（植物保护专业论文）无病毒香石竹（Dianthus+caryophyllus+L）组培玻璃化控制研究.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是在指导教师的指导下， 通过本人努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作 了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写 过的研究成果。与我一同对本论文做出贡献的同志，都在论文中作了明 确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承 担应有的责任。 ， 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：凝鲜芽仁 日期：渺( 、。f r 1 7 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规 定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以 公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 指导教师亲笔签名： 昌檀望 o d 落- 6 t 日期：6r d6 f 期日 密删呵褓缈 秆簇l 文 名 论 签 本 笔 ， 亲 密 者 保 作 不 文沦业毕位学 福建农林人学坝i ，学位论殳无舶毒香“伯绁j 齐玻峭化挣制研究 摘要 玻璃化现象的控制是无病毒香石竹组织苗快繁的关键技术本研究不仅对 香石竹茎尖离体培养的操作规程进行了探讨，还对茎尖诱导培养和试管茁继代 培养的玻璃化现象进行了研究。供试香石竹各品种在诱导培养和继代培养的过 程中均出现较高的玻璃化率，通过调整培养基和培养条件能将粉色和复色品种 的玻璃化率降低到合理水平，但却不能将红色品种的玻璃化率降低到合理水平， 显示其玻璃化发牛可能与基因型有关：当培养基为：m s + b a o 2 m g l - + 琼脂 6 o g - l 。，庶糖3 0g u 。，p h 5 8 - 6 0 ，培养条件为：温度2 3 ，光照2 0 0 0 4 0 0 0 l x 每天光照l oh 时，粉色和复色品种的玻璃化率可控制在1 0 以内，红色品种的 玻璃化率虽然有所下降，但仍高达6 0 以上。香石竹红色品种的无病毒试管苗 由于高玻璃化现象，繁殖系数只有1 ，无法迅速大量扩繁，大大限制了其在牛 产上的应用。本实验通过运用组织培养技术筛选低玻璃化兀性系( r 系) 的方 法，经过2 7 代的定向选择，获得了玻璃化率稳定在8 的香石竹红色品种“多 明格”的r 系，繁殖系数从l 提高到3 ：并对r 系在不同培养条件下的低玻璃化 性状进行试验，结果表明r 系比对照的玻璃化率低得多：对所获得的r 系进行 l o 次的继代培养后，过渡并定植于大阳，其园艺性状没有明显改变。 关键词：香石竹，茎尖培养，玻璃化低玻璃化兀性系 福建农林大学碳士学位论文无病毒香石竹组培玻璃化控制研究 a b s t r a c t t h ep r e v e n t i o no fv i t r i f i c a t i o ni st h ek e yp o i n ti nr a p i dp r o p o g a t i o n o fc a r n a t i o ni nv i t r o t h eo p e r a t i n gc o n s t r u c t i o nf o rs h o o tt i pc u l t u r e o fc a r n a t i o r l a n dt h ev i t r i f i c a t i o ni ni n d u c e dc u l t u r ea n ds u b c u l t u r e h a v eb e e ns t u d i e d d i f f e r e n tf r o mo t h e r s ，t h er e d f l o w e r i n gv a r i e t i e s o fc a r n a t i o nc o u i dn o th a v et h e i rv i t r i f i c a t i o nr a t et od e c r e a s et oa l o wl e v e lb ya d j u s t i n gt h em e d i aa n dc o n d i t i o no fc u l t u r e ，w h i c hs h o w e d t h a tv i t r i f i c a t i o ni sc o n c e r n e dw i t ht h e i rg e n o t y p e s w h e nc u l t u r e di n m e d i ao fm s + b a o 2m g - l + a g a r6 o m g l - 。+ s u g a r3 0 9 - l ，p h5 8 6 0 ，a n du n d e r c o n d i t i o no f2 3 。p h o t oi n t e n s i t y2 0 0 0 4 0 0 0 l x ( 1 0 h d ) ，m o s tv a r i e t i e so f c a r n a t i o nc o u i dh a v et h e i rv i t r i f i c a t i o nr a t e st ob ec o n t r 0 1 1 e dl e s st h a n 1 0 t h ev i t r i f i c a t i o nr a t e so fr e d f l o w e r i n gv a r i e t i e sd e c l i n e da s w e l l b u tw e r es t i l lh i g ha b o v e6 0 b e c a u s eo ft h eh i g hv i t r i f i c a t i o i l r a t e ，t h ep r o p a g a t i o nr a t eo fr e d f l o w e r i n gv a r l e t i e so n l yr e a c h e dl ， w h i c hp r e v e n t e dt h e mf r o mr a p i dp r o p a g a t i o na n dw i d ea p p l i c a t i o n t h e t e c h n i q u eo ft i s s u ec u l t u r ew a su s e dt os c r e e nf o rac l o n ew i t hl o w v i t r i f i c a t i o nr a t e ( rc l o n e ) a f t e r2 7t i m e s s u b c u l t u r e t h erc 1 0 r e w h o s ev i t r i f i c a t i o nr a t ei sa b o u t8 a n dp r o p a g a t i o nr a t er e a c h e s3 h a s b e e no b t a i n e d t h erc l o n ew a sc u l t u r e du n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n st o o b s e r v ei t sv i t r i f i c a t i o nc h a r a c t e r ，w h i c hs h o w e dt h a ti t sv i t r i f i c a t i o n r a t ew a sm u c hl o w e rt h a nt h a to fc k a f t e r1 0t i m e s s u b c u l t u r e t h er c l o n ew a st r a n s p l a n t e di naf i e l d w i t har e s u l tt h a ti tk e p tt h et r a i t s o fi t so r i g i n a lo n ea n dn oh a r m f u lv a r i a t i o nw a so b s e r v e d d a t ao rs h o o tt i pc u l t u r er e p o r t e dh e r em a ym a k ei tf e a s i b l ef o r l a r g e s c a l e dp r o p a g a t i o no fv i r a l f r e ep l a n t l e t so fc a r n a t i o n k e y w o r d s c a r n a t i o n ， s h o o t t i pc u l t u r e ， v i t r i c a t i o n a n t i - v i t r i f i c a t i o nc l o n e 2 福建农林大学硕t 学位论文无病毒香石竹纰培玻璃化控制研究 1 前言 香石竹( d i a n t h u sc a r y o p h y l u sl ) 又名康乃馨，属石竹科 ( c a r y o p h y l l a c e a 0 石竹属( d a n t h u s ) 植物，是世界上最重要的切花品种之一， 其生产面积和销售量列各切花品种之首，在全球栽培面积达8 7 0 0 多公顷( 李惠 芬和马鸿翔，2 0 0 0 ) 。香石竹是著名的“母亲节”之花，也被称为“诚挚的爱” 与“幸福祥和”之花，代表慈祥、温馨、真挚、不求代价的母爱。香石竹起源 于西班牙，由诺尔曼人传入英国，在1 3 世纪时摩尔人就开始栽培重瓣香石竹。 今只的香石竹可周年开花，花茎挺直且长，花朵更大更饱满，花色也十分丰富， 用途广泛，插花、束花、捧花、花蓝等都能体现其高雅娇艳的特点。香石竹产 花量大，栽培的经济效益较高，在当前农业结构调整中，因地制宜，根据市场 经济的发展规律，发展香石竹种茁业和切花业，是个农业持续高效、致富农 民的好途径。 1 1 香石竹的分布及其栽培简史 香石竹原产于南欧，野牛资源主要分布于地中海北岸、法国到希腊一带， 西亚和我国中西部地区也有零星分布。目前，主要栽培于中纬度平原和低纬度 高海拔山区。如欧洲的西欧、南欧、东欧；南美洲的哥伦比亚、墨西哥及中美 一些高原、北美中西部美国科罗拉多州和加利福尼亚，以及东北部大城市周围： 亚洲的中国、f i 本和东南亚的高原地区，澳大利亚西南和东南；非洲的肯尼亚 等地区。 香石竹野生种只在春季开花，人们对野生香石竹的改良始于1 6 世纪，1 7 5 0 年法国育成的理门丹( c v r e m o n t a n t ) ，茎高，一年多次开花，无休眠期。1 8 4 0 年法国人d a l m a i s 利用中国石竹育成常青香石竹类型a t i v n 。1 8 4 6 年，各种花 色的香石竹品种均具四季开花性，1 8 6 6 年，法国人a l e g a t i e r e 育成了树状香 石竹类型，具有茎杆刚直的优点。1 8 5 2 年香石竹引入美国，威廉姆西姆于1 9 3 8 或1 9 3 9 年育成w i l l a ms i m 品种( 李惠芬和马鸿翔，2 0 0 0 ) ，从这个红花植株中 已经产生了白色、粉色、橙色和几种彩斑类型的突变，西姆系的香石竹品种已 遍植全球。 福建农林人学颁 ：学位论文无病毒吞“竹组王培玻璃化控制研究 1 2 香石竹的产业化现状 1 2 1 生物学特性和繁殖方法 香石竹为须根系草本植物，没有明显的主侧根之分，根系主要分布在约2 0 厘米深的表土层中，茎直立，多分枝，株高7 0 1 0 0 厘米，茎部半木质化；叶 线状披针形，全缘，叶质较厚，上半部向外弯曲，对生，基部抱茎。花通常单 生或2 3 朵聚伞状排列，大花品种，花茎具1 6 1 8 个节，小花品种具2 0 2 2 个节，香石竹喜冷凉干燥，阳光充足与通风良好的生态环境，耐寒性好，耐热 性较差，喜肥，生长适宜温度为1 5 2 0 c ，在深厚肥沃，富含腐殖质的微酸性 壤土或稍粘质的壤土上生长良好。 香石竹繁殖分为有性和无性繁殖两种，前者往往由于结籽率低、种子后代 性状变异大、生长缓慢，因而在生产上很少采用。目前牛产上大量采用的是包 括组织培养和扦插繁殖的无性繁殖方式。组织培养具有繁殖系数高，能脱除病 毒，增强生长势，抗高产量等优点，但需要一定的设备，培养期长。近年来世 界上大多数香石竹育苗公司采用组织培养获得无病毒原种母本，再从母本采穗 扦插繁殖育苗，这既能获得大量高质量的无菌种苗，又降低了成本。 1 2 2 产业化现状 香石竹以其生产性高，观赏性好，耐贮运等优点，成为世界上普遍栽培的 商业性切花的主栽品种之一，现占整个切花牛产的1 7 左右。意大利、荷兰是 香石竹切花生产大国，年产切花5 0 亿枝，哥伦比亚是世界上最理想的香石竹栽 培区之一，香石竹切花生产占4 5 ，主要出口到美国，出口额达5 4 5 亿美元( 李 惠芬和马鸿翔，2 0 0 0 ) 。我国栽培香石竹已有八九十年的历史，近年来栽培面积 快速增加，至2 0 0 1 年底，全国香石竹栽培面积1 4 1 l 公顷，牛产切花7 9 亿支， 销售额2 5 亿元。云南省近年来香石竹生产发展迅猛，生产面积超过2 万亩， 占全国香石竹总量的2 3 以上，已成为我国乃至亚洲最大的香石竹生产基地。 但是简陋的栽培设施，粗放的管理技术以及落后的经营模式，严重阻碍了香石 竹切花产量和质量的提高，香石竹亩产量不足4 万支，比日本的平均产量低2 万多支，达到出口质量标准的切花仅占1 0 ，生产设施主要以毛竹棚或单栋钢 4 福建农林大学硕士学位论文无病毒香石竹组培玻璃化控制研究 架大棚为主，几乎全部采用当地土壤栽培，极少无土栽培：生产所用种苗多采用 自繁自育，有的甚至从切花植株上采穗后进行育苗。全国1 4 1 1 公顷的香石竹生 产面积，按正常密度计算每年至少需要2 5 亿株以上种苗，但据全国几家大种 苗公司的销售数据显示，实际使用量还不到总量的1 3 。这里既有种苗的价格 和质量因素，更主要的是牛产者的经营思想尚未明确，低水平的重复，使我国 香石竹生产水平还处于落后的地步。我国目前的香石竹品种全部从国外引进， 随着知识产权品种专利保护的进一步规范，目前引进的母本苗除支付种苗费外 还必须支付更昂贵的专利费，而世界其它香石竹栽培区大都已进入现代化的控 制阶段，温度、湿度、光照及水分可电脑自动化控制，专业研究所的技术指导 使生产者受益匪浅；生产者思想活跃，无土栽培得到广泛使用，优质种苗的使 用率在9 5 以上。近年来，国内一些实力较为雄厚的香石竹生产企业，开始利 用优质的种苗，标准化的栽培管理技术，生产出符合日本花卉市场标准的香石 竹鲜切花，批量出口e j | 本，预示着中国香石竹开始参与到国际市场的竞争。 1 3 无病毒香石竹在生产上的重要性 我国香石竹栽培发展很快，年产鲜切花达十亿枝以上，但是由于病毒病的 影响，香石竹的产量、质量不断下降，引起不同程度的植株矮化，畸形、花叶、 坏死、花朵变小、开裂、花碎色等症状。危害香石竹的病毒病种类有香石竹斑 驳病毒( c a r n a t i o nm o t t i ev i ，峪c a r m v ) 、香石竹潜隐病毒( c a r n a t i o n 7 a t e n ty 打“sc l v ) 、香石竹蚀环病毒( c a r n a t i o ne t c h e d r i n gv i r u s , c e r v ) 、 香石竹坏死斑点病毒( c a r n a t i o nn e c r o t i cf e c kv i r u s , c n f v ) ) 、香石竹脉斑 驳病毒( c a r n a t i o nv e i nm o t t l er ，川sc a v m v ) 。其中c a r m v 和c l v 在我国和 世界其它产区均有发生，c e r v 在我国、日本、欧洲各国产区，c n f v 分布在昆明、 上海、日本、以色列、意大利、美国、澳大利亚、法国等地，c a r v m v 在昆明、 上海、北京、日本、美国、欧洲各国产区均有发生( 段永嘉等，1 9 9 5 ) 。香石竹斑 驳病毒( c a r m v ) 是危害香石竹的主要病毒，自1 9 5 5 年首次报道后，至今普遍发 福建农林人学硕i ：学位论文 无病毒香白竹组培玻璃化控制研究 牛于世界各香石竹栽培地区( 刘伟等，1 9 9 1 ) 。昆明地区是我国香石竹的主产地， 香石竹斑驳病毒流行程度已十分严重。据伊廷双等1 9 9 7 年到1 9 9 9 年的调查结 果表明，昆明地区香石竹斑驳病毒的感染率达8 3 5 6 ( 伊廷双等，2 0 0 1 ) ；在上 海香石竹斑驳病毒也已较普遍，北京、厦门、广州、常州、武汉、桂林和南京等 地的香石竹上也都有c a r ) 4 v 的发生( 张爱平，1 9 9 0 ) 。此外，福建省在1 9 9 5 1 9 9 8 年间c a r m v 的发生率一般为3 0 4 0 ，严重的高达7 2 4 ( 宋瑞琳等，1 9 9 9 ) 。 组织培养是利用植物细胞的全能性，在无菌条件下，利用人工配制的培养 基培养植物的细胞、组织和器官，使之长成完整植株的繁殖方法，根、茎、叶、 花器官等均可作为培养材料，但以带芽茎段较易获得成功。根据目的不同，组 织培养可分为茎尖脱毒培养和一般的组培快繁。茎尖培养获得的脱毒苗，在经 病毒检测鉴定后，确认不带菌的，可采用茎节、节段、叶片等进行组培快繁。 试验证明，这样获得的无毒或低毒种苗种植在同一设施内，在常规管理情况下， 都表现出带毒苗无可比拟的优越性，将无毒苗和带毒苗进行混种试验，无毒苗 1 年后开始感病，但3 年后的切花产量、优质花率仍高于带毒苗。若同一栽培 设施内全部栽植无毒苗，并注意罔问卫牛管理，避免和减少各种栽培过程中病 毒的传播途径，即使在非隔离栽培的情况下，栽培2 3 年的香石竹植株仍能体 现由茎顶获得无毒苗的优质高产性。在实际牛产中，香石竹的优质商品苗主要 采用组培技术获无毒香石竹原种苗，再以原种苗为母本采穗扦插，扦插所得即 为商品苗。采用这种方法获得的商品苗在牛产中牛长势旺盛，切花高产优质， 产品深受市场欢迎。 1 4 香石竹茎尖组培过程中的玻璃化问题 1 4 1 玻璃苗的形态解剖特点 植物试管苗玻璃化是指试管苗呈现半透明状，外观形态往往异常的现象， 自从p h i l l i p s 和m a t h e n s ，h a c k e t t 和a n d e r s o n 最早描述了石竹茎尖培养时所 6 福建农林大学硕j ：学位论文无病毒香石竹组培玻璃化控制研究 出现的半透明形态异常的试管苗现象，及d e b e r g h 等首先进行系统的研究并提 出“玻璃化”概念以来，植物组织培养中玻璃化发生的原因和预防措施逐渐受 到较多的注意和研究。植物试管苗玻璃化在组织培养中普遍存在，在草本和木 本植物中均有发牛，己报道出现玻璃苗的植物已达7 0 多种。与i f 常试管苗相比， 玻璃苗在形态解剖学上发牛显著的变化( h 学贤和陈维伦，1 9 8 7 ) ，分外观明显 异常与基本无异常两种类型( 郭达初等，1 9 9 0 ) 。其玻璃苗的主要症状是试管苗 矮小肿胀，半透明玻璃状，叶片浅绿或黄绿，增厚易脆，叶表面缺少角质层或 腊质发育不全( 郝瑞庆等，2 0 0 2 ) ：玻璃化苗叶片不具栅栏组织，仅有海绵组织，维管 组织发育不全( 韦梅琴等，1 9 9 7 ) ：此外，玻璃苗的茎尖顶端分生组织相对较小， 结构简单缺少维管束原组织，茎尖发育部分保持分生组织特性的时期也缩短( 郭 东红等，1 9 8 9 ，w e r k e re ，l e s h e mb ，1 9 8 8 ) 。且玻璃苗的茎叶细胞体积膨大， 液泡化程度高、胞质稀薄、核变小，细胞无明显长轴，在细胞壁的某些区域出 现空洞不完整( 郭东红等，1 9 8 9 ，g e r s a n ime ta 1 ，1 9 8 8 ) 。 1 4 2 玻璃苗基本成份的含量和酶的活性 玻璃苗的细胞过度含水，还原糖和蔗糖、k 、c a 和c l 的含量明显较高， 而木质素、叶绿素和蛋白质、肌醇和f e 的含量明显较低( 刘思颖和王泰 哲，1 9 8 8 ) ，玻璃苗中某些酶的活性发生了明显变化，如与木质素合成有关的羟 基肉桂酸，c o a 连接酶和本质化进程有关的苯丙氨酸氨解酶的活性比正常苗低 得多( p h a nct ，h e q e d u sp ，1 9 8 6 ) 。玻璃苗中碱性过氧化物酶同工酶活性上升 而酸性过氧化物酶同工酶活性下降。 1 4 3 玻璃苗内源激素的状况 试管苗发生玻璃化后，其内源激素也发生明显变化( 程家胜等，1 9 9 0 ，牛自勉， 1 9 9 5 ) 石竹玻璃化叶片生长索的极性运输大大下降( g e r s a n i e ta 1 ，1 9 8 8 ) ， 其原因可能是玻璃化使细胞问联系疏松、有细胞间气隙、维管组织的发育差 ( w e r k e re ，l e s h e mb ，1 9 8 8 ) 之故，这表明玻璃苗的内源生长素状况可能发生了 明显变化。此外，玻璃化石竹对赤霉素的敏感性高于正常苗( b o t t e b e r1e t a 1 ，1 9 8 8 ) ，提示玻璃苗的内源赤霉素水平也可能发生改变。 福建农林大学硕上学位论文无病毒香杠竹组培玻璃化拄制研究 1 4 4 影响玻璃苗发生的因素 影响玻璃苗发生的因素主要有以下几个方面： 材料：培养材料种类和外植体类型及大小显著影响着玻璃苗的发生，当 外植体越幼小，玻璃苗发生的概率越大；外值体的取材部位也会显著影响玻璃 苗的发生。 培养的环境条件：试管苗在培养过程中，光照、温度、湿度、p h 值均会 影响玻璃苗的发生( 刘非燕和郭达初，1 9 9 6 ，高遐红等，1 9 9 7 ) 光照强度提高，培 养温度相对降低( 储成才和李大卫，1 9 9 3 ) 或用4 0 0 c 热击处理，p h 值7 0 培 养，均可消除玻璃化现象( 周菊华，1 9 9 0 ) 。相对湿度降低也可有效防止玻璃苗发 生。 培养基成分：m s 培养基是控制玻璃化发牛的较理想培养基，培养基中 增加k 、p 、f e 、c a 、m n 、z n 元素的含量，降低b 含量，增加硝态氮，降低 铵态氮，可起到降低玻璃化率的作用，琼脂和庶糖的浓度提高到适当水平，也 会显著降低玻璃化率。 1 4 5 防止玻璃苗的发生的途径 一些植物的玻璃化已能有效的控制，在控制玻璃苗发牛时，大多研究者均 采用如下措施：选不易玻璃化的基因型及部位做外植体：采用透气性好的 材料封口，增加琼脂浓度；选择适宜的糖源及外源激素的种类和浓度：提 高光照强度；降低培养基中n h 4 + 的浓度，并及时转移，以免氨累积。添加 有机物，如青霉素和氯化胆碱等。添加植物激素台成前体如a c c 等，但这 些措施并不一定对所有的物种都有效，在应用时应考虑个体差异。 科学工作者对玻璃苗的形态解剖特征、生理生化特点、发生因素、发牛机 理和综合防治措施等方面进行了广泛研究，这些成果虽为玻璃苗的发牛机理和 综合防治提供了一些有价值的资料，但其发生机理仍还不明确，对玻璃苗发生 的防治措施主要集中在通过改变微环境如培养基成分、水势、光照、温度等来 使对外植体更加适应离体培养的环境，从而降低玻璃化率。这些措施在一定程 度上起到控制玻璃化的作用，但对一些基因型本身易玻璃化的品种仍难达到理 福建农林丈学硕士学位论文无病毒香石竹组培玻璃化控制研究 想的效果。香石竹是组培研究成功并应用较早的切花之，但由于其组织培养 中易出现玻璃化苗，使其在进行大规模组培生产时，存在较大问题，香石竹在 茎尖诱导培养和茎尖试管苗继代培养中的高玻璃化是大量牛产无毒试管苗的主 要障碍。 1 5 本研究的目的及意义 获得大量无病毒试管苗是香石竹优质种苗繁育的基础，过去虽然在国内有 不少科学工作者在香石竹的茎尖脱毒培养上做了大量工作，但大多规模小，品 种单一，很少有从大规模产业化生产的角度来开展研究工作；本研究从规模化 生产无病毒香石竹试管苗的角度，探讨获脱毒效果较好的茎尖培养条件和操作 规程，并对香石竹多个品种的茎尖诱导试管苗以及茎尖试管苗继代培养的玻璃 化现象进行研究，比较香石竹不同基因型在玻璃化发生方面的差异：发现了香 石竹红色品种的高玻璃化现象用常规方法不能有效控制，其繁殖系数仅为1 ， 在生产中难以实现快速扩繁；试验中采用通过调整组织培养条件的方法来控制 香石竹基因型不易玻璃化品种( 如粉色和复色品种) 的玻璃化发生，并首次尝 试采用多次继代培养筛选，定向选择的方法来获得基因型易玻璃化品种( 红色 品种) “多明格”的低玻璃化无性系( r 系) ，以该无性系作继代培养，玻璃化率 可控制在8 左右，大大提高了试管苗繁殖系数，使香石竹红色品种的繁殖系数 从1 提高到3 ；大田栽培实验，考察该无性系能否保持母本的优良园艺性状，有 利于其在生产实践中的应用。本研究的结果将对无病毒香石竹组织苗规模化牛 产提供有价值的参考。 福建农林大学硕e 学位论文无病毒香石竹组培玻璃化摔制研究 2 材料与方法 2 1 材料 本试验所用母本材料皆由上海种业集团提供。供试品种为香石竹红色系大 花品种“多明格”、“马斯特”、“红弗郎西斯科”，粉色系大花品种“奥马”、 复色系大花品种“兰贵人”、“小白菜”。 2 2 试验方法 2 2 1 茎尖组织培养 材料的选择及消毒灭菌：在品种优良、花色纯正、花形好、无病虫寄存的 优良单株上进行采芽，要选择基部健壮的侧芽，芽的长度一般不宜超过1 2 c m 。 芽超过1 2 c m ，中上部的芽已开始花芽分化，不能采用，否则会出现试管小苗开 花现象。采芽后进行清理，逐层剥去叶片，注意不要撕破表皮，留顶部未展的 2 3 对叶，然后切留2 c m 带顶茎段，在加入碱性洗涤剂的清水内充分洗涤，并 用清水漂洗，然后在超净工作台上放入浓度为0 1 o 2 的氯化汞溶液内灭菌 8 l o m i n 。为了防止灭菌不彻底，再转入1 1 5 的次氯酸钠溶液内灭菌 l o m i n ，也可直接在2 的次氯酸钠溶液内灭菌1 5 m i n ，取出后在无菌水内充分漂 沈2 3 次。在各个灭菌及漂洗程序内要不断摇动，使药剂充分接触，灭菌彻底。 最后取出在无菌滤纸上吸干水分待用。消毒剂的种类和浓度均会直接影响材料 灭菌的效果，若取用的材料及部位不同，使用的浓度及时问可不同，但方法相 似。将上述材料放在超净工作台上，肉眼下用镊子及解剖刀剥去嫩叶，露出牛 长锥，然后用镊子将芽的基部固定，在解剖镜下，用刀尖挑起0 2 0 3 m m 、含 1 2 对叶原基的生长点，并迅速接种到培养基上。 培养基采用m s + b a o 2 m g l - i + a ( 琼脂) 6 0 9 l ，3 庶糖，p h 5 8 - 6 0 ，培养温 度2 3 0 c ，光照2 0 0 0 - 4 0 0 0 l x ，每天照1 0h 。病毒检测方法采用双抗体夹心法，委 托福建农林大学植物病毒研究所检测 2 2 2 茎尖诱导试管苗玻璃化现象研究 剥取各品种香石竹茎尖( 0 2 0 3 r m ) ，每瓶接入1 个，对茎尖诱导培养条件处 1 0 福建农林大学硕士学位论文无病毒香石竹组培玻璃化控制研究 理如下述。 改变激素浓度：细胞分裂素采用b a ( 6 - 苄基氨基嘌呤) 表示，蔗糖用字 母s 表示，琼脂用字母a 表示。基本培养基为m s + s 3 0 9 l - + a 6 o g l ，b a 的 浓度分别为0 、0 2 、l 、2 m g l ，共设4 个处理。 改变光强：培养基为m s + b a o 2m g l - , + s 3 0 9 r + a 6 o g l ，每天光照 1 0h ( 8 ：0 0 1 8 ：0 0 ) ，光照强度2 0 0 0 4 0 0 0 l x ；或先将刚接入的茎尖每天光照 i 0h ( 8 ：0 0 1 8 ：0 0 ) ，光照强度2 0 0 0 4 0 0 0 l x 条件下处理7 d ，然后移置培养 室靠窗户光线明亮的培养架上培养，光照强度改为i 0 0 0 0 2 0 0 0 0 l x ，共设2 个 处理。 改变蔗糖浓度：基本培养基为m s + b a o 2 m g l - + a 6 o g 一，蔗糖处理浓 度分别为l o 、3 0 、5 0 、7 0g l ，共设4 个处理。 改变琼脂浓度：基本培养基为m s + b a o 2 m g l - , + s 3 0 9 l ，琼脂浓度分别 为3 、5 、6 、8 9 l ，共设4 个处理。 添加青霉素：基本培养基为m s + b a o 2 m g l - + s 3 0 9 l - + a 6 o g l ，青霉 素浓度分别为0 、t o 、2 0 、4 0 万单位一，共设4 个处理。 每个处理1 0 0 瓶，设两次重复，培养3 0 d 后调查玻璃化苗发牛情况。 2 2 3 茎尖试管苗继代培养玻璃化现象研究 将诱导出的香石竹各品种正常茎尖试管苗转接，进行继代培养，对继代培养条 件作改变激素浓度、改变光照、改变蔗糖浓度和改变琼脂浓度等处理。 改变激素浓度：基本培养基为m s + s 3 0 9 l - + a 6 o f f l 一，b a 的浓度分别为 0 、0 2 、i 、2m g ，共设4 个处理。 改变光强：培养基为m s + b a o 2 m g l - + s 3 0 9 l - + a 6 o g l ，处理隋况见 下表： i f 福建农林大学顾 ：学位论史无病毒香石竹封l 培玻璃化控制研究 处理光照条r ： 1 在培养室中间的培养架上，每天光照1 0h ( 8 ：0 0 - 1 8 ：0 0 ) ，光 照强度2 0 0 0 l x ，采用透明三角瓶为培养容器： 2 培养条件与处理1 相似，光照强度提高到4 0 0 0 l x ； 3 培养条件与处理1 相似，只是将培养容器改为淡监色的罐头瓶， 光照强度2 0 0 0 l x ： 4 培养g f 牛- 与处理3 相似，光照强度提高到4 0 0 0 l x 。将正常苇尖 试管苗在各处理条件f 培养 改变蔗糖浓度：基本培养基为m s + b a o 2 m g r + a 6 o g l 一，蔗糖处理浓 度分别为1 0 、3 0 、5 0 、7 0 9 l 一，共设4 个处理。 改变琼脂浓度：基本培养基为m s + b a o 2 m g l - + s 3 0 9 l ，琼脂浓度分别 为3 、5 、6 、8g l ，共设4 个处理。 以上每个处理2 0 瓶，每瓶接5 株，设两次重复，2 5 d 后调查玻璃化发生情况。 将正常试管苗转接进行第二代继代培养，2 5 d 后调查玻璃化发生情况。将正常试管 苗转接进行第三代继代培养，2 5 d 后调查玻璃化发生情况。继代培养基采用m s 培养 基，培养容器除光照处理外，都采用透明三角瓶糖为蔗糖，p h 5 8 - 6 0 ，培养温度 2 3 0 c ，光照4 0 0 0 l x ，每天照1 0h 。 2 2 4 低玻璃化无性系的筛选 培养基和培养条件： 培养基：m s + b a o 2 m g l - + s ( 蔗糖) 3 0 9 l - + a ( 琼脂) 6 9 。 培养条件：透明三角烧瓶以棉塞封口，温度2 3 c ，光强4 0 0 0 l x ，每天光 照l o h 。以h 代表以上培养基和培养条件。 多次继代培养筛选： 当茎尖诱导出的正常无根苗长到4 c m 高时，转接到继代培养基上( 培养基 和培养条件同h ) ，继代培养2 5 天后，剔除玻璃苗和畸形苗，记录玻璃苗率， 将正常苗转接进行下一次继代培养：2 5 天后，剔除玻璃茵和畸形苗，汜录玻璃 苗发生率，再将正常苗转接，进行下一次继代培养：如此反复进行继代培养，直 福建农林大学硕士学位论文尤病毒香石竹组i 培玻璃化控制研究 到连续继代三次，玻璃苗发生率都下降到1 0 以内时，将其保留作为低玻璃化 的无性系。 r 系与非低玻璃化无性系( s 系) 的离体培养对照实验： 各选r 系和s 系1 0 0 株，在不同的培养基和培养条件下( 表i ) 进行继代培养， 统计它们的玻璃苗发生率和在c 和h 条件下的繁殖系数。 表l 各处理的培养基和培养条件 t a b 】e 】m e d i aa n dc o n d i t j o t i sjnv i t r oc u t t i r e r 系和s 系的大田栽培对照实验： 为了考察香石竹r 系经过多次继代后其园艺性状的稳定性，将r 系连续扩 繁l o 代后种植于大用，设三个重复与对照( s 系) ，每小区种5 0 0 株，区组随机 排列。2 0 0 3 年5 月2 7 日定植，1 2 月1 9 日各区组随机抽取5 0 株，统计其花径， 花枝长度，二次摘心后的侧枝数，有害变异率等方面的数据，用新复极差法进行 分析。 福建农林人学砸l 学位论义尤病毒香石竹组培玻璃化摊制研究 3 、结果与分析 3 1 茎尖试管苗的诱导 3 1 1 无毒茎尖的获取 茎尖分生组织的大小与脱毒率成反相关，即茎尖越大越易剥离，成活率越 高，但脱毒率越小。一般含3 4 对叶原基的0 5 0 8 m m 的茎尖成活率在8 5 ， 比0 2 m m 的茎尖高近3 倍，脱毒率在1 5 2 5 ，而大于0 8 m m 的茎尖脱毒率很 低。以香石竹斑驳病毒( c a r m v ) 为材料，研究茎尖大小与病毒含量的关系，香 石竹各品种的结果相似，愈接近茎顶，病毒含量越小，脱毒效果越好( 表2 ) 。 表2 茎尖大小与脱毒的关系 t a b l e2t h ei m p a c to fs i z e so fs h o o tt i po nv i r a l f r e er a t e s 研究表明，带2 个叶原基的茎尖脱毒率为5 1 9 ，带4 个叶原基的为2 6 6 。 由于康乃馨本身茎尖较小，太小的茎尖剥离及培养难度大，对材料进行3 8 4 0 的高温处理，可以扩大茎尖无毒区域，提高获得脱毒苗的成功率。在3 8 c 下 培养1 个月，可去除香石竹斑驳病毒( c a r m v ) ，2 个月可去除所有病毒。采用 茎段培养获得组培苗，再将组培瓶苗在3 8 c 下的光照培养箱内处理1 0 天或4 0 处理2 3 天，使病毒钝化后再剥0 5 0 8 m m 的茎尖培养，脱毒效果达5 0 以上。这种方法由于操作简便，成活率高，脱毒及培养效果好，在生产上有一 定的实用价值。用3 8 4 0 。c 处理植株6 8 周后，再取外植体l m m 茎尖，可脱 去了香石竹条斑病毒。可见无论是栽培植株还是试管苗，经高温处理后，均可 扩大取材区域，提高获得无毒苗的可能性。 3 1 2 无毒茎尖的培养 将剥得的0 2 0 3 m m 茎尖在m s + b a o 2 m g l 。的培养基上培养，3 4 天后 芽点开始转绿，1 周后体积膨大( 图1 ) ，2 5 4 0 天后丌始展叶( 图2 ) ，转接到 相同的培养基上，2 个月后进一步长成2 3 c m 的无根试管苗( 图3 ) 。这时用双 福建农林大学硕士学位论文 无病毒香石竹组培玻璃化控制研究 抗体夹心法进行病毒检测，淘汰带c a r m v 的个体，保留无毒个体继代繁殖，并 生根出瓶，进一步进行开花鉴定。鉴定合格后的苗，作为原原种不断打芽扦插 扩繁，一株原原种在一年中可打芽近1 0 0 个，作为原种种苗。将原种种苗栽培 形成母本植株，从母本植株上打芽、扦插生根后，作为生产用种苗。这样，一 株原原种母株最后可繁成近万株生产用种苗。在进行病毒及开花鉴定期间，试 管苗可以在4 8 低温下保存或进行茎段快繁，待鉴定工作完成后，即可为生 产提供大量无毒组培苗，这些组培苗可作为母本，也可直接用于切花生产，扦 插扩繁结合组培繁殖进行香石竹的种苗快繁，可加快繁殖速度，保证大规模生 产的种源需要。 由于香石竹品种不同，培养基成分及培养条件不同，茎尖培养会出现死亡、 生长过慢和生长过旺等情况。生长过旺易出现玻璃化，一种表现外观明显异常 ( 图4 ) ，另一种外观基本无异常( 图5 ) 。这是由于激素过高或光照太弱、温度 偏高等因素造成的。一般说来，适当提高铵盐及钾盐浓度，有利于茎尖的成活； 培养基中生长调节物质的种类和浓度对茎尖培养的成败尤其重要，少量的细胞 分裂素也有利于茎尖的成活。 图1 茎尖培养一周时的情况 f i g 1t h e s h o o tt i pc u l t u r e di naw e e k 福建农林大学硕士学位论文无病毒香石竹组培玻璃化控制研究 图2 茎尖培养一个月后的情况 f i g 2t h es h o o tt i pc u l t u r e d i nam o n t h 图4 外观异常的玻璃苗 f i g 4g l a s s l i k ep l a n t l e t w i t ha b n o r m a la p p e a r a n c e 图3 茎尖培养两个月后的情况 f i g 3t h es h o o tt i pc u l t u r e d i nt w om o n t h s 图5 外观基本正常的玻璃苗 f i g 5g l a s s 一1 i k ep l a n t l e t w i t hn o r m a la p p e a r a n c e 3 2 茎尖诱导试管苗玻璃化现象研究 3 2 1 细胞分裂素对茎尖诱导试管苗玻璃化的影响 表3 、细胞分裂素( b a ) 的用量对茎尖培养玻璃化的影响 t a b 3t h ei m p a c to f t h ec o n c e n t r a t i o no fb ao nv i t r i f i c a t i o n i ns h o o tt i pc u l t u r eo fc a r n a t i o n 1 6 福建农林人学硕士学位论文无病毒香“竹组培玻璃化控制研究 ( m g l )( ) 奥马 o4 l 粉色0 2 3 7 l3 7 24 0 7 3 5 4 1 3 5 1 7 5 细胞分裂索( b a ) 作为生长调节剂可以促进细胞分裂，诱导芽的分化，促 进侧芽萌发生长，但应有适量的浓度：在一定范围内，细胞分裂素浓度越高对植 物的分化力越强，玻璃化程序越严重，这主要是由于细胞分裂素使香石竹细胞 分裂加快，侧芽分化过盛，影响了植物体内干物质积累及组织器官发育( 高疆牛 等，2 0 0 1 ) 。培养基细胞分裂素浓度6 一苄基腺嘌呤( 6 - b a ) 能引起苹果砧木试管 苗，叶片g a 3 、i a a 含量下降( 郭启高等，1 9 9 9 ) ，从而引发玻璃化发生。在一些植 物的组织培养过程中，玻璃化率似乎和b a 与i a a 浓度的比值成正相关，也有一 些植物的玻璃化与b a 的浓度无关；与k t 相比，相同浓度的b a 更容易引起试管 j 巧七 一n n 孙 3 5 7 加 心蜗们 2 0 m 1 2 边红底粉 人贵 兰 福建农林大学硕： ：学位论文无病毒香石竹组培玻璃化控制研究 苗玻璃化。同是瑞香芽外植体，当培养基中激素为k t + i b a 时，k t 为l m g 一 和2 m g 一的玻璃苗无多大差异，均为8 3 左右：用相近浓度的b a + n a a 时， 玻璃苗率却猛增至3 7 5 。n a a 的用量增加也会导致玻璃化，可能是过量的n a a 诱导了培养物内源细胞分裂素浓度过高造成的。 试验结果( 见表3 ) 表明：在细胞分裂素( b a ) 用量的不同处理中，降低b a 的浓度虽然能减少红色系品种的茎尖培养玻璃苗，但玻璃苗率都很高，多明格的 玻璃苗率在8 8 2 以上，马斯特和红弗郎西斯科的最小玻璃苗率也分别在9 t 9 和9 4 9 。其他颜色品种的玻璃苗发生率随b a 浓度的降低而减少，且在相同b a 用量的情况下，比红色系品种低得多最大值出现在品种兰贵人，当b a 用量为 2m g l 1 时，玻璃苗率也仅为2 3 2 。 3 2 2 光照强度对茎尖诱导试管苗玻璃化的影响 光强对植物的形态建成有直接作用( 郑均宝等，1 9 9 6 ) ，光照强度影响光合作 用强度，问接影响合成的有机物质，也会影响试管苗内源a b a 的含量，内源a b a 水平参与调节植物一些重要物质的代谢；在弱光下，a b a 含量低，从而易引发 玻璃化。 从表4 中可以看出，光照强度提高，玻璃苗发生率降低。在1 0 0 0 2 0 0 0 l x 的光照强度下，奥马、兰贵人和小白菜的玻璃苗发生率可控制在1 0 以下，红 色系的3 个品种的玻璃苗发生率虽然在高光照强度下有所降低，但其玻璃苗率 仍高达9 0 以上。 袭4 光强照度对苇尖培养玻璃化的影响 t a b 4t h ei m p a c to ft h el u m i n o s i t yo nt h ev i t r i f i c a t i o ni n s h o o tt i pc u l t u r eo fc a r n a t i o n 福建农林大学硕l ：学位论文 尤病毒香石竹纽培玻璃化挖制研究 3 2 3 蔗糖浓度对茎尖诱导试管苗玻璃化的影响 表5 蔗糖浓度对茎尖培养玻璃化的影响 t a b 5t h ei m p a c to ft h ec o n c e n t r a t i o no fs u c r o s eo i lt h ev i t r i f i c a t i o n i ns h o o tt i pc u l t u r eo fc a r n a t