（微生物与生化药学专业论文）利用基因突变技术进行安普霉素单组分产生菌的选育.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究在做 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识 到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 乒莒智日期： ! ! ! ! 生3 旦 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文 和汇编本学位论文。 髁密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：兰整办师签名：弛日期：幽 摘要 摘要 黑暗链霉菌h 6 ( s t r e p t o m y c e $ t e n e b r a r i u sh 6 ) 产生三种抗生素：安普霉素、 氨甲酰妥布霉素和少量氨甲酰卡那霉素b 。多年来科研人员对黑暗链霉菌的研究主 要集中于常规诱变育种和优化生产工艺等方面，虽然取得一些好的进展，但对其抗 生素合成的途径了解较少。二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因工程研究，已在抗 生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素产生等方面取得长足 的进步。为获得黑暗链霉菌h 6 安普霉素单组分产生菌，对黑暗链霉菌h 6 染色体上 的t a c a 基因进行基因进行阻断实验，利用基因突变技术来选育安普霉素单组分产生 菌。 利用p c r 分别获得t a c a 基因内部5 2 3 b p 片段和1 0 6 3 t , p 片段，将两片段重新连 接到p u 2 9 2 5 内。在构建好的质粒中加入x y e 报告基因和e r m e 基因做为筛选标记， 构建基因阻断穿梭载体。转化到大肠杆菌d h 5 0 t 。经接合转移导入黑暗链霉菌h 6 ， 筛选双交换阻断交株。经发酵产物分析，阻断变株不再合成氨甲酰妥布霉素，只合 成安普霉素。从而获得安普霉素单组分产生菌。 关键词：黑暗链霉菌；基因阻断；接舍转移；基因突交 a b s t r a c t a b s t r a c t s t r e p t o m y c e st e n e b r a r i u sh 6p r o d u c e s t h r e ek i n d so fa n t i b i o t i c s ：a m p r a m y c i n , c a r b a m o y l t o b r a m y c i na n ds o m ec a r b a m o y l k a n a m y c i n b t os t u d yt h eb i o s y n t h e t i cp a t h w a y o ft h e s ea n t i b i o t i c sa n do b t a i nt h es t e n e b r a r i u sw h i c hp r o d u e ea m p r a m y c i no n l y , t h et a c a h a sb e e nd i s r u p t e d f i r s t , t h e1 0 6 3 b pa n d5 2 3 b pi n s i d ef r a g m e n t so ft a c ag e n ew a s o b t a i n e db yp c rt h eg e n ed i s r u p t i o nv e c t o r ( p s p u 2 9 2 ) w r sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f e r r e d i n t o 量t e n e b r a d u sh 6b yc o n j u g a t i o n r e c o m b i n a n ts t e n e b r a r i u sh 6 s p u 2 9 2 ) w a s o b t a i n e d w i t h p r o d u c i n ga p r a m y c i n , t h e d i s r u p t a n t n o l o n g e rp r o d u c e s c a r b a m o y l t o b r a m y c i n t h e r e s u l ti n d i c a t e st h a tt h et a c ai sn o tr e l a t e dt oa p r a m y c i n b i o s y n t h e s i sb u tc l o s e l yr e l a t e dt oc a r b a m o y l t o b r a m y c i nb i o s y n t h e s i s k e yw o r d s ：s t r e p t o m y c e st e n e b r a r i u s ；c a r b a m o y l t o b r a m y c i n ；t h eb i o s y n t h e t i cg e n e ( c l u s t e r ) ；g e n ed i s r u p t i o n 2 前言 日u看 氨基糖苷类抗生素( a m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c s ) 是一类结构中既含有氨基糖苷 又含有氨基环醇的抗生素，主要包括链霉素、卡那霉素、安普霉素等，绝大多数是 在链霉菌属中产生的“2 翔。 近年来的的表明，此类抗生素直接作用于细菌3 0 s 核糖体亚单位的1 6 sr r n a 解码区的a 部位结合，虽然氨基糖苷类抗生素结合的是r r n a 的保守区域，但它们对 原核和真核核糖体的作用大不相同。原核生物和线粒体的核糖体对许多氨基糖苷类 抗生素敏感，它们1 6 sr r n a 的1 4 0 8 位上的核苷酸为腺苷。与此相反，真核细胞质 核糖体对大部分氨基糖苷类抗生素不敏感，它们1 8 sr r n a 的1 4 0 8 位上的核苷酸为 鸟苷。由于这类抗生素抗菌谱较广，尤其对需氧的革兰氏阴性杆菌有较强的活性， l 临床广泛应用于治疗结核分支杆菌及其他分支杆菌属所致疾病。缺点在于其大都存 在着不同程度的耳、肾毒性和交叉耐药性，所以目前对氨基糖苷类抗生素的研究主 要在于如下三个方面：1 结构改造，新活性化合物的筛选：2 耐药性产生的分子生物 学机理：3 菌体内次级代谢生物合成的途径，包括中间体的转变、关键酶的结构功能 及其基因表达水平的调控。通过克隆抗生素的生物合成基因，在基因水平上了解其 代谢物产生的过程及其调控机制，将有利于提高人们对生物合成本质的认识，指导 实际应用，改造出人们所需要的高产、单组分菌株，甚至通过基因重新组合可以有 目的的构建、生物表达难以合成的新型化合物。 黑暗链霉菌( s t r e p t o m y c e s t e n e b r a r i u s ) 是1 9 6 7 年美国礼莱公司( e f tf i l l yc o ) 的研究人员从土壤中分离到的一株能产生一组氨基糖苷类抗生素( a m i n o g l y c o s i d e a n t i b i o t i c s ) 的链霉菌。这组氨基糖苷类抗生素被命名为尼拉霉素( n e b r a m y c i n ) 州， 其中组分2 、4 、5 为主组分。组分2 为安普霉素( a p r a m y c i n , a m ) ，组分4 为6 - o 一 氨甲酰卡那霉素b ( 6 ”o c a r b a m o y l k a n a m y c i nb ，c k b ) ，组分5 为6 - 0 氨甲酰妥布 霉素( 6 - 0 c a _ , b a m o y l t o b r a m y c i n , c t b ) 。组分4 、5 经水解，分别形成卡那霉素b 和妥布霉素 5 1 。它们的结构如图1 所示 前言 h 0 h 气鞴1 4 叠铲0 乳z h t d b 口，c i i 图i 安普霉橐、卡那霉素b 和要布霉素结构 n 吕it h e 出u c t 世eo f a l o r a m y c i n , s a , a m y 血ba n dt o b r a m y c i n 1 安普霉素概述 1 1 化学结构及理化性质 安普霉素的化学结构新颖，因其结构中含辛二糖结构而异于其他氨基糖昔类抗 生素。安普霉素的分子结构由三部分组成( a ) 4 - 氨基一4 一脱氧一a 一毗喃型葡萄糖、 ( b ) 辛二糖胺( 含八碳双环结构) 、( c ) 2 一脱氧链霉胺( 2 d o s ) 。安普霉素外观呈白色 或类白色粉末，碱性，有吸湿性，易溶于水，稍溶于低级醇，不溶于其它有机溶剂。 紫外吸收光谱为末端吸收，红外光谱具有典型的多羟基的特征峰。【6 7 1 1 2 抗菌活性及应用 安普霉素是一种广谱抗生素，作用于细菌的核糖体而导致m r n a 密码的错读 ( m i s r e a d i n g ) ，从而抑制蛋白质的合成。安普霉素由于具有独特的辛二糖结构，不易 被钝化氨基糖普类抗生素的乙酞化酶、腺普化酶、磷酸化酶钝化，对多种氨基糖昔 类抗生素的耐药菌有抑制和杀灭作用，使用中不易产生交叉耐药性。同时具有低毒、 低残留量、安全的特点。由于它具有上述特点，被广泛应用于由大肠杆菌、沙门氏 菌等引起的畜禽急慢性腹泻、肠炎等疾病的预防和治疗且疗效显著。安普霉素的抗 性基因常常作为基因工程中重组体筛选的选择性标记【8 , 9 , 1 0 。 3 链霉菌抗生素生物单组分的获得 4 秽诋 鞔 刖舌 根据己报道的推测的基因可能的的功能，对其进行基因突变操作，使特定基因 失去活性，从而改变菌种。新产生的单组分菌种，可以经过进一步的常规诱变或基 因改良工作来提高其产量，最终应用于生产。 链霉菌抗生素单组分生产菌株的获得，主要有单基因在标准宿主中表达、阻断 变株的互补试验、联合共培养、基因中断和基因替代等方法。 3 1 基因在标准宿主中表达 将单个基因克隆到标准宿主中，通过对宿主菌中该基因产物的检测，从而得到 目的基因的功能。 3 2 阻断变株的互补试验 即通过一系列阻断变株的互补结果来决定目的基因的功能，此策略的关键是获 得一系列性质名晾的阻断变株。链霉素( s t r e p t o m y c i n ) 、安普霉素( a p r a m y c i n ) 等 抗生素生物合成基因功能是通过这种方法获得的。这种方法的最大缺点是需要一系 列的阻断变株，使得这种方法的应用受到了限制。 3 3 基因中断和基因替代 基因中断( g c n ed i s r u p t i o n ) 和基因替代( g e n er e p l a c e m e n t ) 广泛用于细菌乃 至高等真核生物基因功能的研究。通过载体上已克隆d n a 与染色体上同源序列间 的整合、交换、剪切，打破原有的核苷酸序列，造成该基因功能的突变，通过可检 测的表型及代谢变化，初步确定基因的功能。该方法对于全新基因及基因组的初步 功能研究是十分有用的。1 1 1 3 3 1 基因中断( g e n ed i s r u p t i o n ) 1 1 2 1 将目的基因内部片段连接到载体上，导入目的菌株，通过同源单交换与染色体 上等位基因发生重组，连同载体整合到基因组中，形成两套不完整的基因，实现基 因的阻断。 这种方法获得的阻断株含两套同源的不完整等位基因，易发生二次交换，整合 的载体发生脱落，发生回复突变，在无选择压力下每世代1 回复。因此，得到的 阻断株稳定性稍差，不适于构建用于生产上的基因工程菌。但该策略简单易行，快 捷方便，特别适用于快速初步的鉴定基因功能，因而被广泛采用。 前言 3 3 2 基因替换( o e n er e p l a c e m e n t ) 1 3 1 将目的基因克隆到载体上，用一个报告基因( 常为抗性基因) 插入目的基因内 部或替换内部的一部分，构建成含突变基因的载体，转化后经双交换替代染色体上 完整的基因，造成基因突变。该方法构建地阻断菌株由于只含一套突变基因，不易 发生脱落，适于构建稳定的基因工程菌。但该策略在构建基因阻断载体时会比较复 杂，当没有合适酶切位点时更是如此。因此，该法不适于快速鉴定功能。 3 3 3 用于基因阻断的载体的选择u 3 l 1 ) 非复制型大肠杆菌质粒( 自杀质粒) 如p k c l l 3 2 ，p o j 2 6 0 等。该类质粒不含有链霉菌的复制起始位点，不能在链霉 菌中复制，只有整合到染色体上，随染色体复制，其报告基因才能表达。用此特性 可筛选基因阻断株。缺点是：不适用于转化率低的情况。 2 ) 温敏型载体系列 质粒上0 f i 位点来自温敏型复制子p s g 5 。在2 8 - 3 0 c 可在链霉菌中复制，高于 3 7 2 2 不复制。根据这个特性可以很方便的筛选发生交换的菌株，并可用于质粒消除。 3 ) 噬菌体衍生载体 如k c 4 0 4 ，k c 5 1 5 等，多为温和噬菌体4 ，c 1 3 衍生来的克隆载体。在其他方法 不容易把质粒导入宿主菌情况下，采用专一性噬菌体是一个很好的方法，但是菌体 操做比较繁琐。 4 ) 不稳定复制子 p i j 4 6 8 0 ，p c s 5 等，在某些菌中，该类载体如果在没有选择性压力条件下极易 丢失。 在实际实验中，温敏性质粒由于操作简单，筛选容易，被广泛应用于基因阻断。 4 结合转移 研究人员很早就发现了接合转移现象。两个通过直接接触，在暂时的沟通中进 行基因转移的过程为接合。这一过程不是在所有细菌之间均可发生。只有那些具有 f 因子( f e r t i l i t yf a c t o r ) 或类似f 因子传递装置的细菌才能接合接合中有f 因子的细菌相当于雌性菌。因此接合看作是细菌的有性生殖过程，又称为细菌杂交。 6 前言 细菌的接合最早在大肠杆菌中发现， 氏阴性菌。接合转移是较复杂的过程”】， 以后在其他菌中也观察到，主要见于革兰 主要包括：转移起始位点缺刻；d n a 转移 的起始：双链分离；单链转移；供体受体互补链的合成及再环化等。质粒接合转移 过程也受遗传的调控，主要是通过f i n o ，f i n p 两基因参与的调控机制一f i n o - f ， 系统来控制转移的起始和关闭。这样就使f 因子与其他能通过接合传递的细菌质粒 一样，在细菌群体中传播，类似引起传染，即原来的f + 菌仍为f + ，而f 一受体菌可 变成f + 菌。 早年人们认为质粒接合转移仅限于种属关系密切相关的细菌之间，但 t e i w u - c u o t 等人突破了这一观念的束缚，他们在体外构建了一种穿梭质粒，并通过 接合转移成功地将此质粒从革兰氏阴性细菌大肠杆菌中转移到许多革兰氏阳性细菌 中【”l 。随后的许多实验表明，种属关系相差很远的物种之间也可以通过接合的方法 实现质粒的转移。在链霉菌中已发现许多具有自我转移性的质粒 ( s e l f - t r a n s m i s s i b l ep l a s m i d ) ，如p i j l o l 、s c p i 、s l p i 等。1 9 8 9 年m a z o d o e r 等人首次报导了通过接合转移的方法，把质粒d n a 从大肠杆菌转移到变铅青链霉菌 中，实现了质粒在大肠杆菌和链霉菌之问的跨种属转移。 接合转移的优点在于：方法简便，无须依赖原生质体的制备和再生；由于质粒 以单链形式进入受体菌，限制一修饰屏障将被部分或完全破坏，d n a 可免造受体菌损 伤；载体质粒可以在大肠杆菌中复制，为构建重组质粒提供了方便。本实验室己成 功建立了黑暗链霉菌h 6 接合转移系统，为克隆其抗生素生物合成基因和利用基因工 程改造奠定了基础。 5 黑暗链霉菌中抗生素生物合成的研究进展 黑暗链霉菌h 6 产生多种氨基糖贰类抗生素，主要有安普霉素( a p r a m y c i n ) 、妥 布霉素( t o b r a m y c i n ) 及卡那霉素b ( k a h a m y c i n b ) 。其中安普霉素因含有八碳糖的 特殊结构令人注目，它的抗菌谱广，对革兰氏阴性菌有较强的抗菌活性，特别是不 容易产生耐药性，对已有的耐药菌产生的绝大部分失活酶仍有抵抗力。 1 4 , 1 5 由于它 具有上述特点，目前主要用于牛、猪、鸡等的大肠杆菌、沙门氏菌和支原体所引起 的白痢、腹泻和肺炎等疾病。所以在该菌株中有关糖次级代谢基因的研究较为复杂 7 前言 且有着一定的意义。 1 6 , 1 7 多年来科研人员对黑暗链霉菌的研究主要集中于常规诱变育种和优化生产工艺 等方面，虽然取得一些好的进展，但对其抗生素合成的途径了解较少。二十世纪八 十年代兴起的链霉菌基因工程研究，已在抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、 组分改善及杂合抗生素产生等方面取得长足的进步。在进行基因突变方面时，可以 根据相关资料来特定的对某一区段的基因进行操作，来达到特定的筛选目的。 氨基糖苷类抗生素( a m i n o g l y c o s i d e a n t i b i o t i c s ) 按其结构可以划分为两大类： 一类是有糖苷取代的氨基环醇类，如链霉素、福提霉素和潮霉素等属于这一类抗生 素。通过对链霉素和福提霉素生物合成机制的研究，对其遗传学及酶作用机制已有 了较透彻的了解；另一类氨基糖苷类抗生素是以2 一脱氧链霉胺为母体的一类衍生 物，临床上主要应用的氨基糖苷类抗生素大多属于这一类，例如新霉素、卡那霉素、 丁酰苷菌素、庆大霉素、妥布霉素等。对2 一脱氧链霉胺类抗生素的生物合成机制己 经通过同位素示踪技术和阻断变株的方法进行了研究，但现有报道很少。催化其生 物合成的酶，除了特别的几个，如相关肌醇的氨基转移酶，大部分还不清楚。黑暗 链霉菌h 6 产生主要组分为安普霉素和氨甲酰妥布霉素。目前国内、外关于黑暗链霉 菌的研究多为常规诱变育种及阻断变株的研究，虽然将前体物质氨基葡萄糖、二脱 氧链霉胺、巴龙霉胺、安普霉胺、八碳糖胺用阻断变株进行生物转化实验，推测出 安普霉素可能生物合成途径，但详细机制有待进一步证实。安普霉素( 化学结构见图 1 ) 是黑暗链霉菌( s t e n e b r a r i u s ) 产生的尼拉霉素复合物( 氨基糖苷类) 的组分2 。安 普霉素是广谱抗生素，特别对革兰氏阴性菌和葡萄球菌有很高的抗菌活性。由于分子 中具有独特的辛二糖结构，对多种氨基糖苷类抗生素的耐药菌有抑制和杀灭作用，使 用中不易产生交叉耐药性。因此进行单组分安普霉素产生菌的选育具有一定的意义。 6 1 妥布霉素生物合成的研究 6 1 1 国外研究进展 在以2 脱氧链霉胺为母体的氨基糖苷类抗生素中，以丁酰苷菌素生物合成的研 究最为典型。f n m i m k ak u d o 等人埔1 应用反向遗传学的方法克隆了催化2 一脱氧链霉 胺类抗生素生物合成起始的2 去氧青蟹肌醇合成酶( d o i ) 基因b t r c oy a s u m a s ao t a 8 刖舌 等人1 9 1 又应用染色体步移技术研究了b t r c 附近的基因( 图4 ) ，并通过目的基因阻 断和表型的分析初步研究了这些基因的功能，推测出了丁酰苷菌素的生物合成途径。 ，m a d a nk u m a rk h a r e l 等人捌正是通过对丁酰苷菌素及庆大霉素生物合成途径中 的2 一去氧青蟹肌醇合成酶( 2 一d e o x y - s c y l l o - i n o s o s es y n t h a s e ) 进行同源比较，从而发 现两个高度保守的区域( d s v l s l k q a v n 和e y g h t v g h ) ，根据这两个高度保 守的区域并结合链霉菌基因特点，从而设计引物成功地从黑暗链霉菌中分离得到编 码2 - 去氧青蟹肌醇合成酶( d o i ) 基因t b m a ，通过生化分析证明其功能捌为：催化 6 _ 磷酸葡萄糖到2 去氧青蟹肌醇的生成，并推测此步反应为2 脱氧链霉胺生物合成 的起始步骤。杨钧等通过对黑暗链霉菌h 6 染色体上的t b m a 基因进行基因阻断实验 证明，阻断变株不再合成氨甲酰妥布霉素，只合成安普霉素。首次从分子水平证明 了t b m a 只参与氨甲酰妥布霉素生物合成，而不参与安普霉素的生物合成。 同时m a d a nk u m a rk h a r c l 等人【刎以2 去氧青蟹肌醇合成酶基因为探针，对黑暗 链霉菌基因文库进行杂交，分离得到了3 3 9 k b 大小的序列，其中包含2 4 个开放阅 读框架和一个转运蛋白。通过同源比较，推测这2 4 个开放阅读框架中包含1 3 8 k b 的妥布霉素生物合成基因簇( 图2 ) ，如推测的2 一脱氧链霉胺生物合成酶系、糖基转 移酶、其它氨基环多醇生物合成酶系等。通过序列分析揭示了在放线菌中从3 一脱氢 奎尼酸合成酶到d o i 合成酶的进化，并推测出妥布霉素生物合成途径( 图3 ) 。妥 布霉素的生物合成以d 一葡萄糖为出发底物，在d o i 合成酶、d o i 氨基转移酶和脱 氢酶的催化作用下，将6 磷酸葡萄糖催化生成2 一脱氧链霉胺，然后与2 一氨基葡萄 糖连接生成巴龙霉胺，再经过多步催化并与不同亚基连接，最终生成妥布霉素及其 衍生物。 9 前言 图2 丁酰苷菌素与妥布霉素的生物合成基因簇 f i g 2b u t i r o s i na n dt o b r a m y d nb i o s y n t h e t i cg e n ec l u s t e r s m 盥蟠兰- h 由嗤n 饨蛔h e 蛔- t n 凸嘲幽“蹦f ， h ：a c - z t n ，d “r _ - m r * 蟊 一吱。 图3 推测的妥布霉素生物合成途径 f i g 3p r o p o s e dp a t h w a yf o rt o b r a m y c i nb i o s y n t h e s i s 6 1 2 国内研究进展 李天伯等 2 1 1 根据链霉菌内多种同源基因的保守性，参考己发表的1 4 种链霉菌 1 0 下 善 l | | 前言 中与己糖次级代谢有关的d t d p 葡萄糖_ 4 ，6 脱水酶序列，经a l i g n m e n t 比较分析， 取同源性最高的两片段设计引物，以s t e n e b r a r i u s h 6 总d n a 为模板p c r 得到了该 菌株自身d t d p 葡萄糖_ 4 ，6 脱水酶的部分基因0 6 k b 片段。以此片段为探针对已建 立的s t e n e b r a r i u sh 6 的完整基因文库进行菌落原位杂交，并对阳性克隆进行进一步 的酶切分析、s o u t h e r n 杂交，得到了与探针连锁的约5 0 k b 区域( 图4 ) 。经测序、 o r f 分析及同源性比较，证明己从链霉菌s t e n e b r a r i u sh 6 中克隆了完整的d t d p 一 葡萄糖4 ，6 脱水酶基因，而且杜煜等2 2 1 已通过基因阻断的方法证明该基因参与妥布 霉素的生物合成。同时，部分测序结果表明此基因两端的序列已连锁了其它次级代 谢生物合成的结构基因( 图5 ) 。 9 k b2 k b4 k b5 k b5 l 【b7 k b1 2 k b9 k b ed cabofg 图4s t e n e b r a r i u a h 6 中与糖有关生物合成基因连锁图 f i g 4t h ep u t a t i v es u g a rb i 叩l t h c s i sr e l a t e dg e n ec l u s t e rf r o ms t e n e b r a r i u sh 6 图5b a m h r 0 k b - o 片段上各基因连锁图 f i g 5t h ep u t a t i v es u g a rb i o s y n t h e a i sl l ：l a l e , dg e n ec l u s t e ro f of r a g m e n t 注：b o b a m h i ；s - s a i i ；k k p n l ；g - 妇l l l ，n c - n c o l 8 6 2 安普霉素生物合成的研究 一方面，通过同位素示踪实验和生物合成前体物质添加等实验以及对其它氨基 糖苷类抗生素的生物合成途径的研究，李相丰等1 提出安普霉素可能的生物合成途 l l 前言 径，见图7 。在安普霉素的生物合成过程中，由阻断变株生物转化结果可以得出： 葡萄糖首先合成2 - d o s 、2 - 氨基葡萄糖，然后两者连接生成巴龙霉胺，巴龙霉胺经 环合生成安普霉胺，最后4 一氨基_ 4 脱氧葡萄糖与安普霉胺连接生成安普霉素。 另一方面，本实验室采用抗性基因连锁方法获得了与安普霉素生物合成相关的 a p r b ，a p r c , a p r d ，a p r ea p r g 五个基因，根据已克隆基因的阻断结果，这5 个基因 都与安普霉素合成有关，而不涉及氨甲酰妥布霉素的生物合成。因此推断，安普霉 素与氨甲酰妥布霉素生物合成基因有可能分布于两个基因簇，即使有部分交叉，两 种抗生素的合成基因也具有很强的区域性。 图6 安普霉素合成相关基因 洚。奄。舒心 _ r l ，d - 性 舶 1 2 前言 图7 安普霉素可能生物合成途径 f i e 7p r o p o s e db i o s v n t l m s i sp a t h w a yo fa p r a m v c i n 7 研究黑暗链霉菌h 6 中抗生素生物合成基因的立题方向 根据m a d a nk u m a rk h a r e l 等2 町的研究，t a c a 基因是与t a c b , t a c c , t a c a , r a c e 和t b r m ，t b m b , t b g t c , t h r o b , t b g z g 连锁存在，妥布霉素生物合成基因簇的一部分。 m a d a n k u m a r k h a r e l 等从黑暗链霉菌中分离得到t a c a 基因并推测其与氨甲酰妥布酶 素的生物合成有关。对其分子生物学功能未见详细报道。 本研究通过基因阻断的方法，定点突变t a c a 基因，使其丧失生物学功能，以获 得单组分安普霉素产生菌为目的。当获得安普霉素单组分产生菌后，可以经过进一 步的常规诱变方法或进行基因改良来提高其效价，为最终应用到生产，创造更大的 应用价值做准备。 正文 实验材料 1 菌种 1 1e c o rd h 一5 克隆的宿主菌。 1 2e c o l de t l 2 5 6 7 ( p u z s 0 0 2 ) 接合转移质粒的宿主菌。 1 3 黑暗链霉菌h 6 ( s t e n e b r a r i u sh 6 ) 安普霉素、氨甲酰妥布霉素、氨甲酰卡那 霉素b 产生菌。 1 4 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 安普霉素、氨甲酰妥布霉素、氨甲酰卡那霉素b 的效价检定菌。 以上菌种均为本室保藏。 2 质粒 p l j 2 9 2 5 1 卸 大肠杆菌克隆载体，t a c z , b a ； p x z l 链霉菌载体，含有e r m e 、x y e 报告基因，由本室构建 3 试剂 3 1 抗生素 硫链丝菌素( t h i o s t r e p t o n e ，t s r ) 购自s i g m a 公司；氯霉素( c h l o r a m p h e n i c o l ，c i ) ， 卡那霉素( k a a a m y c i n ，k m ) ，红霉素( e r y t h r o m y c i a ，e r m ) 妥布霉素( t o b r a m y c i n ， t o b ) ，购自中国药品生物制品检定所；安普霉素( a p a r m i c i n ，a m ) ；吡哌酸( p p a ) 。 3 2 工具酶以及化学试剂 限制性内切酶、t 4 - d n a 连接酶、c i a p 、i p t g 和x - g a l 、t 4d n a 聚合酶、l a t a q 酶均购自大连t a k a r a 公司； d n a 分子量标准：d n a i h i n d l i i 、d l 2 ，0 0 0 购自t a k a r a 公司； r n a s e a 为s i g m a 公司产品； 琼脂糖购自上海y i t o 有限公司； 其它： 邻苯二酚天津市化学试剂一厂( 9 3 0 4 2 5 ) 8 羟基喹啉北京西中化工厂( 8 7 0 1 0 1 ) 甘露醇上海试剂二厂( 9 7 0 2 0 2 ) 正文 t r y p t o n e y e a s te x t r a c t 3 3 试剂盒产品 o l x o i d 公司 0 x o d 公司 d n a 凝胶回收试剂盒( c a t n o s k l l 2 ) 为上海s a n g o n 公司产品； 4 缓冲液 4 1t e 缓冲液：用于溶解d n a t r i s - h c l1 0m m o l l ，e d t a1m m o l l ，p i - i8 0 4 2t s e 缓冲液：用于链霉菌质粒提取 t r i s - h c l e d l ：a 2 5m m o l ，l 2 5 m m o l ，l ， s u c r o s e0 3m o l ，l ， p h 8 0 4 3 大肠杆菌质粒提取缓冲液 溶液hg l u c o s e5 0m m o l l ，t r i s - h c l e d t a 1 0m m o l l ( p n 8 o ) 溶液i i ：s d s l ，n a o h0 2m o l l 溶液h i ：n h g a c7 5m o l l 4 4i x t a e 缓冲液：电泳分离回收d n a 片段 t r i s - a c e t a t e4 0m m o l l ( p h7 6 ) ，e d t a2m m o l l ( p h8 o ) 5 培养基 5 1l b 培养基( ) ：用于大肠杆菌培养 t r y p t o n e 1 0 ，y e a s te x t r a c t0 5 ， n a c l 1 0 ，p h 7 0 - 7 2 固体培养时加1 5 a g a r 5 22 y t 培养基( ) ：用于大肠杆菌培养 t r y p t o n e n a c l 1 0 ，y e a s t e x t r a c t1 0 ， 1 0 ，p h 7 0 5 3c p 培养基( ) ：用于黑暗链霉菌的菌丝培养 0 2 正文 y e a s te x t r a c t 0 4 ， k 2 i - i p 0 4 - 3 h 2 0 0 1 5 ， n a a0 0 5 ， m g s 0 4 - 7 h 2 0 k e 【2 p 0 4 p h n a t u r e 5 4r 2 y e 培养基( ) ：用于链霉菌培养 o 0 5 ， o 1 。 0 o o l 。 s u c r o s e 1 0 3 ，k 2 s 0 40 0 2 5 ， m g c l 2 - 6 h 2 0 1 0 1 ， t r y p t o n e 0 2 ， p e p t o n e 0 4 ， t r a c ee l e m e n ts o l u t i o n * g l u c o s e1 0 ， c a s a m i n oa c i d0 1 。 y e a s te x u a c t0 4 ， o 2 m l ， k h 2 p 0 4 ( o 5 ) 1 0m l ， c a c l 2 2 h 2 0 ( 3 6 8 ) 8 0 m l ， t r i s - h c i ( o 2 5m o l l , p h7 2 )1 0 0m l ， naoh(1mol，l)05m l ， p h n a t u r e 固体培养时加1 5 a g a r t r a c ee l e m e n ts o l u t i o n *( ) ： n a 2 8 4 0 7 1 0 h 2 0 0 0 0 1 ， z n c l 2 2 h 2 0 0 0 0 4 ， f c c l 3 j 6 h 2 00 0 2 ，( n h 4 ) 6 m 0 7 0 2 4 4 h 2 0 0 0 0 1 ， c u c l 2 2 h 2 0 0 0 0 1 ，m n c l 2 4 h 2 0 0 0 0 1 5 5 合成v 号培养基( ) ：用于链霉菌的斜面培养及接合转移 s o l u b l es t a r c h 2 0 ， b e e fe x t r a c t0 1 ， k n 0 3 0 1 ， k 2 i - i p 0 4 3 h 2 0 0 0 5 ， n a c l0 0 5 ， m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 5 ， f e s 0 4 - 7 h 2 0 0 0 0 1 ， a g a r 1 5 ， p h 7 o _ 7 2 5 6 种子培养基( ) ：用于黑暗链霉菌培养 s o y a jb e a n 1 0 ， g l u c o s e1 0 ， 1 6 正文 p e p t o n e 0 3 ，y e a s tp o w d e r0 1 ， c o r np o w d e r0 5 ， c a c 0 3 ( 1 i g h 0 o 1 ， p h n a t u r e t a pw a t e r 5 7 发酵培养基( ) ：用于黑暗链霉菌培养 s o y a lb e a n ，g l u c o s e ，s o l u b l es t a r c h ，y e a s tp o w d e r c a c 0 3 ( 1 j g h t ) ，t a pw a t e r , e t c p h n a t u r e 5 8 生物检定培养基( ) ：用于妥布霉素效价的生物检定 p e p t o n e 0 5 ， b e e fe x t r a c t 0 3 ， k 2 h p 0 4 3 h 2 0 0 3 ， a g a r 1 5 ， 。 p h 7 8 8 0 5 9m s 培养基( ) ：用于链霉菌和大肠杆菌间质粒的接合转移 m a n n i t o l 2 0 ， s o y a lb e a n 2 0 ， a g a r 1 5 ， m g c l 2 6 h 2 0 1 0m m o l l ( 灭菌后加入) ， p h n a t u r e ，1 1 5 2 0 m i n 6 仪器 上海医用分析仪器厂t g l - 1 6 g 台式高速离心机 上海沪南科学仪器联营厂2 0 2 2 型电热恒温干燥箱 南通科学仪器厂电热培养箱 北京智源通生物技术研究所u v - v i 型紫外透射仪 北京六一仪器厂d y y - h 1 2 型稳压稳流电泳仪和d y y - m 型电泳槽 x s z - 1 0 7 型光学显微镜 s a n y o 公司超低温冰箱 s a r t o r i u s 公司b p 2 1 0 s 电子天平 h i t a c h ic r 2 1 g 高速冷冻离心机 m jr e s e a r c h i n c 的p c r 仪 正文 实验方法 1 大肠杆菌质粒d n a 小量提取 接种单菌落到3m l 含相应抗生素的l b 液体培养基中，3 7 ( 2 振荡培养过夜。将 菌液转移到e p p e n d o r f 管中，1 0 ，0 0 0r m i n 离心3 0s ，弃上清。加入1 0 0 山溶液i 振 荡悬浮力口入2 0 0 山溶液颠倒混匀，冰浴1 0 m i n l 加入1 5 0 山溶液，冰浴1 5 n f i n 。 1 0 ，0 0 0r r a i n 离心5r a i n ，转移上清至一新的e p p e n d o r f 管中，加入1m l 无水乙醇， 颠倒混匀，2 0 放置3 0r a i n ，1 2 ，0 0 0r m i n 离心1 0r a i n ，弃上清，沉淀后用7 0 乙醇洗涤，室温干燥，根据质粒的拷贝数溶于2 0 5 0m t e ，一2 0 c 保存备用。 2 大肠杆菌质粒d n a 大量提取 按小量提取法数倍扩大 3 链霉菌质粒d n a 的提取 将链霉菌菌种从斜面上挖块接种到2 0m l 含定浓度抗生素的r 2 y e 液体培养 基中，2 8 c 振荡培养4 8h 。取1m l 菌液于e p p e n d o r f 管中，1 0 ，0 0 0r r a i n 离心1 l a i n 收集菌体。将菌体悬浮于5 0 0 山t s e 缓冲液中( 溶菌酶2 m g m 1 ) ，3 7 c 作用3 0 r a i n ， 加入2 5 0m 碱性裂解液( 3 0 0n n n o l ln a o h ，2 s d s ) ，迅速颠倒混匀，6 5 1 3 水浴 放置1 5 r a i n ，取出冰上放置3 r a i n ，加入8 0 山酸性苯酚：氯仿( 1 ：1 ，v v ) 溶液，混 匀，冰上放置1 0 r a i n ，1 0 ，0 0 0r r a i n 离心1 0 r a i n ，将上清液转移到另一新的e p p e n d o r f 管中，用等体积的中性苯酚抽提一次，再用等体积的中性苯酚：氯仿( 1 ：1 ，v v ) 抽 提一次，最后用等体积的氯仿抽提一次。取出上层水相加入0 6 1 0 倍体积的异丙 醇沉淀d n a ，2 0 放置6 0r a i n ，1 5 ，0 0 0r r a i n 离心1 0r a i n ，弃去上清液，室温干燥， 沉淀溶于2 0i j lt e 缓冲液中，2 0 保存备用。 4 链霉菌总d n a 的提取 4 1 菌丝体培养将链霉菌菌苔从斜面上挖块接种到2 0m lc p 液体培养基中，3 t c 振荡培养2 4 3 0h 。 4 2 菌体收集取5m l 菌液3 0 0 0 r m i n 离心1 0 r a i n 。 4 3 溶菌5m ls t e ( 溶菌酶1 0m g m 1 ) 悬浮菌体，3 t c 水浴3 0r a i n ，取少量s d s 检查，变粘后加入5m l2 的s d s 溶液，5 0 c 水浴3 0r a i n 。 正文 4 4 除蛋白加入等体积的中性苯酚和氯仿，混匀为白色悬浊液后冰浴放置2 3h ， 1 0 。0 0 0r r a i n 4 c 离心1 0 r a i n ，小心吸取上清于另一管中，加入等体积的苯酚氯 仿抽提一次，离心取上清加入等体积氯仿抽提一次。 4 5 沉淀d n a 离心收集上清，加入1 1 0 体积3m o l l n a a c ( p h7 0 ) 和等体积的异 丙醇，缠绕出d n a 。 4 6d n a 纯化分别用7 5 、8 5 和无水乙醇洗涤总d n a ，待乙醇挥发干后，加入 t eb u f f e r 溶解，加入r n a s e3 7 保温2h ， 2 0 保存备用。 5 大肠杆菌d h 一5 c t 感受态细胞的制备 接种大肠杆菌的单菌落于3m ll b 液体培养基中，3 t c 振荡培养过夜。取1m l 培养好的菌液转接到5 0m ll b 液体培养基中，3 7 ( 2 振荡培养1 5 2 0h ，使 o d 6 0 0 = 0 5 0 6 。将菌液倒入离心管中，冰浴1 0r a i n ，3 0 0 0r r a i n 离心1 0r a i n ，弃上 清，菌体悬浮于2 0m l 预冷的0 1 m o f l c a c l 2 中，冰浴2 0 r a i n ，3 0 0 0r m i n 离心1 0 m i l l ， 弃上清，茵体重新悬浮于2m l 预冷的0 1m o f lc a c l 2 中，加入2 m l3 0 0 4 0 甘油，混 匀。2 0 0 山分装于e p p e n d o r f 管中，2 0 保存备用。 6 质粒d n a 转化大肠杆菌 取1 0 0 山感受态细胞，加入1 0v ld n a 溶液，吹吸混匀，冰浴3 0r a i n ，4 2 c 热 休克1 5r a i n ，冰浴2r a i n ，加入8 0 0 山l b 液体培养基，3 7 c 温育1h ，取适量涂布 于含抗性选择标记的l b 平板，余者4 c 保存。含b - g a l 基因筛选标记的载体克隆时 加入2 0 陷，m lx g a l 和3 0p g m li f f g ，l b 平板倒置，于3 7 c 培养过夜，挑取转化 子进行筛选。 7 d n a 酶切和连接 d n a 酶切：按产品说明书进行，一般3 t c 作用2 5h 。 载体的c i a p 处理：经酶切的载体d n a 在5 0m 反应体系，含1 l l l 的c i a p ， 去磷酸化反应3 7 cx 3 0r a i n ，5 0 x 3 0r a i n ；后7 5 cx1 0r a i n 失活c i a p 酶。然后 加入4 0 0 山t