（药理学专业论文）裂殖壶菌schizochytrium+wzu4771的高密度培养.pdf

温卅l 医学院硕士学位论文 中文摘要 摘要目的：采用间歇流加技术研究株裂殖壶菌( s c h i z o c h y t r i u mw z u 4 7 7 1 ) 高密 度培养问题，同时探讨了从冷冻干燥的裂殖壶菌菌体提取油脂的方法。方法： 比较酸热法、有机溶剂提取法和超声波提取法提取裂殖壶菌中的油脂。在装有 3 l 培养基的5 l 发酵罐内，1 0 的接种量、培养温度2 5 、控制溶氧在1 0 饱 和度以下间歇流加葡萄糖进行发酵。结果：酸热法和超声波提取法的油脂得率 高于有机溶剂提取法；氯仿和甲醇的比例为1 ：1 时，油脂的得率最高。按照上 述方法进行发酵耗时6 4 小时，菌体浓度、油脂浓度、d h a 浓度分别为6 5 3 9 l 、 4 9 9 6 9 l 、7 5 7 9 l ，葡萄糖的菌体得率6 5 0 6 ；而在间歇流加葡萄糖的同时流 加1 的酵母粉时发酵耗时9 3 小时，菌体浓度、油脂浓度、d h a 浓度分别为 8 6 6 7 9 l 、6 5 4 7 9 l 、1 1 3 0 9 l ，葡萄糖的菌体得率3 2 3 2 。结论：从样品处 理能力、设备要求、油脂得率及油脂中d h a 得率综合考虑，提取裂殖壶菌中 d h a 的适宜方法为酸热法，氯仿：甲醇萃取剂的比例为2 ：1 。综合考虑发酵时 间、菌体得率等指标，确定适宜的方式为间歇流加葡萄糖。 关键词：裂殖壶菌；流加；油脂提取；d h a 温州医学院硕十学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c ta i m ：t 1 1 i sp a p e rs t u d i e dt h eh i g hd e n s i t yc u l t u r eo fs c h i z o c h y t r i u m w z u 4 7 71b yf e d b a t c h ，c o m p a r e dt h em e a t h o d so fl i p i de x t r a c t i o n m e t h o d s ： c o m p a r s i o no nl i p i d se x t r a c t i n go fs c h i z o c h y t r i u mw z u 4 7 7 1 b ya c i d h e a t i n g e x t r a c t i o n ，o r g a n i cs o l v e n te x t r a c t i o na n du l t r a s o n i ce x t r a c t i o n b yf e e d i n gg l u c o s e i na5 lf e r m e n t e rw i t h3 lm e d i u m r e s u l t s ：t h ep r o d u c t i o nr a t e so fl i p i dw e r e h i g h e rb ya c i d h e a t i n ge x t r a c t i o na n du l t r a s o n i ce x t r a c t i o nt h a no r g a n i cs o l v e n t e x t r a c t i o n t h ep r o d u c t i o nr a t eo fl i p i dw a sh i g h e s tw h e nt h ep r o p o r t i o no fc h l o r o f o r m a n dm e t h a n o lw a sl ：1 t h eb i o m a s s ，t o t a l f a t t y a c i da n dd h ac o u l d r e a c h 6 5 3 9 l ，4 9 9 6 9 la n d7 5 7 9 la f t e r6 4 hf e r m e n t a t i o n ，r e s p e c t i v e l ya n dt h ey i e l do f m y c e l i u mo fg l u c o s ew a s6 5 0 6 ，u n d e rt h ec u l t u r ec o n d i t i o n ：i n o c u l a t i o na m o u n t 10 ，t e m p e r a t u r e2 50 c ，d i s s o l v e do x y g e n 10 a i rs a t u r a t i o n d u r i n gf e e d i n gg l u c o s e a tt h es a m et i m ea d d1 y e a s te x t r a c tt h eb i o m a s s ，t o t a lf a t t ya c i da n dd h ac o u l d r e a c h8 6 6 7 9 l 、6 5 4 7 9 la n d11 3 0 9 la f t e r9 3 hf e r m e n t a t i o n ，r e s p e c t i v e l ya n dt h e y i e l d o f m y c e l i u m o f g l u c o s e w a s3 2 2 3 u n d e rt h es a m ec u l t u r e c o n d i t i o n c o n c l u s i o n ：b yc o m p r e h e n s i v ec o n s i d e r a t i o no ft h ea b i l i t yt o t r e a t m e n to fs a m p l e ，t h er e q u i r e m e n t so fa p p a r a t u s ，t h ep r o d u c t i o nr a t eo fl i p i da n d d h a ，t h eo p t i m u mm e t h o do fe x t r a c t i n gl i p i do fs c h i z o c h y t r i u mw a sa c i d h e a t i n g e x t r a c t i o n ，a n dt h eo p t i m u mp r o p o r t i o no fc h l o r o f o r ma n dm e t h a n o lw a s2 ：1 b y c o m p r e h e n s i v ec o n s i d e r a t i o no ft h ef e r m e n t a t i o nt i m ea n dt h ey i e l do fm y c e l i u m ，t h e s u i t a b l ew a yw a si n t e r m i t t e n ts t r e a ma d dg l u c o s e k e yw o r d s ：s c h i z o c h y t r i u m ，f e d b a t c h ，l i p i d se x t r a c t i o n ，d h a 2 温州医学院硕士学位论文 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已 经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 关于学位论文使用授权声明 日期： 本人完全了解温州医学院有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将 学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权 将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇 编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 日期：日期： 学位论文作者签名： 导师签名： 5 0 温州医学院硕士学位论文 _ ，j 一 刖吾 d h a ( d o c o s a h e x a e n o i ca c i d ，2 2 ：6 a 4 7 1 0 1 3 1 6 1 9 ，全名二十二碳六烯酸) 是一 种重要的长链多不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a r ya c i d ，简称p u f a ) ，属于一3 系列。d h a 具有抗炎、健脑、保护视力、抗癌【l 】、降血脂、防动脉硬化【2 5 1 及延 缓和预防老年痴呆【6 】等生理作用。人和其它哺乳动物只有4 、5 、6 及9 去 饱和酶，缺乏9 以上的去饱和酶，因此无法自身合成d h a ，必须由食物来提供。 d h a 的来源主要有传统来源和非传统来源。传统来源d h a 主要是从鱼油中 获得，非传统来源有含d h a 的细菌、真菌及藻类。然而对真菌油脂及d h a 积累 研究的较多。产d h a 的真菌主要是较低级真菌中的藻状菌，主要有壶菌纲( c l a s s c h y t r i d o m y c e t e s ) 、卵囊菌纲( c l a s so o m y c e r e s ) 、霜霉目( o r d e rp e r o n o s p o r a l e s ) 、 水霉目( o r d e r s a p r o l e g n i a l e s ) 、结合菌纲( c l a s sz y g o m y c e t e s ) 、虫霉目( o r d e r e n t o m o p h t h o r a l e s ) 等，特别是破囊壶菌( t h r a u s t o c h y t r i i d a e ) ，其油脂含量及d h a 含量较高。 裂殖壶菌( s c h i z o c h y t r i u m ) 属于破囊壶菌科( t h r a u s t o c h y t r i a c e a e ) ，破囊壶菌 ( t h r a u s t o c h y t r i d s ) 是一类类似于微藻但缺乏叶绿体故而不行光合作用的真核微生 物，它属于嗜腐败微生物，广泛地存在于有机溶解物多和盐度高的环境中，在海 洋生态系统中扮演着有机物质分解者的角色。关于利用裂殖壶菌( s c h i z o c h y t r i u m ) 培养产d h a 的研究国内外已有许多报道，1 9 9 8 年，t n a k a h a r a 等【7 】利用 s c h i z o c h y t r i u ml i m a c i n u ms r 2 1 在葡萄糖的浓度为9 时得到最大量的d h a ，为 4 9 l ；而在1 9 9 7 年时，t n a k a h a r a 等【8 】就已经用发酵罐中在不同的培养基中培养 s c h i z o c h y t r i u ms p s t r a i ns r 2 1 ，d h a 的量分别为1 3 3 9 l 和1 5 5 9 l ；2 0 0 6 年， a d a mm b u r j a 等【9 】优化了培养条件，发酵o n t t 18 得到4 6g l 的d h a ，且总 脂可以达到菌体的8 0 左右。关于采用流加生产d h a 的报道较少，任路静等【1 0 】 利用c r y p t h e c o d i n i u mc o h n i i 高密度发酵时采用了流加技术，经5 天的连续发酵 获得4 0 8 9 l 的d h a ；陈丽珠等【1 1 】采用流加发酵培养裂殖壶菌经1 2 0 h ，生物量、 脂肪酸及d h a 含量达最大，分别为6 0 6 、4 0 2 和8 0 9 l ，d h a 的累积速率为 温州医学院硕十学位论文 6 6 7 m g 1 h 。 目前报道的从真菌、微藻中提取油脂的方法主要有有机溶剂萃取法、超声波 提取法、酸热法、索式提取法和超临界萃取法等。有机溶剂萃取法提取率较低， 索氏提取法耗时长，超临界萃取法仪器要求较高。而其中酸热法是种操作简单 的方法，但据李植峰报道【1 2 】，该方法对提取二十碳以上的脂肪酸的能力尚有待 研究。 本文以分离自乐清湾的1 株裂殖壶菌【1 3 】( s c h i z o c h y t r i u mw z u 4 7 7 1 ) 为出发菌 株，该菌株具有生长速度快、油脂含量高、脂肪酸组成简单的特性，在前期的特 别是培养基优化研究的基础上，采用间歇流加发酵的方式，研究其高密度培养的 问题，并对利用酸热法萃取其中的油脂的可行性进行了探讨。 4 温州医学院硕二l 学位论文 第1 章裂殖壶菌油脂提取方法的研究 1 1 材料与方法 i i 1 实验材料 i i 1 1 实验样品 裂殖壶菌冷冻干燥的菌体 i i 1 2 试剂 d h a 甲酯( s i g m a ，u s a ) 花生酸甲酯( s i g m a ，u s a ) 花生酸( s i g m a ，u s a ) 氯仿、甲醇、盐酸等为国产分析纯。 1 1 1 3 仪器 k s 2 5 0 超声波细胞粉碎仪宁波科生仪器厂， 8 0 - 2 离心机，常州国华电器有限公司， f r e e z o n e4 5 冷冻干燥器，l a b c o n c ou s a ， i s o9 0 0 1 电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司， h h s 型水浴锅巩义市英峪予华仪器厂等， 岛津g c 一1 4 b 型气相色谱仪， 色谱柱：a t o v 一1 7 0 1 ( 3 0 m x 2 5 0 1 1 m x o 3 3 r t m ) ，兰州中科凯迪化工新技术有限 公司) 。 1 1 2 实验方法 1 - 1 2 1 油脂提取方法 油脂提取一般有索氏提取法，有机溶剂回流法，超声波提取法，c 0 。超临界 流体提取，酸热法等。提取所用溶剂有氯仿：甲醇，石油醚等。 1 1 2 1 1 酸热法【1 2 】 称取一定量的菌体，按每克6m l 的比例加入4m o l l 盐酸，振荡混匀，室 温放置3 0m i n 后，沸水浴煮3m i n ，- 2 0 * ( 2 速冷后加入2 倍体积的氯仿：甲醇， 充分振荡后，5 0 0 0r m i n 离心5m i n ，取氯仿层，加等体积的0 1 氯化钠溶液， 5 温州医学院硕士学位论文 混匀，5 0 0 0r m i n 离心5m i n ，取氯仿层移至干燥的试管中，挥发除去氯仿，得 到油脂，然后5 0 真空干燥至恒重，称量。 1 1 2 1 2 有机溶剂提取法 称取一定量的菌体至圆底烧瓶中，加入一定比例的氯仿：甲醇，6 5 水浴回 流2h ，过滤，残渣再用一半体积的氯仿：甲醇回流lh ，过滤，合并滤液，挥 发除去溶剂，5 0 。c 真空干燥至恒重，称量。 1 1 2 1 3 超声波提取法【1 4 】 称取一定量的菌体至离心管中，加入一定比例的氯仿：甲醇，超声粉碎1 5 m i n ，加入一定比例的蒸馏水，涡旋混匀后离心( 5 0 0 0r m i n 离心5m i n ) ，取氯 仿层，加等体积0 1 氯化钠溶液，混匀，5 0 0 0r m i n 离心5m i n ，取氯仿层至 恒重的试管中，挥发除去氯仿即得油脂，5 0 真空干燥至恒重，称量。 1 1 2 2 计算方法 油脂含量= ( 油脂重量，g ) ( 干菌体重量，g ) 1 0 0 单位体积菌液中油脂的含量( g l ) = 油脂含量( ) 细胞干重( g l ) 1 1 2 3d h a 含量的分析 目前检测脂肪酸最常用的方法是气相色谱法，由于脂肪酸的沸点比较高，脂 肪酸甲酯与相应的脂肪酸相比，在压力相同时，甲酯的沸点比相应脂肪酸的沸点 低，而且，在压力相同时，酯的沸点温差比相应脂肪酸沸点温差大。气相色谱 f i d 检测就是利用物质之间沸点的不同进行分析，所以检测前都要对脂肪酸进行 甲酯化。以下是对上述三种方法所提取的油脂进行甲酯化，然后进气相色谱分析 的步骤。 1 1 2 3 1 油脂甲酯化【1 5 】 三氟化硼催化油脂甲酯化是油脂甲酯化的一般方法，原理是甘油皂化后，释 放出的脂肪酸在三氟化硼存在下进行酯化。由于主要是检测d h a ，所以在萃取脂 肪酸甲酯物时要使用正庚烷代替正己烷。 适量油脂按一定比例加入k o h 一甲醇( o 5 m o l l ) ，6 5 水浴加热，待油脂溶 解后，加入一定量内标物花生酸与b f 。乙醚，继续加热反应。冷却至室温，加入 lm l 正庚烷，混匀，再滴入适量饱和氯化钠溶液，混匀，静置分层取上层，无 水硫酸钠脱水，进行气相色谱测定。岛津g c 一1 4 b 型气相色谱仪，色谱柱： 6 温州医学院硕士学位论文 a t o v 一1 7 0 1 ( 3 0 m x 2 5 0 p m x 0 3 3 p r o ) ( 兰州中科凯迪化工新技术有限公司) 。 1 1 2 3 2 气相色谱分析d h a 含量 1 1 2 3 2 1 气相色谱条件 色谱条件：采用程序升温，初始温度1 8 0 c ，保持2m i n ，然后按5 。c m i n 升到2 4 0 c ，保持1 6m i n ；进样口温度2 5 0 。c ；f i d 检测器，检测器温度2 6 0 c 。 1 1 2 3 2 2 定性分析 取一定量的花生酸甲酯和o i t h 甲酯的标准品混匀，进气相色谱。图谱如图1 - 1 。 f i d l 日( l y x 加c b 0 4 1 4 0 1d d 2 - 1 1 2 0 一 1 0 0 0 0 6 0 一 4 0 一 j 2 0 一 1 5 。7 5 ，j 1 2 。51 。51 ；5盎m ir 图l l 花生酸甲酯标准品和d h a 甲酯标准品( 1 9 3 8 8 ) 的气相色谱图 与标准品对比可知在相应位置出现峰，判断为d h a 。 l l 一 图1 2 不添加花生酸的样品甲酯化后气相色谱图 在花生酸甲酯的相应位置上未有峰出现。故花生酸可以作为内标使用。 7 温州医学院硕士学位论文 图1 - 3 加有内标( 花生酸) 的样品甲酯化后的气相色谱图 1 1 2 3 2 3d h a 的定量分析 d h a 的定量分析主要有内标法和外标法。 外标法：以d h a 甲酯为外标物，取d h a 甲酯配成一系列不同浓度的标准溶液， 分别取一定体积注入色谱仪，得到色谱图，测出峰面积，作出峰面积和浓度的关 系曲线，即标准曲线。然后在同样操作条件下进入相同量( 一般为体积) 的未知试 样，从色谱图上测出峰面积，由上述标准曲线查出待测组分的浓度。 外标法必须保证每次的进样量一致，这对于两端开口的毛细管来说很难实 现，因为载样量有限，往往要进行分流。分流比是在进样之前就设定的，但是样 品的真实分流比与预先设定的分流比并不相符，两者之间的相关关系随很多参数 的变化而变化。这些参数包括样品挥发度的范围、样品量、溶剂、注射的技术、 进样器温度及其内部体积。标准化的方法在进行定量分析时，应选用内标法。 故本实验采用内标法测定d h a 的含量。内标物为花生酸。以花生酸为内标物进行 d h a 含量计算方法如下： ( 1 ) 在d h a 甲酯标准品溶液中加入内标，计算校正因子f f = ( m 。a 。) ( a 。m 。) a 。：样品中d h a 甲酯标准品的峰面积 a ；：样品中内标物的峰面积 m ；：样品中内标物质量，g m “样品中d h a 甲酯标准品质量，g ( 2 ) 样品中d h a 甲酯的量i m 。= ( m ；x a 。) ( ( a 。f ) 温州医学院硕士学位论文 a 。：样品中d h a 甲酯的峰面积 a 。：样品中内标物的峰面积 m ；：样品中内标物质量g m 。：样品中d h a 甲酯质量g 1 1 2 3 2 4 内标法标准曲线的制作 分别配制不同比例的d h a 甲酯和内标物( 花生酸甲酯) ，混匀，分别进气相 色谱仪，以d h a 甲酯的浓度为横坐标，d h a 甲酯和内标物( 花生酸甲酯) 的峰面 积比为丛坐标，如图1 - 4 ：标准曲线方程为：y = 1 8 5 1 7 x + 0 0 2 9 2 ，相关性系数为 r = o 9 9 9 4 。 程 铤 爿 糕 谬 融 = 凸 2 o 1 8 1 6 0 4 o 2 o 0 o 0 0o 2 00 4 00 6 00 8 01 0 01 2 0 c d h a 甲酯c 花生酸甲酯 图卜4 内标法测d h a 标准曲线 1 2 结果与分析 1 2 1 三种油脂提取方法提取率的比较 由表l 一1 可知，酸热法和超声波提取法的提取率接近，而有机溶剂提取法的 提取率比酸热法和超声波提取法低得多。原因可能为，酸热法所使用的盐酸以及 超声波粉碎，均能破坏细胞壁，而有机溶剂萃取法并未破坏细胞壁。 9 温州医学院硕士学位论文 表1 - i3 种不同提取法油脂的得率= 3 ) 提取方法提取率 酸热法 有机溶剂萃取法 超声波粉碎提取法 7 2 5 8 士2 0 7 4 6 5 9 0 8 4 7 2 9 0 4 6 1 1 2 2 氯仿：甲醇比例对油脂提取率的影响 无论是超声波提取法还是酸热法，均用氯仿和甲醇为溶剂提取其中的油脂， 因此研究了不同比例的氯仿和甲醇对提取油脂得率的影响，结果见表1 2 。 由表1 2 可知，无论是酸热法还是超声波粉碎有机溶剂提取法，氯仿和甲醇 的比例为1 ：1 时，油脂的得率最高。在相同的氯仿：甲醇下，两种方法的油脂得 率相近。 表1 2 不同比例氯仿和甲醇萃取剂萃取油脂的得率比较 = 3 ) 由表1 3 可知，相同比例的氯仿：甲醇，无论是酸热法提取还是超声波提取， 其d h a 甲酯占菌体的含量基本相同。但随着氯仿比例的增加，d h a 甲酯占菌体 的含量有增加的趋势。这可能是由于d h a 的c 链较长极性小的缘故，随着氯仿 比例增加极性变小，易于萃取出d h a 。但是如果仅仅用氯仿来萃取油脂，油脂 得率只有3 4 7 4 ，溶剂极性过小反而不利于油脂的提取，这可能和甘油中脂肪 酸的种类有关。当氯仿和甲醇的比例为2 ：1 时，油脂的量稍有降低，但油脂中 d h a 甲酯占菌体量最高。酸热法检测到的d h a 的量比超声波提取法稍低。 表1 3 不同比例的氯仿：甲醇萃取剂萃取的油脂中d h a 甲酯占菌体量0 = 3 ) 1 3 讨论 油脂的提取方法国内外文献报道的较多。1 9 5 9 年，b l i g h 和d y e r l l 6 】建立了一 种从组织中提取总脂的方法。利用氯仿：甲醇：水为l ：2 ：0 8 时成一相，可以充分接 l o 温州医学院硕士学位论文 触被提取组织，浸泡1 8 h ，然后再加入氯仿和水使三者比例为1 ：1 ：o 9 ，这时溶剂 分层，经离心，取下层，干燥即得总油脂。f o p p es m e d e s 等u t q 8 1 两次评价了b & d 方法，得出在油脂提取时增加甲醇的比例可以获得更高比例的油脂。这个方法的 出发点很好，提取溶剂成一相，接触组织充分，且避免加热，不饱和脂肪酸不易 被破坏，但是在整个操作上比较浪费时问。 李植峰等【1 2 】比较了索氏法、超临界c 0 2 萃取法、酸热法和有机溶剂法从雅 致枝霉和橙黄红酵母等微生物中提取油脂，认为酸热法是一种快速、简便、有效 的从真菌中提取油脂的方法。但是该法是否能提取二十碳以上的脂肪酸，没有确 切的定论。从本文的研究结果看，酸热法提取裂殖壶菌冷冻干燥样品中的d h a 得率与超声波法接近，显著高于有机溶剂萃取法，也就是说酸热法可以提取二十 碳以上的脂肪酸。 温州医学院硕士学位论文 第2 章裂殖壶茵5 l 发酵罐高密度培养研究 2 1 材料与方法 2 1 1 实验材料 2 1 1 1 菌种 裂殖壶菌( $ c h i z o c h y t r i u mw z u 4 7 7 1 ) ，从浙江省温州乐清湾西门岛南岙山 红树林的腐败落叶上分离到，菌种加2 0 甘油作为保护剂保存在- 7 0 c 冰箱内。 2 1 1 2 实验试剂 d h a 甲酯( s i g m a ，u s a ) 花生酸甲酯( s i g m a ，u s a ) 花生酸( s i g m a ，u s a ) 酵母膏( o x o i d e n g l a n d ) 正己烷，甲醇，氯仿，三氟化硼一乙醚，氯化钠，氯化钾，七水合硫酸镁， 硫酸钾，磷酸二氢钾，硫酸铵，二水合氯化钙，四水合氯化锰，七水合硫酸 锌，六水合氯化钴，二水合钼酸钠，五水合硫酸铜，六水合硫酸镍，七水合 硫酸亚铁，3 ，5 - - - 硝基水杨酸，氢氧化钠，酒石酸钾钠，亚硫酸钠，苯酚等 试剂均为市售分析纯。 2 1 1 3 仪器设备 岛津g c - 1 4 b 型气相色谱仪 色谱柱：a t o r - 1 7 0 1 ( 3 0 m x 2 5 0 p m x o 3 3 i j f n ) ( 兰州中科凯迪化工新技术有限 公司) ， f r e e z o n e4 5 冷冻干燥器l a b c o n c o ，u s a ， a v a n t ij - e 高效离心机b e c k m a nc o u l t e r ， l 5 - b s o l 立式压力蒸气灭菌器上海华线医用核子仪器有限公司 z h w y - 2 1 0 2 恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司 7 2 2 可见分光光度计上海欣茂仪器有限公司 i s o9 0 0 1 电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 f m g 一5 l 发酵罐上海国强生化工程装备有限公司 1 2 温州医学院硕上学位论文 d z f - 6 0 5 真空干燥箱 8 0 - 2 离心机 n i k o ny s l 0 0 显微镜 2 1 1 - 4 培养基 上海精宏实验设备有限公司 常州国华电器有限公司 江南光学仪器有限公司 种子培养基：3 0 9 l 葡萄糖，l o g l 酵母膏，溶于0 5 倍人工海水( 配方见 表2 - 1 ) 发酵基础培养基：同种子培养基。 以上培养基均在1 2 1 下灭菌2 0 m i n 后使用，p h 值为自然p h ，约6 2 0 。 表2 1 人工海水配方1 9 】 2 1 2 实验方法 2 1 2 1 菌株形态观察 在普通光学显微镜下观察裂殖壶菌( s c h i z o c h y t r i u m w z u 4 7 7 1 ) 的形态。 2 1 2 2 培养方法 2 1 2 2 1 菌种活化 将一7 0 保存的菌种接入装有5 0 m 1 种子培养基的2 5 0 m l 三角烧瓶，纱布封口， 2 5 ，2 0 0 r p m 摇床培养三天进行活化。 2 1 2 2 2 种子培养 将上述活化的菌种按5 的接种量转接到种子培养基中，2 5 ，转速2 0 0 r p m ， 培养4 8 h 。 2 1 2 2 3 发酵培养 温州医学院硕? f ：学位论文 将上述培养好的种子按1 0 的接种量进行接种，转入发酵培养基中进行发酵 罐培养，5 l 发酵罐装量为3 l 。在整个发酵过程中每隔大约4 h 取样检测葡萄糖含 量，同时留样测生物量，通过调节通气量和搅拌速度控制发酵过程的氧饱和度在 1 0 以下，发酵温度控制在2 5 ，并进行间歇流加，具体流加方法为： 补葡萄糖，当葡萄糖浓度降至l o g l 以下时，进行补料( 葡萄糖) ，每次补 糖量约3 0 9 l 发酵液，在第一次补料时开始留样( 用于检测油脂及d h a 含量) ，依 次循环，直至降糖缓慢； 补葡萄糖和酵母粉，补葡萄糖方式与单纯补葡萄糖流加发酵相同，同时在 氮源未耗尽之前，一次性补入l o g l 发酵液的酵母粉。 2 1 2 3 检测方法 2 1 2 3 1 生物量的测定 干重法：从发酵罐中取l o m l 发酵液至事先干燥称重过的离心管中，4 5 0 0 r p m 离心l o m i n ，蒸馏水洗涤两次，洗下的菌体于干燥箱1 0 5 。c 中干燥，称重。 细胞干重( d r yc e l lw e i g h t ) g l = w 折c e l ，1 0 0 0 v ( 捌。一细胞干燥后的重量，g ，v 一所量取的菌液液体积，m 1 ) 2 1 2 3 2 葡萄糖浓度的检测3 ，5 一二硝基水杨酸( d n s ) 比色法【2 0 】 在碱性条件下，葡萄糖变为烯二醇( 1 ，2 一烯二醇) ，与3 ，5 一二硝基水杨酸 在加热条件下反应，3 ，5 一二硝基水杨酸被还原成棕红色的3 一氨基- 5 - 硝基水杨酸。 在一定范围内葡萄糖的量与这种棕红色的物质的吸光值成正比。故利用分光光度 计在一定波长下测吸光值，通过工作曲线来计算葡萄糖的量。 2 1 2 3 2 1d n s 的配置 6 3 克3 ，5 一二硝基水杨酸溶于2 6 2 m 1 2 m o l 1 的氢氧化钠溶液中。将此溶液与 5 0 0 m l 含有1 8 2 克酒石酸钾钠的热水混合。向该溶液中再加入5 克重蒸酚和5 克亚硫 酸钠，充分搅拌使之溶解，待溶液冷却后，用水稀释至u l o o o m l 。储存于棕色瓶中 ( 需要在冰箱中放置一周方可使用) 。 2 1 2 3 2 2 检测波长的确定 2 0 0 n m 一6 0 0 n m 紫外扫描如图2 - 1 ，比较了4 8 0 h m 一6 0 0 n m ，为了消除因空白管 的影响，应该增大检测波长，但是增大检测波长，两者的差值将变小，误差将增 大，如果减低检测波长则准确度将下降。故由图2 - 1 且参考文献，检测波长定为 1 4 温州医学院硕士学位论文 5 5 0 n m 。 1 9 1 7 1 5 吸1 3 光1 1 度 0 9 o 7 o 5 0 3 o 1 4 8 0 4 9 0 5 0 0 5 1 0 5 2 0 5 3 0 5 4 0 5 5 0 5 6 0 5 7 0 5 8 0 5 9 0 6 0 0 波长( r i m ) 图2 1 空白管和待测管4 8 0 。6 0 0 n m 波长扫描 2 1 2 3 2 3d n s 法测定葡萄糖的工作曲线的绘制 首先准确称取0 1 克葡萄糖，溶解于蒸馏水中，定容于l o o m l 容量瓶中，混匀， 配成浓度为l m g m l 的标准葡萄糖溶液，备用。然后按照表2 - 2 中数据加入到试管 中，混匀。 表2 2 葡萄糖曲线的绘制 在沸水浴中反应5 m i n ，立即在一2 0 。c 冷却，然后定容至5 0 m l ，摇匀，在5 5 0 n m 处，以0 号管为空白测吸光度，如表2 2 。以葡萄糖浓度为丛坐标，吸光值0 d 5 5 0 为横坐标建立葡萄糖标准曲线如图2 2 ，标准曲线方程为：y = 1 6 9 0 4 x + 0 0 0 9 2 。 线性相关系数为0 9 9 9 9 6 。 为了测量的准确度，每换一次d n s 就对其做一次标准曲线。 2 1 2 3 2 4 发酵液中葡萄糖的检测 取发酵液在4 5 0 0 r p m 转速下离心l o m i n ，取上清液，稀释5 0 倍。用移液管 吸取稀释后的样品l m l ，加入1 5 m l d n s 试剂，再加入l m l 蒸馏水，沸水浴反应 1 5 温州医学院硕上学位论文 5 m i n ，冷水中冷却，加水至2 5 m l ，摇匀，以o 号管为空白参照，测5 5 0 n m 处吸 光值，根据标准曲线方程计算发酵液样品中的葡萄糖浓度。 o o o0 0 10 0 2o 0 3o 0 40 0 50 0 60 0 70 0 8 葡萄糖浓度g l 图2 2 葡萄糖标准曲线 2 1 2 4 油脂提取方法 采用酸热法，具体方法见第l 章。 2 1 2 5d h a 含量的分析： 采用气相色谱法，具体方法见第1 章。 2 1 2 6 溶氧的测定 使用溶氧电极实时检测。 2 1 2 7 p h 的测定 使用p h 电极实时检测。 2 2 结果与分析 2 2 1 摇瓶种子种龄的确定 为了使接进发酵罐内的裂殖壶菌能以较快的速度生长，种龄比较重要。种龄 决定种子的状况好坏。既要有足够的菌体数，又要保证茵体处于良好的状态。故 考查菌体的种龄。 按上述种子培养方法，定时测量生物量得到图2 - 3 的生长曲线，取对数后得 到图2 - 4 。 1 6 4 2 o 8 6 4 2 o l 1 l o 0 o o o 四裂登 温州医学院硕士学位论文 o 丑酬 霸 o2 0时间( h ) 4 06 0 图2 3 裂殖壶菌种子摇瓶培养生物量变化曲线 8 0 02 0 时间( h ) 4 06 08 0 图2 - 4 裂殖壶菌种子摇瓶培养取对数后的生长曲线 由图2 3 、图2 4 可知，裂殖壶菌在2 4 3 2 小时种子生长进入对数期末期。 但当以培养2 4 小时与3 2 小时的种子接入发酵罐后，生长很不稳定，在罐内有时 能生长有时不能生长。在显微镜下仔细观察种子培养过程中裂殖壶菌内部形态的 变化，发现培养4 8 小时的种子与3 2 小时或2 4 小时的种子明显不同，见图2 5 。 经试验培养4 8 小时的种子接入发酵罐后生长稳定。由图2 - 6 知，在裂殖壶菌生 长2 d ( 4 8 h ) 时，菌体内所含油脂含量达最大，接下来油脂含量逐渐下降，这与在 1 7 8 6 4 2 0 8 6 4 2 o 11111l o 5 0 5 0 5 0 3 2 2 l 1 o 0 专看h 温州目学院碗学位论文 显微镜下观察到的结果基本一致。因此确定摇瓶种子的培养时间为4 8 小时 葛够泸。 3 5r 3 0r 月盼董 1 蔓- 2 d3 dl t d 时间( d ) 图2 - 6 摇瓶中培养时间不周的毅殖壶菌苗体油脂含量变化曲线 22 2 发酵培养基起始葡萄糖浓度的确定 营养限制型是指微生物在营养富余的情况下，生长会受l 一定的抑制。根据 温州医学院硕士学位论文 在摇瓶内的研究表明，当培养基葡萄糖浓度过高时，会抑制裂殖壶菌生长，导致 其迟缓期明显延长，因此必需确定间歇流加发酵的发酵培养基的起始葡萄糖浓 度。 分别配制葡萄糖浓度为3 、6 和9 的发酵基础培养基，按上述方法进行5 l 发酵罐发酵实验，发酵罐装液3 l 。结果见图2 - 7 、图2 - 8 和图2 - 9 。 1 5 b 删 s 卅0 5 0 0 481 21 62 02 42 8 时间( h ) 图2 7 起始葡萄糖为3 的生长及降糖曲线 2 5 2 0 1 5 ，、 b ，o 篓 5 0 4 81 21 62 0 时间( h ) 图2 8 起始葡萄糖为6 的生长及降糖曲线 1 9 侣 住 佃 8 6 4 2 0 5 v 咖s 州 o 温州医学院硕士学位论文 4 0 3 5 3 0 2 5 西 删2 0 s 州1 5 1 0 5 0 o481 69 02 42 83 23 6 时f n j ( h ) 图2 - 9 起始葡萄糖为9 的生长及降糖曲线 由图2 - 7 、2 - 8 和2 9 取对数期的自然对数l n n 。n 。，得到图2 - 1 0 、2 - 1 1 和2 1 2 ，据此可以计算出葡萄糖浓度分别为3 、6 和9 时的平均比生长速率分 别为0 1 2 2 5 、0 0 8 8 7 、0 0 6 5 1 。 2 5 2 o 星1 5 z 三1 0 0 5 0 o 024 6 时问( h 8 ) 1 01 4 图2 1 0 起始葡萄糖为3 的生长曲线对数转换后对数期回归曲线 鬲v巡暴舞鼷 加 ：； 加 伯 。 温州医学院硕士学位论文 4 o 3 5 3 o 2 5 芝 之2 0 1 5 1 o 0 5 o o o51 01 52 02 53 0 时间( h ) 图2 1 1 起始葡萄糖为6 的生长曲线对数转换后对数期回归曲线 051 01 52 02 53 03 5 时间( h ) 图2 1 2 起始葡萄糖为9 的生长曲线对数转换后对数期回归曲线 由图2 - 7 、2 - 8 和图2 - 9 可以计算出，发酵培养基的葡萄糖浓度分别为3 、 6 和9 时，葡萄糖的菌体得率，结果见表2 - 3 。 表2 - 3 葡萄糖浓度分别为3 、6 和9 时葡萄糖的菌体得率及平均比生长速率 由表2 3 可知，当发酵基础培养基的葡萄糖浓度为3 时，葡萄糖的菌体得 率最高，为4 9 5 1 。即在葡萄糖浓度为3 时，葡萄糖的菌体得率最高，且平均 2 l 5 o 5 o 5 0 5 o 3 3 2 2 l 1 0 o 是u 刍 温州医学院硕士学位论文 比生长速率亦最大。故确定发酵基础培养基的葡萄糖浓度为3 。 不同葡萄糖浓度发酵过程的p h 变化趋势见图2 1 3 。由图2 - 1 3 可知，葡萄糖 浓度分别为3 、6 和9 时，发酵过程中的p h 变化趋势相似，在6 7 小时前上升， 然后急速下降，后期又上升。关于在发酵过程中应该怎样控制p h 来获取更多量 的d h a 还需要进一步研究。 7 0 6 5 6 o 5 5 毛5 o 4 5 4 o 3 5 3 o 0l o 时间( h ) 2 0 3 04 0 图2 1 3 葡萄糖浓度分别为3 、6 、9 时发酵过程p h 变化曲线 2 2 3 发酵起始p h 的选择 p h 不仅对菌体生长有影响，且对菌体内油脂及d h a 的积累也有影响。故需 要选择合适的p h 。 按照摇瓶培养裂殖壶菌的配方( 即发酵基础培养基) 配制培养基，然后用 l m o l l 盐酸和l m o l l 氢氧化钠来调整p h ，p h 分别为3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、 1 0 ，灭菌。将经活化的裂殖壶菌种子液按5 的接种量分别接入上述培养基( 2 5 0 m l 锥形瓶装量为5 0 m 1 ) 中，2 5 c ，2 0 0 r p m ，培养7 2 h 。取样，称重。结果如图2 - 1 8 。 温州医学院硕七学位论文 1 6 1 4 1 2 1 0 凹 蔷8 翥 6 4 2 0 图2 1 4 摇瓶中裂殖壶菌在不同p h 培养基中生物量变化 从图2 1 4 可知，裂殖壶菌耐酸碱的范围比较广，在p h 4 一p h 9 范围内在摇瓶 中都可以很好的生长。其中茵体浓度在p h 为6 7 时生物量达最大。然而配制的 原始培养基p h 在6 2 0 左右( 灭菌过后p h 有所降低) ，故在发酵培养时保持原 有的p h ，不再对其做出调整。 2 2 4 间歇流加葡萄糖高密度培养裂殖壶菌 裂殖壶菌( s c h i z o c h y t r i u m ) 在油脂积累时，需要高的碳氮比1 2 1 】。即在裂殖壶 菌基本上利用完氮源合成大量的蛋白( 有一部分是酶) 后，提供足够的碳源来合成 油脂，而起始的高浓度碳源又会抑制其生长，因此采用在裂殖壶菌发酵过程中不 断补充碳源的方式，同时为了保持高的生长速率，需要注意每次流加的葡萄糖量。 图2 1 5 为2 次发酵实验结果，从图2 1 5 可以看出，最大生物量为6 0 6 5 9 l 。 将生长曲线取对数后得到图2 1 6 ，从图中看出，两次流加发酵的菌体生长情况和 降糖速率基本一致。 温州医学院硕士学位论文 3 5 3 0 2 5 瓷2 0 毯 耋1 5 耀 1 0 5 o o 0 0 7 0 5 0 4 甓 面 。霸 2 0 0 1 0 o o2 0 o o 3 0 0 04 0 0 05 0 0 06 0 0 07 0 o o 时间( h ) 图2 1 5 两次间歇流加葡萄糖发酵培养裂殖壶菌的生长与降糖曲线 ol o2 03 04 05 06 07 0 时间( h ) 图2 1 6 两次间歇流加葡萄糖发酵培养裂殖壶菌对数转换后的生长曲线 o 5 o 5 o 5 0 5 o 4 3 3 2 2 l l o 0 号i 一i u h 温州医学院硕士学位论文 图2 1 7 两次间歇流加葡萄糖发酵培养裂殖壶菌的p h 变化曲线 图2 1 7 为流加葡萄糖发酵过程中p h 变化曲线，与图2 1 3 未中间补料的p h 变化曲线较相似，均在6 7 小时前上升，然后急速下降，后期又上升。 o 02 0 时间( h ) 4 0 6 08 0 图2 1 8 间歇流加葡萄糖发酵的生物量、降糖、油脂及d h a 变化曲线 图2 1 8 为整个发酵过程中，葡萄糖消耗、生物量增长、油脂积累及d h a 积 累曲线。从图中可以看出，发酵液中裂殖壶菌生物量与油脂浓度和d h a 浓度呈 正相关，随着发酵液中裂殖壶菌生物量的增加，油脂及d h a 浓度也增加。 把此图中的油脂及d h a 浓度变化换成另一种形式，即油脂占菌体的百分含 8 7 6 铪3“掣ji媚 2 ， o 0 0 o 0 o o o 7 6 5 4 3 2 1 _【捌必苦 皿固嗡害)枷墨m剞o捌娶髌两豫罂 温州医学院硕上学位论文 量及d h a 占油脂的百分含量，如图2 - 1 9 。从图中可以看出裂殖壶菌中油脂的百 分含 9 0 8 0 7 0 6 0 鑫s o 托 塞4 0 震 3 0 2 0 1 0 0 2 0 1 8 1 6 1 4 孚 1 2 面 1 0 篓 山 8 薹