（植物学专业论文）苹果果皮中α法尼烯和类黄酮的提取及其抗氧化能力研究.pdf

y 6 0 1 6 6 e 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：赴 导师签名：勰 日期：友翌竺薹6 冉蚰 苹果果皮中a 法尼烯和类黄酮的提取及 其抗氧化能力研究 院( 系) ：生命科学学院 专业：植物学 研究生：李红 张元湖教授 指导教师： 孟庆伟教授 摘要 苹果作为大众消费水果含有大量次生代谢物，法尼烯和类黄酮是苹 果果皮中一类重要的次生代谢物质，与果实的品质、贮藏过程中的病害、 昆虫诱导作用有关。 本研究以青香蕉苹果为材料，研究了苹果中的重要次生代谢物质a 法尼烯及类黄酮的分离提取和测定技术，并结合外源抗氧化剂，对不同处 理果皮提取物及类黄酮提取物清除d p p h 自由基的性能进行了探讨，主 要结果如下： 1 初步建立了苹果中旺法尼烯的提取分离的技术路线，为进一步研 究a 法尼烯及其生物学效应奠定了基础。 2 改进了a 法尼烯的测定技术。用紫外光谱法和h p l c 两种测定方 法测定了果皮中的a - 法尼烯含量。h p l c 测定法比紫外光谱法的测定结果 更精确。引起紫外光谱法测定值偏高的原因主要有：测定液中的其它物质 在2 3 2 n m 处也有吸收峰，使a 一法尼烯的吸收峰比实际吸收峰高。其次， 提取液在2 1 0 n m 处存在一强吸收峰，此峰可能会干扰并拔高2 3 2 n m 处的 吸收峰而使紫外光谱法测定的结果比实际值偏高。同时测定比较了不同处 理果皮的法尼烯含量。 3 建立了苹果果皮总黄酮的提取技术并测定总黄酮含量。采用正交 试验筛选了果皮总黄酮温浸法提取的最佳提取条件：水浴温度为6 5 ， 乙醇浓度为6 5 ，提取时间为2 h ，固液比为1 ：2 0 。此条件下测得总黄酮 得率为3 6 6 。同时测定比较了果皮阴面和阳面的总黄酮含量，果实阳面 果皮的总黄酮含量比阴面果皮总黄酮含量高。 4 用d p p h 法测定了总黄酮提取物、果皮水溶性提取物和脂溶性 提取物以及其它不同处理果实的清除自由基能力。通过试验证明，苹果果 皮提取物具有较强的清除d p p h 自由基的能力，说明苹果提取物含有能清 除羟基自由基、烷基自由基或者过氧自由基的抗氧化物质。果皮水溶性提 取物的抗氧化能力比脂溶性提取物的抗氧化能力强；果皮阳面提取物的抗 氧化能力比阴面果皮提取物抗氧化能力强。 5 外源抗氧化剂清除d p p h 能力的研究表明，芦丁和槲皮素对 d p p h 均有较强的清除能力，在一定浓度范围内，清除d p p h 的能力 随抗氧化剂物质量的增加而增加，槲皮素具有较强的清除d p p h 自由基 的能力。d p a 是一种传统用于虎皮病防治的抗氧化剂，也具有清除 d p p h 的能力。 关键词：苹果次生代谢物法尼烯总黄酮高压液相层析 抗氧化性能 2 一，。当垒当垄堡耋些兰鐾垒坠。，。一 i s o l a t i o na n da n t i o x i d a n t c a p a c i t y o f 值一f a r n e s e n e a n dt o t a lf l a v o n o i d sf r o ma p p l es k i n s d e p a r t m e n t ：c o l l e g e o f l i f es c i e n c e s m a j o r ：b o t a n y g r a d u a t es t u d e n tl ih o n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rz h a n g y u a n h u p r o f e s s o rm e n gq i n g w e i ， a b s t r a c t a p p l ei s o n eo ft h em o s tp o p u l a rf r u i t ，a n di s o fa b u n d a n ts e c o n d a r y m e t a b o l i t e s f l a v o n o i d sa n d0 【f a r n e s e n ea r et w ok i n d so ft h em o s ti m p o r t a n t s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ，w h i c hc o r r e l a t e dw i t hf r u i tq u a l i t y , s t o r a g ed i s o r d e r , a n di n s e c ta t t r a c t i o n t h e t e c h n i q u e s o fi s o l a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no f0 【一f a m e s e n e a n d f l a v o n o i d so f w h i t e p e a r m a i n a p p l e ，a n dt h ed p p h f r e er a d i c a ls c a v e n g i n g c a p a c i t i e s o fe x t r a c t sf r o ma p p l es k i n ，f l a v o n o i d si s o l a t e df r o mf r u i t ，a n d e x o g e n o u s a n t i o x i d a n t sw e r es t u d i e d t h er e s u l t sw e r e a sf o l l o w e d ： 1 t h ep r i m a r yi s o l a t i o n t e c h n i q u e o f0 【一f a r n e s e n ef r o ma p p l e sw a s o b t a i n e d ，w h i c hw a s o f p o t e n t i a lt ob eu s e dt oc o n t i n u e t os t u d yt h eb i o l o g i c a l e f f e c to fa f a m e s e n e 2 t h em e t h o d so f 旺f a r n e s e n em e a s u r e m e mw e r ei m p r o v e d t h ec o n t e n t o f 伐f a r n e s e n ei na p p l ew a sd e t e r m i n e da n dc o m p a r e db yh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) m e t h o d s a n d b y t r a d i t i o n a lu v 3 s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d ，r e s p e c t i v e l y t h e h p l cm e t h o dw a sm o r e a c c u r a t et h a nu v s p e c t r u mm e t h o d t h e r ew e r es o m ef a c t o r st h a ta f f e c t st h e r e s u l tb yu vm e t h o d ：t h e r ew e r eo t h e rc o m p o u n d sw h i c ha l s oh a v ea b s o r b e d a t2 3 2 n mi nm e a s u r e m e n t ，a n dt h e r ew a sa l s oa nh i g h e ra b s o r p t i o no f 2 1 0 h m ， w h i c hm a yd i s t u r bo rm a k e h i g h e r o f t h ea b s o r bp e a ko f a - f a m e s e n ea t2 3 2 n m 3 t h eo p t i m i z a t i o no fi s o l a t i o nm e t h o do ft o t a lf l a v o n o i d sf r o ma p p l e s k i nw a so b t a i n e db yu s i n go r t h o g o n a lt e s td e s i g n ，a n dt h ec o n t e n to ft o t a l f l a v o n o i d sw a sd e t e r m i n e d t h er e s u l ts h o w e dt h a t6 5 o fw a t e r - b a t h t e m p e r a t u r e ，1 ：2 0o f r a t i oo fs o l i dt oe t h a n o ls o l u t i o n ，a n dt w o h o u re x t r a c t i o n t i m ew e r et h eo p t i m a lc o n d i t i o n su n d e rw h i c ht o t a lf l a v o n o i d si na p p l es k i n w a s3 ，6 6 t h ec o n t e n to ff l a v o n o i d so fa p p l es h a d ea n ds u n - e x p o s e ds i d e w e r ea n a l y z e da n dc o m p a r e d t h es h a d e s i d e a p p l e s k i nh a sl o w e rl e v e l f l a v o n o i d st h a nt h es b l 3 一e x p o s e ds k i n 4 t h e 2 , 2 一d i p h e n y l 一1 - p i c r y l h y d r a z y l ( d p p h ) r a d i c a ls c a v e n g i n g c a p a c i t y o ft o t a l f l a v o n o i d s ，w a t e r - s o l u b l e a n d l i p i d s o l u b l e c o m p o u n d s i s o l a t e df r o ma p p l ew i t hd i f f e r e n tt r e a t m e n t sw a sd e t e r m i n e d e x t r a c t so f a p p l eh a ds t r o n ga n t i o x i d a n ta c t i v i t y a n ds c a v e n g i n gd p p h f r e er a d i c a l a b i l i t yw h i c hm e a n t t h a ta p p l ew a so ft h ea b i l i t yo f s c a v e n g i n gh y d r o x y lf r e e r a d i c a l ，s u p e r o x i d ea n i o na n da l k y lf r e er a d i c a l ，a n di n t e r r u p t i n gt h er e a c t i o n c h a i no fl d l p e r o x i d a t i o n a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo ft h ew a t e r - s o l u b l ee x t r a c t w a ss t r o n g e rt h a nt h a to f l i p i ds o l u b l e ，s u g g e s t i n gt h a tt h e r ew e r ea n t i o x i d a n t s w i t hd i f f e r e n tp o l a r i t yi na p p l e t h er a d i c a ls c a v e n g i n ga b i l i t yo f s u n e x p o s e d s i d eo f a p p l e w a s s t r o n g e rt h a ns h a d e s i d e 5 e x o g e n o u sa n t i o x i d a n t sw e r e a l s ou s e dt ot e s tt h ea b i l i t yo f s c a v e n g i n g d p p h f r e er a d i c a l r u t i na n dq u e r c e t i nh a ds t r o n gc a p a c i t yo f s c a v e n g i n g 4 山东农业大学硕士研究生毕业论文 d p p h f l e er a d i c a l b u tq u e r c e t i n sc a p a c i t yw a ss t r o n g e rt h a nt h a to fr u t i n d p a ，w h i c hw a sa na n t i o x i d a n tu s e dt r a d i t i o n a l l yt oc o n t r o ls u p e r f i c i a ls c a l d a n da l s oh a dt h ea b i l i t yo f s c a v e n g i n gd p p h f r e e r a d i c a l k e yw o r d s ：a p p l e ；s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ；t o t a lf l a v o n o i d s ； f a r n e s e n e ；h p l c ；a n t i o x i d a n tc a p a c i t y 5 主垒兰墨量呈三二耋鎏鲨墼垩垒耋墼塑篓耋尘窒垄墼望垒薹窒型茎二。一 英文符号及中英文对照表 英文缩写英文全称 中文名称 d p ad i p h e n y l a m i n e 二苯胺 m c p1 - m e t h y l c y e l o p r o p e n e 1 - 甲基环丙烯 m h 0 c 1 毫 d p p h v e v c o d 0 2 一 o h f a r d c m s o d w s a l s a 6 - m e t h y l 5 h e p t e n 2 o n e c o n j u g a t e d t r i e n e s 2 ，2 - d i p h e n y l 1 一p i c r y l h y d r a z y l 一t o c o p h e r o l a s c r o b i ca c i d o p t i c a ld e n s i t y s u p e r o x i d ea n i o n h y d r o x y lr a d i c a l s f a m e s e n e d i c h l o r o m e t h a n e s u p e r x i d ed i s m u t a s e 鼢t e r - s o l u b l ea n t i o x i d a n t s l i p i d s o l u b l ea n t i o x i d a n t s 6 甲基5 庚烯一2 酮 共轭三烯 二苯代苦味肼基自由基 生育酚 维生素c ，抗坏血酸 光密度 超氧阴离子自由基 羟基自由基 法尼烯 二氯甲烷 超氧化物岐化酶 水溶性抗氧化物质 脂溶性抗氧化物质 6 山东农业大学硕士研究生毕业论文 1 引言 1 1 初生代谢和次生代谢 植物，尤其是高等植物，含有丰富的小分子有机化合物。这些化合物 有自己独特的代谢途径，通常是由初生代谢派生而来的。1 8 9 1 年，k o s s e l 明确提出了植物次生代谢的概念。植物初生代谢产物( p r i m a r ym e t a b o l i t e s ) 是维持细胞生命活动所必需的。植物次生代谢产物( s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s ) 是指物体中一大类并非生长所必需的小分子有机化合物，其 产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生代谢物质 在植物体内合成与分解的过程称为植物次生代谢。植物次生代谢是植物在 长期的进化中对生态环境适应的结果。许多的植物在受到病原微生物侵染 ，后，产生并积累次生物质，以增强自身的抵抗力，这样的小分子物质称为 植保素( p h y t o a l e x i n ) 。很多的萜类、生物碱和异黄酮成分都是植保素。 还有一些次生代谢物质作为信号分子参与植物的生理活动，如水杨酸和茉 莉酸。还有的与植物异株相克、种子传播、吸引昆虫授粉以及防御捕食有 关。 植物初生代谢和次生代谢是相互联系，密不可分的。一些被视为次生 代谢的重要途径如萜类代谢和苯丙烷代谢在高等植物中普遍存在。不仅这 类途径中产生的次生代谢物作用重大而且在这类途径中同样产生一些初 生代谢物。初生代谢提供了许多的小分子物质作为次生代谢途径的前体， 如莽草酸、氨基酸等。在很多的情况下，次生代谢产物也同样用于初生代 谢产物的合成，如蛋白质、脂肪酸等的生物合成。 植物次生代谢物质的种类繁多，结构迥异，包括酚类、黄酮类、香豆 素、木质素、生物碱、糖苷、萜类、甾类、皂苷、多炔类、有机酸等，一 般归类为酚类化合物、萜类化合物、含氮有机物。 有研究表明，萜烯类物质的产生主要与植物受到微生物的侵害有关， 该类物质能够抵御微生物的进攻。此外，萜烯类物质是虫害诱导植物产生 的挥发物的主要成分。 植物次生代谢物质的合成在植物体内是高度分支的途径，这些途径在 植物体内或细胞中并不开放，而是定位于某一类器官、组织、细胞或细胞 李红苹果果皮中小法尼烯和类黄酮的提取及其抗辇【化能力研究 曼曼黑曼量皇曼! 曼堂皇曼曼! ! 皇量皇曼! ! 曼舅曼皇! 曼皇曼曼烹晕曼曼詈曼曼! 曼笪曼曼! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 曼曼曼 器中，并受到独立的调控。如萜类物质的形成是在特异性的组织中并且通 过不同酶学机制独立调控的。另外，植物次生代谢物质合成的一个特征就 是许多次生代谢物质的生物合成是由两个不同的中间产物缩合形成的，而 这两个中间产物又分别起源于不同的次生代谢途径。还有一部分次生代谢 物质的合成是在通过形成母体次生代谢物的基础上经过体脱氢、甲基化、 氧化等加成反应而形成以一系列母体次生代谢的衍生物。 次生代谢是植物体固有的防御机制。今后一段历史时期，人类将面临 着难以攻克的恶性顽固性疾病的挑衅，如肿瘤、心血管疾病等。通过植物 次生代谢产物寻找新药的途径，已越来越受到重视。生药学将发展成为一 门新的综合性的边缘科学，已经引起了众多科学家的重视。因此随着人们 对生命本质的进一步认识，随着科学技术的不断发展，尤其是高科技的发 展，人类对植物资源的开发利用将进入一个更高更新的阶段，人类战胜疾 病的技能，包括许多新的特效药物的生产和应用的能力，也将有极大的提 高。 自然界中植物物种丰富，数量浩大，为人类提供了宝贵的资源财富。 在众多的资源植物中，药用植物越来越受到人们的重视，特别是一些荒野 植物资源为人类新药的开发提供了一个重要的源泉。其实，人类利用植物 次生代谢的药用历史十分悠久，传统的中草药方和其他民族的草药方，其 有效成分大多为植物次生代谢物质。可是，由于植物生长和栽培的气候、 季节、地理及政府禁令的影响，加上全球生态环境的破坏，对野生植物的 破坏，使得一些珍稀植物资源处于濒临灭绝的境地。因此如何持续利用植 物细胞培养作为工业化生产植物次生代谢物的设想，3 0 多年来已经获得了 初步的成功。近年来人们从植物次生代谢物质中寻找新药，已取得了令人 鼓舞的进展。 次生代谢产物中以类黄酮和萜类代谢物质的研究较为活跃，本论文旨 在对苹果中主要次生代谢物质a 法尼烯及类黄酮的研究概况作一综述。 1 2 苹果中次生代谢物质的研究进展 1 2 1 旷法尼烯研究进展 山东农业大学硕士研究生毕业论文 图1 * 法尼烯的分子结构 f i g 1m o l e c u l a r s t r u c t u r eo f * f a r n e s e n e d 法尼烯是存在于苹果果皮 中的一种非常重要的挥发性次生 代谢物质，具浓郁的果香味( h u e l i n 和c o g g i o l a ，1 9 7 0 ) a 1 9 6 4 年， m u r r a y 等首先从苹果的天然蜡质 层中鉴定出一种倍半萜物质法尼 烯。1 9 6 6 年澳大利亚的科学家 h u e l i n 和m u r r a y 进一步查明这种 物质是a 一法尼烯( 【3 e ，6 e 一3 ，7 ，1 1 一 t r i m e t h y l - 1 ，3 , 6 ，10 - d o d e e a t e t r a e n e ) ， 首次在自然杂志上报道了苹果角质层中的倍半萜物质啦一法尼烯可 诱导虎皮病的发生( h u e l i n 和m u r r a y , 1 9 6 6 ) 。实验证实0 【法尼烯与苹果 贮藏中重大的生理病害虎皮病的发生有关。尽管虎皮病真正的致病因 子致病机理还不清楚，但a 法尼烯氧化产物积累导致虎皮病发生的理 论己得到普遍承认。 人们在虎皮病研究的同时还发现a 一法尼烯在植物体的存在具有一定 的普遍性。n 一法尼烯除存在于苹果、梨外，还存在于蛇麻花、香蕉、橙子、 柑橘( m i l l e r ，1 9 8 9 ) 、釉子( y u e n ，1 9 9 5 ) 、棉花( t u r l i n g s ，1 9 9 8 ) 、玉米 ( a n e t ，1 9 7 4 ) 等植物以及蚂蚁、老鼠、地中海果蝇( m a ，1 9 9 9 ；c o s s e ， 1 9 9 5 ：s u t h e r l a n d ，1 9 7 1 ) 等动物中，并发现值法尼烯含量与植物的冷害 程度呈正相关，尤其发现法尼烯与昆虫的诱导性相关，它是苹果蠹蛾幼 虫、成虫的引诱剂( t u r l i n g s ，1 9 9 8 ；z a n g e l ，1 9 9 8 ；a l a n ，2 0 0 1 ) 。但至 今尚无伐法尼烯纯品出售。同时在大量的虎皮病机理方面的研究中，有关 法尼烯的含量仍采用果实正己烷提取液的紫外吸收光谱法测定，本研究采 用h p l c 测定苹果果皮中的法尼烯含量，并将其与紫外光谱法进行比较。 1 2 2 类黄酮的研究进展 1 2 2 1 类黄酮化合物的性质 生物类黄酮( b i o f l a v o n o i d s ) 亦称维生素p ，常与维生素c 伴存，在 自然界分布广泛，属于植物次生代谢产物，是一组存在于蔬菜、果、花和 9 谷物中的天然色素，因多里黄色而称生物类黄酮。生物类黄酮无毒，广泛 存在于植物界中，人体不能合成，而且在体内代谢很快。人体摄入生物类 黄酮主要来自饮料、茶、咖啡、可可、水果、果酒( 尤其是红葡萄酒) 和 啤酒，甚至醋都是其重要的来源。 黄酮类化合物( f l a v o n o i d s ) 以前主要指2 一苯基色原酮 为基核的化合物，目前己扩展为具有2 个芳环通过3 个碳键结合的化合物， 即c 。一c 3 一c 6 骨架的化合物( 舳根据中央三碳链的氧化程度，b 环联结位置( 2 或3 位) 以及三碳链是否构成环状等特点，可将重要的天 然黄酮化合物分为： 黄酮( f l a v o n e s ) 黄酮醇( f l a v o n o l 3二氢黄酮类 q p )g二氢黄酮 ( f l a v a n o n e s ) 醇( f l a v o n o n 瓯埯 异黄酮( i s o f e a v o n e s ) 吕 二氢异黄酮( i s o f l a v a n o n e s ) o ( d i h y d r o c h a l c o m o s ) 。也有研究者按照黄酮三碳结构的氧化程度，将其分 为花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和黄烷醇类。 在维管植物中，已有4 0 0 0 种类型的黄酮化合物被确定，并且随植物 的生长发育和环境条件不同而在类型和数量上不同。m o h a m e d 等( 2 0 0 1 ) 以乔纳金和e l a s t a r 苹果品种为试材测定了成熟果实期内花青素3 糖苷、 根皮苷和儿茶素、槲皮素在果实中的分布是相同的。花青素主要存在于果 皮中，其它部分也有一定的含量槲皮素3 糖苷仅存在于果皮中。 品 山东农业大学硕士研究生毕业论文 芦丁( r u t i n ，又名芸香苷) 和槲皮素( q u e r c e t i n ，又名栎精) 是较早期用 来作为食品抗氧化剂的黄酮类化合物。芦丁存在于荞麦、槐米、烟叶等茎 叶中，用乙醇提取可制得。槲皮素是芦丁的菅元，芦丁在酸或者酶的水解 下会释放出大量的槲皮素。槲皮素为广泛存在于天然植物中的黄酮类化合 物，具有降血压、保护心肌缺血再灌注损伤、清除氧自由基、钙拮抗和蛋 白激酶c 抑制等作用。 1 2 2 2 类黄酮化合物的研究现状 黄酮类化合物在自然界中分布极其广泛，以游离的苷原或与糖等结合 成苷的形式存在，1 9 世纪后开展了有关黄酮化合物的化学和生理活性的 研究。黄酮类化合物廉价易得，是首选的天然抗氧化剂，具有酚类抗氧化 的通性及显著的生物活性。p r a t t 等人研究黄酮类化合物的抗氧化活性， t 认为黄酮类化合物是作为一级抗氧化剂而起作用的。上世纪6 0 年代的就 已经证明黄酮具有抗油脂过氧化的作用( 陈尚猛，1 9 9 0 ) 。但是8 0 年代以 来，尤其是近年来，对黄酮类化合物的研究逐渐转向清除自由基的能力、 抗衰老以及对老年病的防治功效上。近年来随着研究方法和技术的不断提 高，发现了许多新的种类和生理作用，特别是抗自由基及抗癌防癌的作用， 使生物类黄酮的研究进入了新的阶段，掀起了生物类黄酮的研究、开发利 用热潮，其在医药食品领域的应用具有广阔的前景。 近年来发现，类黄酮具有很强的抗氧化活性，体外氧自由基吸收容量 法( c a o ，1 9 9 7 ) 证实很多黄酮的抗氧化活性大于维生素e 。在离体条件 下，类黄酮通过清除超氧阴离子和羟基自由基抑制起始阶段的脂类过氧化 作用。类黄酮自由基又和自由基团发生反应终止传递链。除了具有抗氧化 的性质，一些类黄酮作为金属离子螯合剂，抑制过氧化驱动的产生活性氧 自由基主要源的f e n t o n 系统。 黄酮类化合物中具有各种不同取代情况的酚羟基，分子中心的a 、e 不饱和吡哺酮使黄酮类化合物表现出一定的抗氧化活性。从上世纪6 0 年 代以来，对黄酮或酚类化合物的抗氧化性质，特别是在食用油脂中的抗氧 化性做了大量的研究。但往往以一种单一的实验体系钡 定其抗氧化特性， 然而对于某些天然化合物的生物活性的评价如果局限于一种体系，可能就 难以全面体现其生物学上的真实意义，所以对任何一种抗氧化剂的评估都 李红苹果果皮中a - 法尼烯和类黄酮的提取及其抗氧化能力研，i 与相应的试验体系密切相关，因此需要多种体系相互补充，刁能弄清天然 或合成的化合物在不同的体系中的实际效果，特别是有迹象表明黄酮类化 合物的意义不局限于油脂的抗氧化剂，它们很可能具有某种生物抗氧化剂 的功能( 胡春，1 9 9 6 ) 。 药理学研究表明：黄酮类化合物在消炎，抑制异常的毛细血管通透性 的增加以及阻力下降，扩张冠状动脉、增加冠脉流量、影响血压、改变体 内的酶活性、改善微循环、解痉、抑菌、抗肝炎病毒、抗肿瘤等方面具有 重要作用，有很高的药用价值。近年来，从中药中提取分离黄酮类化合物 的研究开展比较活跃，从黄芪、麦冬、摆满艳、铁轴草、瓦松、野松、银 杏叶中提取分离了许多黄酮类化合物( 陈运中，1 9 9 8 ；程耀景2 0 0 2 ；董 钰明，2 0 0 2 ；何倩琼，2 0 0 0 ；黄华艺，2 0 0 2 ) 。 人们对食品的安全性越来越重视，因为惧怕果皮上带有农药及其它化 学物质等而往往把果皮弃掉，而恰恰是该部分的抗氧化物含量最丰富。若 是能将这一部分抗氧化活性物质提取分离应用，将为果品加工业开辟新的 发展方向。另外，黄酮类化合物在食品中也有着相当广阔的应用前景，它 可作为油脂的抗氧化剂，作为类s o d 活性物质，它还可以防止天然色素 褪色，是一种良好的天然褪色防止剂( 李爱军，2 0 0 1 ) 。节果中的类黄酮 化合物的分析国外已有所报道，但是国内对于苹果类黄酮的分离鉴定、生 物学活性还缺乏系统的研究，对其生理活性和药用机理也不是很清楚，使 果实中的天然抗氧化剂资源没有得到充分的开发利用。 1 3 抗氧化性能评价 1 3 1 自由基反应与抗氧化研究 许多研究己经证明，在衰老过程中，机体内氧化和抗氧化系统之间的 平衡发生了变化，表现为氧化作用增强，抗氧化能力减弱( b r i a n e ，1 9 8 0 ) 。 随着年龄的增长、抗氧化酶类如s o d 等活性降低，体内清除氧自由基的 能力受到影响，氧自由基浓度升高，引发脂质过氧化的连锁反应 ( h a g i h a r a ，1 9 8 4 ) 。毒性氧自由基作用于细胞膜、核酸、蛋白质和酶类， 导致不可逆的损伤，从而产生各种生理紊乱、病理改变。这可能是引起人 山东农业大学颂，l 研究生毕业论文 类衰老的重要原因( 张嘉鳞，1 9 9 9 ：张秋菊，1 9 9 7 ) 。产生过多的自由基 也是引起植物衰老的原因之一。 自由基( f r e er a d i c a l ) 即包含一个未成对电子的原子或原子团，它 是在细胞代谢过程中连续不断产生的具有高度活性的物质，生物体内常见 的自由基有超氧阴离子自由基( 0 2 ) 、羟基自由基( o h ) 、烷基自由基 ( r o ) 等。人体中自由基的产生，一是由物理及化学因素引起的，如电 离辐射、x 光照射、烟酒、废气、精神压力及其某些药物等。另一种是在 细胞氧化代谢的过程中产生的，生命活动离不开氧气，但是，在有机体利 用氧的过程中，特别是氧过量时，会形成太多的超氧自由基( 0 2 - - ) ，而 出现氧的毒性作用。氧自由基具有强氧化作用，不仅可以直接攻击细胞膜， 破坏细胞膜和细胞成分，同时也能再度激活脂质过氧化反应，可使体内的 脂质过氧化物( l o p ) 浓度升高，l o p 又通过自身催化作用连续生成大 量的过氧化物，从而形成自由基的恶性连锁反应，引起膜损伤和交联键的 形成，能降低酶的活性，使核酸代谢误差，溶酶体内的色素堆积致使细胞 衰老。使细胞的结构和功能受损，产生一系列的病理变化，是引起癌症、 衰老。心血管等退化性疾病的罪恶之源( 胡春，1 9 9 6 ) 。 0 2 。形成最早，o h 作用最强，r o o h 连锁反应循环最持久，一旦清 除了0 2 。、o h 的形成即中断，则可从根本上预防体内形成过多的o h 和 其它活性氧自由基，达到防癌、抗癌、抗心血管的目的。抗氧化物质可以 阻断自由基的链式反应。目前国内外就天然产物中提取的活性物质对自由 基的清除效果的研究还不多见。因此研究天然活性物质清除0 2 、- o h 自 由基的能力，对于其生物学作用及相关疾病的防治有着极其重要的意义。 1 3 2 抗氧化剂 广义的抗氧化剂是指自由基及活性氧的清除剂、阻断剂及修复剂等物 质的总称。抗氧化剂的发展是从工业抗氧化剂开始的，1 8 9 8 年， s l b i g e l o w 发现少量的亚硫酸钠做还原剂可以保护对氧化敏感的材料， 并最早提出了“抗氧化剂”的概念。此后工业抗氧化剂迅速发展，广泛用于 防止塑料、橡胶、纤维粘合剂等加工时的降解，抑制燃料油粘度及酸度的 增加等方面。 牟红苹果果皮中法尼烯和粪黄酮的提取发其抗氧化能力研冗 除此之外，抗氧化剂还大量应用于食品工业。油脂及含油脂食品在贮 存中，油脂中的不饱和脂肪酸极易被氧化生成氢过氧化物，进而分解为低 级脂肪酸，导致食品发生酸败，并产生有毒物质。因此，添加抗氧化剂已 经成为贮存食品的有效手段，它能够延缓甚至阻遏食品由于空气的氧化作 用而引起的氧化腐败，并对维生素类和必需氨基酸等一些易氧化的营养成 分起保护作用。 近年来，随着分子生物医学的发展，抗氧化剂在生物化学及医学中的 应用也日趋广泛。自从1 9 5 6 年h a n n a n 提出自由基学说以来，愈来愈多 的研究证实有机体产生的自由基会导致各种病变如：动脉粥样硬化、一t l , 血 管疾病及肿瘤等，而适当补充外源性抗氧化剂可以改善这一状况。事实上， 目前几乎所有被证实对特定疾病有治作用的营养组分都具有抗氧化活性， 如v e 、v c 、d - 胡萝h 素等，它们通过切断链反应抑制脂质过氧化，从而 保护有机体免受自由基损伤。 1 3 3 d p p h 自由基反应机理及其应用 通过测定植物提取物清除自由基的能力能够表明其抗氧化能力的强 弱，研究自由基的检测方法并探讨物质对自由基的清除作用具有重要的意 义。迄今用于评价植物抗氧化能力的方法虽已有诸如硫氰酸盐 ( t h i o c y a n a t e ) 法、硫代巴比妥酸( t b a ) 法、o r a c 法( a u t o m a t e do x y g e n r a d i c a la b s o r b a n c ec a p a c i t ya s s a y ) 等。但是这些方法或者所需试剂或大型 仪器的费用昂贵，尚缺乏一种灵敏、简单易行的有效方法。d p p h 自由基 是一种稳定的自由基，通过检测生物试剂对d p p h 自由基的清除能力可 以表示其抗氧化活性的强弱。目前，国外已有很多的学者用d p p h 自由 基分析法研究物质清除自由基的性质( j o s e ，1 9 9 8 ；m a k o t o ，1 9 9 8 ： e s p e r a n z a ，1 9 9 8 ) 。 d p p h 即二苯代苦味肼基自由基，是一种很稳定的以氮为中心的自 由基，它的稳定性主要来自共振稳定作用及三个苯环的空间障碍，而使处 在中间氮原子上的不成对电子不能发挥其应有的电子成对作用，由于 d p p h 为人们提供了一个试样与稳定自由基反应的信息，故可将此法用 于自由基清除剂的筛选研究工作。 山东农业大学硕士研究生毕业论文 d p p h 分光测定法的原理是依据d p p h 孤对电子在5 1 7 n m 附近有 强烈吸收，其醇溶液呈深紫色。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电 子配对而使其吸收逐渐消失或减弱，褪色程度与接受的电子数量成定量关 系。因而可用分光法进行定量分析，测定吸收减弱的程度，以评价自由基 清除剂的活性。若受试物能够清除，则提示受试物具有降低羟基自由基、 烷基自由基或过氧化物自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作 用，抗氧化剂对d p p h 自由基得清除率越高，其抗氧化能力的越强。 苹果果实中的天然成分及抗氧化能力研究是近年来国外研究的热点 问题( m a r i a n ，2 0 0 0 ) 。具有较强抗氧化能力的果实在冷藏过程中不会发 生病害( g o n g ，2 0 0 1 ) 。采用d p p h 自由基分析法测定苹果水溶性和脂 溶性提取物抗氧化能力还尚未见报道。 1 3 4 果皮中的抗氧化物质与苹果病害的发生 在虎皮病的致病机理研究中，人们还发现苹果果皮中的天然抗氧化 物质与虎皮病的发生有着密切的关系。a n e t ( 1 9 7 2 ) 提出晚采果之所以虎 皮病发生率低于早采果，是由于晚采果果皮中含有较多的抗氧化物质，可 抑制仪一法尼烯的氧化所致。随后他又在1 9 7 4 年以1 6 个苹果品种为试材， 发现果皮内有足够能够抑制值一法尼烯自氧化的抗氧化物质时，虎皮病就不 发生。m e i r ( 1 9 9 8 ) 研究发现，苹果果皮中抗氧化活性与虎皮病的发生呈 显著负相关，其相关程度远高于0 t , 一法尼烯及共轭三烯与虎皮病的关系。因 此，苹果中主要抗氧化物质的研究也是近年来国外研究的热点问题之一。 1 4 本研究的目的、意义 g t 一法尼烯是存在于苹果果皮中的一类重要的挥发性次生代谢类物质， 具有浓郁的果香味，与果皮的虎皮病害有关；此外，还有研究显示与昆虫 诱导有关。但是，至今仍然无c c 法尼烯纯品出售；大量的虎皮病害机理方 面的研究中有关旺一法尼烯含量仍采用果实己烷提取液的紫外吸收光谱法。 为了进一步了解果实的病害机理，尤其a 法尼烯的生物学效应，本论文比 较了0 t 。法尼烯的两种提取工艺，寻找提取法尼烯的最佳提取途径；采用 h p l c 测定苹果果皮中的0 【法尼烯含量，并比较了h p l c 和u v 紫外光谱 李红苹果果皮中a - 法尼烯和类黄酮的提取及其抗氧化能力珂f 冤 法的测定结果，至今还没有这方面的报道。 许多的流行病学研究表明，蔬菜、水果的摄入量与心脑血管病以及一 些肿瘤的发病率和死亡率呈负相关，这些疾病的发病与自由基造成的氧化 损伤呈正相关关系，而蔬菜和水果中含有大量已知和未知的抗氧化物质。 因此，人们推测蔬菜、水果中的抗氧化物质对于预防上述疾病的发生发展 有着重要意义。但是，一些采用人们熟知的抗氧化物质如b 一胡萝h 素、 维生素e 、c 的人群补充干预试验并没有取得令人满意的结果( 郭长江， 2 0 0 0 ) ，由此看来，水果和蔬菜中可能还存在着其它的更为重要的抗氧化 物质，这些重要的抗氧化物质清除自由基的能力，是减少某些疾病的发生 率和死亡率的主要原因。 近年来，类黄酮因其具有较强的抗氧化活性成为众多研究学者的研究 热点。类黄酮多为各种中草药的主要成分，所以研究多集中在中草药类黄 酮物质的提取和分离。植物中的黄酮类化合物的生物活性是多样的，除了 具有抗氧化作用外，还有抗癌和防治心血管疾病等作用。苹果中类黄酮提 取分离的研究和报道却很少，目前黄酮类所具有的抗氧化功能还未能在商 业上开发利用，尚有许多问题需要解决。关于苹果中抗氧化物质的提取分 离的研究报道很少，尤其以d p p h 自由基体系评价苹果提取物抗氧化性 能的报道更少。本研究的目的之一在于建立苹果中果皮中类黄酮的提取技 术，并评价苹果提取物的抗氧化性能。 本研究从苹果中重要次生代谢物质仪法尼烯及类黄酮的提取技术着 手，研究不同处理苹果提取物及总黄酮、外源抗氧化剂清除d p p h 自由 基的抗氧化能力，为迸一步研究c c 法尼烯的生物学效应和苹果中的天然成 分奠定基础。具有重要的理论和实际意义。 山东农业大学硕士研究生毕业论文 2 材料与方法 2 1 实验材料 青香蕉苹果和红富士苹果：2 0 0 2 年和2 0 0 3 年于商业采收时间采摘于 泰安郊区果园。 2 2 实验设备 u v l 6 0 1 一紫外可见双光分光光度计( 日本岛津) l c c l a s s v p 高效液相色谱分析仪( 日本岛津) k q 1 0 0 b 型超声波清洗器( 舒美昆山是超声仪器有限公司) g 1 m a l l zw d 9 0 0 t l 2 3 2 微波炉( 顺德市格兰仕电器实业有限公司) s c 1 5 数控超级恒温槽( 上海新芝生物技术研究所) 分析天平s a n o d u sa n a l y t i c ( 德国) 恒温可调电热套( 邺县电子仪器厂) 索氏抽提器( 重庆北暗玻璃仪器分厂) j a 3 0 0 3 a 电子天平( 上海精天电子仪器有限公司) 旋转蒸发器( 上海亚荣生化仪器厂) b o p f i g e 高速冷冻离心机( h e r a e u si n s t m m e m ，德国) 2 3 实验方法 2 3 1 果实的处理 供试青香蕉苹果( 2 0 0 2 年和2 0 0 3 年9 月2 8 同) 于采收后当天( 第0 周) 用2 9 l 的二苯胺( d p a ) 乳剂浸果3 0 秒，晾干后入o 冷库贮藏。 供试青香蕉苹果于采收后第0 周用1 0 9 i l m c p ( 1 - 甲基环丙烯) 处理果 实1 2 h 后入0 冷库贮藏。 取样：贮藏一定时间的苹果，用削皮机取下果皮，立即放入液氮中， 冷冻干燥或研磨成粉，置于- 8 0 低温冰箱中保存。 2 3 2 果皮含水量的测定 按照赵世杰主编的植物生理学实验指导( 2 0 0 2 ) 实验2 方法测定。 李红苹果果皮中q _ 法尼烯和类黄酮的提取及其抗氧化能力聊f 究 2 3 3 果皮叶绿素含量的测定 按照汤章城主编的现代植物生理学实验指南( 1 9 9 9 ) 方法测定。 2 8 4 果皮蜡质含量的测定方法 随机挑选处理的苹