（生物化学与分子生物学专业论文）产细菌素paracin17菌株群体感应行为初探.pdf

中文摘要 中文摘要 副干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p a r a c a s e i ) h d l 7 是从酸菜发酵液中分离出的一 株乳酸杆菌。研究发现，该菌的发酵液中存在一种抑菌性能比天然防腐剂n i s i n 还 优越的细菌素类物质p a r a c i n l 7 ，目前人们对副干酪乳杆菌产细菌素p a r a c i n l 7 及 其是否存在群体感应的调控知之甚少。本课题主要通过两方面对h d l 7 群体感应 系统及其与细菌素p a r a c i n l 7 抑菌活性的表达之间的关系展开研究。 本课题是研究副干酪乳杆菌h d l 7 在不同茵体密度下合成细菌素p a r a c i n l 7 抑菌活性表达的变化趋势。研究表明在不同发酵条件下细菌素p a r a c i n l 7 的抑菌活 性与h d l 7 菌体密度密切相关，并确定阈值密度培养条件；并通过在正常密度和 阈值密度两种培养条件下，分别添加低浓度和高浓度的信号分子溶液后再发酵的 这种方法，证明发酵液中含有信号分子，其为影响细菌素p a r a c i n l 7 抑菌活性主要 因素；而添加不同浓度( 菌体密度为1 0 6 、1 0 7 、1 0 8 和1 0 9 个m l ) 的经过酶处理和 未经酶处理的信号分子溶液后再发酵试验发现，细菌素p a r a c i n l 7 即信号分子，其 自身浓度在调控作用中为主要影响因素。并通过高密假设试验研究表明在一定的 菌体密度范围内( 1 0 8 个m l ) ，细菌素p a r a c i n l 7 抑菌活性与h d l 7 菌体密度成正 比，一旦菌体密度超过这个范围( l0 8 个m l ) ，其抑菌活性的表达并不随菌体密 度的增加而增加，甚至会抑制细菌素p a r a c i n l 7 的抑菌活性的表达。此研究结果初 步说明副干酪乳杆菌h d l 7 的群体感应系统调控细菌素p a r a c i n l 7 的生物合成， 并且细菌素p a r a c i n l 7 在调控作用中其自诱导作用占主导地位。 另一方面试验研究不同菌株即原始菌株h d l 7 与突变菌株y 兀- n 1 1 在相同的 菌体密度下产细菌素p a r a c i n l 7 水平差异性，结果表明n l l 的细菌素p a r a c i n l 7 产 量是原始菌株的6 9 9 倍。最终获得了产细菌素p a r a c i n l 7 的高产菌株y t t - n 1 1 ， 这为之后在分子水平上对h d l 7 的群体感应系统调控细菌素p a r a c i n l 7 的生物合 成的研究奠定良好的基础。 本研究首次得到了副干酪乳杆菌h d l 7 的q s 系统调节其生物合成细菌素 p a r a c i n l 7 的直接的实验性证据，为细菌素p a r a c i n l 7 生产产量的提高提供了一定 黑龙江大学硕士学位论文 的技术指导。另外对l p a r a c a s e i h d l 7 群体感应调控系统的机理及产细菌素条件 优化等方面的研究奠定基础，这使得细菌素p a r a c i n l 7 及其合成系统具有更广阔的 开发和利用空间。为提高细菌素产量并广泛应用于食品，药品行业奠定了基础。 关键词：副干酪乳杆菌h d l 7 ；细菌素p a r a c i n l 7 ；群体感应；菌体密度 i l a b s t r a c t a b s t r a c t l a c t o b a c i l l u s p a r a c a s e ih d 1 7w a si s o l a t e df r o mc h i n e s es a u e r k r a u tj u i c ei n2 0 0 3 i th a db e e np r o v e dt h a tt h es t r a i nc a np r o d u c eak i n do fn o n - a c i da n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ， w h i c hh a db r o a ds p e c t r u mo fi n h i b i t i o n i ti ss u p p o s e dt h a tt h ep r o d u c t i o no fp a r a c i n1 7 m a yb er e g u l a t e db yt h eq u o r u ms e n s i n gs y s t e mo fl p a r a c a s e ih d 1 7 f o rt h i s h y p o t h e s i s ，t h et o p i cw i l lp r o v ei t i nt h ep h y s i o l o g i c a ll e v e l 1 1 1 ei s s u em a k e st h e d e m o n s t r a t i o na b o u tt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h eq u o r u m s e n s i n go fh d1 7a n d p a r a c i n l 7a c c u m u l a t i o nb yt w oa s p e c t s o nt h eo n eh a n d , r e s e a r c ho nt h ed i v e r s i f i c a t i o no ft h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo f b a c t e r i o c i np a r a c i n l 7i nad i f f e r e n tc e l l d e n s i t y s t u d i e sh a v es h o w nt h a tt h e a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fp a r a c i n l 7w a sc l o s e l yr e l a t e dt ot h ec e l ld e n s i t yo fh d l 7b y f e r m e n t a t i o ni nd i f f e r e n tc u l t u r ec o n d i t i o n s o nt h i sb a s i s ，a f t e ra d d i n gl o w - d e n s i t y c o n c e n t r a t i o n sa n dh i 曲一d e n s i t yc o n c e n t r a t i o n so fa u t o i n d u c e r , i tw a ss h o w e dt h a tt h e a u t o i n d u c e rw h o s ec o n c e n t r a t i o nw a st h em a i nf a c t o ro fa f f e c t i n gb a c t e r i o c i np a r a c i n l 7 a c c u m u l a t i o n ；m e a n w h i l e ，b a s e do nt h ec o n c l u s i o nt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no fs i g n a l i n g m o l e c u l e si sa sd i f f e r e n ta st h ec e l ld e n s i t yo fh d1 7b yf e r m e n t a t i o n , a f t e ra d d i n g d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fa u t o i n d u c e r ( b a c t e r i a ld e n s i t yi s10 6 、1 0 7 、10 8 和1 0 9 a m i ，) i tw a sf o u n dt h a tp a r a c i n l 7a st h ea u t o i n d u c e rs e l f - i n d u c e dd o m i n a t e di nr e g u l a t i o n b y a s s u m i n gh i g hd e n s i t y , t h es t u d ys h o w e dt h a tt h ea c t i v i t yo fb a c t e r i o c i np a r a c i n l 7w a s i n c r e a s e dw i t ht h ec e l ld e n s i t yo fh d1 7i nac e r t a i nc e l ld e n s i t yr a n g e ( 10 8 a m l ) ，t l l ee x p r e s s i o no fa n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw a sn o t i n c r e a s e d 谢t l lt h ec e l ld e n s i t y , e v e ns u p p r e s st h ea c t i v i t yo fb a c t e r i o c i np a r a c i n l 7 ， w h i c hp r o v e dt h a tt h eq u o r u m - s e n s i n gs y s t e mo fl p a r a c a s e ih d 1 7 r e g u l a t e dt h e e x p r e s s i o no fa n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fb a c t e r i o c i np a r a c i n l 7 ，a n dp a r a c i n l 7a st h e a u t o i n d u c e rs e l f - i n d u c e dd o m i n a t e di nr e g u l a t i o n o nt h eo t h e rh a n d ，c o m p a r i n gt h ep r o d u c t i o no ft h eb a c t e r i o c i nb e t w e e nt h e o r i g i n a ls t r a i nh d 1 7a n dt h em u t a n ts t r a i ny r r _ n1 1 i nt h es a m ec e l ld e n s i t y y 1 _ r - n1 1 w a so b t a i n e db yn t gm u t a g e n e s i so ft h eh d l 7 ，a n dt h e nm a d et h es t r a i n sh d l 7a n d y r r n1 1f e r m e n t a t i o na tt h es a m ec o n d i t i o n s i tw a ss h o w e dt h a tt h ep r o d u c t i o no ft w o i i i 黑龙江大学硕士学位论文 s t r a i n sw e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t ，t h es t r a i nn11i s6 9 9t i m e so ft h eo r i g i n a ls t r a i no n b a c t e r i o c i np a r a c i n l 7a c c u m u l a t i o n a sar e s u l t ，w eo b t a i n e dy n n 1 1 ，ah i g h - y i e l d i n g s t r a i no fp r o d u c i n gb a c t e r i o c i np a r a c i n1 7 ，w h i c hw i l lp r o v i d eag o o df o u n d a t i o nf o rt h e r e g u l a t i o no fb a c t e r i o c i np a r a c i n l 7b yt h eq u o r u m s e n s i n go fh d1 7a tt h em o l e c u l a r l e v e l t h er e s u l t sa b o v ea r et h ed i r e c te x p e r i m e n t a le v i d e n c et h a tq ss y s t e mh a sb e e n r e g u l a t e do nb i o s y n t h e s i so fb a c t e r i o c i np a r a c i n l 7f o rt h ef i r s tt i m e ，w h i c hw i l lp r o v i d e t h et e c h n i c a lg u i d a n c ef o ro b t a i n i n gh i g h y i e l d i n go fb a c t e r i o c i np a r a c i n1 7 a na m o u n t o fd a t ai nt h i ss t u d yw o u l ds u p p o r tt h ei d e aa n dt h i sw o r kw i l lb ev e r ys i g n i f i c a n t b e c a u s eo ft h ef e wd a t ai nt h i sf i e l d i nt h i sw a y , w ew i l lh a v em o r ea c q u a i n t a n c ew i t l l t h em e c h a n i s mo fb a c t e r i o c i np a r a c i n l 7 ，a n dp r o v i d eat h e o r e t i c a lb a s i sf o rt h ec o n t r o l o fb a c t e r i o c i ns y s t e ma n dt h eo p t i m i z a t i o no fb a c t e r i o c i np r o d u c t i o n , w h i c hm a k e p a r a c i n l 7a n di t ss y n t h e s i ss y s t e mh a v i n gm o r ee x t e n s i v ed e v e l o p m e n ta n ds p a c e i n o r d e rt oc o m p l e t et h es t u d y , i ts h o u l db ea n a l y z i n gh ep r o c e s sa n dm a n n e ro ft h eq s s y s t e mr e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no fp a r a c i n l 7 k e y w o r d s ：l a c t o b a c i l l u sp a r a c a s e ih d l 7 ：p a r a c i n l 7 ：q u o r u ms e n s i n g ；b a c t e r i a l d e n s i t y i v 缩略语表 缩略语表 缩略语英文名 中文名 h d l 7 上脚幻6 口c 肌淞彤聊甜p f 副干酪乳杆菌h d i 7 h d l7 口。j 日口1u 。l l 口。 a m p s a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s q s q u o r u ms e n s i n g a u t o i n d u c e r s 抗菌肽 群体感应 自身诱导素 a h l n a e y l h o m o s e r i n el a c t o n e s n 一酰基高丝氨酸内酯 a b c a t p - b i n d i n gc a s s e t t e t c s t w oc o m p o n e n ts y s t e m a i pa u t o i n d u c e rp r o t e i n a p a c c e s s o r yp r o t e i n o h h l a t p 一结合盒 双组分系统 自诱导肽 辅助蛋白 n ( 3 - o x o h e x a n o y l ) 一 n 3 氧已酰基高丝氨酸内酯 l h o m o s e r i n el a c t o n e g 。 g r a m n e g a t i v eb a c t e r i a g + g r a m p o s i t i v eb a c t e d a 革兰氏阴性细菌 革兰氏阳性细菌 v i i i 黑龙江大学硕士学位论文 o h h l n 一( 3 - o x o h e x a n o y l ) n - 3 一氧已酰基高丝氨酸内酯 l - h o m o s e r i n el a c t o n e s a m s - a d e n o s y l m e t h i o n i n s 一腺苷甲硫氨酸 a c p a c y l c 州e rp r o t e i n s 酰基化酰基载体蛋白 m 蕾 m 蕾 m 上蔫 m 上清 m 一- l 5 m _ t _ t l m 曹+ l 5 m 上 1 0 8 1 0 8 1 0 8 一 1 0 s 9 1 0 8 。l o 1 0 8 - 1 0 发酵到稳定期的m r s 菌体；依此类 推i 5 m 曹。 发酵到稳定期的m r s 发酵上清液； 以此类推1 5 ml - m 。 发酵到稳定期的m r s 菌体与1 5 m r s 上清混合再发酵1 2 h ；依此类推 l 5 m 洲上清。 菌体浓度为1 0 8 时的发酵上清液，依 此类推1 0 7 ，1 0 9 ，1 0 1 0 。 将菌体浓度为1 0 8 时的发酵上清液浓 缩1 0 倍后，接入1 0 8 的菌体再发酵 2 4 h 得到的上清液。依此类推1 0 1 0 。 将菌体浓度为1 0 8 时的发酵上清液浓 缩1 0 倍后，接入1 0 8 的菌体再发酵 4 8 h 得到的上清液。依此类推1 0 9 。1 1 。 独创性声明 a m 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉堑太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名：旋舞 签字日期：抄扣年f 月咖日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕉堑太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨垄堑太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 7 0 咖 月 ，d 望力i手碍年 麦 扣辱弘 名 期 签 日 师 字 导 签 畸舢确啪粕阳 名 事 鹤 碑 者 吖 储 如 刘 辄 沦 日 位 字 学 签 绪论 第1 章绪论 1 1 副干酪乳杆菌的概述 1 1 1 副干酪乳杆菌特点及应用 ( 1 ) 副干酪乳杆菌的特点 副干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p a r a c a s e i ) 属于乳酸菌( l a c t i ca c i db a c t e r i a ，l a b ) 的干酪乳杆菌群【1 】，是一种兼性厌氧、不运动、无芽孢的杆菌或长杆菌，革兰染色 显示为阳性，过氧化氢酶实验为阴性。可发酵葡萄糖产l 乳酸。另外有研究表明【2 j ， 该菌还能产生一种具有抑菌或杀菌生物活性的细菌素，在抑制多种病原微生物和 食物腐败菌等方面具有重要意义。副干酪乳杆菌广泛存在于传统的发酵乳制品和 人体胃肠道中，还有少量报道表明也可从泡菜、发酵豆制品、发酵鱼制品以及一 些酒类如低度清酒和白兰地中分离得到该菌种【3 】。 ( 2 ) 副干酪乳杆菌的应用前景 副干酩乳杆菌具有十分重要的生理作用及经济价值，在工农业生产、食品发 酵及防腐、医疗保健、环境保护和科学研究等生物学领域均有巨大的应用潜力m 】。 尽管如此，相对于其他乳酸菌如嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o - p h i l u s ) 、乳 双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i s ) 、鼠李糖乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sr h a m n o s u s ) 、乳 酸乳球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i s ) 等，现阶段对于副干酪乳杆菌的研究还有待进一步 深入，副干酪乳杆菌发酵产品的品种相对单一。在我国，除了l p 3 3 和l p a r a c a s e i h d l 7 外，副干酪乳杆菌研究和应用的相关报道还较少网，而迄今为止，国外关于 该菌具有抑菌作用的性质出现一些报道【l o 1 1 1 。 n e m c o v a 等1 2 】证明l 册r 口c 嬲p f 可显著降低刚断奶幼猪体内梭菌属和肠杆菌的 数量；a t a n a s s o v a 等f 1 3 】用l p a r a c a s e is u b s p p a r a c a s e im 3 发酵，其产物对细菌和 霉菌均有抑制作用；研究表明，副干酪乳杆菌不仅对很多细菌有拮抗作用，还可 抑制酵母及霉菌的生长。已有大量资料表明，副干酪乳杆菌在益生菌领域有很广 阔的开发及应用前景。s c h w e n n i n g e r 等【1 4 】通过添加詹氏丙酸细菌 ( p r o p i o n i b a c t e r i u mj e n s e n i i ) 和副干酪乳杆菌副干酪亚种( 三p a r a c a s e is u b s p 黑龙江大学硕士学位论文 p a r a c a s e i ) 的混合培养物到酸奶中，证明其可在6 c 下能有效抑制酵母腐败菌、霉 菌等的生长；o r t i g o s a 等【1 5 】利用副干酪乳杆菌和植物乳杆菌混合发酵，所得的产品 与普通产品的物理化学性质类似，但肠杆菌和肠球菌数量显著降低。 1 1 2 副干酪乳杆菌细菌素的研究 细菌素( b a c t e r i o e i n s ) 这个术语最初用于描述大肠杆菌素的抗菌蛋白类物质， 现在已广泛用于定义大量核糖体合成的抗菌物质。乳酸菌产生的细菌素对病原菌 和食品腐败菌具有很强的抑制能力。它们在乳酸菌代谢产物中广泛存在，具有相 对固定的抗菌谱( 包括l i s t e r i a ，c l o s t r i d i u m 和革兰氏阳性细菌等) 。在这类物质中， 分子量小、热稳定好的细菌素被公认在食品保藏最具有开发和应用前景。 根据乳酸菌细菌素的组成、大小、热稳定性、作用方式、输出机制和抑菌谱 等，乳酸菌细菌素大致被分为4 类【1 6 】：( 1 ) 羊毛硫抗生素( 1 a n t i b i o t i e s ) ，是小的 热稳定肤( 分子质量 3 0 k d a ) 。( 4 ) 复合细菌素，活性除需蛋白部分外还需其他化学成分( 如 类脂，碳水化合物) 的作用。 近年人们对第一类和第二类乳酸菌细菌素进行了深人研究，有大量关于这些 天然抑菌剂特征的详细报道但只有少数被证明在食品和生物医学领域有重要的经 济潜能，如l a b 、a m p s 、n i s i n 和l a c t i c i n 3 1 4 7 被用作食物防腐剂。其中乳链菌肽 n i s i n 是最引人注目的羊毛硫抗生素类细菌素，它是由某些乳酸链球菌 ( s t r e p t o c o c c u sl a c t i s ) 和乳酸乳球菌l 1 a c t i s 在代谢过程中生成的具有高效、无毒、 耐酸、耐高温、无残留、无抗药性等特点的细菌素【2 0 1 ，其能抑制大部分革兰阳性 菌及其芽孢的生长和繁殖，包括对造成食品严重危害的许多腐败菌，特别是对金 黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 、链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 、肉毒杆菌 ( b a c i l l u sb o t u l i i - l u s ) 有强烈抑制作用。因此，n i s i n 已通过世界粮农组织( f a o ) 、 世界卫生组织( w h o ) 及美国食品和药物管理局( f d a ) 认证，在全世界约6 0 2 绪论 多个国家( 包括美国、欧盟和亚洲的一些的国家和地区) 被用作食品保护剂，并 获得了广泛的应用于用于食品防腐保鲜，亦被用来治疗牛乳腺癌。这也使细菌素 的研究成为微生物学研究中的一个活跃领域。 关于第二类细菌素，大量工作集中于乳酸片球菌素( p e d i o c i n ) 族细菌素的研 究，构成了第二类细菌素的最大亚组。p e d i o c i n 的三维结构研究发现，其n 端中 部形成独特的氨基酸序列，c 端0 【螺旋则与其抑菌活性密切相判2 1 1 。有趣的是 l e u c o c i n a ( 一种类似p e d i o c i n 的细菌素) 的抗菌活力依赖于反应的立体专一性， 暗示了p e d i o c i n 类细菌素和n i s i n 一样也是和靶细胞的特殊受体分子反应，有研究 报道验证了这个猜测瞄j 。现在只有p e d i o c i np a 一1 a c h 在工业中有应用。而目前报 道的副干酪乳杆菌细菌素只有p a r a c i n l 7 ，这种细菌素存在于副干酪乳杆菌( 上 p a r a c a s e i ) h d l 7 发酵液中，其最大的优点是可抑制多种g + 、g 一和酿酒酵母生长， 性能比上面提到的n i s i n 更为优越【2 3 】；已有研究证明该细菌素的分子量小于10 k d a ， 并且具有很好的热稳定性、对胰蛋白酶敏感、有很广的抑菌谱等特点1 2 4 。因此推 测这种细菌素可能是属于第二类小分子疏水性热稳定肽( 1 0 1 1 个 m l ) 上清液添加到低密度菌体发酵液( 1 0 5 个m l ) 中时，低密度菌体中细菌素 黑龙江大学硕士学位论文 的生成会迅速增加；另外发酵2 4 h 和4 8 h 的h d l 7 茵体发酵液，其抑菌能力相差 较大。以上种种现象表明副干酪乳杆菌h d l 7 产生细菌素p a r a c i n l 7 的产量可能 受到菌群密度影响和控制【2 5 1 。 1 2 细菌群体感应现象 细菌的群体感应( q u o r u ms e n s i n g ，q s ) 是依赖信号分子密度识别的一种调节 细菌群居行为及细胞之间相互交流的通讯机制，可调控基因表达，是细菌细胞外 信号传递的过程。即细菌通过可扩散的小分子信号，感知细胞群体的密度，从而 引起一些特定基因在细菌群体中的协调表达口3 1 。有些细菌会低水平地分泌被称为 自身诱导素( a u t o i n d u c e r s ，a i s ) 的小分子信号分子，细菌通过自身诱导素进行信 息的交流。当信号分子浓度较低时，它不足以诱导目的基因的表达。但随着细菌 浓度的增大，信号分子的浓度会增大，直至其浓度达到一定阈值时，就会诱导一 些结构基因及其自身合成基因的表达，进而产生更多的信号分子来诱导这两种基 因大量表达，如此形成一种正反馈机制。这种通讯机制的存在，使得细菌可以协 调基因的表达，进而协调其群体行为，使单细胞细菌的群体行为具有了某些多细 胞生命体的特征【2 6 1 。这种细胞与细胞之间的交流( c e l l - t o c e l lc o m m u n i c a t i o n ) 就叫 做q s 调控系统。 1 2 1 细菌群体感应的发现 长期以来，人们一直认为仅在多细胞生物中存在着细胞与细胞之间的信息交 流，细菌则是单纯地以单个细胞的生存方式存在于环境中。2 0 世纪7 0 年代，n e a l s o n 等【2 刀首次报道在海洋细菌费氏弧菌( p h o t o b a c t e r i u m f i s c h e r i ) 中发现了由其自身群 体感应调控的生物发光现象。由此揭开了人们认识、研究细菌群体感应的序幕， 有关这种现象的描述、作用机制以及相关菌株的特点等方面的研究引起人们极大 地兴趣。进入2 0 世纪8 0 年代后，调节发光现象的信息分子的结构被阐明【2 8 j ，同时， 从具有群体效应的哈维氏弧茵( b r i oh a r v e y i ) 获得的诱导荧光的功能性基因被克 隆到大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l d 中，并成功地以细胞密度依赖的方式在e c o l i 中诱 导出荧光。至2 0 世纪9 0 年代，研究证实在细菌中，无论革兰氏阳性菌( g + ) 还是 4 绪论 阴性菌( g ) ，都存在着细胞与细胞之间的信息交流1 2 9 1 。 截至2 0 0 6 年，科学家对近百种微生物的q s 进行了深入研究，发现有多种与微 生物q s 相关的化学信号分子，r e a d i n g 并- i i s p e r a n d i o l t 3 0 】按照自体诱导信号分子的性质 以及感应模式，将细菌q s 信息系统分为以下类型：( 1 ) 革兰氏阴性菌以n 一酰基高 丝氨酸内酯类( a h l s ) 及其衍生物作为信号分子的信息系统；( 2 ) 革兰氏阳性菌 中寡肤为信号分子的信息系统；( 3 ) l u x s a i 2 型的信息系统【3 1 】；( 4 ) a i 3 肾上腺 素去甲肾上腺素信息系统【3 2 1 。 ， 1 2 2 细菌群体感应的机理 1 2 2 1 革兰氏阴性( g 。) 菌群体感应及其信息系统 革兰氏阴性菌中典型的q s 系统为l u x i l u x r 调节系统【3 3 1 ，此为费氏弧菌调 节生物发光的q s 系统。大多数革兰氏阴性菌都有与此类似的调节机制3 4 1 ，其自诱 导剂为酰基高丝氨酸内酯的衍生物( n a c y l h o m o s e r i n el a c t o n e s ，n a h l s ) ，此类自 诱导剂是一类水溶性、膜透过性的两亲性化合物，可以自由穿越或通过特定的转 运机制透过细胞膜以保持膜内外浓度的一致，目前已经在细菌中发现了近5 0 余种 a h l s 信号分子1 3 引。g 菌的l u x i l u x rq s 系统中，l u x i 型蛋白是最广泛的一类 a h l s 合成酶，在细菌生长初期，l u x i 蛋白以s 腺苷甲硫氨酸( s a d e n o s y l m e t h i o n i n ， s a m ) 和酰基化酰基载体蛋白( a c y l c a r r i e rp r o t e i n s ，a c p ) 为底物合成自身诱导 物a h l s 。而a h l s 可根据其分子大小不同而选择经自由扩散或者主动运输通过细 菌细胞壁、膜，并在环境中累积，达到一定浓度阈值后，a h l s 进入细胞与胞内 d n a 结合蛋白l u x r 结合进而启动下游靶基因的转录【3 5 】，引起一系列的生理效应 ( 见图1 ) 。 墨垄三銮：翌吉：兰兰圣 国l - l 革兰氏阴性苗群体感应系统模式雷州 f i g l i q o o r u ms e n s i n g i n g r a m n e g a t i v eb a c t e r i a 1 2 2 2 革兰氏阳性( g + ) 菌群体癌应及其信息系统 g + 菌的o s 系统与o 甫不同，通过分泌修饰后的小分子寡肽类物质作为信号 分子感应菌群密度和环境因子的变化，并将环境信息传递给双组分信号转导系统 ( t w oc o m p o n e n ts y s t e m ，t c s ) ，后者再调控相关基因的表达。信号因子被称为自 诱导肽( a u t o i n d u c i n gp e p t i d e s ，a i p s ) ( 见图l 3 ) ，这些自诱导肚结构多变，但分 子量都较小，在5 1 7 个氪基酸残基之间。不同菌中前体肚的长度及组成差异较大， 形成的a i p $ 分子也不同，c 端第5 位是一个保守的半胱氪酸，它与c 末端的氨基 酸残基以硫酯键相连，形成类酯正是这些氧基酸序列以及空间结构决定了a l p 分子的特异性d q ( 见图1 - 2 ) 。 d p 娜c d。吐妇柚哟 w 下。叩 0 - - c = o a x p - i 口q 女o 一_ p - l ，坤1 e r , g w n 6 f d 岫k - i n c v n c 孔f i， s - - c oi i # _ f m 。弋墨。”“露。一一。 拈t c y n m i， e t 船f 岫r c 口僻_ _ * _ _ _ _ 柚日 # c = o i p 。4 _ ，_ i 岬日 图 - 2 部分革兰氏阳性菌中的信号分子唧 f i 9 1 2 t h e $ 1 r u c o l r eo f a u t o i n d u c e r i ns o m eo f g + b a c t e r i a 簟论 g + 菌o s 系统是由一个专一性的自诱导肽转运系统与一个调节信号转导系统 ( t c s ) 组成的，也被称为三组分系统( 见图l 一3 ) 。其原理是首先在细菌体内台成 a i p s 的前体这些寡肽前体经过一系列的修饰加工后成为有活性且稳定韵寡肚信 号( a l p s ) ，然后通过a b c 转移酶( a t p b i n d i n gc a s s e t t e t r a n s p o r t e r ) 与a t p 结台 的转运复合物分泌到细胞外l ”l 。当分泌到细胞外的自诱导荆a i p s 浓度达到一定阀 值时，双组分感应识别元件就会探测到这种信号分子，激活特定的受体酶蛋白， 并与细胞膜上的组氨酸激酶( h i s t i d i n ep r o t e i nk i n a s e ，h p k ) 感受器结合，使自身 一个保守的组氨酸残基( h ) 上进行磷酸化，然后再将磷酸基团信号传递给下游的 反应调节蛋白( r e s p o n s er e g u l a t o rp r o t e i n ，r r ) 天冬氮酸残基( d ) 磷酸化，最后 磷酸化的反应调节蛋白结合d n a 特异的目的启动子，并调控某些基因的表达。目 前还未发现革兰氏阳性苗产生a h l 的例子。 图l o 革兰民阳性菹群体感应组氮酸激响应调节蛋白系统( 转白张票琴p ”) f i g3q u o r u m s e n s i n gs y s t e m s i n f o c d b o m e g r a m p o s i t i v eb a c t e r i a 研究证明g + 菌o s 系统参与多种生理过程，如金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ) 和变异链球菌( s t r e p t o c o c c u s m u t a n t s ) 的生物膜形成和致病力；粪肠球菌 ( e n t e r o c o c c u s f a e c a l i s ) 质粒接合转移能力：栖鱼肉杆菌( c a r n o b a c t e r i u m p i s c i c o l a ) 、屎肠球菌( e n t e r o c o c c i i s f e a c i u m ) 、乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i s ) 、 植物乳酸菌( l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ) 、沙克乳杆菌( l a c t o b a c i l l u ss a k e i ) 等调控 黑龙江大学硕士学位论文 细菌素合成【3 9 】。 表1 2 几种由寡肽介导的群体感应系统1 3 3 】 t a b l e1 - 2q u o r u ms e n s i n gm e d i a t e db ya u t o i n d u c i n gp e p t i d e s 近年研究发现，在某些g + 菌q s 体系中的a i p s 不仅是信号分子，还具有抗菌 能力，如乳酸球菌产生的乳链球菌素n i s i n ，不但作为信息调节细胞生物合成和免 疫基因的表达，也作为抗生素拮抗其他微生物d o 。植物乳球菌( 三p l a n t a r u m ) 产 生的植物乳杆菌素a 也有信息素和抗生素的双重活性【4 1 】。 这些具有抗菌能力的a i p s ( 即a m p ) 的基因簇中额外多了一个辅助蛋白 ( a c c e s s o r yp r o t e i n ，a p ) 编码基因，并与a b c 转运体编码基因的产物组成了这种 a i p s 输出和处理体系：其结构基因都位于其相应的免疫蛋白基因之前。产生的a p s 大多数富含半胱氨酸，具有疏水性。另外，a i p s 的最大生产量与产生菌的非最适 生长条件有关。a i p s 的合成大多数情况下是始于细菌对数生长期的中后期，在稳 定期达到最大值。这是因为在非最适生长条件下，细菌可以利用q s 在短时间内产 生大量的a m p ，使其浓度迅速增加，以杀死竞争者，同时可间接地阻止目标生命 体启动或发挥其防御反应，保证了a m p 的生产效率【4 2 】。 近年来已有不少学者研究发现，许多细菌群体当其菌体密度达到一个临界阈 值时，这些能产生杀死或抑制其他微生物的化学物质，这一现象被称为受群体感 应机制控制的细胞密度依赖性基因表达【4 3 】。郭秀春等研究表明海洋细菌假交替单 绪论 胞菌( p s e u d o a l t e r o m o n a ss p ) n j 6 3 1 代谢其抗菌物质时依赖于其细胞密度，具有 群体感应调控系统。同时发现外源细菌a u r e u s 可释放某些信号分子诱导细菌 n j 6 3 1 在低密度条件下产生抗菌代谢产物，这说明细菌n j 6 3 1 也可能同时存在 种间群体感应系统调控其抗菌物质的代谢【删。依据同样理化手段，王蔚璐研究变 异链球菌( s t r e p t o c o c c u sm u t a n t s ) 分泌的抗菌性多肽变链素，再次证明，变异链 球菌根据菌群密度的变化分泌和感应信号分子以调控变链素的合成和分泌，参与 菌群间的交流，调控牙菌斑生物膜的稳定性【4 5 】。另外，李曼采用理化手段和分子 生物学技术相结合的策略，首先构建基因缺失的q s 突变株，然后通过分别添加信 号分子和信号分子抑制剂手段与原始菌株比较p h a 积累量增减，以初步验证p h a 受菌体的群体感应调控，最后通过分子水平分析最终验证了铜绿假单胞菌的群体 感应系统正调控聚羟基脂肪酸酯( p h a ) 的生物合成【4 引。 到目前为止，人们对q s 的研究和探索多集中于g 菌，又鉴于g + 菌q s 涉及到一 些生物膜，毒素因子以及细菌素的生成，所以，人们对g + 菌q s 的兴趣日趋强烈， 而其相关方面的研发与应用也日趋成为了社会关注的热点。 1 2 2 3l u x s i a i 2 型的信息系统 上述q s 系统中的a h l 和a i p 信号分子和信号响应的方式具有细菌特异性， 在细菌种间无法进行交流。最近发现的l u x s 系统，其自身诱导素为2 ，在g + 菌和g 菌中均存在，因此细菌种间可通过其进行交流。最早的m 2 是在哈维氏弧 菌( h a r v e y i ) 发现的，它是一种依赖蛋白质l u x s 的信号分子，其分子结构是一 种呋喃酰硼酸二酯类化合物。目前已在沙门氏菌属( s a l m o n e l l a ) 、欧文氏菌属 ( e r w i n i a ) 、埃希氏菌属( e s c h e r i c h i a ) 等4 0 余种的g + 茵与g 菌中发现该类信号 分子，是细菌的“通用语言”【4 刀。细菌可以利用它来感知其他细菌的数量来调控自 身的行为1 4 s 。细菌识别a i 2 型信号分子的方式与革兰氏阳性细菌中双组分激酶的 识别系统完全一致，双组分激酶识别灿2 型分子后把磷酸化基团传递给受体蛋白， 从而启动相关的基因的表达。并且有研究发现