（蔬菜学专业论文）豌豆早期结瘤素基因克隆及psenod12a与pslectin基因导入烟草研究.pdf

摘要 豌豆早期结瘤素基因克隆及p s e n o d l g a 与 p s l e et i n 基因导入烟草研究 蔬菜学专业硕士研究生黎林 指导教师张兴国研究员 摘要 共生固氮结瘤是豆科植物与根瘤菌硒者相互作用的结果。从根瘤菌接触根毛至形成成熟 根瘤的过程。其实就是根瘤菌和宿主植物的有关基因的表达及其基因表达产物之间相互作用 的过程。这个过程涉及根瘤菌与植物两者之间的分子对话、相互识别、信息传导和基因表达 的复杂网络调控。如果能把这个过程的各个环节诠释清楚。不但可以改善或促进豆科植物的 共生固氮，而且有可能在菲豆科植物，特别是主要农作物上实现共生固氮，从而提高农作物 的产量与品质，大大缓解在氮肥生产和旌用过程造成的资源紧缺和环境污染的压力，造福于 人类。 目前研究已经证明，植物凝集素在豆科植物识别根瘤菌的过程中起着不可缺少的重要作 用，通过豆科植物间凝集素基因的转化，可使一些豆科植物识别原本不能识别的根瘤菌。一 种植物在不同的生态环境可与多种根瘤菌共生，说明豆科植物与根瘤菌共生的多样性，这也 修正并发展了传统的根瘤菌寄主专一性和植物互接种族的概念。e d w a r d s 等0 9 9 1 ) 和f i 各f t e 等 ( 1 9 9 1 ) 分别将豌豆凝集素转入到马铃薯、烟草中；王逸群、荆玉祥( 1 9 9 9 ) 进行了豆科植物凝 集素基因和植物血红蛋白基因双价基因的植物表达载体的构建，并分别转化到烟草和水稻，研 究凝集素在转基因植株中的细胞生物学定位及其表达机制，以期最终能实现将豆科植物凝集 素基因转化到非豆科植物，并能使非豆科转基因植株识别相应的根瘤菌，通过凝集素基因扩 大根瘤菌宿主范围。 共生固氮体系中，在宿主植物内部有一类基因在根瘤菌入侵根毛到固氮根瘤的形成过程 中表达，被称之为结瘤素基因( n o d u l i ng e n e ) ，并依表达时间先后而分为早期结瘤素基因和 晚期结瘤素基因。早期结瘤素基冈在根瘤发育早期表达，参与“根瘤菌一根毛”相互作用及 根瘤形态发生过程，对植物与根瘤菌之问的信息传递、根瘤菌的侵染及根瘤的形成有着重要 作用。到目前为止，越来越多的早期结瘤素基冈已经被鉴别出来，并得到克隆和测序，但是 人们对这些基因作用机理的研究还不是很透彻，也需要探讨将这些早期结瘤素基因从宿主豆 科植物转移到非豆科植物后的功能与作用。 两南大学硕十学1 = 7 = 论文 本研究通过特异引物、p c r 技术从豌豆基因组d n a 中克隆出早期结瘤素基因 p s e n o d l 2 a 、p s s y m 7 、p s s y m 3 5 ，并将豌豆早期结瘤素基因p s e n o d l 2 a 和凝集紊基因( p s t ) 构建成了植物双元表达载体p v c r 2 1 2 0 ，用农杆菌介导法转入烟草。主要实验结果如下： 1 克隆了豌豆早期结瘤素基因p s e n o d l 2 a 以豌豆基因组d n a 为模板，利用特异引物和p c r 技术，扩增获得p s e n o d l 2 4 基因。序 列分析表明，该基因全长1 2 8 2b p ，含有编码1 1 0 个氨基酸的3 3 3b p 的开放阅读框和9 3 6b p 的5 端控制区。与g e n b a n k 公布的已知序列( x 8 1 3 6 6 ) 相比，其核苷酸序列及推测的氨基酸 序列的周源率分别为9 9 9 ( 仅有1 个碱基不同话口1 0 0 。 2 克隆了豌豆早期结瘤素基因p s s y m 7 以豌豆基因组d n a 为模板，利用兼并引物和p c r 技术，扩增获得p s s y m 7 基因片段，该 基因片段长7 4 3 b p 。通过用g e n e i o u sp r o 锄4 5 4 进行在线分析比对，发现它与编码g a r s 蛋 自家族的豌豆s y m 7 基因( 登录号a j 8 3 2 1 3 9 ) 核苷酸同源率达9 9 1 。该基因片段推导的蛋白 序列长度约为2 4 8 个氨基酸，用g e n e i o u sp r ot r i l4 5 ，4 进行在线分析比对，发现它与豌豆g r a s 蛋白家族( 网上登录号为c a h 5 5 7 6 9 ) 的序列同源率达9 9 8 。 3 ，克隆了豌豆早期结瘤素基因p s s y m 3 5 以豌豆基因组d n a 为模板，利用特异引物和p c r 技术，扩增获得p s s y m 3 5 基因。由于 该基因大于5 k b ，因此分两段克隆该基因，然后进行拼接。p s s y m 3 5 u p ( p r o m o t e r 区域) 长为 8 3 8 b p ，p s s y m 3 5 d o w n ( c d s 区域) 长为3 a 9 9 b p 。用g e n e i o u sp r ot r i l4 5 4 进行分析，该基因有 3 个内含子。与g e n b a n k 上公布的豌豆p s n i n 基因( a j 4 9 3 0 6 3 ) 相比，同源率为9 9 9 ，将由 克隆的p s s y m 3 5 基因推导的蛋白质与公布的豌豆结瘤过程早期的蛋白( n c b i 登录号 a 岫3 7 9 4 6 ) 比对，同源率为9 8 7 。 4 将p s e n o d l 2 4 与p s l e c t i n 两个基因导入了烟草基因组 先将p s e n o d l 2 a 连接到中间载体p v c t 2 0 2 0 上，构建成p v c t 2 0 2 0 - 1 2 a ，再与植物表达 载体p v c t 2 0 2 0 p s l 进行重组，构建成p v c l 2 1 2 0 双元表达载体。利用农杆菌介导法将 p s e n o d l 2 a 与p s l e c t i n 两个基因导入烟草( n i c o r i a n at a b a c u mk c v , w m c o n s i n 3 8 ) 中。共获得 8 个独立的卡那霉素抗性烟草株系，移栽后全部成活并开花结果。p c r 检测初步确定 p s e n o d l 2 4 基因和p s l 基因已整合进烟草基因组。 关键词：豌豆；p s e n o d 2 a ；p s $ y m 7 ；p s s y m 3 5 ；转基因烟草 a b s t r a ( 了r 曼曼量皇蔓皇曼量曼i 一 1 1 i i , 曼曼曼曼曼曼皇皇舅曼詈曼皇皇曼曼曼量曼曼量蔓! 曼量皇葛 i s o l a t i o no fe a r l yn o d u l i ng e n e sf r o mp i s u ms a t i v u ma n d i n t r o d u c t i o no fp s e n o dl2 aa n dp s l e c t i ni n t on 记o t i a n a t a b a c u m m a s t e rd i g r e ec a n d i d a t el il i n a d v i s o rx i n g g u oz h a n g ( c o l l e g eo fh o r t i c u l t u r ea n dl a n d s c a p ea r c h i t e c t u r e ，s o u t h w e s t u n i v e r s i t y , c h o n g q i n g4 0 0 7 1 5 ，c h i n a ) a b s t r a c t s y m b i o t i cn i t r o g e nf i x t i o ni st h e r e s u l to fi n t e r a c t i o nb e t w e e nl e g u m ea n dr h i z o b i u m t h e s u c c e s s i v es t e p sf r o mt h er h i z o b i u m0 0 m ei n t oc o n t a c tw i t hr o o th a i rt of o r mm a t u r en o d u l i n ，i nf a c t , i st h e p r o g r a mo fg e n ee x p r e s s i o no f t h er h i z o b i u ma n di t sh o s t ，t h i si n c l u d em o l e c u l e c o m m u n i c a t i o n 、r e c o g n i t i o nr e a c t i o n 、i n f o r m a t i o nd i s s c m i n a t i o n 、n e t w o r k - m a n i p u l a t i o no fg e n e e x p r e s s i o n 1 fw ec a nm a k ec l e a rt h es e c t i o n so ft h i sp r o c e s s ，w ec a l ln o to n l ym a k eu 簖o ft h e s y m b i o t i cn i t r o g e nf i x f i o ni nl e g u m e ，b u ta l s oi n t r o d u c ei ti n t on o n - l e g u m e s ，e s p e c i a l l ya g 打c n l m r a l c r o p t h r o u g ht h i s , w ec 丑ni m p r o v et h eg r o s sp r o d u c t i o n ；r e d u c et h ep r e 3 u r co fs h o r t o r e 润u r c e sa n d e n v r o n m e n t a lp o l l u t i o n i t sag r e e nr e v o l u t i o nt h a tb r i n g sb e n e f i tt om a n k i n d f o r m e rs t u d i e sh a v es h o w e dt h a tt h el e g u m i n o u sl e c t i n sp l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nt h e r e c o g n i t i o no fr h i z o b i a s o m el e g u m e sc o u l dr e c o g n i z et h er h i z o b i u mt h a th a d n tb e e nr e c o g n i z e d a f t e rt h er e l e v a n tl e c t i ng e n eb e i n gi n t r o d u c e d i nv a r i o u se e o t o # c a le n v i r o n m e n t ，o n eh o g tc a n i n t e r a c tw i t hs e v e r a lr h i z o b i u m ，t h i si n d i c a t et h ed i v e r s i t yo fs y m b i o s i sb e t w e e nl e g u m ea n d r h i z o b i u m ，i ti sm o d i f i c a t i o na n dd e v e l o p m e n t st ot r a d i t i o n a lc o n c e p to fs p e c i f yo fr h i z o b i u m h o s t a n dc o - i n o c u l a t eo fp l a n t s 。e d w a r d se t 娥1 9 9 1 ) a n dh ef l ee ta l ( t 9 9t ) h a di n t r o d u c e dt h e l e g u m i n o u sl e c t i n s i n t op o t a t oa n dt o b a c c o ；y i q u nw a n g 、y u x i a n gj i n ( 1 9 9 9 ) h a d c o n s t r u c t e dt h ep l a n t - e x p r e s s i o nv e c t o ro f l e g u m i n o u sl e c t i n sa n dl e g , h e m o g l o b i ng e n e s ，t h e n i n t r o d u c e di ti n t ot o b a c c oa n dr i c e n e yh a ds t u d i e dt h ee x p r e s s i o nm e c h a n i s ma n dc e l lb i o l o g y o r i e n t a t i o n ，t h em a i na i m 沁t oi n t r o d u c el e g u m i n o u sl e c t i n si n t od o l l - l e g u m e s ，柚dl e tt h e n o n - l e g u m e sd i s t i n g u i s hf r o mr h i z o b i a ，u l t i m a t e l y , e x m n dt h eh o s to fr h i z o m a i nt h es y s t e mo fs y m b i o t i cn i t r o g e n ，t h e r ea r es u c h l i k eg e n e si nt h eh o s tt h a te x p r e s si nt h e p r o g r a mo fn a d u l a t i o n ，i t sc a l l e dn o d u l i ng e n e 。i n c l u d i n ge a r l yn o d u t mg e n e ( e n o o ) a n dl a t e n o d u l i ng e n e ( n o d ) e a r l yn o d u l i ng e n e sw e r ei n d u c e da lt h ee a r l ys t a g eo fl e g u m et o o ln o d u l e i l l 西南大学硕十学位论文 f o r m a t i o n i tp l a y e d 柚i m p o r t a n tr o l ei nt h ei n f o r m a t i o nc o m m u n i c a t i o nb e t w e e np l a n t sa n dr h i z o b i a , t h ep r o c e s so fi n f e c t i o na n dt h ef o r m a t i o no fr o o tn o d u l e s of a r ，m o r ea n dm o r ee a r l yn o d u l i ng e n e s w e r ed i f f e r e n t i a t e d ，c l o n e da n ds e q u e n c e d b u tt h em e c h a n i s mo ft h e i rf u n c t i o nw a sn o t w e l l i n f o r m e dy e t i nt i f f ss t u d y , p s e n o d l 2 a ，p s s y m 7a n dp s s y m 3 5g e u e , w h i c ha r ee a r l yn o d u l i ng e n e s , w e 陀 o b t a i n e df r o mp e a ( p i s u ms a t i v u ml ) b yp c ra m p l i f i c a t i o n t h ee x p r e s s i o nv e c t o ro f p s e n o d l 2 a a n dp s l e t i ng e n ew a sc o n s t r u c t e d ，a n dt h e n ，w ei n t r o d u c e dt h ee x p r e s s i o nv e c t o ri n t ot o b a c c o ( n i c o t i a n at a b a c u ml c v w i s c o n s i n 3 8 ) v i aa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sm e d i a t e dm e t h o d n e m a i nr e s u l t ss h o wa sf o l l o w s ： 1 c l o n e de a r l yn e d u l i ng e n e s p s e n o d l 2 4g e n ef r o m s u ms a t i v u m t h ep s e n o d l 2 ag e n ef r a g m e n tw a sa m p l i f i e db ym e a n so fp c ru s i n gp e ag e n o m i cd n aa s t e m p l a t ea n dap a i ro fs p e c i f i co l i g o n u c l e o t i d e sa t5 一a n d3 一e n da sp r i m e r s e q u e n c ea n a l y s i s s h o w e dt h a tt h ef r a g m e n tc o n s i s t e do f1 2 8 2b p ，w h i c hc o n t a i n e da no p e nr e a d i n gf r a m eo f3 3 3b p ， a n de n c o d e dap o l y p e p t i d eo f1 1 0a r g oa c i d s c o m p a r i s o nw i t hp r e v i o u s l yp u b l i s h e ds e q u e n c e ( 1 0 c a t i o ni ng e n b a n ka sx 8 1 3 6 6 ) s h o w e d9 9 9 h o m o l o g i e si nn u c l e o t i d es e q u e n c ea n d1 0 0 i n a m i n oa c i ds e q u e n c er e s p e c t i v e l y 2 c l o n e de a r l yn o d u l i ng e n e s - p s s y m 7g e n ef r o mp s u ms a t i v u m t h ep s s y m 7g e n ef r a g m e n tw a sa m p l i f i e db ym e a n so fp c ru s i n gp e ag e n o m i cd n aa s t e m p l a t ea n dap a i ro fa n n e xo l i g o n u c l e o t i d e s a sp r i m e r t h es e q u e n c el e n g t hi s7 4 3 b p ，u s i n g g e n e i o u sp r ot r i l4 5 4a n a l y z ei to nn e t ，w ef o u n dt h a t9 9 1 h o m o l o g i e si nn u c l e o t i d es e q u e n c e p i s u ms a t i v u ms y m 7 g e n ef o rg r a sf a m i l yp r o t e i n ( 1 0 c a t e di na j 8 3 2 1 3 9 ) i te n c o d e dap o l y p e p t i d e o f2 4 8a 1 3 - 1 运oa c i d s ，9 9 8 i na m i n oa c i ds e q u e n c er e s p e c t i v e l yw i t hp i s u ms a t i v u mg r a sf a m i l y p r o t e i n ( c a h 5 5 7 6 9 ) 3 c l o n e de a r l yn o d u l i ng e n e s - p s s y m 3 5g e n ef r o mp s u ms a t 如u m t h ep s s y m 3 5g e n ef r a g m e n tw a sa m p l i f i e db ym e a n so fp c ru s i n gp e ag e n o m i cd n aa s t e m p l a t ea n dap a i ro fs p e c i f i co l i g o n u c l e o t i d e sa sp r i m e r b e c a u s et h eg e n eb i g g e rt h a n5k b ，s ow e c l o n e di tb yt w os e q u e n c e s ，a n dt h e nc o n n e c t e dt oo n e n ef r a g m e n to fp s s y m 3 5 u p ( p r o m o t e r r e g i o n ) c o n s i s t e do f8 3 8b p ，p s s y m 3 5 d o w n ( c d sr e g i o n ) c o n s i s t e do f3 1 9 9b p a n a l y z i n gi tw i t h g e n e i o u sp r o 醐4 5 4 t h es e q u e n c eh a st h r e er x o n s c o n t r a s t e dw i t hp s n i no o c a m di ng e n b a n k a j 4 9 3 0 6 3 ) ，h o m o l o g i e si nn u c l e o t i d es e q u e n c ei s9 9 9 a n d9 8 7 i na m i n oa c i ds e q u e n c e r e s p e c t i v e l yw i t hn o d u l ei n c e p t i o np r o t e i no fp s u ms a t i v u m ( c a d 3 7 9 4 6 ) 4 i n t r o d u c e dp s e n o d l 2 4a n dp s l e c t i ni n t ot o b a c c o sg e n o m e t h ep s e n o d l 2 tg e n ew a sf i r s tl i n k e di nm i d v e c t o ro fp v c t - 2 0 2 0 ，j o i n e dw i t ht h ep l a n t e x p r e s s i o no fp v c t - p s lw h i c hw a sc o n s t r u c t e db e f o r e t i m e ，w eb u i l tt h ee x p r e s s i o nv e c t o ro f a b s i r a c i p v c t 2 1 2 0 ，a n dt h e n ，w ei n t r o d u c e dt h et w og e n e si n t ot o b a c c ov i aa g r o b a c t e r i u mt u r n e f a c i e n s m e d i a t e dm e t h o d e i g h tk a n a m y c i n r e s i s t a n tt o b a c c o # a n t sw e r eo b t a i n e da n da l lo ft h e s ep l a i n s w e r ea l i v e p c rd e t e c t i o ns h o w e dt h a tt h ep s e n o d l 2 aa n dp s l e t i ng e n eh a v eb e e ni n t e g r a t e di n t o t o b a c c o sg e n o m e k e y w o r d s ：p e a ：p s e n o d l 2 i ：p s s y m7 ；p s s y m 3 5 ：t r a n s g e n i ct o b a c c o v 缩略词表 缩略词表 两南大学硕+ 学位论文 5 8 独创性声明 学位论文题目：熟垦呈翅结疽塞基因立隆丞旦旦堑塑z 丝皇丝纽 基固昱魍堇婴究 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也 不包含为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中 作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者 答字嗍：7 肘日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：1 坏保密， 口保密期限至，年月止) 。 学位论文作者签名：乡陆妒 导师签名： j 签字日期：泸卯年b 月8 日 签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第1 章文献综述 第1 章文献综述 俗话说：。庄稼一枝花，全靠肥当家。”植物需要氮肥，犹如人体需要蛋白质一样。但是 世界上大多数地区的土壤都缺乏氮素养分，为了获取农作物高产，需要施用大量氮肥。1 9 世 纪末，入口增长对食物生产的需求不断增大，肥料紧缺。人们面临挨饥受饿的危险，科学家 们都在想方设法解决这个问题。1 9 1 3 年，发生了一件具有划时代意义的事件，h a b e t - b o s c h 发 明了用化学方法生产氮肥，在高温高压下催化n 2 为n 璃。随着农业的发展，氮素化肥的生产 和施用量急剧增加，2 0 世纪年代初，世界氮肥施用量约为6 l o o 万吨，1 9 9 5 年约8 0 0 0 万 吨，我国早在1 9 9 6 年氮肥施用量就达到了2 2 0 0 万吨，随着入口的增长，需求量也将越来越 大。不容置疑，工业氮肥解决了我国庞大人口的衣食问题。但是，由于过量地施用化肥，对 全球造成了较大的负面影响：第一，人工合成氮素肥料要耗费大量能源，不仅成本高，而且 污染水源和空气，破坏生态环境，危害人类健康，进口化肥需要巨额资金：第二，氮肥施用 量愈大；肥效愈低；利用率仅3 5 ，甚至更低；第三，硝酸盐随水渗漏，造成严重的环境污 染；第四，单纯施用化肥，土壤板结肥力下降j 第五。随着我国人口增长，如仍按粮食需 要生产工业氮肥，将给能源造成更大压力。氮是各类生物生长发育所必需的主要元素之一。 氮素营养在农业生产中发挥着重要作用，肩负着提高作物产量、培肥土壤、维持生态系统平 衡的使命。据统计，人造氮肥占全球氮素总量的3 0 左右，除闪电在瞬间圃氮5 左右外，其 余全靠生物来固氮。 在能源紧张和环境污染的双重压力下，传统的固氮方式已经难以适应各种需求，使生物 固氮研究得到前所未有的重视。如果主要农作物能够自主固氮，就可以摆脱对化肥的依赖性， 既节省能源，又能对环境友好。这是继工业革命之后，人们期待的一次“绿色革命”。 1 1 豆科植物一根瘤菌共生固氮体系的概述 1 1 1 豆科植物共生固氮研究概况 生物固氮在提供植物氮素营养方面占据着非常重要的地位，1 9 9 5 年联合国粮农组织 ( f a o ) 大概估算，世界每年的生物同氮量将近2 1 0 6 t ( 相当于4 l o s t 尿素) ，约占全球植物 需氮量的3 4 。所以，生物固氮是地球上最大规模的天然氮肥工厂哪。 豆科植物嘏瘤菌的共生固氮体系指豆科植物的根可以被根瘤菌感染，能够诱导根形 成根瘤，固定空气中的氮，转化为植物的氮素营养。共生固氮体系在生物固氮中占有十分重 要的地位，它的固氮量约占生物固氮量的4 5 ，相当于当今全世界合成氨生产的3 倍，而主要 的固氮共生体是农业生产上的一类重要经济作物豆科植物。豆科植物的共生固氮量是菲 豆科植物l 司氮量的4 5 8 倍【2 1 。 西南大学硕十学位论文 表1 - 1 ：生物固氮分类 t a b l e1 1 ：c l a s s i f i c a t i o no fb i o l o g i c a ln i l r o g e nf i x a t i o n 扩大共生固氮的范围，使非豆科植物，特别是农作物能自主固氮，从而达到少施化肥、 增产粮食和保护环境的目的，是生物固氮研究领域的一个宏伟目标。1 8 8 6 年德国学者赫尔利 格尔( h er m a n nh el l r i e g e1 ) 提出大豆根瘤具有固氮功能后，共生固氮的研究，特别是对豆科植 物共生固氮体系的研究开始了全新的研究局面。共生同氮体系根瘤菌与宿主植物的关系最紧 密，效率最高，它是目前生物固氮研究的焦点之一。对它的研究主要有两个目的，一是揭示 根瘤菌与宿主植物相互作用机理，二是扩大宿主范围，使非豆科植物，如水稻、小麦、玉米 等粮食作物也能共生固氮。这一研究涉及根瘤菌与植物两者之间的分子对话、相互识别、信 息传导和基因表达的网络调控。这门科学是一个交叉学科，包括农学、化学、物理学和生物 学，而生物学中又包括遗传学、分子生物学、生物化学、生物物理学等学科。我国研究人员 发现种植物在不同的生态环境可与多种根瘤菌共生，这将是对传统的根瘤菌寄主专一性和 植物互接种族的概念的修正。( 荆玉祥等，1 9 9 5 t 3 1 聂延富通过2 舢d 的作用，能使小麦根系诱 导结瘤；英国科学家利用酶降解根细胞壁，促使根瘤菌进人水稻和油菜根系中，形成了类根 瘤的结构。陈廷伟、t c h a n 等通过固氮螺菌实验，进一步证实2 4 - d 对小麦结瘤的作用，认为 这种根瘤结构为“类根瘤”，可能由于果胶细菌释放的酶破坏了初生根和根毛的细胞壁，使得 同氮能力可以表达，这将为非豆科植物诱导结瘤和固氮提供依据。豆科植物根毛顶端细胞表 面糖类卵磷脂现在被认为是影响选择根瘤菌寄主专一性的识别因子，在根瘤菌侵入豆科植物 根时有细胞壁水解酶的参加，这是种植物寄主特定的根瘤菌种间在溶解根毛顶端细胞壁时 2 第1 章文献综述 的有效行为，且随着对有机体侵染的发展形成了根瘤，进而导致建立了两种生物体间的共生 体系。这表明根瘤菌可通过破损的细胞壁裂缝进人非豆科植物，然后在其细胞内繁殖，形成 类根瘤，并最终使得固氮能力得到表达。 目前，生物固氮研究已经被列为“国际生物学计划”中的重点研究内容，为此还定期召 开国际固氮大会。各国政府都将其视为重点科技攻关项目。我国启动了9 7 3 计划“高效生物 固氮作用机理及其在农业中的应用”项目组。高效生物固氮作用机理研究要求生物学、农学、 化学和物理学相互结合，研究其结构功能和化学模拟、固氮基因表达中铵遏氧敏感、共生结 瘤固氮中植物与微生物相互关系的基因表达和调控、截留因子的结构和人工合成。固氮根瘤 及其诉诸植物的基因组学、功能基因组学和蛋白质组学等在分子和原子水平上，从不同方面 互相交叉、有机结合，引进新概念、新技术进行综合研究。 1 1 2 共生结瘤固氮体系的生理反应机制 豆科植物与根瘤菌形成共生关系并结瘤固氮是一个复杂的过程，此过程具体表现是在豆 科植物根上形成特异的结构根瘤，根瘤行使固氮的功能。根瘤的形成是植物宿主和根瘤 菌对抗与协调的统一，这个过程受到豆科宿主和根瘤菌双方一系列基因的共同调节和控制。 首先，植物根毛区分泌类黄酮物质，类黄酮物质被根瘤菌的结瘤蛋白( n o d d - p r o t e i n s ) 识别，并相互结合，当达到一定水平时，诱导根瘤菌结瘤基因的表达并合成结瘤因子( n o d f a c t o r s ，f s ) ，进而引起根瘤菌在植物根毛附近富集并发生趋化作用，这些结瘤因子是一些脂 几丁质寡糖( 1 i p o - c h i t i no l i g o s a c - c h a r i d e s ，l c o s ) ，结瘤因子是脂寡聚糖，其基本骨架是由3 5 个b 1 ，4 糖苷链连接的葡萄糖胺几丁寡聚体。它们能被植物特异性地识别，并且促使根 瘤菌吸附到植物根毛细胞上。有人形象的称这一过程为根际的殖民化( 黄家风等，2 0 0 2 ) ( 图 1 a ) 。 与此同时，植物的根迅速作出一系列反应，如钙峰及离子流( c a 2 + 、a 、矿) 的形成、 根毛顶端膨胀和新的顶端生长、根毛分枝和卷曲等现象的发生( 图1 b ) 。在根毛卷曲部位附 着的根瘤菌进入细胞壁之间，植物细胞壁局部水解，细胞质膜向内生长，同时新的细胞壁物 质沉积在内陷的质膜处，形成一种管状结构，即侵入线( i n f e c t i o n t h r e a di t ) ，也叫侵染线。( 图 1 c ) 。随后，根瘤菌在侵入线内不断繁殖生长，并推动着侵入线不断伸长，直达根部皮层细 胞1 4 l ，与此同时，某些皮层细胞进行有丝分裂，根瘤原基( n o d u l ep r i m o r d i u mn p ) 开始形成。 伸长的侵入线随后产生分枝，以类似顶端生长的方式，在根毛内向前推进并穿过皮层细胞， 最后在根瘤原基细胞细胞质中释放根瘤菌，后者进一步分化成被膜包围着的可以固氮的类菌 体( 图1 d 、e 、f ) 。至此共生体初步形成，根瘤原基逐渐发育为根瘤【5 ，6 7 ，蜊。 3 瘤菌 一。 毛 c乒入线d o ，1 鼍 e f 皮层细胞 。? 。矿嗡 侵入线 圈卜1 ：豆科植物根瘤苗共生固氟体系早期结癌反应 ( a ) 报毛表面分泌的他拳信号使根窟茁向根毛发生趋化作用根瘤菌吸附到根毛表面；( b ) 接物的掇m 速作m 一系列反应，根毛顶端膨胀、新的顶端生长、撮毛卷曲，* 包裹根瘤菌；( a 在根毛卷曲榔位附着的根鲁苗进 细胞壁之问植物细胞壁局部水解，缃胞质腋自内生长，同 时新的目胞壁物质沉积在内陷的质膜处，形幔 线( i k b o nn m dl 曰； ( d 、ef ) 根 窟值在侄八线内不断鬟殖生长井推动着侵 线不断伸长，与此吲h ，根痛原基( n o d u l e m 肿m mn p ) 开始形成。仲长的侵 线随后产生分枝，向前推进在根瘤原基日胞细胞质中 释放报癌苗，后者进步分化成被膜包峒着的可以同氪的粪曹体 f i g1 - 1 ：t h ee a r i ys l a g 鹧o f r h z o b 圳, i n f e d i o n l ) 凸咖k 嘞卫l s e 】涮i z 鲥j oa 卅s 刚d 如mt h c 伽a 衄m mh 血n d l i b t i 咕h i z o b 瑚 雄朗蚯，t h e 埘2 0 b t t 孔h 酣t o t h er o o t h a i r ；( b ) t k 哪tr om p h 坤t o o th mc 砷 - 即舯他 一p t kr 吐o b 甜：( c y 珏er b l z o l , l a l bm cp h m t u 眦i l 皇，t h eo d lw a l l g 轴，t h eo 山，t b 口d 啪i n b y ，t h e 讪w m c hd e g r a d e ds i n kd 0 t h ec c m _ t 啊n e ，b 皿m c i t , ( d 、e 、聊t h e i h j z 曲) “p f o p a 窖a 虹d 血c i t c ! o n 舭，a m t i m e i k 州n i 酬c e l l sa ”i n d u d t od e d i 血 n d m c a n d f o r m m c o d - _ l cp l i 瑚d i i 瑚：t h e f r f 一4 ， w _ t h ei tr c h l b c 啦o ft h ed e v e l o p i n gp r l m o r d i u m ，t h e i 曲诚mm 1 s di bt h e q _ h s m o d krm e l a t t e r d m m 州扯h bb a e t e m i d s 第1 章文献综述 1 2 植物的结瘤素及结瘤紊基因在共生固氮中的作用 1 2 1 什么是结瘤紊以及结瘤素基因 豆科植物与根瘤菌共生作用最后形成根瘤，这个过程两者之间发生着非常密切的物质和 物理化学的信号的传递。近年来，人们利用分子生物学技术发现了上百种植物基因参与了共 生固氮。人们将特异地存在于根瘤菌感染产生的根瘤细胞中并参与共生固氮作用的植物基因 产物统称为结瘤素( n o d u l i n ) ，编码它们的基因则称为结瘤素基因( n o d u l i ng e n e ) ( l e g o c k ia n d v e r m a1 9 8 0 ，v a i lk a m m e n l 9 8 4 ) 。它们对于根瘤结构的形成及维持，固氮活性的保护以及固氮 产物的代谢都有重要作用。通过对c d n a 基因库的差别筛选，人们已经从多种植物中分离鉴 定出了许多结瘤素基因。 1 2 2 结瘤素及其基因的分类以及它们在共生固氮中的作用 结瘤素可根据它们在根瘤中产生的时间先后分为早期结瘤素和晚期结瘤素。相应地，结 瘤素基因又分为早期结瘤素基因和晚期结瘤素基因。早期结瘤素基因( e n o d ) 是根瘤发育早期 表达的，参与根瘤菌根毛相互作用及根瘤形态发生过程，对植物与根瘤菌之间的信息传 递、根瘤菌的浸染及根瘤的形成有着重要作用( n a pa n db i s s e l i n g1 9 9 0 ) 。早期根瘤素基因一般 是在根瘤接种数小时后到根瘤形成、固氮作用之前出现。据报道，不同植物根瘤的早期结瘤 素基因有所不同，但共同的是都有e n o d 2 、e n o d 5 、e n o d l 2 、e n o d 4 0 等f 7 ，1 0 i 。除了e n o d 家族 的基因，还有一类基因也属于早期结瘤素基因，它们是s y m ( s y m b i o t i c ) 基因。这类结瘤素基 因包括豌豆( p i s u ms a t i v u m ) 中的p s s y m 8 、p s s y m 9 ( m a r k w e ia n dl a m e ，1 9 9 2 ) 、p s s y m l o 、 p s s y m l 9 、p s s y m 3 0 ( s a g a ne ta l ，1 9 9 4 ) 这5 个基因调控着共生固氮中根毛卷曲的过程；s y m 7 、 s y m l 4 、s y m 3 5 佣s y g a n o ve ta l ，1 9 9 9 ) ，这3 个基因影响着侵入线的发生；s y m 2 ( d e g e n h a r d te ta l 1 9 7 6 ) 、s y m 3 6 ( s a g a ne t a l ，1 9 9 4 ) 、s y m 3 7 、s y m 3 8 这4 个基因与侵入线在根毛里的发育有很大 的关系：s y m 5 ( g u i n e la n dl a r u e ，1 9 9 1 ) 、s y m l 6 ( g u i n e la n ds l o e t j e s ，2 0 0 0 ) 、s y m 3 4 这3 个基 因与侵入线在根里面的生长有密切关系1 6 , 1 1 】；除此之外，还有p s e n o d 5 、p s e n o d l 2 、 p s e n o d 4 0 、百脉根( l o t u sj a p o n i c u s ) 中的l j n f r l 、l j n f r 5 、蒺藜苜蓿( m e d i c a g ot r u n c a t u l a ) 中的m t n f p 等都是早期结瘤的一些结瘤素基因【1 2 1 。随着研究的不断深入，更多的早期结瘤素 基因将陆续被发现、克隆并