（农业昆虫与害虫防治专业论文）干扰cytc表达对afmnpv诱导斜纹夜蛾细胞凋亡的影响.pdf

硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：袁因 日期：2 0 1 1 年6 月日 学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解华中师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华中师范大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅； 学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手 段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定) 保密论文注释：本学位论文属于保密，在年解密后适用本授权书。 非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：寅闰 日期：悍6 月f 日 导师签名： 日期：劲 日 本人已经认真阅读“c a m s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a m s 高校学位论文全文数据库中全文发布，并可按“章程 中的 规定享受相关权益。回重途塞堡童卮滥厦；旦圭生；旦二生；旦三生筮壹! 作者签名：丧国 日期： 矽，阵6 月1 日 导师签名： 日期：乙i 日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 中文摘要 c y t c 是一类水溶性蛋白，是由核基因编码合成，依附在线粒体内膜表面。c y t c 作为一种载体，在呼吸链电子传递过程起重要作用。一旦c y t c 功能出现障碍或是 c y t c 缺失，将会致使呼吸链功能出现异常，进而引起a t p 缺乏，最终使细胞出现 死亡。此外，c y t c 由线粒体释放至细胞质也是线粒体介导凋亡信号转导的最重要 事件，即通过c a s p a s e 等途径诱导细胞凋亡。尽管在哺乳动物细胞凋亡研究中已经 证实c y t c 能由线粒体释放至细胞质进而影响细胞凋亡，但昆虫细胞凋亡中是否也 存在同样的途径并不没完全阐明。在双翅目昆虫细胞凋亡研究中，关于c y t c 的作 用存在一些不同结果。到目前为止，普遍性认为c y t c 不会从线粒体释放至细胞质， c a s p a s e 的活化与细胞凋亡也不依靠细胞c y t c 。然而，鳞翅目昆虫细胞凋亡的研究 结果却与双翅目体系相反的结论。如：利用2 d e x o r y d r i b o s e 诱导舞毒蛾i p l b l d f b 细胞的细胞凋亡，发现了c y t c 的释放和c a s p a s e 3 的活性；紫外线诱导s f 9 细胞凋 亡，w e s t e r n 杂交检测到c y t c 由线粒体释放至细胞质，且能激活相关的凋亡蛋白。 同时，杆状病毒p 3 5 基因的表达会抑制c y t c 从线粒体释放出来。 本实验室利用杆状病毒处理鳞翅目斜纹夜蛾s l - 1 细胞，c y t c 会由线粒体释放 至细胞质中，且能激活c a s p a s e 3 的活化。但是这些研究主要建立在w e s t e r n 杂交上， 需要利用其他方法验证。本实验室已利用r n a i 技术研究c y t c 在s l - 1 细胞凋亡体 系的作用。研究发现，利用r n a i 沉默s l - 1 细胞的c y t c 表达后，再经杆状病毒处 理细胞，c y t c 的m r n a 水平降低、c a s p a s e 3 的活性有所降低等。 在前期的研究基础之上，我们继续采用r n a i 技术进一步研究c y t c 在鳞翅目 昆虫细胞凋亡中作用。利用体外转录的方法，合成相应的d s r n a ；用双染( a n n e x i n v - f i t c 和p i ) 对经r n a i 处理的细胞进行细胞凋亡率的检测；经r n a i 干扰，病毒 诱导凋亡细胞后，分析c a s p a s 9 的活性等。 从形态上，利用显微镜观察经d a p i 染色的细胞，我们可以发现r n a i 沉默c y t c 的表达，细胞凋亡数量减少，凋亡小体和半月牙变少等。同时，不同时间段( 2 4 h 、 4 8 h 和7 2 h ) 转染d s r n a ，应用d n a 电泳检测发现转染c y t cd s r n a 的细胞d n a 片段化程度相对较低。 采用a n n e x i nv - f i t c 和p i 对处理细胞进行双染色。流式细胞仪检测到转染 e g f p d s r n a 4 8 h 、c y t cd s r n a 4 8 h 然后接种病毒和只加病毒处理的细胞凋亡率分别 约为6 7 4 9 、5 1 8 8 和6 3 2 。 利用c a s p a s e 9 的特异性底物与提取蛋白反应后，荧光分光光度计测值。正常 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 细胞的c a s p a s e 9 值很低。转染e g f pd s r n a 4 8 h 、c y t cd s r n a 4 8 h 然后接种病毒和 只加病毒处理的c a s p a s e 9 活性约分别为1 0 8 3 、7 2 和1 0 2 3 。显然，沉默细胞色素 的表达抑制c a s p a s e 9 活性说明c a s p a s e 9 活性是细胞色素c 依赖性的，这是鳞翅目 昆虫凋亡细胞中首次关于细胞色素c 与c a s p a s e 9 关系的报道。 通过显微镜形态观察、d n a 电泳、流式细胞仪检测和c a s p a s e 9 活性的测定结 果，我们可以初步断定c y t c 在a f m n p v 诱导的鳞翅目昆虫细胞s l - 1 细胞凋亡具 有重要作用。因此，我们认为细胞色素c 在哺乳动物和鳞翅目昆虫细胞凋亡中具有 相似的功能。 关键词细胞色素c ；细胞凋亡；r n a 干扰；杆状病毒 ab s t r a c t c y t o c h r o m eci s ac l a s so fw a t e r - s o l u b l ep r o t e i n ，w h i c hi ss y n t h e s i z e db yn u c l e a r g e n e sa n da t t a c h e dt ot h em i t o c h o n d r i a l i n n e rm e m b r a n es u r f a c e 舡ac a r r i e r , c y t o c h r o m e cp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h ep r o c e s so fe l e c t r o nt r a n s f e ro ft h er e s p i r a t o r yc h a i n o n c e c y t o c h r o m ecd y s f u n c t i o n a lo rc y t o c h r o m ecd e l e t i o n ，t h ef u n c t i o no fr e s p i r a t o r yc h a i n w i l lb ea b n o r m a l t h e r e b yc a u s eal a c ko fa t pa n de v e n t u a l l ye e l ld e a t ho c c u r i na d d i t i o n ， c y t o c h r o m er e l e a s e sf r o mm i t o c h o n d r i at ot h ec y t o s o lw h i c hi st h em o s ti m p o r t a n te v e n t s o fm i t o c h o n d r i a - m e d i a t e da p o p t o t i cs i g n a lt h a tc a s p a s ep a t h w a yi n d u c e sa p o p t o s i s a l t h o u g hs t u d i e si nm a m m a l i a nc e l l sh a v ec o n f i r m e dt h er e l e a s eo fc y t o c h r o m ecf r o m m i t o c h o n d r i at oc y t o p l a s m ，t h e r e b ya f f e c t i n ga p o p t o s i s ，b u ta p o p t o s i si ni n s e c tc e l l st h e s a m ew a yw h e t h e ro rn o tt h e r ea r en o tf u l l ye l u c i d a t e d i nt h es t u d yo fa p o p t o s i so ft h e i n s e c t ，r o l eo fc y t o c h r o m ech a ss o m ed i f f e r e n tr e s u l t s t h es t u d i e si nd r o s o p h i l as u g g e s t t h a tc y t o c h r o m eci sn o tr e l e a s e df r o mm i t o c h o n d r i ad u r i n ga p o p t o s i si nt h a ti n s e c t ，a n d t h a tc y t o c h r o n ecp l a y sn or o l ei nc a s p a s ea c t i v a t i o ni nt h e s ec e l l s i nc o n t r a s tw i t h r e p o r t si nd r o s o p h i l a ，t h er e l e a s eo fc y t o c h r o m ecf r o mm i t o c h o n d r i aa n dc o n s e q u e n t l y a c t i v a t i o no fc a s p a s e - 3w e r ed e m o n s t r a t e dd u r i n gl e p i d o p t e r a nc e l la p o p t o s i s t h e r e l e a s eo fc y t o c h r o m ecf r o mm i t o c h o n d r i ai nu l t r a v i o l e t i n d u c e ds p e d o p t e r af r u g i p e r d a s f - 9c e l l sw a so b s e r v e db yw e s t e r nb l o t t i n gs of a r ，t h e r ei su n i v e r s a lv i e wt h a tc y t - cc a n n o tr e l e a s e sf r o mm i t o c h o n d r i at ot h ec y t o s o l ，a n dc a s p a s ea c t i v a t i o na n da p o p t o s i sd i d n o td e p e n do nc y t o c h r o m ec w eh a de a r l yf o u n dt h a tc y t o c h r o m ecw a sr e l e a s e df r o mm i t o c h o n d r i at o t h e c y t o p l a s m a n dc a l la c t i v a t e d a p o p t o s i s r e l a t e dp r o t e i n s i n u n d e r g o i n ga p o p t o t i c s p o d o p t e r al i t u r as l - 1c e l l si n d u c e db yb a c u l o v i r u s h o w e v e r ，t h e s e s t u d i e sw e r em a i n l y b a s e do nt h ew e s t e r nb l o t t i n g i no r d e rt op r o v i d ef u r t h e ra ne v i d e n c eo nt h er o l eo fc y t o c h r o m eco na p o p t o s i s i n d u c e dw i t hb a c u l o v i m sa f m n p vi nl e p i d o p t e r a nc e l l sw eu s e dt h et e c h n i q u eo fr n a i n t e r f e r e n c et oi n v e s t i g a t ea ne f f e c to fi n t e r f e r i n gc y t o c h r o m ec p r e l i m i n a r ys t u d i e sh a v e d e m o n s t r a t e dt h a ts c l i e n c i n gt h ee x p r e s s i o no fc y t o c h r o m ecc a ni n h a b i ta p o p t o s i s i n d u c e db yb a c u l o v i r u sa f m n p vs l - l a n dt h em r n al e v e lo fc y t o c h r o m eci nt h ec e l l s t r e a t e dw i t hd s r n ad e c r e a s e da n dc a s p a s e 一3a c t i v i t yd e c r e a s e d i i i o nt h eb a s i so fp r e v i o u sr e s e a r c h ，h e r ew ec o n t i n u et ou s er n a it od e e p l yr e s e a r c h r o l eo fc y t o c h r o m eci na p o p t o s i so fl e p i d o p t e r a ni n s e c t s d s r n a sc o r r e s p o n d i n gt ot h ec o d i n gr e g i o n so fc y t o c h r o m ecw e r et r a n s c r i b e di n v i t r oa n dt h et r a n s c r i p t i o np r o d u c t i o n sw e r ei d e n t i f i e db ye l e c t r o p h o r e s i s s l - 1c e l l s t r e a t e dw i t hd s r n aa tv a r i o u sl e n g t h so ft i m ea r ei n f e c t e db ya f m n p v f o r1 0 h a n dt h e n v i s u a l i z e db yw i t hd a p is t a i n i n g u n d e rf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ，t h en u m b e ro f a p o p t o t i cc e l l si n d u c e d w i t ha f m n p va n da p o p t o t i cb o d i e sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya n d d e c l i n e dw i t hd s r n at r e a t m e n tt i m ec o u r s e d n a sw e r ee x t r a c t e df r o mc e l l st r a n s f e c t e dd s r n aa td i f f e r e n t t i m ep e r i o d s ( 2 4 h ，4 8 ha n d7 2 h ) a n da n a l y z e do i lg e le l e c t r o p h o r e s i s l e v e lo fd n af r a g m e n t a t i o no fc e l l s w h i c ha r et r a n s f e c t e dw i t hc y t o c h r o m ecd s r n ai sl o w e rt h a nt h a tc e l l st r e a t e dw i t h o u t d s r n a t od e t e c tq u a n t i t a t i v e l ya p o p t o t i cc e l l s ，a f t e rc e l l st r e a t e dw i t hd s r n af o r4 8 ha n d i n f e c t e dw i t ha f m n p vc e l l sf o r1 0hw e r es t a i n e dw i t ha n n e x i nv - f i t ca n dp i r a t eo f a p o p t o s i si nc e l l st r e a t e dw i t hd i f f e r e n tt r e a t m e n t sw a sd e t e c t e db yt h ef l o wc y t o m e t r y f c m a n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ea p o p t o t i cr a t i oi nc e l l si n f e c t e dw i t ha l o n ea f m n p v w a s 6 3 2 ，i nc e l l st r e a t e dw i t he g f pd s r n ap l u sa f m n p vw a s5 1 8 8 a n di nc e l l st h e t r e a t e dw i t hc y t o - d s r n ap l u sv i r u sw a s6 7 4 9 t h ec a s p a s e 一9a c t i v i t ya s s a yp e r f o r m e do nt h ec e l l si n c u b a t e di nt h ep r e s e n c eo f d s r n aa n dv i r u s e sr e v e a l e das i g n i f i c a n t l yd e c r e a s ei nc a s p a s e - 9a c t i v i t yw i t hr e s p e c tt o t h ec o n t r o lc e l l st r e a t e dw i t he g f pd s r n aa n dw i t h o u tc y t o c h r o m ecd s r n aa n do t h e r t r e a t m e n t s t h i si st h ef i r s tr e p o r ta b o u te f f e c to fs i l e n c i n gc y t o c h r o m ece x p r e s s i o no n t h ea c t i v i t yo fc a s p a s e - 9i nl e p i d o p t e r a ni n s e c t ，i n d i c a t i n gc y t o c h r o m eci sa s s o c i a t e d w i t ha c t i v i t yo fc a s p a s e 一9 t h e s er e s u l t ss t r o n g l yd e m o n s t r a t et h a tc y t - ci se s s e n t i a lf o ra f m n p v - i n d u c e d a p o p t o s i si ns p o d o p t e r al i t u r ac e l l sa n dc a s p a s e 9a c t i v a t i o ni sd e p e n d e n t o nc y t o c h r o m e ca n dc y t o c h r o m ecp l a ya ni m p o r t a n tr o l ef o ra p o p t o t i cs i g n a l i n ga n dm a yb er e q u i r e d f o rl e p i d o p t e r a ni n s e c ta p o p t o s i s w es p e c u l a t et h a tt h er o l eo fc y t o c h r o m eci n l e p i d o p t e r a nc e l l sa n dm a m m a l i a nc e l l sa p o p t o s i si sh o m o l o g o u s k e yw o r d ：c y t - c ；a p o p t o s i s ；r n as i l e n c i n g ；a f m n p v i v 硕士学位论炙 m a s t e r st h e s i s 中文摘要 a b s t r a c t 目录 1 前言” i i i i l 1 1r n a i 简介一1 1 1 1r n a i 的概述1 1 1 2r n a i 的作用机制2 1 2r n a i 的应用及未来需要解决的问题”2 1 2 1r n a i 在线虫和果蝇研究方面的应用3 1 2 2r n a i 在农作物方面的应用一3 1 2 3r n a i 在病毒和害虫控制的应用3 1 2 4r n a i 在医学方面的应用”3 1 2 5r n a i 未来需要解决的问题4 1 3 细胞凋亡的概述”4 1 4 细胞凋亡的机制4 1 4 1 外部通路( 死亡受体通路) 5 1 4 2 内部通路( 线粒体通路) 5 1 4 3 执行通路6 1 4 4 穿孔素颗粒酶通路7 1 5 细胞凋亡的检测7 1 5 1 显微镜检测法7 1 5 2d n ai 洚解”8 1 5 3 流式细胞仪检测细胞凋亡8 1 5 4c a s p a s e 的活性检测8 1 5 5 核酸酶分析”8 1 6 细胞凋亡与医学“9 1 7 细胞色素c 与昆虫细胞凋亡9 1 8 本实验的研究背景、目的1 1 一， 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 实验材料m 1 2 2 1 实验试剂1 2 2 1 1 细胞培养基1 2 2 1 2 病毒1 2 2 1 3 细菌培养培养基1 2 2 2 细胞系、病毒、质粒和菌株。1 3 2 3 酶及其它常规试剂1 3 2 4 常用溶液及配制1 3 2 5 实验所用仪器1 4 3 实验方法 川川 1 5 3 1c y t - cd s r n a 的合成”1 5 3 2e g f pd s r n a 的合成1 5 3 2 1 质粒提取1 5 3 2 2p c r 扩增1 5 3 2 3p l i t m u s c g f p 的构建1 6 3 2 4 阳性克隆的筛选1 6 3 2 4 1 感受态细胞的制备1 6 3 2 4 2 重组质粒的转化1 6 3 2 4 3 阳性克隆的鉴定1 6 3 2 5d s r n a 的合成1 7 3 3 细胞学形态观察1 7 3 4d n a 电泳1 7 3 5 流式细胞仪检测。1 7 3 6c a s p a s e 9 活性的检测”1 7 4 实验结果1 8 4 1c y t - cd s r n a 的合成1 8 4 2e g f pd s r n a 的合成1 8 4 2 1e g f p 的制备1 8 4 2 2 重组质粒p l i t m u s e g f p 的构建”1 9 4 2 3c g f pd s r n a 的合成1 9 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 4 3 细胞形态观察2 0 4 4d n a 电泳2 1 4 5 流式细胞仪检测细胞凋亡率2 1 4 6c a s p a s e 9 活性的测定2 3 5 讨论 参考文献” 致 2 4 2 6 3 1 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 1 1r n a i 简介 1 前言 1 1 1 删的概述 r n a i 的发现要追溯到1 9 9 0 年，n a p o l i 和j o r g e n s e n 在研究c h s ( c h a l c o n e s y n t h a s e ) 对花青素合成的影响时，发现了r n a 干扰的现象【1 1 。在随后几年，r o m a n o 与m a c i n o 等也发现了r n a 干扰现象【2 ，3 】。直到1 9 9 8 年，a n d r e wzf i r e 等在线虫中 研究反义r n a 抑制时，对照组d s r n a 相对于正义或反义r n a 表现出更强的抑制 效果。根据此现象，a n d r e wz f i r e 等推测在d s r n a 诱导的抑制过程中存在某种扩 增效应，且存在特定酶参与其中，将其现象命名为r n a 干扰【4 j 。r n a i 干扰的基本 工作流程如图1 【3 捌。 图1 ：r n a i 的基本工作流程示意图 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 1 1 2r n 础的作用机制 到目前为止，d s r n a 如何诱导基因沉默的机制已经完全阐明，其作用机制如图 2 。在新杆状线虫中转染反义s i r n a 和d s r n a 后均能发现m r n a 量的减少。最近 很多报道2 1n t 反义s i r n a 的有效性如d s r n a 一样，但反义s i r n a 在细胞内的稳 定性相对较差，在结合到r i s c 过程中，更容易降解。此外，最近研究发现存在一 种解开d s r n a 的解链酶能能结合到类似r i s c 复合体，从而导致d s r n a 作用时间 晚于反义s i r n a 6 , 7 1 。 d i c e r 图2 ：r n a i 的作用机制示意图 1 2r n a i 的应用及未来需要解决的问题 援联黪臻鬃翻t 蚺 r n a i 是当前基因功能研究的重要工具，因其在基因沉默方面具有效率高、特异 性等特性。不同于许多传统的基因筛选方法，r n a i 技术提供了强大的反向遗传学方 法，如在哺乳动物系统的应用。随着大量生物体基因序列的完成，应用r n a i 技术研 究基因功能更容易实现1 8 1 。 2 硕士学位论炙 m a s t e r st h e s i s 1 2 1r n a i 在线虫和果蝇研究方面的应用 到目前为止，r n a 干扰技术可以用于线虫、果蝇、老鼠和人类等中进行相关的 研究 d s r n a 导入线虫中能降解特定m r n a 的表达，这标志着r n a i 在体内研究的开 始。在线虫中的研究中，发现r n a i 是全身性的，如：将d s r n a 注入某一组织，在其 它的组织也产生相应的基因沉默【叭。在果蝇中，不能像线虫一样通过喂养d s r 咖 察相应的效应，而需通过注射或载体进入体内表达【1 0 】。在苍蝇中，转基因r n a i 长用 于相关的人类生物学，如癌症、发炎、伤口愈合、机体紊乱、免疫和神经系统错乱 笙【1 1 】 寸o 1 2 2r n 在农作物方面的应用 r n a i 在植物中的应用主要集中在如何提高农作物产量和营养价值，特别是在主 要粮食作物方面如玉米和稻米。此外，r n a i 还可以用于提高相应蛋白含量的工程作 物，如减少棉花种植的自然植物毒素的含量，从而可以提高其产量。虽然在农业方 面，r n a i 改良植物产品还很少见，但r n a i 在农业中已有大量成功应用成果，例如： 应用r n 简能抵抗常见的植物病掣1 2 , 1 3 , 1 4 】。 1 2 3r n a i 在病毒和害虫控制的应用 近几年来，很多蜂巢都消失了，最可能是与一种致死病毒，即以色列急性麻瘅 病毒( l 心v ) 有关。除了与感染以色列急性麻瘅病毒有关，害虫、营养不良和体弱 都可能导致蜂巢的消失。通过向蜜蜂饲养相应s i r n a 抑n i a p v 的表达，使其抵抗以 色列急性麻瘅病毒的感染【1 5 】。 r n a i 在控制害虫方面发挥了重要的作用，特别是控制甘比亚疟蚊。r n a i 还用 于分析宿主和病原体的相互作用和提供防治害虫机制基本的观点。如何在种群转染 r n a i 抑制病原体的方法已被找到。其中一种策略是快速转换承载病原体昆虫到能抵 抗该病原体的基因改造种群中，例如：如果野生蚊子种群能被疟疾替换，这就提供 了一种有效的方法控制这些破坏性的疾病。这种途径的挑战是形成一种快速取代野 生种群的方法。这种方法还处于发展的早期阶段【1 6 ，1 7 1 。 1 2 4r n a i 在医学方面的应用 相对于传统药物，r n 简能专一和稳定地沉默基因表达。此外，由于导致疾病的 任何蛋白易对r n a i 敏感，先前被认为无药可治的疾病，现在可利用r n a i 作用于这 3 硕士学位论炙 m a s t e r st h e s i s 些疾病的靶位点。生物技术公司和药物公司处于依靠s i r n a s 发展r n a i 治疗癌症、 高胆固醇血症、心脏血管和神经变性疾病等的早期阶段。无疑，r n a i 已成为生物技 术公司和药物公司的主要关注方面。作为一个治疗手段，r n a i 主要问题是其试剂的 传递性、专一性和稳定性。因s i r n a s 进入人体体液导致其降解、无效应等，传递性 则成为目前最大的障碍。因而，如何改造r n a i 使其能到达治疗位置成为目前的一个 研究热点。在治疗方面，r n a i 的另外一个优势可能来自化学改造或其它入境提高 r n a i 的专一性【1 8 , 1 9 】。 1 2 5r n a i 未来需要解决的问题 尽管我们已经了解了r n a 沉默的机制，还有很多问题还有待解决。第一，是否 存在应用a 叩来分离两条s i r n a 链的s i r n a 解旋酶。第二，在体内，r i s c 是有什么 蛋白组成和每个组成r i s c 成分的分子功能是什么。第三，r i s c 是如何表达m r n a 翻译的。第四，r n a i 是如何引起染色质结构的改变或d n a 甲基化的。随着我们对 r n a 沉默探索越多，r n a i 更多的优势就被越多的开发出来l 2 0 j 。 1 3 细胞凋亡的概述 细胞凋亡的定义是由k e 仃w v l l j e 和c u r r i e 在1 9 7 2 年第一次用来描述一种特殊的 细胞死亡方式。细胞凋亡是细胞死亡的一种方式，但其不同于细胞坏死。细胞坏死 涉及一系列由于细胞消化酶导致形态学改变、细胞膜的破裂和与细胞死亡相关的蛋 白变性。与细胞坏死相反，细胞凋亡则是一种清除过量或剩余死亡细胞有程序化、 积极地和高选择机制的细胞死亡方式。细胞凋亡是由很多不同的刺激诱导开始的， 如d n a 断裂、细胞内损伤、毒素和细胞外信号。在相同的刺激下，并不是所有的细 胞都会死亡。应用放射或药物治疗癌症会导致某些细胞出现问题，从而会导致细胞 凋亡。在多细胞生物体，细胞凋亡是发育和细胞调控的重要组成部分1 2 1 , 2 2 j 。 1 4 细胞凋亡的机制 细胞凋亡机制是高度复杂的，涉及一系列依赖能量的分子过程。研究揭示细胞 凋亡主要有两条途径：外部或死亡受体通路和内部或线粒体通路。然而，有些研究 发现两种凋亡通路是相联及一种通路的分子能影响另外一种的【矧。细胞凋亡还存在 另外一种通路，即包含t - 细胞介导细胞毒素和依赖穿孔素颗粒酶的凋亡通路。穿孔 4 硕士学位论炙 m a s t e r st h e s i s 素颗粒酶通路是通过颗粒酶a 或颗粒酶b 诱导细胞凋亡的。外部、内部和颗粒酶b 通路都集中在同一末端或执行通路，这通路是由于c a s p a s e 3 裂解开始，继而导致 d n a 断裂、细胞骨架与核蛋白降解、蛋白质交联、凋亡体的形成、吞噬细胞受体的 配体表达和吞噬细胞的摄取。颗粒酶a 通过单链d n a 断裂从而激发一系列依赖 c a s p a s e 的细胞死亡通路i 川。 1 4 1 外部通路( 死亡受体通路) 外部信号通路开始细胞凋亡涉及跨膜受体介导的相互作用。这些包括死亡受 体，如t n f 受体。t n f 受体基因家族具有富含丰富的半胱氨酸胞外区和具有称为死 亡结构域的8 0 个氨基酸的胞内区。线粒体通路在传递死亡信号从细胞表面到细胞内 部方面起关键的作用。截止到现在，配体和相应的死亡受体包含a p 0 3 i _ d r 3 、 t n f - a t n f r l 等。t n f a t n f r l 和f a s l f a s r 模型是目前最好用来描述线粒体凋亡 通路发生的过程。这些模型包括一簇受体和同源三聚配体。配体结合后，细胞质接 头蛋白被招募，其蛋白能表现相应死亡区域。f a s 配体和f a s 受体结合后，引起与接 头蛋白f a d d 的结合。然后，f 如d 能与c a s p a s e 8 前体蛋白结合形成d i s c ，激活下 游c a s p a s e 8 以及各种效应分子c a s p a s e s ( ! z l l - c a s p a s e 3 、c a s p a s e 6 等) ，从而引发细 胞凋亡i z 5 ，n 6 。 1 4 2 内部通路( 线粒体通路) 启动细胞凋亡的内部信号通路包括直接作用于靶细胞产生多样化信号的无受 体介导的一系列细胞内刺激和线粒体引起的事件。启动内部通路的刺激产生多样化 信号，这些信号可能是正信号或负信号。负信号涉及某些生长因子、激素类和细胞 活素类的缺失，这些缺失可导致阻止细胞死亡程序的失败，从而导致细胞死亡。正 信号包括毒素、辐射、缺氧和病毒感染等。所有的这些刺激可导致内部线粒体膜改 变，从而使m p t 孔开放、线粒体跨膜蛋白的丢失和两个凋亡前体蛋白组从膜间到胞 质溶胶1 2 7 1 。一组凋亡前体蛋白1 訇s m a c d i a b l o 、c y t c 和l 姐s 组成【2 8 1 。这些蛋白能 激活依靠c a s p a s e 的内部通路。细胞色素c 结合和激活a p a f - 1 ( 或c a s p a s e 一9 前体) ，从 而凋亡体形成。c a s p a s e 9 前体导致c a s p a s e 9 激活【2 引。而h t r a 2 o m i 和s m a c d i a b l o 采用抑制凋亡蛋白抑制剂活性从而引发细胞的凋亡1 3 0 。另外，线粒体蛋白可干扰 和抑制脚的作用。然而基因敲除实验表明单独结合l a p 有可能不能足够证明线粒体 蛋白可作为凋亡前体【3 1 】。 通过b c l 2 蛋白家族，控制和调节线粒体亡事件。在调节b c l 2 家族蛋白方面， 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s p 5 3 起重要的作用，但其完整的机制到目前为止还没有完全阐明。b c l 一2 蛋白家族可 调节线粒体膜通透性1 3 2 , 3 3 j 。b c l 2 家族的2 5 个基因已被识别。b c l 2 蛋白家族不仅有抗 凋亡蛋白，也有促凋亡蛋白，例如：抗凋亡蛋白b c l x l 和b c l 2 等，凋亡前体蛋白 b a x 和b a d 等。根据这些蛋白的作用，人们可以利用它们来鉴定细胞是否会凋亡还是 抑制凋亡。据认为，b c l 2 蛋白家族行为的主要机制是通过调节细胞色素c 的释放从 而改变细胞膜的通透性。b a d 丝氨酸磷酸化后再结合到1 4 3 3 ( 一个多功能磷酸丝氨 酸结合分子家族成员) 。当b a d 被丝氨酸磷酸化，它结合1 4 3 3 和在胞质溶胶中分离。 但一旦b a d 不被丝氨酸磷酸化，它可转移到线粒体释放细胞色素c 3 4 , 3 5 j 。b a d 还可以 结合b c l x l 或b c l 2 ，使它们保护作用无效，导致细胞死亡。b c l x l 和b c l 2 能抑制 c y t c 从线粒体释放，虽然其机制还没完全被解释。有报道指出，b c l x l 和b c l 2 最初 是通过控$ 1 j c a s p a s e 前体的活性来抑制细胞凋亡1 3 6 。有研究表明，不论是b c l x l 或 b c l 2 的过量表达都将小调另外一个，揭示这两个蛋白相互调节作用。 b c l 一2 家族其中两个成员p u m a 和n o x a 同样也属于促凋亡蛋白。在p 5 3 介