广泛的应用。在分 子生物学领域，利用该技术分离出的d n a 序列可以用作绘制遗传图谱的探针，也可以直接测序， 被证明是十分有效的一种方法。 其基本原则是利用多个嵌套的转座子插入序列特异引物和一个短的随机筒并引物( a r b i 沁 d e g 朗e r 砒e p r i m e a d ) 组合，以突变体基因组d 1 q a 为模板进行多次p c r 反应，采用高温特异性 扩增( t h 值：5 7 石0 ) 与低温随机扩增( 1 h ；4 4 4 6 ) 相闯进行的方法。最终获得转座子插 入侧翼区特异性片段，并作为探针筛选分离基因，该方法可降低非侧翼区特异产物的背景，己在 拟南芥和水稻中获得了成功。 1 a 。p c r 技术有以下优点：( 1 ) 简单。只要设计好引物即可以用基因组d 1 q a 作模板直接 筛选到目标序列，节省了p c r 反应前后的许多费时费力的操作程序。对纯度要求也不高。( 2 ) 特异性高。用短的简并性引物和长的特异性嵌套引物相组合，通过不对称的温度循环和分级反应， 使反应体系有利于特异性引物的扩增，最终的扩增产物中目的片段占绝对优势，反应产物可以直 接做探针标记和测序模板。( 3 ) 高效灵敏。使用任何一个a d 引物，在6 0 8 0 的反应中能够 产生特异性产物。运用不同的a d 引物就能够有效地获得目标片段。( 5 ) 不涉及连接反应，反应 4 t c l r 3 5 小麦抗病相关基因的克隆及分析 产物准确可靠，重复性好。基于以上优点，现在这种技术己成为分子生物学中的一种强大工具。 但是这种反应需要较多的引物组合，反应条件设置比较精细，由于a d 引物存在有限结合位点， 对于个别的侧翼序列，郎使使用不同的简并引物也难以扩增到阳性结果。 目前，已成功地从p l 、y a c 和b a c 克隆中分离获得插入末端的d n a 序列和拟南芥的t _ d n a 侧翼序列5 “捌。y 抽g 等【捌利用该技术从水稻b a c 克隆中分离到了插入序列；罗丽娟等| 6 0 】利用该 方法分离到了t d n a 标记的水稻( 0 啦口疗wl f c v f 勃n 6 a m ) 突变体侧翼序列：方进等【6 1 谴 过1 a i l p c r 技术扩增出携带x 2 2 j 基因的t - d l n a 的侧翼序列。 4 植物病程相关蛋白基因的研究进展 植物病程相关蛋白( p a l l l o g e n s i s r e l a l e dp m t e i n s ，p r p ，r p s ) 是指植物在病理或病理相关环境 下诱导产生的一类蛋白。1 9 8 9 年在西班牙号召的植物病程相关蛋白研讨会提出“病理或病理相关 的环境”是指胁迫环境或逆境，如某些病原物的侵染、某些化学制剂的应用等。在自然衰老期问 出现的少量蛋白或伤口诱发的大量蛋白常常伴随着对病原的反应，也称病原相关蛋白。编码p r 蛋白的基因称为p r 基因。p r 蛋白是在被病原菌侵染的植物中发现的，其主要的功能与植物的抗 病性相关。因此，关于植物p r 蛋白及其基因表达的研究颇受重视。p r 蛋白是首先在烟草对t m v 抗性反应( h r ) 中被发现的即j ，而且p r 蛋白还在发生过敏反应的植物上部来接种叶，曩中出现， 与植物系统获得抗性( s a r ) 发生有关，是植物产生s a r 的重要指标【6 ”。迄今为止描述的几乎 所有系统获得性抗性( s a r ) 都与p r p 积累有关。但是，p r 基因表达与 m 或s a r 之间的相关 性并不是绝对的，在许多情况下不存在相关性。例如，用a b a 注射烟草茎部可以诱导烟草对t m v 的系统获得抗性，但并不刺激p r 蛋白的产生”1 。 大多数p r p 具有c h i 廿n a s e 和b 1 ，3 9 1 u c a n a s e 活性，在体内和体外均显示出抗真菌活性【6 ”。 p r p 直接与病菌作用，其水平与病原菌数量呈正相关i ，h 心抑制剂( k i n e t j n + n a a ) 能使病 情显著加剧【6 ”。p r p 最早在烟草中发现，后来在3 0 多种植物中都有发现。目前p r _ p 的分类主要 依靠其氨基酸顺序和血清学关系的比较，然后每一种p r p 再按照它们在s d s - p a g e 电泳中的迁 移率进行编号。p r p 的编码基因仍按照植物基因命名委员会规则命名。已发现的p r p 归类为1 7 个属，即p r - l 到p r - 1 7 。 近年来，p r 基因的表达、核苷酸序列分析、转基因植物在病原物和植物寄主互作研究中的 作用及其在抗病育种中的应用颇受重视。开展p r 蛋白的合成机制及功能研究，从细胞和分子水 平研究p r 蛋白的功能及其编码基因的表达、遗传规律和植物诱导抗性，并与植物常规抗病育种 紧密