硕士学位论文-结核分枝杆菌亚单位疫苗Mtb10.4-HspX的构建及免疫特性和保护效果评价.doc

分类号： 密级： 研 究 生 学 位 论 文论文题目（中文）结核分枝杆菌亚单位疫苗Mtb10.4-HspX的构建及免疫特性和保护效果评价论文题目（外文） Construction and Evaluation of a multistage Mycobacterium tuberculosis subunit vaccine candidate Mtb10.4-HspX研究生姓名学科、专业病原生物学研究方向结核亚单位疫苗研究 学位级别硕 士导师姓名、职称论文工作起止年月2009 年 9 月至 2012 年 4 月论文提交日期 年 月论文答辩日期 年 月学位授予日期校址：甘肃省兰州市原 创 性 声 明本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名： 日 期： 关于学位论文使用授权的声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。本学位论文研究内容：可以公开不易公开，已在学位办公室办理保密申请，解密后适用本授权书。（请在以上选项内选择其中一项打“”）论文作者签名： 导师签名： 日 期： 日 期： 结核分枝杆菌亚单位疫苗Mtb10.4-HspX的构建及免疫特性和保护效果评价中文摘要结核病由结核分支杆菌感染引发,是人类健康的一大威胁。在世界各地，随着耐药菌株和艾滋病病毒感染的增加，结核病仍具有较高的发病率和死亡率。结核分支杆菌感染人体之后，可以以潜伏状态存在很长时间并且在人体免疫力低下时使被感染者发展为活动性结核，因此潜伏期结核分枝杆菌的诊断和控制是人类面临的一大难题。当前结核病疫苗卡介苗(Bacilli Calmette Gurin, BCG), 在全球很多地区得到广泛应用，但相关研究证实BCG可以预防儿童结核，但对成人肺结核和潜伏感染结核无效。因此，迫切需要研究针对成人结核病和潜伏感染结核病的新型疫苗和新型疫苗免疫策略。目的：研究用于加强BCG效应的有效结核亚单位疫苗，控制甚至根除包括持留菌在内的各感染阶段的结核分枝杆菌。本课题选用结核分枝杆菌对数生长期Mtb10.4 (Rv0288)和休眠期保护性抗原HspX (Acr, Hsp16.3, Rv2031c)，构建无亲和标签融合蛋白Mtb10.4-HspX(MH), 并对其免疫特性和保护效果进行评价。方法：PCR扩增基因Mtb10.4和HspX, 并将他们依次插入到表达载体pET-30a(+)的多克隆位点中构建重组质粒Mtb10.4-HspX-pET30a(+)，将此质粒转化入大肠杆菌BL-21(DE3)中表达融合蛋白MH。无标签融合蛋白MH通过三步连续层析法得到纯化。用ELISPOT技术，检测MH对人T细胞的免疫反应。将该蛋白和佐剂二甲基三十六烷基铵(DDA)和海藻糖二霉菌酸脂（TDM）混合构建亚单位疫苗。在0、3、6周，用MH疫苗连续免疫C57BL/6小鼠三次，设BCG和磷酸缓冲液（PBS）免疫组为对照，末次免疫后6周检测此疫苗的免疫原性。MH疫苗在BCG初免后12、14周连续加强免疫C57BL/6小鼠两次，BCG和PBS免疫组为对照，第20周（末次免疫后6周）检测其加强BCG的免疫效果；第24周(末次免疫后10周)用H37Rv毒株经尾静脉注射攻击被免小鼠，感染后42天，检测小鼠肺脏结核菌载量，并分析肺组织病理损伤程度，以此评价此疫苗加强BCG的保护效果。结果：MH在大肠杆菌中可溶性稳定表达，且依次经离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析得到纯化，纯度达到95%；MH体外刺激结核病人及结核分支杆菌潜伏感染人群的外周血淋巴细胞，可使其分泌大量干扰素（IFN-）。MH亚单位疫苗单独连续免疫小鼠三次，诱发小鼠产生大量抗原特异性细胞因子（IFN-、IL-17）和抗体（IgG1、IgG2b、IgG2c）。BCG初免MH加强组小鼠产生的细胞因子（IFN-、IL-17）和抗体（IgG1、IgG2b、IgG2c）明显高于BCG单独免疫组。毒株攻击后, MH加强免疫组小鼠肺脏荷菌量明显低于PBS组（P0.00）和BCG组（p=0.069），组织病理损伤较轻及且损伤面积明显小于PBS（P0.05）和BCG（p0.05）组。结论：MH对结核病患者、结核病潜伏感染者均显示具有较强的免疫原性，联合佐剂DDA-TDM免疫小鼠可引发较强的抗原特异性的细胞和体液免疫应答且具有加强BCG的免疫保护效果。因此，MH联合佐剂DDA-TDM有望成为针对活动性结核病和潜伏感染感染结核病的有效候选疫苗。关键词：结核分支杆菌，亚单位疫苗，Mtb10.4， HspX，多阶段疫苗Construction and Evaluation of a multistage Mycobacterium Tuberculosis subunit vaccine candidate Mtb10.4-HspXAbstractTuberculosis (TB) is a major health threat caused by Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). With the increasing drug-resistant strains and HIV infection, TB remains one of the major diseases with high morbidity and mortality worldwide. Central to the success of M. tuberculosis as a pathogen is its ability to persist for long periods of time in latent state in human cells and may develop into active disease. The current vaccine, Bacilli Calmette-Guerin (BCG)， is widely used in many areas of the world. It protects children from severe TB, but can not prevent reactivation of latent TB and is unreliable against the pulmonary TB in adults. Therefore, novel vaccines and vaccination strategy which target adult TB, especially latent infection are urgently needed.Objective: To search for more effective vaccines to enhance the immunogenicity and protective efficacy of Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin (BCG) and to control or even eradicate M. tuberculosis in all stages of infection including the persister bacteria, antigens of Mtb10.4 (Rv0288) expressed in replicating bacilli and HspX (also called Acr, Hsp16.3, Rv2031c) highly expressed in dormant bacilli were fused together to construct a multistage fusion protein Mtb10.4- HspX (MH for short) and its immunogenicity and protective efficiency were analyzed. Methods: The DNA sequences coding mature protein of Mtb10.4 and HspX were generated by PCR amplification. The plasmid encoding Mtb10.4-HspX was generated by inserting the genes Mtb10.4 and HspX into the multiple cloning sites of the expression vector pET30a (+) respectively and was transformed into E. coli strain BL21 for production of the fusion protein MH. Three successive chromatographic purification steps were involved in the purification of MH.The human T-cell responses to MH were evaluated using ELISPOT. MH was emulsified in an adjuvant composed of N, N-dimethyl-N,N- dioctadecylammonium bromide (DDA) and mycobacterial cord factor trehalose-6, 6-dimycolate (TDM) to construct subunit vaccine. Mice received inoculations three times at 0st, 3rd, and 6th week, mice received PBS or BCG as the control, and the immunogenicity of MH was analyzed at 6 weeks after the last immunization. The m ice primed with BCG and boosted by MH subunit vaccine two times at the 12th and 14th week were used to analyze its immunity boosting BCG at 6 weeks after the last immunization. All groups were challenged with 5105 CFU of virulent M .tuberculosis H37Rv via caudal vein at 24th week, 10 weeks after the last boosting. Protection was assayed by counting colony forming units (CFUs) of bacteria in infected lungs and spleens at the 42 days after the challenge. Results: The fusion protein MH was stably produced in E. coli in supernatant, and was purified by hydrophobic chromatography, ion-exchange chromatography and gel filtration chromatography successively. MH induced higher numbers of IFN-producing T cells in groups of TB patients and persons latently infected with M. tuberculosis. The mice immunized with MH three times produced high levels of cytokines（IFN-、IL-17）and antibodies（IgG1、IgG2b、IgG2c）. The frequencies of IFN- and IL-17 secreting lymphocytes from the mice primed by BCG and boosted by MH were higher than that immunized with BCG without boosting (p0.05) or PBS (p0.05). BCG-prime and MH-boost induced a significant reduction in the number of bacteria in the lungs compared to PBS controls (P 0.05), a reduction compared to BCG group (P=0.069), and presented the smallest lesions among the three groups (p0.05).Conclusion: MH in adjuvant DDA-TDM generated strong antigen-specific humoral and cell-mediated immunity, and had the capability to enhance BCG-primed immunity and the protective efficacy against M. tuberculosis in mice. These findings suggest that MH in DDA -TDM has the potential to be a good multistage tuberculosis vaccine candidate.Key words: Mycobacterium tuberculosis，Subunit vaccine，Mtb10.4， HspX，multi-stage vaccine目 录中文摘要IAbstractIII前 言1一材料与方法31.1主要材料31.2主要仪器设备41.3实验动物41.4 受试人群41.5 实验方法41.5.1 融合蛋白Mtb10.4- HspX（MH）的构建41.5.2. 融合蛋白MH的表达51.5.3融合蛋白MH的纯化61.5.4 蛋白SDS-PAGE电泳相关试剂配制及方法71.5.5 Western Blot检测融合蛋白MH的活性91.5.6 检测纯化后融合蛋白MH的杂质101.5.7 Bradford法测定蛋白浓度111.5.8亚单位疫苗MH在人群中免疫反应的检测121.5.9 亚单位疫苗MH/DDA-TDM的制备方法131.5.10 亚单位疫苗MH/DDA-TDM的免疫原性检测131.6 统计学分析方法181.7 MH的中试研究181.7.1种子批建立工艺181.7.2 发酵工艺191.7.3 纯化参数优化及放大19二、结果202.1重组质粒Mtb10.4-HspX-pET30a(+)的构建及鉴定202.2重组蛋白MH的表达及纯化222.3 MH对人群T细胞的免疫反应232.4 结核亚单位疫苗MH/DDA-TDM的免疫原性242.5 BCG初免, MH加强的免疫反应检测262.6 MH对小鼠的保护效果评价及组织病理损伤检测282.7 中试研究结果：30讨论31结论33参考文献34综述38前言38现有疫苗BCG及局限性39结核新疫苗的研发策略40研发结核病新疫苗过程中存在的问题421抗原筛选422疫苗运输载体433疫苗评价模型及指标434研制结核疫苗面临的挑战44结论和展望44参考文献45攻读硕士学位期间发表的论文和成果48致 谢49兰州大学硕士研究生学位论文 结核分枝杆菌亚单位疫苗Mtb10.4-HspX的构建及免疫特性和保护效果评价前 言结核病由结核分枝杆菌感染引起，是全球传播范围最广、持续时间最久、危害最为严重的传染病1。二十世纪八十年代以来，随着耐药菌株尤其是耐多药结核菌(MD-RTB)的出现与流行及人类免疫缺陷病毒(HIV)获得性免疫缺陷综合症(艾滋病，AIDS)的传播与流行，在世界各地结核病的发病率呈现回升趋势，发病率和死亡率高居不下2, 3。世界卫生组织（WHO）在2009统计的数据显示,全球有1.4亿例新发结核病人，1680万结核病人死亡4。结核分支杆菌作为结核病的病原体，其难于控制的原因之一在于结核菌可以在人体免疫细胞中以潜伏感染状态存在很长时间，以此逃避机体特异性免疫反应对其的清除，并且可在人体免疫力低下时发展成为活动性结核病5。WHO估计，全球有大约有20亿潜伏感染结核病患者，其中10%在免疫力低下时发展为活动性结核病6。结核分支杆菌的潜伏感染状态成为控制和消除结核病的一大难题。中国作为全球结核病高发国家之一，仍面临着十分严峻的结核病流行形势。2000年，全国结核病流行病学抽样调查结果显示，中国结核病流行存在高感染率、高发病率、高死亡率、高耐药率及青壮年发病率较高等特点7。对于结核病的控制策略很大程度上依赖于疾病的诊断和至少三种不同抗痨药物长期的治疗。其结果是，多重耐药的不断发展造成控制结核病的巨大障碍（Espinal 2001）。在近30多年来，没有任何一个新药加入一线抗痨药物的阵营。在结核病发病率较高的国家，人们最为需要的并不是去获得治疗，而且许多患者对抗痨治疗是无效的，显而易见研制一种新的抗结核疫苗是目前最为迫切的需要。1921年Calmette和Guedn通过13年的努力，将牛分枝杆菌培育230代获得的一种减毒活疫苗，研制出了第一个结核病疫苗卡介苗。这种并不昂贵的疫苗作为当前唯一应用于人群接种的结核病疫苗，从20年代初就开始在全球范围内广泛使用。已经证明它具有长期的安全性和免疫佐剂活性,能诱导细胞免疫和体液免疫反应。在刚出生时或出生后的某一时间接种BCG，可以获得比较持久的免疫保护。然而长期的临床应用实践显示，BCG的保护效果并不理想。在不同人群、不同地区保护水平差异很大，尤其是对成人肺结核的保护效率介于0-80%不等8, 9。此外，BCG对潜伏感染结核病的复发和再燃无效10。既然人类是结核杆菌唯一的储存宿主，那么研制出比BCG更有效的新疫苗就有可能根除结核病。因此，为了能在全球范围内彻底消灭结核病，我们迫切需要研发针对成人结核病和潜伏感染结核病的新型疫苗和疫苗免疫策略5。当前，国内外研发新的结核病疫苗已经成为热点之一，其中有很多新型结核疫苗处于临床或临床前研究阶段。根据疫苗的应用策略，这些新研发疫苗可分为两大类，一，取代原有疫苗BCG的活菌疫苗（如 rBCG3011, rBCG: ureC-llo+ 12）和减毒结核分枝杆菌疫苗13, 14）；二，用于加强原有疫苗BCG效应的亚单位疫苗（如 MAV-85A15, Aeras-40216, Ag85B-ESAT- 617, Ag85B-TB10.4 18 和Mtb72f19）。亚单位疫苗包括重组蛋白疫苗、DNA疫苗和以病毒为载体的疫苗三种形式，其中蛋白疫苗因成份明确、相对安全，更易于被人们所接受。 应用基因工程技术构建结核亚单位疫苗，首先要筛选有效的结核保护性抗原。结核分支杆菌在人体内存在生长阶段和潜伏感染阶段，且不同阶段分泌不同的蛋白。随着结核分支杆菌抗原的免疫原性、抗原性、抗结核分支杆菌感染的保护力等方面的研究，它们被广泛应用于结核病的防治。研究发现，结核菌细胞壁表面蛋白、结核菌分泌性蛋白（胞内或胞外）是主要的免疫保护性抗原，将成为结核新疫苗研究的理想候选抗原。现在进入临床研究阶段的结核疫苗大都选用结核分枝杆菌早期分泌性抗原，如Ag85复合物中的Ag85A（FbpA）、Ag85B（FbpB）或Ag85C （FbpC2）三种蛋白，ESAT6 （the 6KD early secreted antigenic target）家族的ESAT6、CFP10或TB10.4蛋白等。结核分支杆菌潜伏期抗原很少被应用到结核病的防治中。结核病潜伏感染人群在全世界人口中占据很大比例，因此预防结核病的潜伏感染的复发和再燃是控制甚至消除结核病的关键因素。在今后的结核疫苗研究中，应该将潜伏感染期抗原考虑进来。理想的结核病疫苗是包括结核分枝杆菌不同生长期的抗原，进而可清除体内不同生长阶段段的结核分枝杆菌。新的疫苗研究策略认为结核疫苗应该包括多阶段的结核抗原，如休眠抗原和复制菌分泌的早期抗原5，多阶段抗原联合应用可有效预防结核分枝杆菌的感染及处于潜伏感染分支杆菌的复发与再燃。因此，在新的疫苗构建，要考虑既对抗复制菌又对抗休眠菌20。鉴于针对多生长阶段结核菌疫苗设计的新策略，本研究选用结核分支杆菌早期抗原Mtb10.4 和 休眠期抗原HspX作为候选抗原，将两抗原融合构建新的结核亚单位疫苗。( I ) Mtb10.4抗原是结核分支杆菌早期分泌性蛋白，属于 ESA T-6蛋白家族21。在小鼠，豚鼠和灵长类的动物接种含有ESAT-6抗原的融合蛋白可引发较强的免疫反应且对结核杆菌具有一定的防护力17, 22, 23。据报道Mtb10.4在结核病人和BCG免疫人群引发强的免疫反应，与ESAT-6相比更易被结核病人识别24。因此，以抗原Mtb10.4为基础的亚单位疫苗可能成为对抗结核病的理想候选疫苗18, 25。（）HspX蛋白是主要由非复制菌分泌的重要的休眠抗原26, 27，在无症状的潜伏感染中显示长期的重要性28。此外，与结核病人相比，在潜伏感染人群HspX可以引发较强的免疫反应29。为研发可以应用于临床的结核病亚单位疫苗，本课题应用基因工程技术将抗原Mtb10.4和HspX串联在一起，构建无亲和标签蛋白Mtb10.4-HspX。亲和标签包括6His 标签，GST 标签，FLAG 标签等，可以通过一步亲和层析纯化重组蛋白质，简化蛋白纯化的步骤。但是，用亲和标签去简化生物工艺的方法并没有在业生产中得到广泛应用。此外由于亲和层析过程中要用到镍离子（Ni）等有毒成分，因此带标签的融合蛋白在临床研究中也没有得到广泛接受30, 31。所以，本研究，构建无亲和标签融合蛋白MH，根据蛋白质本身的理化性质，应用三步连续层析的方法成功进行纯化。然后，我们研究了人外周血淋巴细胞对融合蛋白MH的免疫反应性。将蛋白MH联合佐剂DDA-TDM32构建亚单位疫苗, 免疫C57BL/6小鼠检测其免疫原性。此外，用结核分枝杆菌感染的C57BL/6小鼠模型评价此亚单位疫苗用于加强BCG的免疫力及保护力。49一材料与方法1.1主要材料DNA聚合酶， PCR产物纯化试剂盒，DNA胶回收试剂盒, PCR产物纯化试剂盒，质粒抽提试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。限制性核酸内切酶购自Ferments公司。E.coli DH5、E.coli BL-21(DE3)、卡介苗（BCG，丹麦株）由兰州生物制品所惠赠。二甲基三十六烷基铵（DDA）,索状因子(the mycobacterial cord factor trehalose-6,6-dimycolate ,TDM)购自Sigma-Aldrich公司；结核菌素纯蛋白衍化物（PPD）蛋白、HspX蛋白由本实验室自己制备；RPMI1640 购自Invitrogen 公司；IgG1、IgG2b、IgG2c购自Rockland公司；Ni-NTA His-Bind Resins购自Novagen公司；酶联免疫斑点ELISPOT试剂盒购于荷兰U-CyTech 公司产品; OADC增菌液及7H10培养基均购自美国BD公司；鼠IFN-r/IL-17预包被ELISA试剂盒、人IFN-r预包被ELISPOT试剂盒购自北京达科为生物技术有限公司;萘啶酸、两性霉素B、多粘菌素B、甲氧苄啶均购自美国Sigma-Aldrich公司；氨苄青霉素购自上海生物生工工程有限公司；H37Rv感染实验相关材料由武汉大学ABSL-3实验室提供。1.2主要仪器设备PCR仪（上海山富科学仪器有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安医疗器械厂); 电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；超低温冰箱（Thermo Fisher Scientific）；DZF-6090真空干燥箱（重庆恒达仪器厂）；Bio-Rad550型酶联免疫检测仪（美国）；Biosys Bioreader自动酶联斑点图像分析系统（德国Bio-sys GmbH）；PB-10 Sartorius 普及型PH计；DYY-12 型电泳仪（北京市六一仪器厂）；ZF-258全自动凝胶成像分析系统（上海嘉鹏科技有限公司）；RM-220 艾利蒲超纯系统；AKTA purifierTM UPC100；BT124 电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；SW-CJ-2FD 型双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；TDZ5-WS 多管架自动平衡离心机（长沙湘仪仪器有限公司）；KJ-2 型CO2细胞培养箱（电子工业部第四十八研究所）；免疫小鼠结核菌H37Rv株感染相关实验仪器设备由武汉大学ABSL-3实验室提供。1.3实验动物C57BL/6小鼠（SPF级）购于上海斯莱克实验动物中心，8周龄。小鼠接受疫苗免疫期间饲养于甘肃省中医学院实验动物中心（SPF级），小鼠接受H37Rv株感染前一周和感染后均饲养于武汉大学ABSL-3实验室，均自由饮水进食。1.4 受试人群 本研究包括28例结核病人，10例密切接触结核病人者（结核分支杆菌潜伏感染者），11例BCG初免健康人群。结核病人来自于兰州市肺科医院，均为痰涂阳性的活动性结核，包括初治病人（19例）和复治病人（9例）。密切接触者来自于兰州市肺科医院且对ESAT6和CFP10反应阳性，均为从事医护工作大于5年的健康个体。健康人群来自于兰州大学健康大学生志愿者，均为PPD阳性。1.5 实验方法1.5.1 融合蛋白Mtb10.4- HspX（MH）的构建(1) 根据GenBank中结核分支杆菌H37Rv株基因Mtb10.4 Rv0288, 相对分子量（Mr）为10.4103 96AA 和HspX Rv2301、（Mr）为16.3103，144 AA的序列，设计4条引物:表1-1 引物序列(2) PCR扩增Mtb10.4基因：考虑到Mtb10.4基因后面要连接HspX, 所以设计引物时把Mtb10.4终止信号去掉。以结核杆菌H37Rv株DNA为模板，用5端引物Mtb10.4F和3端引物Mtb10.4R扩增Mtb10.4全基因序列。PCR反应条件：96预变性1min, 98变性10s, 54复性15s, 72延伸30s, 30个循环；72延伸10min。PCR产物经胶回收纯化试剂盒进行纯化。(3) 构建重组质粒Mtb10.4- pET30a(+)：用Nde和Sac双酶切经基因Mtb10.4和质粒pET30a（+），MTB10.4和质粒酶切产物分别纯化后和T4连接酶16共孵育12h进行连接，然后转化入E. coli DH5中。最后，用PCR技术验证筛选阳性克隆并进行测序鉴定。(4) PCR扩增HspX基因：以H37Rv DNA为模板，用HspX F和HspX R扩增HspX基因片段。PCR反应条件：96预变性1min,98变性10s，55复性20s, 72延伸30s, 30个循环；72延伸10min。PCR产物经胶回收试剂盒进行纯化。(5) 构建重组质粒Mtb10.4-HspX- pET30a(+)：用Sac和Hind双酶切纯化后的HspX基因和重组质粒Mtb10.4-pET30a(+)，酶切产物分别纯化后用T4连接酶进行连接，然后转化入E. coli (DH5)。PCR验证筛选阳性克隆并进行测序鉴定。1.5.2. 融合蛋白MH的表达(1) 相关试剂及培养基的配制1) LB培养基： 胰蛋白胨（Tryptone） 10g/L 酵母提取物（Yeast Extract） 5 g/L 氯化钠（NaCL） 10g/L2) 卡那霉素(Kana)：用蒸馏水配制为50mg/mL的浓度，共50mL，用0.22m滤器过滤除菌，分装为1mL/管，-20保存。3) 诱导剂IPTG：用蒸馏水配制为1mM的浓度，共50mL，用0.22m滤器过滤除菌，分装为1mL/管，-20保存。4) 磷酸盐缓冲液（PB）: （Na2HPO412H2O 20mMol/L，NaH2PO42H2O 20mMol/L,PH7.4）(2) 从以上经转化后的E. coli（DH5）中提取重组质粒pET30a- Mtb10.4-HspX，转化入表达菌株E. coli BL21(DE3)中，PCR验证筛选阳性克隆并进行测序鉴定。将鉴定合适的菌株保存在80%甘油中，即为保存菌种pET30a-Mtb10.4-Hsp/BL21 (DE3)。(3) 取10ul的菌种加入到5ml的LB培养基中进行活化，然后取1ml活化后菌体加入200mlLB培养基中震荡培养3h 10mim至OD600nm达到0.6，加入IPTG(1.0mmol/L) 100ul ，25诱导振荡培养12h; 4 10 000rpm/min离心10min收集菌体。菌体重悬于PB缓冲液（Na2HPO412H2O 20mMol/L，NaH2PO42H2O 20mMol/L,PH7.4）10ml/g湿菌，冰浴下超声破碎细菌1h(180200 W, 超声4s 停5s); 10000rpm/min离心20min 后分别收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析蛋白表达情况。1.5.3融合蛋白MH的纯化(1) 相关缓冲液的配制A液：20mM PB;pH7.4 B液：20mM PB,1M NaCl; pH7.4C液：20mM PB,0.15M NaCl; pH7.4缓冲液均用0.45um滤器过滤除菌。(2) 将收集的菌体重悬于20mM PB缓冲液中，冰浴下超声破碎1h左右，4 10,000rpm离心10min, 离心后收集含MH蛋白的上清进行纯化。上清用0.45um滤器过滤除菌。(3) 第一步纯化：选用强阴离子交换介质Q HP（XK 16/20）进行离子交换层析。首先用无菌超纯水清洗层析柱介质并且用A液平衡。然后将溶解于A液中的蛋白上样，每次10mg。最后用A液和B液进行梯度洗脱。将不同洗脱梯度的液体10ml/管进行收集, 经SDS-PAGE分析将含有MH的样品合并在一起进行下一步的纯化。 (4) 第二步纯化：选用疏水层析介质Butyl HP（XK 26/20）进行纯化。首先用无菌超纯水清洗层析柱介质并且用A液平衡。然后将经过离子交换层析的合并样品与等体积的B液混合上样, 使蛋白含高盐上柱。最后用A液和B液进行梯度洗脱。将不同洗脱梯度的液体10ml/管进行收集, 经SDS-PAGE分析将含有MH的样品合并在一起进行下一步的纯化。 (5) 第三步纯化：选用凝胶过滤层析介质Superdex 75 pg （分离范围：30070000）(XK26/100)进行最后一步纯化去除微量杂蛋白。首先用无菌超纯水清洗层析柱介质并且用C液平衡。然后将疏水层析后收集的蛋白样品上样。最后用C液进行洗脱。收集洗脱样品5ml/管，SDS-PAGE分析将含有MH的样品合并在一起即为纯化后MH样品。 将纯化后的MH样品用0.45um的滤器过滤除菌，分装，保存于-80冰箱。1.5.4 蛋白SDS-PAGE电泳相关试剂配制及方法(1) 相关试剂的配方1) 30%聚丙烯酰胺贮液称取150g丙烯酰胺，4g N,N-甲叉双丙烯酰胺，加超纯水溶解至500ml，待其完全溶解后用滤纸过滤，避光4保存。2) 1.5M三羟甲基氨基甲烷-盐酸，Tris-HCL，PH8.8 称取18.15g三羟甲基氨基甲烷加适量超纯水溶解，用浓盐酸调PH值至8.8，加超纯水定容至100ml。3) 1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸,Tris-HCl, pH6.8 称取12.10g三羟甲基氨基甲烷加适量超纯水溶解，用浓盐酸调PH值至6.8，加超纯水定容至100ml。4) 10%十二烷基磺酸钠(SDS)称取1g十二烷基磺酸钠（SDS），加超纯水溶解至100ml，室温保存。5) 10%过硫酸铵(Ap)称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解至10ml,溶解后，4冰箱保存。混匀后，室温保存。6) 1甘氨酸电泳缓冲液 称取3g三羟甲基氨基甲烷，14.4g甘氨酸，1g十二烷基磺酸钠（SDS）加适量超纯水溶解，用浓盐酸调PH值至8.3，加超纯水定容至1L。7) 2SDS-PAGE上样缓冲液表1-2 2SDS-PAGE上样缓冲液配制方法试剂含量0.5M pH6.8 Tris碱2.0ml10% SDS4.0ml甘油2.0ml1% 溴酚蓝0.05ml超纯水定容至10mlDTT0.154g(用时现加)8) 考马斯亮蓝G250染色液表1-3 考马斯亮蓝G250染色液配制方法试剂浓度含量Coomassie Blue G-2500.1% (w/v)1.0 g甲醇40% (v/v)400 ml冰醋酸10% (v/v)100 ml超纯水定容至1000ml避光室温保存9) 脱色液：冰乙酸、甲醇和超纯水按1:3:6的比例配置。(2) 电泳条件及步骤1）12%分离胶、5%积层胶的制备表1-4 12%分离胶、5%积层胶的制备方法试剂12%分离胶 (10ml)5%积层胶（4ml）超纯水3.3ml2.7ml30%聚丙烯酰胺贮液4ml670ul1.5M Tris(pH 8.8)1.5ml_1.0M Tris(pH 6.8)_500ul10%SDS100ul40ul10%AP100ul40ulTEMED5ul5ul将配制分离胶混匀灌入电泳槽中，加水覆盖，室温下静止20-40分钟聚合。待分离胶聚合后，倒出上面的水，再灌入配置好的浓缩胶，迅速插入样品梳，室温下静止20-40分钟聚合。操作过程中注意避免出现气泡。2）蛋白样品处理：将蛋白样品及分装后的maker与2SDS-PAGE上样缓冲液按1:1的比例混合，沸水水浴10min，使蛋白变性。3）上样：待积层胶聚合后，竖直拔出样品梳，用1SDS电极缓冲液灌满电泳槽前后槽，用10ul加样枪在加样孔中加入处理好的蛋白样品及蛋白Marker 10l/孔。4）电泳：将电泳槽带电极的盖子改好后，接通电源，恒电压80V 电泳20-30min至分离胶后，可将电压调至100V-150V继续电泳（电压调高后可明显缩短电泳时间，不影响点用效果），约2小时，直至电泳样品目测到达分离胶的底部，关闭电泳仪，电泳结束。5）染色与脱色：将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热1min后，摇床振荡30分钟染色，倒掉染色液。用超纯水除去残留的染液，再加入脱色液。可用微波炉加热，振荡摇床约1小时，如果多次替换脱色液并延长加热时间可明显缩短脱色时间，直至条带清晰可见。1.5.5 Western Blot检测融合蛋白MH的活性(1) 相关试剂的配制1）膜转移缓冲液（39mM Glycine，48mM Tris，0.037%SDS，20%甲醇）称取14.4g的甘氨酸（Glycine），3.03g的Tris, 加入600ml超纯水充分搅拌溶解, 加超纯水将溶液定容至800ml, 加入200ml甲醇。室温保存。2）TBST缓冲液（20mM Tris-HCl， 150mM Nacl， 0.05% Tween20）称取8.8g Nacl, 加入20ml 1M Tris-HCl（PH8.0）, 加入800ml超纯水，充分搅拌溶解。加入0.5ml Tween20后充分混匀，用超纯水定容至1L，4保存。3）封闭缓冲液（5%脱脂奶粉）称5g脱脂奶粉加入到100ml的TBST Buffer中，4保存待用（现配现用）。(2) Western条件及步骤1) SDS-PAGE电泳: 同1.6.3（2）2) 转膜：首先将PVDF膜剪裁成5.38.3cm大小，滤纸剪裁810cmm大小浸入甲醇1-2min。然后，按照白板/海绵/四层滤纸/PVDF膜/胶/四层滤纸/海绵/黑板的顺序依次排列制作三明治固相载体。冰浴状态下连接电极，转移槽中冰盒放置在黑板侧，内外槽中加满转移缓冲液。转膜条件：200V，200mA（恒流快转），1h。3) 封闭：将PVDF膜用TBST冲洗，冲洗一下即可（1-2min）。用封闭液将膜覆盖（2张PVDF膜背靠背，交叉放入5%脱脂奶粉中），水平摇床缓慢轻摇4h。4) 洗膜：将封闭后的PVDF膜放入TBST中，水平摇床缓慢轻摇，清洗10次，10min/次，。5) 孵育一抗（抗原免疫小鼠血清）：根据maker显示，将PVDF膜上目的蛋白所在位置的PVDF膜剪裁掉，注意切角标记。将剪裁好的PVDF膜条放入装有稀释好的一抗离心管中(一抗将膜条覆盖,一个离心管只能加两条，且背靠背）。室温水平摇床缓慢轻摇12h。6) 洗膜：将一抗孵育后的PVDF膜放入TBST中，水平摇床缓慢轻摇，清洗3次，10min/次，。7) 孵育二抗（兔抗鼠多克隆抗体）：将清洗好的PVDF膜放入含有稀释好的二抗（1:5000）的大离心管中（与一抗相同，一个离心管只能加两条，且背靠背）。室温，水平摇床避光缓慢轻摇3h。8) 洗膜：将二抗孵育后的PVDF膜放入TBST中，水平摇床缓慢轻摇，清洗5次，10min/次，。9) 显影（暗室中操作）：在曝光盒中平整铺好保鲜膜，将PVDF膜平整放在下层保鲜膜上，每条PVDF膜逐滴加上ECL超敏发光液，将上层保鲜膜覆盖PVDF膜（注意赶出气泡）。在暗室中观察荧光强度，考虑曝光胶片厚度（张数）。剪裁1张胶片，压在PVDF膜上，避免移动，盖上曝光盒，避光放置30min。将胶片取出依次放置于显影液，超纯水，定影液中。最后自来水冲洗胶片后观察结果。1.5.6 检测纯化后融合蛋白MH的杂质1.5.6.1内毒素检测(1) 细菌内毒素标准溶液的配制：标准曲线为0.1，0.25, 0.5, 1.0EU/ml 。(2) 阴性对照为细菌内毒素检查用水(3) 鲎试剂，显色基质，偶淡化试剂等的溶解(4) 实验操作：取无热原试管，加入100u细菌内毒素检查用水，内毒素标准溶液，或检测样品，再加入100ul鲎试剂;试管混匀，37孵育6min;温浴结束后，加入100ul显色基质溶液，混匀，37孵育6min；温浴结束后，加入500ul偶淡化试剂1，混匀；加入500ul偶淡化试剂2，混匀；加入500ul偶淡化试剂3，混匀，静止5min,与545nm波长处读取吸光度值；建立标准曲线，计算所测样品内毒素含量。1.5.6.2大肠杆菌宿主细胞残余蛋白的检测（Ec HCP）(1) 用移液枪吸取25ul标准液，对照液，和待检样品加入96well平板。(2) 用移液枪吸取100ul anti-E. coli:HRP 加入每孔。(3) 室温（25左右）振荡孵育90min。(4) 倾倒孔内液体，排干，然后用洗液洗四次，最后排干。(5) 用移液枪吸取100ulHRP加入孔内。(6) 室温静止孵育30min。(7) 用移液枪吸取100ul终止液加入每孔终止反应。(8) 在450nm出读板(9) 做标准曲线，计算所测样品Ec HCP的含量。1.5.7 Bradford法测定蛋白浓度 (1) 配制考马斯亮蓝染色液称取100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入100ml85%的磷酸，用超纯水定容至1000ml。(2) 标准品牛血清白蛋白（BSA）的配制 称取10mg BSA，溶于8ml超纯水后，用超纯水定容至终浓度为1mg/ml，4保存待用。(3) 按下表加样，每管样品和染液充分混合后，在10min内检测595n