（动物学专业论文）夜蛾科昆虫胚胎的超低温保存研究.pdf

夜蛾科昆虫胚胎的超低温保存研究 专业：动物学 博士生：罗丽 指导老师：庞义教授 摘要 本文选取鳞翅目夜蛾科昆虫一甜菜夜蛾作主要对象，系统研究了甜菜夜蛾 胚胎的超低温保存技术及处理程序对胚胎发育，孵化幼虫的影响。此外，对斜 纹夜蛾胚胎的超低温冷冻保存也作了初步研究。 作者研究了5 种传统保护剂( 二甲基亚砜，甘油，甲醇，l ，3 一丙二醇，乙二 醇) 和3 种新型保护剂( 2 - 氨基1 一乙二醇，3 一氨基一1 一丙醇及3 甲氧基1 ，2 丙 二醇) 对甜菜夜蛾胚胎的毒性及其玻璃化能力，从中筛选出乙二醇作为保存甜 菜夜蛾胚胎的低温保护剂。 发育5 0 h 的甜菜夜蛾卵，经1 4 次氯酸钠及正已烷去除外卵壳和蜡质层后， 获得了9 9 8 的渗透率，7 0 左右的孵化率。利用乙二醇对去卵壳后的甜菜夜 蛾胚胎进行三步法渗透( 2m o l le g5 m i n 一4m o l le g , 5 m i n - - - 8m o i l e g + 5 p v p , 3 0 s ) ，置入液氮冻存7 m i n ，3 7 复温后于o 2 5 m o l l 的蔗糖溶液中 稀释3 r a i n ，覆盖石蜡油保湿孵化，可获得8 8 的孵化率。把三步渗透法第三 步的乙二醇浓度提高到8 6 m 一9 m ，并延长渗透时间，不覆盖石蜡油进行保湿孵 化，可以获得1 5 5 4 1 2 的孵化率。由以上程序冻存的胍胎所孵化幼虫，其外 部形态及行为表现异常，即体色透明，行动缓慢，黑色素减少，不主动取食， 4 8 h 内死亡。 深入研究表明，去卵壳处理过程不影响胚胎发育及孵化幼虫的生长发育， 保护剂的渗透及在胚胎中的残余，诱导胚胎期酚氧化酶和初孵幼虫海藻糖酶活 性的升高，基因组d n a 去甲基化，初孵幼虫表皮的鞣化和硬化过程受阻，形 成肿胀型幼虫，但是这些影响都可以修复，对孵化幼虫不造成致命性损伤。冻 存及复温过程对胚胎发育的影响最大，基因组d n a 去甲基化，c 孔消失，表 皮肿胀，中肠受损，其中复温过程中保护剂的反玻璃化及大冰晶的形成是造成 孵化幼虫最终死亡的直接原因。 其它发育期的甜菜夜蛾卵对去卵壳及保护剂处理都极其敏感，液氮冻存后 均无法孵化。改用天然饲料喂养甜菜夜蛾，虽然可以提高虫卵对保存程序的抗 性，但冻存后也不能成功孵化。和甜菜夜蛾相比，发育至3 5 h 和5 0 h 的斜纹夜 蛾胚胎对化学物质的处理更为敏感，胚体极易变形破裂，难以实现超低温种质 保存。 实现一个物种的超低温保存是一项非常耗时的研究，本研究为以后研究奠 定了基础，探明了昆虫胚胎超低温冻存程序的改良方向。 关键词：冷冻保存，玻璃化，胚胎，保护剂，甜菜夜蛾，斜纹夜蛾 s t u d i e so nt h ec r y o p r e s e r v a t i o no fn o c t u i d a ei n s e c te m b r y o s s p e c i a l i t y ：z o o l o g y n a m e ：l n o l i s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rp a n gy i a b s t r a c t t h ev i t r i f i c a t i o no f s p o d o p t e r ae x i g u ae m b r y o sa n dt h ee f f e c t sf r o m p r o c e d u r e s w e r es t u d i e d t h ev i t r i f i c a t i o no f s p o d o p t e r al i t u r ae m b r y o sh a da l s ob e e nt r i e d e t h y l e n eg l y c o l ( e g ) w a ss e l e c t e df r o m8k i n d so fc r y o p r o t e c t a n t s ( c p a s ) t e s t e d ，i n c l u d i n gm e t h a n o l ，e t h y l e n eg l y c o l ，1 ，3 - p r o p a n e d i o l ，g l y c e r o l ，d i m e t h y l s u l p h o x i d e ，2 - a m i n o 一1 一e t h a n o l ，3 - a m i n o 一1 一p r o p m l o la n d3 - m e t h o x y 1 ，2 - p r o p a n e d i o l ， f o ri t sc o n s i d e r a b l yl o wt o x i c i t ya n ds t r o n gg l a s s f o r m i n gt e n d e n c yt oc r y o p r e s e r v e s p o d o p t e r ae x i g b ! ae m b y r o s 9 9 8 o f 5 0 hs e x i g b l ae m b r y o sw e r ep e r m e a t e da f t e rd e c h o r i o n a t i o nw i t h1 4 h y p o c h l o r i t es o l u t i o na n dh e x a n e ，a n da b o u t7 0 o fe m b r y o ss u r v i v e d w i t ht h e 3 - s t e pl o a d i n g ( 2m o l le g5 r a i n - - + 4m o l le g , 5 m i n _ 8m o l le g + 5 p v p , 3 0 s ) a n dl s t e pu n l o a d i n g ( o 2 5 m o l l s u c r o s e ，3 m i n ) p r o c e d u r e s ，t h eh i g h e s th a t c h i n gr a t e a c h i e v e da f t e rs t o r a g ei nl n 2a n di n c u b a t i o nw i t hp a r a w mo i lc o v e r al k t l el o w e r h a t c h i n gr a t e so f1 5 5 4 12 a l s oa t t a i n e dw i t ht h ee l e v a t i o no fe gc o n c e n t r a t i o n f r o m8 0 mt o8 6 mo r9 0 mi nt h et h i r dl o a d i n gs t e p n e wh a t c h e dl a r v af r o mt h e e m b r y o sv i t r f i c a t e ds h o w e ds o m ea b n o r m a l i t i e ss u c ha st r a n s p a r e n tb o d y , m e l a n i n l o s s ，s l o wa c t i o na n dn o ta c t i v e l yf e e d i n g n oo n es u r v i v e do v e r4 8 hi na l lt r e a t i n g g r o u p s e v a l u a t i o n so fi n j u r i e sf r o mt r e a t i n gp r o c e d u r e sw e r ea l s oc a r r i e do u t t h e r e s u l t ss h o w e dt h a td e c h o r i o n a t i o nd i dn o tc a u s ea n yd i f f e r e n c e sc o m p a r e dt oc o n t r o l l a r v a c p a sl o a d i n ga n df r e e z e t h a wc y c l ed i dh a r mt od e v e l o p i n ge m b r y o sa n d h a t c h e dl a r v a a f t e rl o a d i n ga n du n l o a d i n gt r e a t m e n t so fe g , s o m er e p a i r a b l e i i i n j u r i e sa p p e a r e d ，i n c l u d i n gt h ea c t i v i t i e se l e v a t e do ft w oe n z y m e s ( p h e n o l o x i d a s e a n dt r e h a l o s e ) ，b l i m pp h e n o t y p ei nc u t i c l ea n dg e n o m ed e m e t h l y a t i o n u m e p a i r a b l e i n j u r i e sp r o d u c e dd u r i n gf r e e z e t h a wc y c l e ，a n d t h er a p t u r eo fm i d g u tt i s s u e s p o s s i b l yf o rl a r g ec r y s t a lf o r m i n g i nt h a w i n gp r o c e s ss h o u l db et h ed i r e c tr e a s o nl e d t ot h ed e a t ho f h a t c h e dl a v v a n oa n yp o s k i v er e s u l t sy i e l d e di no t h e rd e v e l o p i n gs t a g e so f xe x i g u ae m b r y o s f e e d i n gse x g l l ul a r v aw i t ha m a r a n t hs h o w e ds t r o n g e re n d u r a n c e t od e c h o r i o n a t i o n a n dc p a st r e a t m e n t ，b u t d i dn o t g e ta ws u r v i v a l a f t e rv i t r i f i c a t i o n s a m e c r y o p r e s e r v t i o np r o c e d u r e so fse x i g r ad i dn o tw o r kw h e na p p l i e d t os p o d o p t e r a i i t u r ae m b r y o s ，w h i c hw a sv e r ys u s c e p t i v et oc h e m i c a lt r e a t m e n t sr e q u i r e d i n c r y o p r e s e v a t i o na n dal a r g en u m b e ro fe m b r y o sr u p t u r e da f t e rd e c h o r i o n a t i o n ，c p a t r e a t m e n ta n dv i t r i f i c a t i o n d e v e l o p m e n t o fa c o m p l e t e l y s u c c e s s f u l c r y o p r e s e r v a t i o np r o t o c o l i s t i m e c o n s u m i n g ，a n dp r e s e n tw o r kp o i n t e do u tt h ed i r e c t i o nf o ri m p r o v e m e n ta n d p r o v i d e dt h ef o u n d a t i o no ff o l l o w i n gw o r k k e y w o r d s ：c r y o p r e s e r v a t i o n ，v i t r i f i c a t i o n , e m b r y o ，c r y o p r o t e c t a n t ，s p o d o p l e r a e x l g u c l ，s p o d o p t e r al i t u r a 。 a f p s c p a s c v d m s o e g f d p a s e h p l c h p t l c i n a s i n p s l d h m p p i p o s c p t h p s v m a n t i 奇e e z ep r o t e i n s c r y o p r o t e c t a n t s 缩略词 抗冻蛋白 低温保护剂 c o n c e n t r a t i o no f v i t r i f i c a t i o n 玻璃化所需浓度 d i m e t h y ls u l p h o x i d e 二甲基亚砜 e t h y l e n eg l y c o l 乙二醇 f i u c t o s e 一1 ，6 - d i p h o s p h a t a s e l ，6 一二磷酸果糖酶 h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 h i g h p e r f o r m a n c et h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y 高效薄层层析 i c en u c l e a t i n ga g e n t s 冰核剂 i c en u c l e a t i n gp r o t e i n s 冰核蛋白 l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e 乳酸脱氢酶 m e l t i n gp o i m 熔点 p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l磷脂酰肌醇二酸 p h e n o l o x i d a s e 酚氧化酶 s u p e r c o o l i n gp o i n t 过冷点 t h e r m a lh y s t e r e s i sp r o t e i n s 热滞蛋白 v i t e l l i n em e m b r a n e卵黄膜 v 第一篇综述 罗丽夜蛾科昆虫胚胎的超低温保存研究 第1 章生物材料的超低温保存 1 1 超低温保存技术 利用低温保存生物材料的历史由来已久，1 7 7 6 年，s a l l a n z a n i 利用雪冷冻马 的精子即是这方面最早的记载( 薛庆善，2 0 0 1 ) 。低温冷冻保存技术发展到今天 大致可分为二种：第一种是逐步降温法，第二种是玻璃化( v i t r i f i c a t i o n ) 法。这 二种方法在原理、操作及适用对象上皆不相同。逐步降温法采用分步降温，先将 保存物慢速降温至置核湿度( n u c l e a t i o nt e m p e r a t u r e ) ，再放入液氮中保存。该法 适用于单细胞、少细胞或含单一细胞类型的生物材料，而对于那些多细胞类型的 复杂生物材料，如胚胎、组织、器官等往往难以奏效。同时利用逐步降温法冷冻 保存还必须具备一定的设各，如程序降温仪，低温显微镜等，这增加了操作的复 杂性和推广难度。 玻璃化保存法可解决逐步降温法无法解决的问题。所谓玻璃化是指以足够快 的速率将冷冻对象降温至液氮温度及液氮温度以下时出现非晶态( a m o r p h o u s s t a t e ) 的现象，这种非晶态被称为玻璃态，它不是晶态，却能像晶体一样保持自 己的形状，“其x 射线衍射曲线却与液态曲线相似，同属近程有序，远程无序， 不会引起或较少引起生物材料内部微观结构的改变”( 华泽钊等，1 9 9 4 ) 。这一保 存技术最早由b j l u y e l 在1 9 3 7 年提出( l u y e te la 1 ，1 9 3 7 ) ，但早期的研究却 因技术手段及相关理论研究的落后而被搁置，直至上世纪8 0 年代，才重新被科 学家所重视。到目前为止，玻璃化低温冷冻保存技术已在畜牧业、医学等领域得 到广泛应用，并成功保存了猫胚胎( m u r a k a m ie la 1 ，2 0 0 4 ) ，羊胚胎( b a r i le ta 1 ， 2 0 0 1 ) ，猪胚胎( c u e l l oe ta 1 ，2 0 0 4 ) ，人的卵母细胞( s h a we la 1 ，2 0 0 3 ) ，精子 ( k e i k oe la 1 ，2 0 0 3 ) ，人胚肾( b o t t o m l e ye ta 1 ，2 0 0 4 ) ，卵巢组织( r a h i m ie la 1 ， 2 0 0 4 ) ，角膜( c h r i s t i a ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 及人胚胎( k u w a y a m ae la 1 ，2 0 0 4 ) 等生物 材料。 玻璃化冷冻保存方法的程序基本上是一致的。第一步，选择合适的保护剂渗 罗丽夜蛾科昆虫胚胎的超低温保存研究 入生物材料；第二步，以足够快的速率降至液氮温度或液氮温度以下；第三步， 以极快的速率复温，以防止反玻璃化( d e v i t r i f i c a t i o n ) 和重结晶( r e c r y s t a l l i z a t i o n ) 现象的发生；第四步，活性生物材料的恢复。本章拟从保存方法的各个环节入手， 阐述目前玻璃化冷冻保存技术的研究成果及研究趋势，以期对非哺乳动物胚胎特 别是昆虫胚胎的保存有所借鉴。 1 i 1 渗透化处理 对于鱼类、昆虫等非胎生动物来说，其胚胎外层的保护性卵壳( e g g s h e l l ) 是保护剂渗入的主要障碍。昆虫的卵壳从外至内包括三层结构( m a r g a r i t i se ta 1 ， 1 9 8 0 ) ：外卵壳( c h o r i o n ) ，蜡质层( w a xk i y e r ) 和卵黄膜( v i l e l l i n em e m b r a n e ， v m ) 。渗透障碍主要是由外卵壳和蜡质层造成，外卵壳是由1 9 种以上的蛋白组 成的网格状结构，蜡质层一般认为主要由蜡质构成，但w a n g ( 2 0 0 0 b ) 用高效 薄层层析( h i g h - p e r f o r m a n c et h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y , h p t l c ) 对5 种双翅目昆 虫的蜡质层研究后发现：蜡质不是主要成分，仅在其中2 种昆虫中存在，且含量 低于3 ，主要成分为：碳氢化合物( h y d r o c a r b o n s ) 占3 3 ，甘油三酯( t r i g l y c e r i d e s ) 1 8 ，甘油二酯( d i g l y c e r i d e s ) 1 9 ，甘油单酯( m o n o g l y c e r i d e s ) 5 和磷脂 ( p h o s h o l i d s ) 2 4 。 目前去除卵壳的方法就是针对外卵壳和蜡质层两层物质设计的。最简便、经 济有效的方法是次氯酸钠和链烷类物质并用的化学法，如果蝇卵用5 0 的c l o r o x ( 2 6 n 的次氯酸钠) 去壳，其孵化率达7 0 一9 0 ( m a z u re ta 1 ，1 9 9 2 c ；l y n c he t a 1 ，1 9 8 9 ) 。其他处理方法有机械去除法( 1 w a r n a t s ue ta 1 ，1 9 9 3 ) 和酶消化法( c a b r i t a e ta 1 ，2 0 0 3 ) ，但这两种方法效果均不理想，前者需很高的操作技巧，且易对胚 胎造成致死性机械损伤，后者处理时间长，成本较高。去除蜡质层用链烷类物质， 如正已烷，庚烷即可实现。m a z u r 等还发现，1 2 小时后的果蝇胚胎在添加了丁 烷后渗透化效果大大提高，而1 2 小时之前的果蝇胚胎用纯链烷即可以完全去掉 蜡质层，如果添加少量丁醇，反而伤害很大，这说明蜡质层的结构在发育过程中 起了某种变化，或者是因为已成虫彤的胚胎开始了几丁质层的合成，造成后期卵 渗透比早期卵困难( m a z u re ta 1 ，1 9 9 2 a ) 。 因此，次氯酸钠和链烷类物质合用作为卵壳的去除剂是目前最为理想的方 2 罗丽夜蛾科昆虫胚胎的超低温保存研究 法。 1 1 2 保护剂渗透 1 1 2 1 概况 绝大多数成功的低温冷冻保存实例都离不开保护剂的使用。到目前为止，仅 有极少数的生物材料可以不经保护剂处理直接保存于液氮中，已报道的有蜜蜂胚 胎中的全能性核( t o t i p o t e n tn u c l e i ) ( y ue ta 1 ，1 9 9 7 ) ，人精子( i s a c h e n k oe ta 1 ， 2 0 0 4 ) 等结构较简单的生物材料。 保护剂的使用，或采取渗透型和非渗透型结合使用，或将两种以上的渗透型 保护剂配合使用，以分步渗透的方式进行处理，降低了对保存的活体材料的渗透 压力和化学毒性。早在1 9 8 5 年，r a i l 和f a h y 就利用一种高浓度的玻璃化溶液成 功实现了鼠胚胎的低温保存，这也是玻璃化低温保存技术应用成功的首例( r a i l & f a l a y ，1 9 8 5 ) 。这种玻璃化溶液被称为v s l ，具体成分是2 0 5 ( w v ) - - 甲基亚 砜( d m s o ) 、1 5 5 ( w v ) 酰胺、1 0 ( w v ) 1 ，2 一丙二醇以及6 ( w v ) 聚乙二醇( 分 子量为8 0 0 0 ) 。其中d m s o 和1 ，2 一丙二醇是主要的渗透型保护剂，前者渗透性强， 但毒性较大，乙酰胺可以起到中和毒性的作用，1 ，2 丙二醇的玻璃化形成能力较 强，二者联合使用，可以降低玻璃化所需浓度( c o n c e n t r a t i o no f v i t r i f i c a t i o n ，c v ) ； 6 的聚乙二醇作为非渗透型保护剂一方面可以缓解保护剂渗透过程中细胞外溶 质浓度的急尉下降，缩小细胞内外由溶质浓度引起的渗透差，另一方面也可以降 低c v ，减少保护剂对细胞的毒性。早期形成的这种理论在今天依然适用，而且 应用越来越广泛。例如w a n g ( 2 0 0 0 a ) 保存美洲锥蝇等双翅目昆虫胚胎时使用的保 护剂溶液含有乙二醇，丙二醇及海藻糖( t r e h a l o s e ) ，经液氮保存可获得5 2 5 的 孵化率，2 1 9 的化蛹率。m a z u r 处理果蝇胚胎时先用2 m 的7 , - - 醇于( e t h y l e n e g l y c o l ，e g ) 2 3 。c 处理3 0 分钟，再用8 5 m 的e g + 1 0 p v p ( 聚乙烯吡咯烷酮， p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ) 于5 处理5 分钟，结果获得了4 5 的孵化率( m a z u re t a 1 ，1 9 9 2 b ) 。 1 1 2 2 类型 罗丽夜蛾科昆虫胚胎的超低温保存研究 常用的渗透型保护剂主要是些多羟基醇，如乙二醇，1 ，2 - 丙二醇，二甲基 亚砜，甘油等，非渗透型保护剂有聚乙烯吡略烷酮( p v p ) ，葡聚糖( d e x t r a n ) ， 菲可( f i c o l l ，水溶性聚蔗糖) ，蔗糖等。近年也有一些新的具有较强玻璃化倾向 的化合物出现：一类化合物是用甲氧基替代多羟基醇中部分或全部羟基( w o w ke t a 1 ，1 9 9 9 ；r a s c he ta 1 ，1 9 9 8 ) 。这类化合物和传统的多羟基醇相比有如下优点： 甲氧基和羟基相比，不会发生分子问作用，因此具有更强的水合能力；对细 胞膜的脂相具更高的渗透系数，因此渗透能力更强。以上特性使这类化合物在宏 观上表现为降低了形成玻璃态所需的冷冻速率和c v ，提高了复温时玻璃态的稳 定性。但这类化合物的高渗透性也会产生一定的负面影响，即可能产生更高的毒 性。目前对这类物质的研究还仅停留在一般的热力学研究上，实际应用尚未见报 道。另一类化合物是氨基醇( b a u d o te ta 1 ，2 0 0 2 ) ，即用氨基替代二元醇中的羟 基，例如：2 一氨基一】一乙醇( 2 a m i n o 1 e t h a n 0 1 ) ，3 一氨基一1 一丙醇 ( 3 - a m i n o 1 p r o p a n 0 1 ) 。这些化合物和甲氧基替代醇一样具有更强的玻璃化能力， 能更好地维持玻璃态的稳定性，但氨基的介入使得化合物的p h 值发生巨大改变 ( 偏碱性，3 0 的2 一氨基一1 一乙醇p h 值为1 2 ) ，应用时必需先调节p h 值， 这在很大程度上增加了整个冷冻体系的复杂性，所以目前应用得比较广的还是乙 二醇，丙二醇等传统的多羟基醇。 1 1 3 辅助剂 在玻璃化冷冻保存过程中除使用保护剂以外，还常使用一些辅助剂，抗冻蛋 白是使用得较多的一种，但是由于抗冻蛋白的抗冻机理还不甚明了，目前提出的 一些理论，结合水学说，表面结合学说，吸附抑制学说都不能完整地解释所有的 实验结果，表现为对生物活性系统有时具保护作用( p a l a s ze ta 1 ，1 9 9 6 ；r u b i n s k y e ta 1 ，1 9 9 2 ) ，有时具毒害作用( l e b o e u f e ta 1 ，1 9 9 7 ；c h i h i r oe ta l ，2 0 0 2 ) 。但 能肯定的是，内源性的抗冻蛋白可以与生物膜( t o m c z a ke ta 1 ，2 0 0 2 ) ，冰晶 ( r a y m o n de ta 1 ，1 9 7 7 ) 以及生物组织内的其它些物质发生作用，但使用前抗 冻蛋白的保存方式及保存时间( l ie ta 1 ，2 0 0 2 a ) ，使用时抗冻蛋白的种类、浓 度、作用时间( r u b i n s k ye ta 1 ，1 9 9 2 ) 均对低温冷冻保存的效果有影响。s u p e r c o o l x 一1 0 0 是另一种对冰晶有抑制作用的人工合成分子，其价格比抗冻蛋白便宜，有 罗丽夜蛾科昆虫胚胎的超低温保存研究 人将其成功地应用于人类卵巢组织的冷冻保藏( i s a c h n k oe la 1 ，2 0 0 2 ) 。合成的 多聚p v a ( p o l y m e r p o l y v i n y l a l c o h 0 1 ) 可以直接抑制冰晶的继续生长或通过失活 异质成核剂来阻止结冰，并能降低甘油和d m s o 实现玻璃化所需的浓度，有效 抑制乙二醇的反玻璃化( w o w ke ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 细胞骨架结合剂是另一类正在尝试使用的辅助剂，应用t a x o l t m 能防止低 温保存过程中所产生的膜破裂，可以提高解冻后鼠卵母细胞的发育率( p a r ke la 1 ， 2 0 0 1 ) 。另有报道发现在玻璃化溶液中添加t a x o l t m 还能起着恢复m a p 激酶磷酸 化水平的作用( h w a ne ta 1 ，2 0 0 2 ) ，m a p 激酶在控制染色质和微管行为方面起 着重要作用。细胞松弛素( c y t o c h a l a s i nb ) 也是能和细胞骨架成分( 如微丝，细 胞膜等) 进行可逆性结合的一类试剂，在g v ( g e r m i n a lv e s i c l e ) 期猪卵母细胞 的玻璃化保存中可以协调细胞骨架与脂肪粒的相互作用，避免脂肪粒发生硬化， 并保证脂肪粒作为后期恢复的能量来源。细胞松弛素的使用把冻存后猪卵母细胞 的恢复率从5 6 提高到2 2 - 2 ( i s a c h e n k oe la 1 ，1 9 9 8 ) 。 冷冻过程中对胚胎造成的氧化压力是导致胚胎保存成功率低的原因之一，抗 坏血酸的使用可降低鼠胚胎中过氧化氢的水平，并能促进囊胚期内细胞团( i n n e r c e l lm a s s ，i c m ) 的发育( m i c h e l l ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。其它物质如谷氨酸钠、甜菜碱 也能起着类似的作用( f o n s e c ae ta 1 ，2 0 0 3 ) ，且已成功应用于乳酸杆菌的低温保 存。 胆固醇在保护细胞膜方面也起作用( m o o r ee ta 1 ，2 0 0 5 ) 。胆固醇，磷脂 ( c h o l e s t e r o 脚h o s p h o l i p i d s ) 的比例是膜的流动性和稳定性的决定因素。胆固醇 的添加可以降低膜的凝固温度，增加膜的流动性，胆固醇通过环化糊精可以很容 易地侵入膜或者从膜中抽提出来。已证明在马的精子保存中很有效( p u r d ya n d g r a h a m ，2 0 0 4 ) 。 以上辅助剂都在一定程度上提高了冻存材料的恢复率，有利于保持生物材料 解冻后的活性。 1 1 4 检测方法 虽然目前多细胞生物体系的低温冷冻保存取得了很大进展，但实验结果往往 难以一致，重复性差，这与处理过程中缺少精确的定量方法有关。保护剂的渗透 罗丽夜蛾科昆虫胚胎的超低温保存研究 剂量往往只能通过时间进行间接定量，这即是这些程序的缺陷之一。 最简单的对于保护剂渗透情况的研究是观察被保护剂处理后的生物材料的 体积变化，其体积的变化情况与细胞内外溶液的渗透压相关，两者的关系可以用 方程式来表示：d v d t = pm a ( 1 1 1 _ i i 。) ( 李广武等，1 9 9 8 ) ，pm 是细胞膜 的水渗透率( w a t e rp e r m e a b i l i t yo f c e l lm e m b r a n e ) ，a 代表细胞的表面积，i i1 、 l i 。分别为膜内和膜外的渗透压。这种体积的变化可以通过计算机辅助实时摄像 显微镜( c o m p u t e ra i d e dr e a l t i m ev i d e om i c r o s c o p y ) 进行观察和计算( z h a n g e ta 1 ，1 9 9 8 ) ，图像被数字化后可以计算出体积的变化，他的研究将理论与实际 相结合，证实了保护剂处理后，活性材料的体积先是变小，而后又逐渐恢复原来 的体积。此外，一种改良的相差扫描量热法( d i f f e r e n t i a ls c a n n i n g c a l o r i m e t r y ，d s c ) 也可以测出冷冻过程中样品的体积变化情况( l u oe t a 1 ，2 0 0 2 ) 。 除此之外，定量检测保护剂的渗透情况的方法还有以下几种：荧光标记显 微注射( f l u o r e s c e i n - l a b e l e dm i c r o i n j e c t i o n ) 法( e r o g l ue ta 1 ，2 0 0 2 ) ：核磁共 振( n u c l e a r m a g n e t i cr e s o n a n c e ，n m r ) 法( h a g e d o r ne ta 1 ，1 9 9 6 ：l i ue ta 1 ，2 0 0 3 ) ； 高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 法( s u z u k i e t a 1 ，1 9 9 5 ) ；气相色谱( g a sc h r o m a t o g r a p h y ，g c ) 法( a l m a d ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 其中质子核磁共振( h 1 - n m r ) 仅可以测得保护剂的量，而梯度核磁共振( g r a d i e n t f i e l d n m r ) 技术还可以测出保护剂在样品中的分布状况( m e g a r me ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 而最新探索出来的一种方法是通过仪器检测保护剂处理后引起的膜电阻值 的变化来测定样品的渗透情况。结果显示阻值的变化很明显，且整个测量过程费 时少，但是因为还没有其它的数据可供比较和验证，还需进一步证实和完善 ( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 1 1 5 降温、复温及复温后保护剂的去除 1 1 5 1 降温 液氮( 1 9 6 。c ) 是低温保存生物材料的首选，经济、安全、实用。降温的方 式可以采用一步法降温，即将材料直接投入液氮中，如墨西哥果蝇胚胎 6 罗丽夜蛾科昆虫胚胎的超低温保存研究 ( r a j a m o h a n e ta 1 ，2 0 0 2 ) ，地中海实蝇胚胎( r a j a m o h a ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 和美洲锥 蝇胚胎( w a n ge ta 1 ，2 0 0 0 a ) 的保存：也可采取二步法，即先在液氮蒸气中停 留几秒至几分钟，再放入液氮中保存，或者将材料在室温下先用液氮冻成颗粒状， 再放入液氮( 王丽华等，1 9 9 7 ) 。方式的选择须依具体材料而定，不同的材料有 不同的最佳冷冻方式。泥氮( s l u s hn i t r o g e n ，2 0 5 。c ) 是一种比液氮温度更低的 物质，s t e p o n k u se ta l ，( 1 9 9 0 ) 先用液态丙烷( 1 i q u i dp r o p a n e ) 预处理果蝇胚胎，之 后用泥氮保存，该方法与液氮保存相比，孵化率从9 4 提高到1 8 4 ( s t e p o n k u s e ta 1 ，1 9 9 0 ) 。这可能是因为胚胎经过预冷，进入泥氮前已成固态，不易造成胚胎 破裂。但w a n g e ta 1 ( 2 0 0 0 b ) 却认为泥氮易造成样品的破裂( f r a c t u r e ) ，因而在保 存家蝇( m u s c ad o m e s t i c a ) 时用泥氮的效果反而更差。尽管如此，如果不考虑成 本，泥氮作为一种更为低温的物质，应该能够提供更快的冷冻速率及更高的冷冻 效率。 1 1 5 2 复温 复温速率在低温保存程序中是另一个直接影响生物材料活性的重要因素，其 重要性甚至超过降温速率( s c h r e u d e r se ta 1 ，1 9 9 2 ) 。复温速率的大小与反玻璃 化现象息息相关，s c h r e u d e r se ta 1 ( 1 9 9 2 ) 在保存果蝇胚胎时，利用相差扫描量 热法研究乙二醇p v p 溶液时发现，以2 0 0 。c m i n 复温时不发生反玻璃化，但以 更低的速率复温时，反玻璃化现象发生。因此，选择一个合适的复温速率至关重 要。 电磁波的使用可以得到迅速而且一致的复温效果，是传统水浴复温方式的一 大突破( b a n d o te ta 1 ，1 9 9 9 ) 。但是，因为各种技术参数，如最佳吸收频率、处 理时间与冷冻材料之间的关系较为复杂，要将此技术广泛应用于生物材料的冷冻 保藏还有许多工作待做。 1 1 5 3 保护剂的去除 保护剂的去除是整个冷冻程序中十分必要的一步。保护剂的残留会影晌生物 材料的活性，包括一些重要代谢酶活力的降低，如乳酸脱氢酶、葡萄糖6 磷酸 脱氢酶( a d a me ta 1 ，1 9 9 5 ；r o b l e se ta 1 ，2 0 0 2 ) 。果蝇胚胎经乙二醇溶液渗透 罗丽夜蛾科昆虫胚胎的超低温保存研究 平衡后孵化率下降至8 0 ( s t e p o n k u se t a l ，1 9 9 0 ) ，家蝇胚胎经以乙二醇为主的 玻璃化溶液平衡后，最高的孵化率仅为7 0 ( w a n ge ta 1 ，2 0 0 0 b ) 。 利用非渗透性的糖溶液可以有效移去已经渗透进去的保护剂，c h oe ta 1 ( 2 0 0 0 ) ，m u k a i d ae ta 1 ( 2 0 0 3 ) 采用0 - 0 5 m 的蔗糖溶液，分多步；w a n ge ta 1 ( 2 0 0 0 b ) 使用o 5 m 的海藻糖溶液，分二步，都达到了去除保护剂的作用，并 且一般分多步的效果要好于一步去除的方式( k o b a y a s h ie ta 1 ，1 9 9 8 ) 。此外， k o b a y a s h ie ta 1 ( 1 9 9 8 ) 还指出单糖( 半乳糖) 要比双糖更易与保护剂混合，达 到去除的目的。l i ue ta 1 ( 2 0 0 3 ) 利用核磁共振技术制各了经乙二醇和甲醇处理 的冈比亚疟蚊a n o p h e l e sg a m b i a e 幼虫在水中渗透不同时间后保护剂流出的动力 学曲线，进一步证实了利用细胞内外渗透压之差去除保护剂的有效性。 1 1 6 小结 玻璃化低温冷冻保存技术对于科学研究及实际应用的意义是深远的。它可以 节约大量的人力、物力和财力，实现大批量生物活性材料的保存，亦可以防止实 验室在大批量饲养时难以杜绝的污染、基因漂移( 如转基因动物的种质稳定性) 及种质退化等问题。而丰富的昆虫资源如果有这项技术作支持，一些珍贵和濒临 灭绝种的种质保存问题也就可得到解决。在医学方面，玻璃化低温冷冻保存技术 在解决不孕不育问题方面的应用已经非常成熟，大量患者从中受益，除此之外， 该项技术也使器官移植的顺利推行成为可能。因此，大力发展此项技术的相关研 究势在必行。 目前玻璃化低温冷冻保存技术在哺乳类动物的卵母细胞、精子及早期胚胎的 保存方面是非常成功的。非哺乳类动物，如鱼及昆虫的胚胎，因为基本结构、生 理特征、生存环境的不一致，难以建立一套普遍适用的方法。鱼胚胎含有较多的 卵黄，一般的保护荆不易渗透，即使渗透其分布也不均一，难以达到低温保护的 效果，此外，海水鱼及淡水鱼渗透行为差异显著；昆虫胚胎的保存仅限于果蝇、 家蝇、美洲锥蝇，中华蜜蜂等少数几种双翅目昆虫胚胎的保存，其它目昆虫只见 l ie ta 1 ( 2 0 0 1 ) 对甜菜夜蛾( s p o d o p t e r ae x i g u a ) 胚胎的研究。作为一项非常有 应用前景的技术，理论化、模型化应该是其发展的最终目标。 8 罗丽夜蛾科昆虫胚胎的超低温保存研究 1 2 一些特殊生物材料的低温保存 1 2 1 卵母细胞 卵子的冷冻保存技术在临床医学上有非常重要的作用，可以为推迟妊娠或者 无法妊娠患者提供卵源。在动物的遗传育种领域，可以为畜禽遗传资源的保存提 供理论和技术上的支持。 卵母细胞作为生殖细胞，它与一般的单细胞有着诸多不同( 倪江等，2 0 0 4 ) ： ( 1 ) 卵母细胞表面结构特殊。哺乳动物的卵母细胞表面具有一层嗜酸性的膜， 称为透明带( z o n ap e l l u c i d a ) ，而非哺乳动物的卵母细胞表面形成卵黄被( v i t e l l m e e n v e l o p e ) ，透明带或者卵黄被上存在着种特异性受体( s p e c i e s - s p e c i f i cb i n d i n g r e c e p t o r ) ，与受精过程中精卵之间的识别和特异性结合有关。( 2 ) 细胞内组织结 构不同。卵母细胞内水分含量高，充满卵黄体( y o u c b o d y ) 和脂肪滴( 1 i p i dd r o p l e t ) ， 质膜下还含有大量的皮层颗粒( c o r t i c a lg r a n u l e ) 。( 3 ) 成熟卵母细胞的发育过程 较一般细胞复杂。卵原细胞进行分裂分化形成初级卵母细胞，在形成成熟的卵母 细胞之前要经历两次成熟分裂，第一次成熟分裂后长期停滞于分裂前期一胚泡 期( g e r m i n a lv e s i c l es t a g e ) ，第二次成熟分裂后停止于分裂中期( m e t a p h a s e1 1 s t a g e ) 。这些停滞期在适当条件的刺激下可以被激活，重新进入分裂期。( 4 ) 卵 母细胞对低温异常敏感。卵母细胞这些结构、组成及发育上的特殊性，使得卵母 细胞的冷冻保存技术研究遭遇到很多困难，例如：透明带的破坏、减数分裂轴的 解聚、染色体的异常、冻存后卵母细胞体外受精率低、受精后胚胎的继续发育率 低以及个体出生率低( c h e ne ta 1 ，2 0 0 3 ；a n d r ea n d r e u b e n ，1 9 9 6 ；s h a r m ae ta 1 ， 2