体外核医学2016解读.ppt

第六章体外分析,深圳大学第一附属医院核医学科申群喜,待测物质浓度与检测手段,临床化学分析,pg/L,ng/L,mg/L,mg/L,g/L,免疫分析,TherapeuticDrugs,ThyroidHormone,FertilityHormone,Allergy,CancerMarkers,InfectiousDisease,Vitamins,SerumProteins,常量,微量,超微量,定义：,利用放射分析方法或其派生的相关技术，测定生物样品中微量生物活性物质含量检测：激素肿瘤标志物药物浓度受体,分类：,Clicktoaddtitleinhere,4,2,3,体外分析技术,体外放射分析,体外非放射分析,放射性竞争结合分析,放射性非竞争结合分析,放射免疫分析*,(IRMA),免疫放射分析*,酶免疫分析,(EIA),化学发光免疫分析,(CLIA),荧光免疫分析,(FIA),(RIA),胶体金标记分析(CGIA),第一节放射免疫分析Radioimmunoassay,RIA,Ag,Ab,+,Ag-Ab,环境因素：离子强度生理盐水或缓冲液酸碱度pH6-pH9,pH7左右温度15-40,37最适,抗原抗体特异性结合反应,一.RIA基本原理*,讨论简单化，假定的“理想模式”：抗原和标记抗原对抗体具有完全相同的免疫活性2.抗体只有一种抗原结合位置1+1=1反应3.反应符合质量作用定律Ag+AbAgAb,一.RIA基本原理*,V1,V2,AgAb,AgAb,K=,一.RIA基本原理*,（一）竞争抑制免疫结合反应：体外条件下过量的放射性标记抗原（*Ag）与非标记抗原（即待测抗原，Ag）同时与限量的特异性抗体（Ab）进行竞争抑制免疫结合反应（三种成份）,Ag-Ab+Ag,*Ag,Ab,+,*Ag-Ab,(B),(F),+*Ag（过量部分）,*Ag:标记抗原Ag:非标记抗原Ab:特异性抗体*Ag-Ab:标记的抗原-抗体复合物Ag-Ab:非标记的抗原-抗体复合物,一.RIA基本原理*,一.RIA基本原理*,RIA原理示意图,一.RIA基本原理*,（二）剂量反应曲线/标准曲线：定量基础：*Ag-Ab的量（因变量）与Ag的量（自变量）之间存在竞争性抑制数量关系函数关系：二次函数关系用标准竞争抑制曲线（简称标准曲线）替代,一.RIA的基本原理*,标准曲线的制备,一.RIA基本原理*,标准曲线,一.RIA基本原理*,标准曲线(CG),（三）未知样品的检测:同等条件下待测抗原+过量的标记抗原+限量的特异性抗体温育分离B和F测量放射性活度查标准曲线求出浓度,一.RIA基本原理*,一.RIA基本原理*,未知样品的检测,Ag,未知样品的检测,一.RIA基本原理*,完整的试剂盒（商品化）包括：1.抗体2.标记抗原3.标准抗原4.质控品5.沉淀剂,二.RIA基本试剂,（一）抗体（Antibody,Ab）IgG类“三高”:1亲和力以亲和常数K表示2特异性以交叉反应率表示3滴度以抗体最适稀释度表示,二.RIA基本试剂,AgAb,AgAb,K=,抗体的制备：多克隆抗体免疫动物所得抗血清单克隆抗体杂交瘤技术所得抗体,二.RIA基本试剂,（二）标记抗原（*Antigen,*Ag）抗原分子中一个或数个原子被放射性核素所取代标记的放射性核素有3H14C125I等125I比活度高半衰期合适（60天）利用酪氨酸的“嗜碘性”标记,二.RIA基本试剂,（二）标记抗原（*Antigen,*Ag）要求：1.同质性2.高放射性比活度（kBq/ug)3.放射化学纯度95%4.免疫活性高,二.RIA基本试剂,（三）标准抗原（标准品）高浓度的纯品物质化学标准品结构清楚物理化学方法可测定质量单位(ng/L)生物标准品不能用物理化学方法测定采用与被测物质相似分子形式的物质生物单位(mIU/L)要求：1.均质性2.纯度高3.定量准确,二.RIA基本试剂,（四）待测样品血浆血清体液组织液要求：符合放射性检测方法的要求去除可能存在的干扰成份,二.RIA基本试剂,（五）检测仪器计数仪：125I检测射线闪烁计数器：3H或者14C检测射线,二.RIA基本试剂,（一）理想的分离方法：1.完全分离2.不影响反应的平衡3.不受外界或其它试剂的干扰4.操作简便重复性好5.来源方便价格低廉,三.RIA分离方法,（二）常用分离方法的比较：分离方法优点缺点,三.RIA分离方法,分离快适用于任何温育体积沉淀易于观察便宜组分介质及损伤组分的分析新方法的研究和建立分离快，适用于任何温育体积，蛋白质含量较低的分离介质蛋白质浓度影响小，通用，特异性高，分离完全分离快，简易，适用于大批样品的检测,条件不易掌握，分离不完全，对蛋白质敏感点样量少，不能处理大量样品，测定体积受限，特殊设备对蛋白质浓度、离子强度及PH都敏感，沉淀不稳定二抗价格高、流程长，二次温育可能建立新的平衡依赖商品供应，抗体用量大，价高，固相抗体贮存不稳定,活性炭吸附法电泳法沉淀法双抗体法固相法,（一）误差的种类：1.系统误差确定的原因:仪器设备试剂质量标准曲线拟合方式等结果：倾向性偏高或偏低以“准确度”(accuracy)表示2.随机误差难以确定的原因：放射性测量的统计涨落探测仪器不稳定等结果：双向性以“精密度”(percision)表示,四.RIA质量控制,（二）精密度与准确度的区别与联系,四.RIA质量控制,甲乙丙丁,甲：即准确又乙：不准确，丙：尚准确，丁：即不准确精密但精密但不精密也不精密,1零标准管结合率（B0%）30%-50%2非特异性结合率（NSB%）5%-10%3室内质控图制作及质控规则,四.RIA质量控制,（三）室内质量控制,（四）室间质量控制,第二节免疫放射分析Immunoradiometricassay,IRMA,一.IRMA基本原理*,（一）非竞争性免疫结合反应：体外条件下过量的放射性标记抗体（*Ab）与非标记抗原（Ag）进行非竞争性免疫结合反应（二种试剂）,*Ab,+,Ag-*Ab+*Ab,Ag,（B）,（F）,（二）剂量反应曲线/标准曲线：定量基础：Ag-*Ab的量（因变量）与Ag的量（自变量）之间存在正相关的函数关系用标准结合曲线（简称标准曲线）替代,一.IRMA基本原理*,标准曲线的制备,一.IRMA基本原理*,IRMA标准曲线的制备,一.IRMA基本原理*,RIA标准曲线的制备,B%,标准曲线,一.IRMA基本原理*,B%,B%,IRMA的标准曲线,RIA的标准曲线,一.IRMA基本原理*,二.IRMA常用方法,双抗夹心法(doubleantibodysandwichmethod)2.标记第三抗体法(labeledthirdantibodymethod)3.双标记抗体法(doublelabeledantibodymethod),优点：l反应动力学：非竞争性且抗体过量容易达到平衡温度变化对结果影响不大。l灵敏度：比RIA高出10100倍。l加样误差少：加样误差主要来自抗原一个环节缺点：l需要特殊的分离方法。l对半抗原不适应l要大量的*Ab，昂贵,三.IRMA优缺点,四.IRMA与RIA主要区别*,第三节非放射免疫分析技术,1酶标记免疫分析技术2化学发光免疫分析技术3时间分辨荧光免疫分析技术4胶体金标记分析技术,一酶标记免疫分析技术（enzymeimmumoassay,EIA)酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体的免疫分析的技术结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性。常见方法为ELISA。常用的酶为辣根过氧化物酶底物是四甲基联苯胺(TMB)，反应后显黄色。,二化学发光免疫分析技术(CLIA)以化学发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。1化学发光免疫分析吖啶酯2化学发光酶免疫分析金刚烷3电化学发光免疫测定三联吡啶钌,三时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA）,采用稀土元素标记抗体，利用时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得稀土元素的特异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。,四胶体金标记分析技术技术（colloidal-goldimmunoassay，CGIA）,采用胶体金为标记物，利用氯金酸（HAuCl4)在还原剂的作用下，形成红色的胶体状态。,问题：,放射免疫分析反应物有几种？放射免疫分析抗原通常用什么标记?免疫放射分析反应物有几种？,小结,掌握:1.放射免疫分析的原理、