（分析化学专业论文）某些染料小分子与dna相互作用的电化学和光谱研究.pdf

某些染料小分子与d n a 相互作用的电化学和光谱研究 摘要 近年来，随着化学合成的现代技术、化合物分离手段和化学分子结构解析技 术，以及分子识别，分子闻相互作用的理论和研究技术的发展，d n a 与其它分子 相互作用的研究成为一个比较活跃的研究领域。d n a 和其它小分子之问的相互作 用与d n a 的复制和转录、基因突变、基因药物以及一些遗传疾病等息息相关。 因此，研究d n a 和其它小分子的反应在生命科学中非常重要。本论文应用电化 学方法和紫外可见光谱法研究了四种染料小分子没食子蓝( g c ) 、维多利亚蓝b ( b ) 、灿烂甲酚紫( b c v ) 、新亚甲蓝( m 忸) 和d n a 的相互作用。 论文研究了没食子蓝( g c ) 、维多利亚蓝b ( v b b ) 、灿烂甲酚紫( b c v ) 的 电极过程及与溶液中d n a 的相互作用，通过对加入d n a 前后它们的氧化还原峰 电流，蜂电位及一些电化学参数如电子转移系数a 和电极反应标准速率常数k 的变化的研究发现，它们均可与d n a 发生结合作用，并分别求出了它们的结合 比m 和结合常数卢。探讨了它们与d n a 结合反应的条件和模式，发现g c 与d n a 主要发生了嵌插作用，v b b 、b c v 与d n a 主要发生了静电结合作用并分别以 g c 、v b b 、b c v 为探针建立了新的d n a 电化学分析方法。检测限分别达到0 0 7 8 m g l 、0 0 3m g l 和0 0 7 6m g l 。另外，本论文还研究了新皿甲蓝( n m b ) 与溶 液中和电极上d n a 的相互作用。n m b 与s s d n a 主要以静电作用相结合，而n m b 与d s d n a 通过静电和嵌插两种作用方式相合。研究了n m b 在d n a 修饰电极表 面的富集和解析。求得了n m b 与d n a 作用的结合常数和电化学参数。结果表明 n m b 与s s d n a 和d s d n a 具有不同的结合性质，可用于识别s s d n a 和d s d n a ， 并可指示c a m v3 5 s 基因的杂交。 关键词：d n a ，没食子蓝，维多利亚蓝b ，灿烂甲酚紫，新亚甲蓝，玻碳电极， 相互作用，电化学 e l e c t r o c h e m i c a la n d s p e c t r o s c o p i cs t u d i e so nt h e i n t e r a c t i o n o fd y em o l e c u l e s a b s t r a c t w i t l lt h ed e v e l o p m e n to fm o d e mt e c h n i q u e so fc h e m i c a ls y n t h e s i s c o m p o u n d s e p a r a t i o n , c h e m i c a lm o l e c u l a rs t r u c t u r ea n a l y s i s ，a n dt h et h e o r ya n di n v e s t i g a t i o n t e c l m i q u e so f m o l e c u l a rr e c o g n i t i o n , r e c e n t l ym u c ha ：t t e n t i o na r ep a i dt ot h ei n t e r a c t i o n o fd n aw i t ho t h e rm o l e c u l e s 1 1 l ci n t 日a c t i o nb e t w e e nd n aa n do t h e rm o l e c u l 嚣 p l a y si m p o r t a n tr o l e si nl i f es c i e n c ea n di sr e l a t e dt ot h er e p l i c a t i o na n dt r a n s c r i p t i o no f d n a , g e n em u t a t i o na n dd i s e a s eo r i g i n s t h u s ，t h es t u d y o nt h ei n t e r a c t i o ni so f g r e a t i m p o r t a n c ef o rb o t ht h e r a p e u t i ca n ds c i e n t i f i cr e a s o n s i nt h i sp a p e r , t h ei n t e r a c t i o n so f f o u rd y e s ，g a l l o e y a n i n e ( g c ) ，v i c t o r i ab l u eb ( 、_ r b b ) ，b n 玎i a n tc r e s y lv i o l e t c v ) a n d n e wm e t h y l e n eb l u e ( n m b ) ，w i t hd n aw e r ei n v e s t i g a t e du s i n ge l e c t r o c h e m i c a la n d 艰协s p e c t r o s c o p i cm e t h o d s j t h ei n t e r a c t i o n so fg c v b ba n db c v , r e s p e c t i v e l y , w i md n ai ns o l u t i o nw e r e s t u d i e di nt h i st h e s i s a f t e rai n v e s t i g a t i o no nt h ec h a n g e so ft h er c d o x p e a kc u r r e n l s ， t h ep o t e n t i a l sa n ds o m ee l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r s , s u c ha st h ec h a r g et r a n s f e r c o e i f f i c i e n taa n dt h ee l e c t r o d er e a c t i o ns t a n d a r dr a t ec o n s t a n tk s ，o ft h ed y e sb e f o r e a n da f t e rt h ea d d i t i o no fd n a , w ef o u n dt h a ta l lo ft h e mc a nb i n dt od n a 。a n dt h e b i n d i n gn u m b e r sm a n dt h eb i n d i n gc o n s t a n t s 母o f t h ec o m p l e x e sw e r ec a l c u l a t e d t h e o p t i m a lb i n d i n gc o n d i t i o n sa n dt h eb i n d i n gm o d e l sw e r ei n v e s t i g a t e d ，r e s p e c t i v e l y a c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，t h eb i n d i n gm o d eb e t w e e ng ca n dd n ai s i n t e r c a l a t i v eb i n d i n g ，a n db e t w e e nv b bo rb c va n dd n ai se l e c t r o s t a t i cb i n d i n g a n d n e wd n ae l e c t r o c h e m i c a la n a l y s i sm e t h o d sa l ee s t a b l i s h e du s i n gg c ，v b ba n db c v 舔p r o b e s ，o f w h i c ht h ed e t e c t i o nl i m i t so f d n a t i t l eo 0 7 8m g l 、0 0 3m g ，la n do 0 7 6 m 儿r e s p e c t i v e l y o t h o l l l o r e , t h et h e s i sa l s oi n v e s t i g a t e st h ei n t e r a c t i o n so fn e w m e t h y l e n eb l u e ( n m b ) w i t l if i s hs p e r md n a ( d s d n a ) i ns o l u t i o n , a n dw i t hs s d n a a n dd s d n ai m m o b i l i z e d0 1 1t h eg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e n m bs h o w e da l le l e c t r o s t a t i c b i n d i n gw i t ht h ei m m o b i l i z e ds s d n a , a n db o me l e c t r o s t a t i ca n di n t e r c a l a t i v eb i n d i n g s w i t ht h ei m m o b i l i z e dd s d n a t h eb i n d i n gc o n s t a n t sa n dt h ee l e c t r o c h e m i c a l p a r a m e t e r so f n m b a tt h eb a r eg c e ，s s d n a g c ea n dd s d n a g c ew e r ec a l c u l a t e d , r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t so fe l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p ya l s oi l l u s t r a t e d t h a tn m bc a ni d e n t i f ys s d n aa n dd s d n a t h ed i f f e r e n c eo fi n t e r a c t i o np r o p e r t i e so f n m bw i t l lt h ei m m o b i l i z e ds s d n aa n dd s d n ah a sb e e nu s e df o rt h eh y b r i d i z a t i o n d e t e c t i o no f c a m v3 5 sg e n ef r a g m e n t k e yw o r d s ：d n a , g a l l o c y a n i n e , v i c t o r i ab l u eb ，b r i l l i a n te r e s y lv i o l e t , n e w m e t h y l e n eb l u eg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ，i n t e r a c t i o n , e l e c t r o c h e m i s t r y 青岛科技大学研究生学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢中所罗列的内容以外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请 的论文或成果。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中做了 明确的说明并表示了谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名： 徐自 日期： 刁年，6 月胗日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解青岛科技大学有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或 使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科 技大学。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密口。 ( 请在以上方框内打“”) 本人签名 导师签名 绷 焦奎 日期：湘年6 月一日 日期：加夕年6 月l z 日 9 1 青岛科技大学研究生学位论文 第一章文献综述 脱氧核糖核酸( d n a ) 是重要的生命物质，是生物遗传信息的主要载体，与生 物的生长、发育、繁殖等正常的生命活动及突变、癌变等异常生命活动有关，因 此，研究d n a 的结构和功能，可以从分子水平上了解生命现象的本质，解释各种 药物的作用机理，而有关d n a 的研究也就成为分子生物学和生物化学的重要课 题。 许多有机小分子能与d n a 发生相互作用，通过各种模式的作用机理影响到基 因的调控与表达，因此研究有机小分子与d n a 的相互作用很有意义，一方面可作 为生物探针建立测定d n a 高灵敏度的分析方法，另一方面可以作为靶向分子研究 其与d n a 作用的模式和机理及生物活性之间的关系，帮助人们了解某些疾病的发 病机理，以及研究药物对治疗疾病的重要意义【”。因此对d n a 的研究是现代生物 学、医学和生命科学的重要课题之一。2 0 0 3 年4 月1 4 日，美国联邦国家人类基因 组研究项目负责人弗朗西斯柯林斯博士在华盛顿宣布，由中、美、英、日、法、 德科学家经过1 3 年努力共同绘制完成了人类基因组序列图，人类基因组计划所有 目标全部实现。被誉为生命科学的“登月”计划的人类基因组序列图提前完成， 这标志着人类在揭示生命奥秘、认识自我的漫漫长路上又迈出了重要的一步。 1 1d n a 的结构 脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u e l e i ea c i d ，d n a ) 是核酸的一种，它由磷酸、d - 2 脱氧核糖和碱基构成。其中碱基又包括四种，即腺嘌呤( a d e n i n e ) 、鸟嘌呤 ( g u a n i n e ) 、胞嘧啶( c y t o s i n e ) 和胸腺嘧啶( t h y m i n e ) 。d n a 的基本构成如下 所示： r磷酸 lr d 2 脱氧核糖 iir 腺嘌呤 ( a ) 腧黼赭酸1 碱刮黧：c g ； ill 胸腺嘧啶( t ) d n a 由多条脱氧核糖核苷酸罐构成，每条链均以磷酸基( 磷酸酯键) 为桥， 从一个核苷的3 链接到相邻核糖的5 位置上，这就是d n a 的一级结构。1 9 5 3 年， w a t s o n 和c r i c k n 提出了d n a 分子的双螺旋结构模型( 即d n a 的二级结构) ，揭 某些染料小分子与d n a 相互作用的电化学和光谱研究 示了遗传信息是如何储存在d n a 分子中，以及遗传性状何以在世代间得以保持 的奥秘。这是生物学发展史上具有里程碑意义的重大事件。其主要内容如下： ( 1 ) 在d n a 分子中，两股d n a 链围绕假想的共同轴心形成一右手螺旋 结构，双螺旋的螺距为3 4n n l ，直径为2 0n n l 。 ( 2 ) 链的骨架( b a c k b o n e ) 由交替出现的、亲水的脱氧核糖基和磷酸基构成， 位于双螺旋的外侧。 ( 3 ) 碱基位于双螺旋的内侧，两股链中的嘌呤和嘧啶碱基以其疏水的、近 于平面的环形结构彼此密切相近，平面与双螺旋的长轴相垂直。一股链中的嘌呤 碱基与另一股链中位于同一乎面的嘧啶碱基之间以氢链相连，称为碱基互补配对 或碱基配对( b a s ep a i r i n g ) ，碱基对层间的距离为o 3 4 啪。碱基互补配对总是出 现于腺嘌呤与胸腺嘧啶之间( a = t ) ，形成两个氢键；或者出现于鸟嘌呤与胞嘧啶 之间( g ) ，形成三个氢键。 ( 4 ) d n a 双螺旋中的两股链走向是反平行的，一股链是5 03 琵向，另一 股链是3 05 凭向。两股链之间在空间上形成一条大沟( m a j o r g r o o v e ) 和一条小 沟( m i n o rg r o o v e ) ，这是蛋白质识别d n a 的碱基序列并与其发生相互作用的基 础。 d n a 双螺旋的稳定由互补碱基对之间的氢键和碱基对层间的堆积力( b a s e s t a c k i n gf o r g e ) 维系。d n a 双螺旋中两股链中碱基互补的特点，逻辑地预示了 d n a 复制过程是先将d n a 分子中的两股链分离开，然后以每一股链为模板( 亲 本) ，通过碱基互补原则合成相应的互补链( 复本) ，形成两个完全相同的d n a 分子。因为复制得到的每对链中只有一条是亲链，即保留了一半亲链，将这种复 制方式称为d n a 的半保留复制( s e m i - c o n s e r v a t i v er e p l i c a t i o n ) 。后来证明，半保 留复制是生物体遗传信息传递的最基本方式。 在二级结构的基础上，d n a 还可扭曲或卷曲形成三级结构。 1 2d n a 的性质 1 2 1d n a 的物化性质 1 2 1 1 溶解性 大分子d n a 为疏松的石棉一样的纤维状结晶，一般都微溶于水，不溶于乙 醇、乙醚、氯仿等有机溶剂，但d n a 的钠盐比自由酸易溶于水。 2 青岛科技大学研究生学位论文 1 2 1 2 紫外吸收 d n a 中含有双键的嘌呤和嘧啶，所以具有强的紫外吸收性质，其最大吸收波 长在2 6 0n i l l ，蛋白质也具有紫外吸收性质，但其最大吸收波长为2 8 0n m ，利用这 一性质，通过测定在2 6 0n l n 处和2 8 0n l n 处吸光度并根据它们的比值可估计d n a 的纯度。当a 2 6 0 a 2 比值为1 8 2 0 之间。表明d n a 试样的纯度较高，d n a 在2 6 0 n l l l 处的摩尔吸光系数e 为6 6 0 0 ( m o f l ) - 1 c l n 1 f 3 1 。 1 2 1 3d n a 的变性、复性 当d n a 受到某些理化因素的影响，使分子中的氢键、碱基堆积力等被破坏， 双螺旋结构解体，分子由双链( d s d n a ) 变为单链( s s d n a ) 的过程称为变性。 变性的实质是维持二维结构的作用力受到破坏，使双螺旋破坏，但是d n a 的一 级结构未变，即变性不引起共价键的断裂。多种因素能引起d n a 变性，如提高 p h 、提高温度或急剧降低离子强度。d n a 变性后，其许多物理性质随之改变， 如黏度降低、沉降速度增加，旋转偏振光能力改变等。， d n a 的变性是可逆的，解除变性条件后，解开的两条d n a 互补链又可以重 新恢复形成双螺旋结构，并恢复有关的性质和生物功能。这个过程称为d n a 的 复性。例如对热变性的d n a 溶液，缓慢冷却，双螺旋又重新形成。 1 2 2i ) n a 的电化学性质 ， d n a 的电化学性质研究始于上个世纪5 0 年代，p a l e c e k 使用示波极谱发现d n a 具有电活性。在d n a 的组分中，核糖和核磷酸均不具有电活性，鸟嘌呤、腺嘌呤 和胞嘧啶均可在汞电极上还原产生还原峰，而鸟嘌呤在汞电极一1 6 0v 下还原的产 物还可在0 3v 产生一个氧化峰。鸟嘌呤和腺嘌呤可在碳电极上氧化，腺嘌呤的 氧化峰约在+ 1 2v ，鸟嘌呤的氧化峰约在1 - 0v i ”。 1 。3d n a 与有机小分子的作用模式 d n a 分子中平行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架和两条核苷酸链螺旋形 成的大沟和小沟构成了有机小分子与d n a 相互结合的位点，作用的方式主要有 共价结合、剪切作用、长距组装及非共价结合等四种类型，另外还有氢键、范德 华力、疏水作用等弱相互作用5 用。绝大多数的小分子与d n a 的作用形式为非共 价结合，它又包括静电作用、嵌入结合和沟面结合，而且通常不是一种力的单独 某些染料小分子与d n a 相互作用的电化学和光谱研究 作用，而是多种作用力的协同作用。 1 3 1 共价结合 共价结合是指有机小分子与d n a 的各种碱基以共价键结合生成稳定的配合 物，主要有核酸的烷基化反应，d n a 的链内交联、链间交联反应等，虽然符合条 件的有机小分子不多，但与非共价结合相比，其特异性识别能力要强得多，而且 反应不可逆。 1 3 ，2 剪切作用 有机小分子通过与d n a 分子双链的特异性结合而导致d n a 链的断裂，这种 剪切作用导致d n a 的损伤，也是导致基因突变的原因。这类d n a 切割剂中药物 和金属配合物占了相当大的比例嘲。博莱霉素 9 1 ( b l e o m y c i n ) 是一种典型的d n a 切割化合物，分子结构的特殊性使其能够识别并结合在d n a 中5 - g c 3 序列的 鸟嘌呤上，然后经一系列化学反应最终导致d n a 断链。b a r t o n 等i t 0 1 合成的r h z n 双核配合物，左边的p , h ( m 3 的配体插入d n a 大沟区【1 1 】，右边的锌肽起水解酶的 作用1 1 2 i ，使超螺旋的p b r 3 2 2 d n a 断裂变成切口和线状两种形式 t 3 3 长距组装 带正电的有机小分子对d n a 有凝聚作用，当其与d n a 作用时，会诱导d n a 超螺旋结构的形成。有机小分子在d n a 表面进行排列或堆积称为有机小分子在 d n a 分子表面的长距组装。 1 3 4 非共价结合 ( 1 ) 静电作用( e l e c t r o s t a t i c b i n d i n g ) 。指小分子与d n a 分子的带负电荷的核糖 磷酸基骨架之间通过静电作用而结合。该作用没有选择性，是非特异性的。 ( 2 ) 嵌入结合( i n t e r c a l a t i o nb i n d i n g ) 。是指平面芳环的小分子嵌入d n a 分子双 螺旋的碱基对之间。结合的作用力来自芳环的离域彳体系与碱基的瓤体系问形成 霄百相互作用及疏水相互作用。大部分金属配合物和抗癌药物与d n a 的相互作用 都存在嵌入方式。 ( 3 ) 沟面结合( g r o o v e b i n d i n g ) 。即小分子与双链d n a 的大沟或小沟的碱基边 缘直接发生相互作用。小分子与d n a 的小沟壁紧密作用，作用形式主要是氢键作 用和范德华力。小分子主要在小沟区发生结合，这是由于小沟区为a - t 富集区， 而且存在水合结构，具有芳香环结构的小分子易于自由扭转来适合小沟区，同时 取代沟内的水分子进入小沟区。大沟结合的药物和d n a 主要以氢键结合。 4 青岛科技大学研究生学位论文 1 4d n a 探针的分类 1 4 1 有机染料 早在一个世纪以前，人们就发现微生物的细胞核可与碱性染料结合显色，便 于在显微镜下观察。由于染料往往具有氧化还原活性，有机染料与d n a 的作用便 成为电化学研究的一个重要课题。这对于了解d n a 分子的理化性质和筛选合适的 d n a 杂交指示剂具有重要价值。一些有机染料分子，如有平面结构的多环芳烃 ( 如吖啶类、吩噻嗪类、卟啉类等) ，可以以嵌插方式作用于d n a 分子碱基对， 还可以通过自身所带的电荷与d n a 发生静电吸附作用，一些三苯甲烷类染料如乙 基紫1 1 3 】、结晶紫【1 4 】等也已经被用于研究与d n a 的相互作用。 吩噻嗪类染料包括亚甲蓝( m e t h y l e n eb l u e , m b ) 、甲苯胺蓝( t o l u i d i n eb l u e , t b ) 和硫堇( t h i o n i n e ) 等。m b 是一种常用的核酸染色剂。早期对m b 与d n a 作用的光 度法研究认为m b 与d n a 通过嵌插作用结合嗍。k e l l e y l l 6 l 等采用含有1 5 个碱基的 巯基衍生化寡聚核苷酸固定在金电极表面研究m b 与d n a 的嵌入作用。通过计时 库仑数据计算得到m b 和表面固定的d h i a 亲合常数为3 8 1 0 6 ( m o l l ) 1 ，结合位点 数为每1 5 碱基的d n a 链结合1 s + m b 。z h a o 【l 刀等使用循环伏安和光谱法研究了环 糊精存在条件下m b 与d n a 的相互作用。m b 可能与d n a 形成的l ：1 的结合物，且 其结合常数为1 3 x 1 0 5 ( m o l l ) 。亚甲蓝与环糊精之间形成了1 ：1 的包络物，且其包 络常数k 为4 4 x 1 0 5 ( t o o l l ) 。包络物仍能与d n a 形成1 ：1 的结合物，其结合常数为 7 2 1 0 4 ( t o o l l ) ，略小于m b 单独与d n a 作用时的结合常数。该实验证明了d n a 与m b 主要通过静电作用模式结合。e r d e m 1 8 增发现m b 在单链d n a 修饰碳糊电极 ( s s d n a c p e ) 上的电流要比杂交后电极大。y a n g 19 】等用含有不同数目的鸟嘌呤( g ) 碱基的2 1 链的寡聚核苷酸研究了m b 与d n a 的相互作用。他们发现m b 在探针修饰 电极上的电流与g 碱基的数量成正比，推测m b 主要与d n a 的g 碱基结合。m b 可 以有效的区分单双链d n a ，因此常被用作d n a 杂交指示剂 2 02 ”。 本课题组【2 4 l 用循环伏安法和微分脉冲伏安法研究了在p h6 0 的b r 缓冲溶液 中t b 与d n a 的相互作用。t b 在玻碳电极上有一对可逆性良好的氧化还原峰。加 入d n a 后氧化还原峰电流明显降低，氧化峰电位负移。t b d n a 结合反应前后的 电化学参数如电极反应电子数、电子转移系数和电极反应标准速率常数基本没有 发生变化，说明t b 与d n a 结合反应生成了一种非电活性的复合物，而使t b 的峰 电流下降。求得了两者的结合比为n ( t b ) ：n ( d n a ) = 1 ：1 ，结合常数为7 5 0 1 0 4 。 冶保献【25 】等用光谱电化学和电化学技术研究了硫堇与d n a 相互作用的电化 某些染料小分子与d n a 相互作用的电化学和光谱研究 学和光谱电化学性质，发现d n a 与硫堇作用后电流减小，而通过卵磷酯固定于 电极表面的硫堇也可与d n a 作用，但是电流减小的比例远小于硫堇与溶液中 d n a 的结合，说明硫堇能插入d n a 双螺旋结构内部。杜江燕1 2 6 】等用电化学和光 谱方法研究了溶液p h 对硫堇与小牛胸腺d n a 的相互作用的方式的影响。电化学 测量结果表明，在p h7 2 的磷酸盐缓冲溶液中，硫堇与d n a 的作用方式以嵌插 作用为主，在p h6 5 的磷酸盐溶液中，硫堇与d n a 之间的作用方式既存在嵌插 结合也存在静电作用。 由于染料分子中一般存在不饱和基团或大的共轭百键体系，有的还具有荧光性 能，所以多种研究方法如光度法、荧光法、电化学法和共振光散射法等已经应用 于研究染料分子和d n a 的相互作用。牛淑妍f 27 】等用电化学循环伏安法及紫外可 见光谱法对菲啶类染料溴化乙锭( e b ) 与d n a 的相互作用进行了研究后发现e b 能与d n a 分子发生嵌插作用；方禹之【2 8 】等人以乙基( 3 二甲基丙基) 碳化二亚胺 盐酸盐( e d c ) 为偶联活化剂，将e b 成功地标记在人工合成的含有2 1 个碱基的寡 聚d n a 片段上，制备成e b 标记d n a 探针并用电化学方法将待测样品d n a 片段固 定在石墨电极表面，在一定的温度、p h 值和离子强度条件下与e b 标记d n a 探针进 行杂交反应，从而对靶序列d n a 片段进行识别和测定。 何锡文【2 9 】等人采用紫外可见光谱法研究吩嗪类染料中性红与d n a 的相互作 用后发现小分子物质与d n a 分子的非共价键力作用将改变d n a 分子构型，破坏 其模板作用。姜慧君0 0 1 等人采用光谱电化学法研究了中性红和d n a 的相互作用 并发现随着溶液p h 值的改变，由于n r 分子存在方式不同，n r 与c t - d n a 之间 相互作用的方式也随之不同。在p h = 7 0 时，二者的作用方式主要为嵌插作用， 当p i - i = 6 0 时，二者主要的作用方式改变为静电作用。 刘绍璞【3 1 】等人在t f i s 缓冲溶液中系统研究了碱性三苯甲烷类染料的光谱特 性，发现鲱鱼精d n a 可以和三苯甲烷类染料结合而使其共振光散射显著增强并产 生新的共振光散射光谱，体系的散射强度与d n a 的浓度在一定范围内呈线性关 系。本课题组 3 2 1 使用光谱和电化学方法研究了罗丹明b ( p , h o d a m i n cb ，r b ) 对d n a 的识别作用。r b 在+ 0 9 2 v 有一个不可逆的氧化峰，加入d n a 后由于r b 与d n a 发 生识别作用，导致r b 的峰电流降低，而峰电位基本没有发生改变。在加入d n a 后电化学参数基本上不发生变化，说明r b 与d n a 识别后形成了一种非电活性的 复合物，导致溶液中游离的r b 浓度降低，相应峰电流下降。 1 ，4 2 金属配合物 金属离子配合物，尤其是过渡金属配合物是一类重要的核酸探针，这类化合 物的主要作用有两种：设计人工核酸酶从而实现对d n a 链上某些特定位点的剪 6 青岛科技大学研究生学位论文 切作用。设计成性能优良的抗肿瘤药物或抗病毒药剂。 自从6 0 年代r o s e n b e r 9 3 3 1 发现二氯二氨合铂( ) 具有优良的抗癌活性以来， 现已有多种具有类似结构的平面四边形铂配合物处于l 陆床实验阶段。这类药物的 抗癌活性与其能和d n a 链共价结合并导致d n a 结构变化的能力密切相关。一些 具有八面体结构的过渡金属配合物，尤其是r u 、r h 、c o 配合物与d n a 相互作 用的研究也一直受到人们的重视。许多r u 配合物具有的独特发光性能，使其成 为研究d n a 性质的一种有效的光物理和光化学探针。计亮年【3 ”5 j 等合成了一系 列r u 的平面配体配合物，研究了这些配合物与小牛胸腺d n a 的光断裂作用，发 现是由于激发态的配合物与溶液中的氧分子发生能量转移生成单线态氧活性氧 化物种。将鸟嘌呤碱基氧化而导致d n a 断裂。杨频 3 6 - 3 8 】等人选择c o ”、n i 2 + 作为 中心离子，合成了 c o ( p h e n ) d p p z ”、 c 0 0 ) p y ) 2 d p p z ”、 n i ( p h e n ) 2 d p p z ”、 【c o ( p h c n ) 2 d p p z 2 + 等配合物，采用光度法、荧光法和圆二色谱法等手段研究了它们 和小牛胸腺d n a 的相互作用，发现配合物与d n a 作用后吸收光谱减色、红移和 荧光增强等效应，并发现这些配合物在光照下可使d n a 断裂，从而为设计与d n a 结合力强、以光切断d n a 的新型抗癌剂提供了根据。本课题组 3 9 - 4 2 1 合成了多种 金属配合物，其中包括双核铁配合物 f c ( p h e n ) 0 t 2 0 ) 3 2 0 ”；多吡啶混配铜配合 物c u ( p h e n d i o n e ) ( d a p ) 2 + ( p h c n d i o n e = l ，1 0 邻菲罗啉5 ，6 - - - 酮，d a p = 2 ，3 二氨基吩 嗪) 和c u ( l l 7 2 ) ( l = 2 ，2 联吡啶，l = 对甲基苯甲酸) ；电中性混配钴配合物 c o ( e i m ) 4 ( n c s ) 2 ( e i l n = 1 乙基咪唑) ；低分子量水溶性壳聚糖铜、镉配合物c h t c u 和c h t c d 等等。在水溶液中和修饰电极上研究了各配合物和s s d n a 或d s d n a 在电极表面的相互作用，讨论了结合机理，得到了配合物和d s d n a 或s s d n a 在 电极表面的结合参数。并发现c u ( p h e n d i o n e ) ( d a p ) ”、c o ( e i m ) 4 0 q c s ) 2 、c u ( l l 2 ) 和c h t c d 等可用于转基因植物片段的定性和定量分析。 i 4 3 抗癌药物 研究药物分子和d n a 的相互作用，可以了解药物的药理和毒性，特别是对于 了解药物分子对d n a 特定位点的识别作用以及对d n a 构象产生的影响，在体外筛 选出高效合理的抗癌药物具有重要意义。这些药物分子包括：多肽及蛋白质类； 蒽环类；烯炔类；乙撑亚胺类等。 s c h u s t e r 4 3 】等人以蒽醌类的抗癌药物的衍生物作为光学激发剂研究了d n a 的 断裂，发现具有葸醌结构的功能基团具有较低的激发能级并且可以特异性剪切 d n a 片段，因此可以设计成人工核酸酶而具有较大的研究和应用价值。 庞代文等人在研究抗癌药物和d n a 的相互作用方面作了较多的工作，他们研 究了道诺霉素 4 4 1 ( d n m ) 在石墨粉末微电极和d n a 修饰石墨粉末微电极上的电化 7 某些染料小分子与d n a 相互作用的电化学和光谱研究 学行为，发现经d n a 修饰的粉末微电极的充电电流和氧化还原峰电流都较未修饰 的电极明显增大，推测出充电电流增大是由于d s d n a 吸附固定于石墨粉末的表面 后，因其有很强的亲水性。使粉末微粒的浸润表面积大大增加所致，在此基础上 提出了测定微量d n m 的方法并且实现了在人尿样中d n m 的痕量测定；他们还研 究了一种自己合成的f e ( i i ) s c l l i 自喊1 4 5 l 和d n a 的相互作用，采用光谱和电化学法研 究后发现d s d n a 和此类s c h i 丑f 碱发生较强的相互作用，特别是f e ( i i ) s c h i f f 碱配合物 更容易和d s d n a 结合。推测t s c h i 蹦类配合物的生物作用过程可能涉及到吸氧、 催化以及和d n a 的相互作用等多方面的协同作用。 李启隆 4 6 1 等人采用钴离子注入修饰电极研究了柔红霉素( d n r ) 与d n a 的相 互作用，发现d n r 可以通过嵌插方式与d n a 作用形成了一种非电活性的络合物， 并且加入d n a 后d n r 的电化学行为并没有发生变化。用非线性拟合得至) j d n r 与 d n a 的结合比和结合常数分别为4 和1 0 9 x 1 0 8c m 3 m o l 。 彭图治f 4 7 1 等人在活化浸蜡石墨电极上研究了更生霉素( a c t d ) 的电化学行 为以及与d n a 的相互作用。发现加入d n a 后a c t - d 的峰电流明显降低，推测出 a c t - d 和d n a 生成了非电活性络合物。采用电化学法计算出结合反应的结合比和 结合常数分别为8 和5 。8 7 x 1 0 9c m 3 m o l 。作者认为极有可能是两个多肽侧链与d n a 小沟中的碱基之间发生氢键作用，增强了药物对d n a 的结合能力，采用x 晶体衍 射法研究后发现a c t - d 倾向于结合g c 碱基对。 1 5d n a 与有机小分子相互作用的常见研究方法 1 5 1 光谱法 小分子与d n a 相互作用后，其结构和化学性质会发生交化，根据这些变化可 以判断它们之间的作用方式，进而阐述其作用机理。常用的光谱学研究法有紫外 可见吸收光谱法、荧光光谱法、共振光散射法等。 1 5 1 1 紫外一可见吸收光谱法 紫外一可见吸收光谱是研究d n a 与小分子相互作用的一种最方便、最常用的 技术。因为含有碱基生色团的双螺旋结构d n a 分子在2 6 0n n l 附近处有强吸收，而 且许多小分子或本身具有光学活性，或与d n a 结合后可以产生光学活性，所以可 根据相互作用前后d n a 或小分子的吸收谱带的变化对二者相互作用模式进行判 断。通常小分子与d n a 发生相互作用后，如果它们的吸收光谱上观察到减色、等 吸收点、光谱红移等三种光谱现象，则表明小分子与d n a 以嵌插方式键合，这是 青岛科技大学研究生学位论文 因为嵌入的小分子与d n a 碱基对可发生丌电子堆积，作用配体的n 空轨道与碱基 的n 轨道发生偶合，使能量降低，从而产生红移现象、减色效应 4 8 , 4 9 】。若它们的 吸收光谱受d n a 的影响较小，无减色效应和红移现象，则说明该小分子与d n a 之间只存在静电作用。彭俊峰 s o l 等利用紫外光谱研究了虫草素与小牛胸腺d n a 的 作用机理，从光谱图上可以看出d n a 发生了明显的减色效应并有一定的红移现 象，说明虫草素可能以腺嘌呤碱基嵌入到d n a 双螺旋碱基对问。 1 5 1 2 荧光光谱法 在d n a 探针技术的多种研究方法中，荧光光谱技术由于其高灵敏性而获得了 广泛的应用。荧光技术不仅是研究d n a 损伤和修复的主要手段，而且日益成为基 因检测的理想工具。荧光光谱法主要根据相互作用前后反应物荧光强度的变化， 对二者作用模式进行判断。d n a 分子本身在常温条件下不发射荧光，一般引入有 机小分子荧光探针来研究相互作用，它是基于荧光试剂的加入，导致溶液中荧光 强度的增强或猝灭来测定d n a 。卞伟【5 l 】等用荧光光谱和磷光光谱法研究了四溴荧 光素( t b f ) 与d n a 的相互作用。探讨了盐效应和乙醇在d n a 存在和不存在条件下 对t b f 体系荧光强度的影响，以及不同p h 在d n a 存在和不存在条件下对体系磷光 强度的影响，求得了无d n a 存在以及有d n a 存在下的荧光猝灭常数，并通过荧光 猝灭实验和磷光偏振实验得出了t b f 和d n a 的可能作用方式。 1 5 2 电化学方法 采用电化学方法也可以研究小分子与d n a 的相互作用，虽然在一定程度上受 小分子是否具有电活性的影响，但这种方法比较适合于一些吸收光谱比较弱或由 于其电子跃迁谱带与d n a 发生重叠而无法用光谱方法来研究的分子。电化学方法 研究生物小分子与d n a 的相互作用是基于d n a 的存在对体系伏安特性的影响，包 括由于反应所引起体系的式量电位的移动和当小分子与d n a 分子结合后其扩散 系数的大幅度下降而导致电流的减小等电化学行为的差别。 电化学方法研究小分子与d n a 相互作用主要是利用极谱和伏安技术，如循环 伏安法、线性扫描伏安法、直流极谱法、交流极谱法、吸附溶出伏安法、吸附转 移溶出伏安法、微分脉冲极谱法、卷积伏安法、计时库仑法、阴极( 阳极) 溶出伏 安法、方波伏安法、示波滴定法等。d n a 的其它电分析方法包括电位法，阻抗法， 电化学发光法等。z h a op 7 等使用循环伏安和光谱法研究了环糊精存在条件下亚甲 蓝( m e t h y l e n eb l u e , m b ) 与d n a 的相互作用，实验证明了d n a 与m b 主要通过静电 作用模式结合。h a s o n 5 2 】等使用电容测量技术、电化学阻抗谱和恒电流计时电位 9 某些染料小分子与d n a 相互作用的电化学和光谱研究 法研究了悬汞电极表面棘霉素( e c h i n o m y c i n ) 与s s d n a 和d s d n a 的相互作用。电容 测量显示棘霉素在0 5 3 v 有一个依赖于交流伏安电压频率的准电容峰，棘霉素 d s d n a 的复合物也有这准电容峰，但是棘霉素与s s d n a 作用后未发现该峰。j w a n g 等t 5 3 】使用碳糊电极以计时电位溶出分析研究了道诺霉素( d a t m o m y c i n , d n m ) 与d n a 相互作用，研究显示药物与溶液中的d n a 和固定在电极表面的d n a 作用 有差别，对迸一步探索d n a 与药物的作用有重要意义。 1 5 3 其他方法 在确定小分子化合物与d n a 作用模式方面，流体学方法( 如粘度法、沉淀 速度法及在凝胶中的泳动速度等) 有其独特的应用，该法常被用来验证小分子化 合物究竟是否以插入方式与d n a 作用。核磁共振、平衡渗析、x - 射线衍射法等 被用于小分子与d n a 相互作用机理的研究。煳十线晶体衍射和质谱法能提取小 分子化合物与核酸分子的结合位点及结构变化的信息。序列凝胶电泳和足印分析 技术是生物学中研究核酸与其它分子相互作用最基本的两种手段。总之，对小分 子化合物与d n a 相互作用的研究，仅仅用单一方法是远不能令人满意的，必须 综合运用各种方法和手段进行全方位的研究才能得到比较可靠的结论。 1 6 有机小分子与d n a 相互作用