（物理化学专业论文）新颖表面活性剂对牛血清蛋白（bsa）结构的影响研究.pdf

山东大学博一i j 学位论文 摘要 表面活性剂与蛋白质的相互作用研究有重要的理论和实际意义。首先，二者 都是日用化学品中常用的物质，其相互作用广泛存在，所以表面活性剂对蛋白质 的影响必须考虑，例如球型蛋自由于其具有催化酶反应、表面吸附、结合其他分 子和形成分子聚集体的能力，被用作多种食品、护肤品和制药产品的功能成分； 其次，由于蛋白质不构成同系物，不同的蛋白质的性质有非常大的区别，所以蛋 白质与表面活性剂相互作用的一些研究成果并不具有普适性；再次，随着一些新 型表面活性剂，比如糖胺类表面活性剂、含氟表面活性剂的研究和应用的逐渐增 加，它们对于蛋白质的影响尚属于未知的领域，正是基于以上的原因，表面活性 剂与蛋白质相互作用的研究一直非常活跃。 近年来，这一领域的研究主要集中在三个方面：表面活性剂与蛋白质复合物 的结构以及蛋白质性质的变化；表面活性剂与蛋白质混合溶液的相行为；表面活 性剂与蛋白质的界面吸附。此类研究中，相对于阴离子型表面活性剂，阳离子型 表面活性剂与蛋白质的的相互作用研究较少，而一些新型的表面活性剂如含氟的 表面活性剂、糖胺类表面活性剂对蛋白质的影响尚处于摸索阶段。本论文选择牛 血清蛋白( b s a ) ，研究了其与糖胺类表面活性剂、阴离子全氟表面活性剂以及 阳离子碳氢表面活性剂的相互作用。本论文共分四部分。 第一部分：概述了研究表面活性剂和蛋白质相互作用的重要意义，综述了蛋 白质与表面活性剂相互作用的研究进展和存在的问题。 第二部分：选择了一种糖胺类阴离子表面活性剂蔗糖葡萄糖6 - 羧酸钠果糖 6 羧酸钠1 ( n 十二烷基甲酰胺) ( s d a d ) ，研究了其与b s a 的相互作用，同 时选择了已广泛研究的具有相同疏水链的s d s 作比较。表面张力、电导和z e t a 电位等实验结果表明：s d a d 与b s a 发生了缔合作用，与s d s 相比，这种缔合 作用更依靠疏水作用力相结合。s d a d b s a 混合体系的荧光结果表明：加入 s d a d 后蛋白质的荧光强度先急剧降低后又开始增强，同时，蛋白质的荧光峰从 3 4 8 n m 蓝移至3 3 0 n m 附近。c d 光谱结果表明：当s d a d 的浓度达到l m m 时， 蛋白质的a 螺旋的含量从4 4 3 下降到3 1 4 ，同时p - 折叠的含量从2 1 7 上 升到3 2 6 ，说明蛋白质二级结构发生了变化。s d a d b s a 混合体系与s d s b s a 山东人学博j j 学位论文 混合体系的动态光散射结果相似：随着表面活性剂浓度的增加除了4 6n l t i 左右 的半径分布外，在较大位置出现半径分布，并且随着表面活性剂浓度增加，这个 半径分布向较大方向移动，直到1 0 8 0n t l l 左右稳定，并且当表面活性剂在蛋白质 上的结合达到饱和后，会出现一个独立的半径分布，即溶液中形成的自由表面活 性剂胶束的水动力学半径。通过s d s b s a 混合体系的负染色透射电镜照片，可 以非常清晰地看出b s a 结构随s d s 浓度增大的变化过程，并且观察到了蛋白质 展开后的“珠链”结构，与s d s 不同，s d a d b s a 混合体系的负染色电镜结果 显示在表面活性剂浓度较大时，体系呈现一种交联结构。实验结果说明蛋白质与 s d a d 形成了缔合物，并导致了蛋白质的变性。 第三部分：选择了阴离子全氟辛酸钠( s p f o ) ，利用电导、z e t a 电位、荧光 光谱和c d 光谱等技术研究了s p f o 与b s a 的相互作用，同时选择了辛酸钠( s o ) 进行了比较研究。电导和z e t a 电位的结果表明：s p f o 和s o 都可以结合在b s a 上。s o b s a 混合体系的荧光光谱结果表明：加入表面活性剂s o 会导致蛋白质 的荧光强度降低，浓度大于l m m 后，蛋白质的荧光强度开始恒定，直到表面活 性剂的浓度接近1 5 m m ，在这个阶段蛋白质的荧光峰位并没有发生明显的变化。 当s o 的浓度大于2 0 m m 后，蛋白质的荧光强度又开始降低，直到表面活性剂的 浓度大于1 0 0 m m 后恒定，同时蛋白质的荧光峰发生蓝移，从3 4 8 n m 左右变化到 3 3 5 n m 左右。与s o b s a 混合体系不同，在s p f o b s a 体系中，当表面活性剂 浓度很低时( l 。 2 实验部分 2 1 实验药品 蔗糖葡萄糖6 羧酸钠果糖6 羧酸钠1 ( n 十二烷基甲酰胺) ( s d a d ) 由 德国拜罗伊特大学物理化学实验室h e i n zh o f f m a n n 教授赠送，使用前未经处理； s d s 购自s i g m a 公司；牛血清蛋白( b s a ，f r a c t i o nv ，9 7 ) 购自r o c h e 公司； 实验用水为三次蒸馏水。 2 2 实验仪器 d d s 3 0 7 电导率仪( 上海雷磁公司) ；p r o c e s s o rt e n s i o n m e t e rk r i j s s 1 2 程序 界面张力仪( 瑞士) ；j s 9 4 h 微电泳仪( 上海中晨公司) 。 2 3 实验方法 2 3 1 溶液配制 b s a 溶液配制：将准确称量的牛血清蛋白用三次水溶解，磁力搅拌8 小时 后，加入少量的n a n 3 ，防细菌滋生，用三次水定容，储存在冰箱中备用。 2 3 2 电导率的测定 分别配制2 5 1 0 0 m m o l l 一的表面活性剂溶液。取此溶液，用微量进样器注入 恒温在2 5 左右的5 m l 待测溶液中( 初始溶液为三次水或定浓度的蛋白质溶 4 1 山东人学博i ：学位论义 液) ，精确计算每次加入表面活性剂的体积，以确保表面活性剂在溶液中的总浓 度均匀递增，与此同时测定溶液电导率。 2 3 3 表面张力的测定 用三次蒸馏水配制表面活性剂或表面活性剂蛋白质的浓溶液( 约为其c m c 的5 1 0 倍) ，该溶液未加入缓冲溶液调节其p h 值，待恒温一定时间后用吊片法 测量溶液的平衡表面张力。即将待测溶液通过计算机控制逐渐滴入到2 0 m l 的水 或蛋白质底液中，记录不同表面活性剂浓度时的表面张力，根据表面张力等温线 求出。和c m c 值。 2 3 4z e t a 电位的测定 将配制好的表面活性剂蛋白质混合溶液，在2 5o c 下利用j s 9 4 h 微电泳仪 测定其z e t a 电位，每个样品测定l o 次取平均值，电压为1 0 m v ，正负极交换时 间为7 0 0 m s 。 3 结果与讨论 3 1 表面活性剂蛋白质混合体系的电导率 3 1 1s d s b s a 混合体系电导率 在溶液中含有或不含有0 5 9 l 。b s a 时，测定不同浓度s d s 下溶液的电导 率值，用s d s 的浓度对电导率值作图，得到图2 5 。 4 2 皇 之 i v 譬 c s m i m m o l l i 图2 5 含有或不含有b s a ( o 5 9 l 1 ) 时s d s 电导率随浓度变化曲线 山东人学博i ：学位论文 图2 5 含有或不含有b s a ( 0 5 9 l j ) 时s d s 电导率随浓度变化等温线。从 图中可以看出，在0 5 9 l b s a 存在下s d s 的电导率曲线发生了明显的变化。在 溶液中不含有b s a 时，s d s 电导率曲线在浓度为8 3 m m o l l 1 左右出现一个拐点， 这个浓度即为s d s 的临界胶束浓度，在这里我们称为c m c o 。当溶液中存在 0 5 9 l 。1 b s a 时，在s d s 浓度较低时( c 1 ) ，电导率曲线上升缓慢，因为此时属 于表面活性剂与蛋白质的特定结合阶段( s p e c i f i cb i n d i n gr e g i o n ) ，表面活性剂依 靠静电作用结合在蛋白质带相反电荷的区域。电性中和降低了s d s 电导率的上 升。随着s d s 浓度的增加，表面活性剂与蛋白质的结合转为疏水相互作用，静 电相互作用的影响可以被忽略，所以电导率随着表面活性剂浓度的增加均匀增 加，直至s d s 浓度接近l l m m 时。在s d s 浓度接近l l m m 时，电导率曲线出现 一个拐点，这表明s d s 在蛋白质上的结合达到饱和，在溶液中开始形成自由胶 束。 另外，通过上图可以发现，在蛋白质存在下，s d s 电导率等温线的拐点不再 那么明显，电导率曲线折点主要是因为表面活性剂达到临界胶束浓度后，形成自 由胶束导致，而在b s a 存在下，当b s a 吸附表面活性剂达到饱和后，溶液中 s d s 胶束与s d s b s a 复合物处在一种平衡状态，而s d s b s a 复合物对于电导 率有较大贡献，所以电导率曲线折点不再发生明显变化。 在不同浓度的蛋白质存在下，表面活性剂的c m c 值发生变化，蛋白质的浓 度越高c m c 值越大，如图2 6 所示。这说明蛋白质的浓度越高，其吸附的表面 活性剂越多。 图2 6 在不同浓度的b s a 存在下s d s 的电导率随浓度变化曲线 4 3 山东人学博l j 学位论文 图2 6 为在不同浓度的b s a 存在下s d s 的电导率随浓度变化曲线。根据在 不同浓度的b s a 存在下得到的c m c 值，我们可以得出表面活性剂c m c 的变化 与加入的蛋白质的量之间存在定量关系。根据a r a i 等【2 8 1 观点，大分子与表面活 性剂形成的复合物有一定的组成，( c m c * c m c o ) 即为缔合到大分子的表面活 性剂浓度。我们利用c m c 幸( 蛋白质存在下形成胶束的浓度) 与c m c o ( 表面活 性剂的临界胶束浓度) 的差值a c m c 与蛋白质的浓度作图得到一条直线，如图 2 7 所示，该直线的方程为y = 4 8 4x + o 3 7 2 ，相关系数为0 9 8 8 。我们根据直线 的斜率可以求得每克b s a 结合的s d s 的量为1 4 1 9 ，该结果与文献报道基本一 致。1 2 9 】这也说明的我们方法的可行性。 主 曼 o = 譬 图2 7a c m c 对c b s a 作图结果 3 1 2s d a d b s a 混合体系电导率 j 暑 皇 工 、。， 譬 图2 8s d a d 电导率等温线 山东大学博上学位论文 与s d s 不同，s d a d 电导率随浓度变化曲线的折点变化不明显，如图2 8 所示。我们认为主要是因为，s d a d 极性头空间较大，形成胶束后依然有较大的 活动空间，电导率未受到胶束形成的抑制，所以曲线折点不明显。尽管如此，依 然可以通过曲线判断表面活性剂的c m c 约为2 5 9 x 1 0 m o l l 。 在o 5 9 l o b s a 存在时，与空白底液相比，s d a d 电导率等温线发生了一定 一 的变化，c m c 值增大，。约为3 4 8 x1 0 一m o l l 。通过前面分析s d s b s a 混合体 系的电导率知道，这是由于表面活性剂结合到蛋白质上造成的，并且c m c 的变 化值与蛋白质的浓度之间存在定量关系。由于蛋白质存在下，表面活性剂的电导 率曲线折点非常不明显，测量结果存在较大误差，所以未做定量分析。 与s d s b s a 混合体系不同，s d a d 浓度较低时，电导率等温线未出现缓慢 上升的特征。我们认为这与s d a d 的结构有关系，其极性头空间较大，较难与 蛋白质带相反电荷的区域发生静电作用，其主要靠疏水相互作用结合在蛋白质 上。所以，这种结合未表现在电导率等温线上。 3 1 3 小结 ( 1 ) 在蛋白质存在下，底液的电导率值都有一定的升高，这是因为b s a 本 身带一定的电荷，其水溶液有定的导电能力。 ( 2 ) 在b s a 溶液中s d s 与s d a d 的c m c 值都增大，这表明表面活性剂结 合在蛋白质上。根据不同浓度的b s a 存在下s d s 电导率的增大值我们计算得出 了每克b s a 结合的s d s 的量大约为1 4 1 9 。 ( 3 ) 在s d s 浓度较低时，电导率曲线上升较为缓慢，这是因为s d s 靠静 电作用结合在蛋白质上，静电中和而使电导率值上升较小。在s d a d 溶液中未 出现缓慢上升的特征，说明s d a d 主要靠疏水相互作用与蛋白质结合。 3 2 表面活性剂蛋白质混合体系的表面张力 3 2 1s 1 ) s 蛋白质混合体系的表面张力 4 5 山东人学博一卜学位论文 图2 9s d s 的表面张力随浓度对数变化等温线 图2 9 为溶液含有b s a 和空白底液中s d s 表面张力随浓度对数变化曲线。 从图中可以看出，在不含有b s a 时，s d s 表面张力等温线只有一个拐点，通过 等温线我们可以得出s d s 的c m c 值为8 1 x 1 0 。3 m o l l 1 ，该结果与文献报道 ( 8 2 x 1 0 。3 m 0 1 l 1 ) d o 及电导率测定结果( 8 3 x 1 0 一m 0 1 l 。1 ) 基本一致。在底液中 含有牛血清蛋白的条件下，表面张力等温线出现双拐点现象，曲线可以分为四个 区域。区域1 为s d s 浓度小于c l 时，这个区域属于特定结合( s p e c i f i cb i n d i n g ) 区域，此时表面活性剂浓度较低，依靠静电作用，结合在蛋白质具有相反电荷的 区域。c 1 约等于2 4m m o l l 。 第二个区域是一个平台，在此区域s d s 浓度增加不改变溶液表面张力，这 表明协同结合的开始，此时所有加入的表面活性剂都结合在蛋白质上或者与溶液 介质形成平衡，而没有吸附在气液界面上。这个平台在s d s 浓度接近5 5 m m o l l 1 时结束，我们称这个浓度为c 2 。当s d s 浓度大于c 2 后，表面张力出现 急剧下降，这个阶段是协同结合阶段，通常认为蛋白质的展开就发生在这个阶段。 当表面活性剂浓度达到1 1 2m m o l l 。1 时，这个浓度我们标记为c m c * ，出现另外 一个平台，这表示表面活性剂在蛋白质上的结合达到饱和，溶液中表面活性剂开 始形成胶束。浓度大于c m c * 后，溶液中s d s 胶束与s d s b s a 复合物形成平衡。 表面张力结果和电导率结果都表明，在b s a 浓度等于o 5 9 l 。1 时，s d s 在 蛋白质上吸附达到饱和的浓度约为1 lm m o l l 。 山东人学博：l ：学位论文 3 2 2s d a d 蛋白质混合体系的表面张力 ? - e z e ， 卜 c 舢 m m o l l 一 图2 1 0 溶液中含有或不含有b s a ( 0 5 9 l j ) 时s d a d 表面张力等温线 图2 1 0 为底液中含有或不含有b s a ( o 5 9 l 。1 ) 时s d a d 表面张力等温线。 从图中我们可以得到s d a d 的c m c 值，约为2 4 7 x 1 0 。t o o l l - 1 。在溶液中含有 0 5 9 l d b s a 时，表面张力曲线发生了明显的改变，但与s d s 表面张力等温线不 同未出现双拐点现象。在s d a d 浓度较低时( 2 5 m m o l l 一； c s o a o i 3m m o l l 1 ) ，牛血清蛋白的z e t a 位会急剧下降，直到达到一个相对稳 定的值，这可能是由于表面活性剂的结合导致了蛋白质的结构发生了改变，而吸 附了更多的表面活性剂导致的。而此时对应的表面活性剂的浓度约为b s a 存在下 表面活性剂的c m c 值( 对于s d s ，约为9 0 m m o l l ；对于s d a d 约为3 0 m m o l l 一) ， 而相关文献也报道了这种现象【3 4 3 5 1 。 3 3 3 小结 b s a 的z e t a 电位随两种表面活性剂的浓度升高而下降，说明两种表面活性剂 都通过疏水作用结合在蛋白质上，造成了蛋白质z e t a 电位的下降，当表面活性剂 的浓度接近c m c 时，b s a 的z e t a 电位趋于稳定，说明表面活性剂在蛋白质上的结 合接近饱和。 4 本节结论 ( 1 ) 表面张力方法和电导率方法都证明在b s a 存在下，两种表面活性剂的 e m c 值都增大。这表明两种表面活性剂都结合在了b s a 上。在b s a 存在下，s d s 的电导率曲线在浓度较低时上升较缓，表面张力曲线出现双拐点，而s d a d 没有 出现上述特征，说明两种表面活性剂与蛋白质的结合作用力在不同的阶段是不同 的。 ( 2 ) 两种不同表面活性剂在蛋白质上的吸附量分别为：每克b s a 结合 s d s l 4 1 9 ，s d a d l 1 8 9 。 ( 3 ) z e t a 电位结果表明，b s a 的z e t a 电位随着两种表面活性剂浓度的增加而 降低，证明b s a 结合了表面活性剂。 山东人学博i j 学位论文 第四节表面活性剂与b s a 的相互作用对b s a 结构的影响 1 理论基础 1 1 荧光光谱法 荧光光谱技术在表面活性剂与蛋白质相互作用研究中的应用已经有大量报 道【3 伽】。通过荧光光谱不仅可以测量胶束的聚集数，体系的微极性和微粘度，还 可以研究表面活性剂与蛋白质的结合常数等。常见的方法有内源荧光、外源荧光 和非辐射能量转移等。 蛋白质分子中的t r p 、t y r 和p h e 残基能够吸收2 7 0 3 0 0n n l 的紫外光而发 出紫外荧光。t r p 、t y r 和p h e 由于其侧链生色基团不同而产生不同的荧光光谱， 其荧光峰( k 戤) 分别位于3 4 8 、3 0 3 和2 8 2 眦，其中，t r p 的荧光强度最大， p h e 的荧光强度最小。因此蛋白质的内源荧光主要是由t r p 和t y r 残基所发射。 当蛋白质溶液中加入表面活性剂时，表面活性剂与蛋白质之间的相互作用会导致 蛋白质荧光的猝灭，利用此猝灭现象可以确定蛋白质的荧光猝灭机理以及它们的 结合常数等。荧光淬灭作为一个揭示蛋白质荧光基团接近淬灭物质机理的有力方 法被广泛应用。荧光淬灭有静态淬灭和动态淬灭两个过程。二者都需要蛋白质荧 光基团与淬灭物质的分子接触。 动态和静态淬灭都可以用s t e m v o l m e r 方程描述： 凡l f = 1 蜗v q 】 ( 2 3 ) f o 、f 分别为淬灭物质存在或不存在时蛋白质的荧光强度。【q 为淬灭物质的 浓度；k s v 为s t e m v o l m e r 淬灭常数，珞 ，= k q z o ，岛是双分子淬灭常数，勖是没有淬 灭物质存在时荧光团的寿命。虽然动态和静态淬灭过程都可以用s t e m - v o l m e r 描 述，只有测定了荧光寿命才能判断发生了哪个过程。由于动态淬灭是一个激发态 减少的速度过程，淬灭剂存在( f ) 或不存在( 下o ) 情况下的荧光寿命可以由下 式给出： 【o r = l + k q l ：o q ( 2 4 ) 这个方程阐明了动态淬灭的一个重要特征，荧光强度与荧光寿命下降的值是 相等的。这种荧光寿命的降低没有发生在静态淬灭过程。 5 2 山东大学博：学位论文 在动态和静态淬灭同时存在的情况下，一个更加完善的淬灭数据处理被提了 出来，通过包含一个附加的静态淬灭指数项。因此， 民- 伊e x p ( q 】) = l + j 毽v 【q 】- 1 + k q x o q - 可o t ( 2 5 ) 静态淬灭通过一个参数v 表现出来，通常导致静态淬灭数据曲率的上升。方 程2 5 概括了方程2 3 和2 - 4 ，包含静态淬灭指数项。 蛋白质表面活性剂复合物的形成是一个单体蛋白质与有一定范围的具有不 同表面活性剂结合数的化合物的多重平衡的例子。这些平衡可以通过一系列的平 衡表现出来，这里p 代表蛋白质，s 代表表面活性剂。 p + shp s p s + s 专p s 2 p s 卜j + shp s i 假定理想状态，对于一个n 步的平衡，可以写为： 蜀飓k 3 焉= i f s 胛】 p 】【s 】玎 ( 2 - 6 ) 如果平衡常数都相同，即k l = k 2 = k 3 = 一局= k ，彩么 局= p s 打 p 】【s 】一 ( 2 - 7 ) 每个蛋白质分子结合表面活性剂分子的平均数( ) 可以通过结合的表面 活性剂浓度除以全部的蛋白质的浓度计算出来。 = 匹fl i p s 】一) ：( 1 + 口s 】打) ( 2 - 8 ) 通过方程2 8 ，可以得出 = 刀 p s 玎】( p 】+ p s 一】) = 咒( 研s 】) n ( 1 + ( 研s 】) 勺 ( 2 - 9 ) 由于平衡常数不可能相等，通常来说，方程2 8 是正确的，因为，一个表面 活性剂分子的结合肯定影响到第二个表面活性剂分子的结合。结合位点之间协调 性的变化程度使k 不一样，与方程2 9 假设的不同。考虑到这个因素，可以用一个 h i l l 转换，下式。 邗( 盟s 】) 棚( 1 + ( 研s 】) 一h ) ( 2 1 0 ) n h 是协调系数，k 是一个内在的结合常数。 一个可供选择结合方法是s c a t c h a r d 方程。 = n k i s ( 1 嘲s 】) ( 2 - 11 ) 这个方程在n h = 1 的情况下，与h i l l 方程是一样的。方程2 1 1 可以写作 【s 5 3 山东人学博一i j 学位论文 = k ( n ) 。不存在协同作用时， s 】对 作图是一条直线。存在协同作用 下， s 与 之间的线性关系可以观察到重大的偏离。 普通的描述表面活性剂在固液界面吸附的等温线方程也值得一提。这个等温 线方程是在假设的条件下得到的，吸附过程由两步组成：第一步，表面活性剂吸 附到固体表面；第二步，吸附的表面活性剂与半胶束的形成发生疏水相互作用。 从导致结合方程式形成的普通的等温线可以得到两种情况： r 二毛 s 】 = 旦一 ( 2 1 2 ) l1 + k i s f 研s 】” 一= = 一 l1 + 研s 】” ( 2 1 3 ) r 与l 为给定的表面活性剂的浓度为【s 】时和的饱和时的表面活性剂的吸附 量。n g 半胶束中的单体的数目。这种等温线的一个有吸引力的地方是，可以非 常好的描述s 与l s 型等温线，经常地因为表面活性剂与固液界面相互作用形成。 除此之外，对于一个结合在单位上的简单平衡，l a n g m u i r 等温线可以通过大量作 用的简单规律得到。 a a m 舣= k s ( 1 坶s 】) ( 2 - 1 4 ) a 是一个测量位占有的参数。这个等温线与方程1 0 ，n = l 时，完全相同。 当然，对于蛋白质的研究不仅可以利用其内源荧光，而且可以通过外源荧光 性质研究获得更多关于蛋白质分子的信息。对蛋白质表面活性剂体系而言，最 常用的荧光探针有芘( p y ) 、1 苯胺基萘8 萘磺酸( a n s ) 、2 对甲苯胺基萘6 磺酸( t n s ) 、1 一( n 二甲基胺) 萘5 磺酸( d n s ) 等，这些荧光探针在水溶液 中的量子产率很低，但在非极性溶剂中，其量子产率明显增大，且荧光峰蓝移。 本论文主要采用蛋白质内源荧光的淬灭研究蛋白质与表面活性剂的相互作用。 1 2c d 光谱法 蛋白质在溶液中存在多种二级结构，如0 【螺旋、p 折叠、p 转角以及无规卷 曲等。加入表面活性剂后，由于表面活性剂与蛋白质的相互作用，往往会使蛋白 质的结构发生些变化，如折叠以及去折叠等。通常圆二色( c i r c u l a rd i c h r o i s m c d ) 光谱法可用于研究表面活性剂诱导蛋白质二级结构的变化。 山东大学博l j 学位论文 蛋白质的c d 光谱一般分为两个波长范围，1 7 8 2 5 01 1 1 1 1 为远紫外区c d 光谱， 2 5 0 - 3 2 0 n m 为近紫外区c d 光谱。远紫外区是肽键的吸收峰范围，反映了主链构 象。在远紫外区，一般天然蛋白质的c d 光谱包含一个正峰( 在1 9 0a m 波长左右) 和一个负槽( 在2 0 5 2 3 5u r n 波长范围) ，其中，负槽的形状与主链构象密切相关， 0 t 螺旋给出2 0 9 和2 2 21 1 1 1 1 左右的两个负槽，称为双槽曲线；b 折叠给出2 1 5 n m 左右 的负剧4 4 1 。近紫外区主要与侧链生色团有关，近紫外c d 光谱可灵敏地反映出芳 香氨基酸残基以及二硫键的微环境变化。 1 9 6 9 年g r e e n f i e l d 用圆二色光谱数据估计了蛋白质二级结构后【4 5 1 ，有关c d 光谱研究蛋白质结构的报道增多m 8 1 。 圆二色现象是由光学活性物质对左右圆偏振光的吸光率之差引起的。当一束 平面偏振光通过具有手性的介质时，由于该介质对左右旋圆偏振光的折射率不 同，使得它们通过介质的速率也不同，因此叠加产生的平面偏振光的偏振方向将 会改变，产生旋光性；同时，由于手性介质对左右旋圆偏振光的摩尔吸光率 ( l ( ”，e d 0 0 ) 不同，产生一个差值a s ( x ) - l ( 柚吒dq ) ，使得左右旋圆倔振光通过介 质后的振幅也将不同，这样两者叠加而形成椭圆偏振光。圆二色也常用摩尔椭圆 率【e ( 九) 】( 单位为d e g c m 2 d m o l 。1 ) 来表示，【0 ( 九) 】与( 九) 存在以下换算关系【4 9 】， 0 = 4 5 0 0 n 。l o g e l0 a e ( 2 - 15 ) 一般手性物质的圆二色性与波长有关，如果对手性物质按照一定的波长扫 描，便得到其c d 光谱图，从图谱上可以了解其分子及结构上的手性特性。 蛋白质或多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的、具有特定结构的生物大分 子，主要的光学活性生色基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键， 另外，有的蛋白质辅基对蛋白质的圆二色性也有影响。蛋白质一般有一级结构、 二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和四级结构几个结构层次，相同的氨 基酸序列，因蛋白质的折叠结构不同，影响了其光学活性生色基团的光学活性， 其圆二色性也有较大的差异。蛋白质的圆二色性主要由活性生色基团及折叠结构 两方面圆二色性的总和。根据电子跃迁能级能量的大小，蛋白质的c d 光谱分为 三个波长范围【5 0 】：( 1 ) 2 5 0 n m 以下的远紫外光谱区，圆二色性主要由肽键的n _ 兀 电子跃迁引起【5 1 】；( 2 ) 2 5 0 - - 3 0 0 n m 的近紫外光谱区，主要由侧链芳香基团的7 【一兀+ 电子跃迁引起；( 3 ) 3 0 0 - - 7 0 0 n m 的紫外可见光光谱区，主要由蛋白质辅基等 山东人学博l ：学位论文 外在生色基团引起。蛋白质的c d 光谱已经应用于预测蛋白质的折叠结构等。相 应于蛋白质c d 产生的机理，远紫外c d 主要应用于蛋白质二级结构的解析，近紫 p c d 主要揭示蛋白质的三级结构信息，紫外可见光c d 主要用于辅基的偶合分 析。 远紫外区c d 光谱主要反映肽键的n - 色性。在蛋白质或多肽的规则二级结 构中，肽键是高度有规律排列的，其排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情 况。具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生c d 谱带的位置、吸收的强弱都不 相同。因此，根据所测得蛋白质或多肽的远紫外c d 谱，能反映出蛋白质或多肽 链二级结构的信息，从而揭示蛋白质或多肽的二级结构。 单一波长常用于测定蛋白质或多肽由动力学或热力学引起的二级结构的变 化。0 【螺旋结构在2 0 8 n m 及2 2 2 n m 有特征吸收峰，可以利用这两处的摩尔椭圆度 【0 】2 0 8 或【0 】2 2 2 来简单估计a 螺旋的含量【5 2 】。 1 3 动态光散射 任何均相或多相液态体系的散射粒子都存在着热运动，因此真正的弹性光散 射是不存在的。由于散射粒子的热运动而使散射光产生d o p p l e r 频移，d o p p l e r 频 移分布范围较窄，故称为准弹性散射。另外，由于d o p p l e r 频移和散射粒子的热 运动直接相关，所以通过测定准弹性光散射的频谱就可了解散射粒子的动态性 质。由于激光技术及计算机技术的发展和应用，就能计算出散射光电场强度的自 相关函数，从而使得使用光散射法观测散射粒子的动态性质成为可能。通过准弹 性光散射的测量，可方便地求出溶质分子或粒子的扩散系数、流体力学半径等动 态力学参数，而且通过处理，还可以计算出体系的粒度分布和分子量分布等静态 方面的重要参数。因此，动态光散射技术是研究高聚物溶液及胶体和粗分散体系 的一种有效方法【5 3 1 。 散射光的检出装置由二微孔装置( 直径r l 和1 2 ，间距为d ) 和光电倍增管组成， 如图4 4 所示。通常，测量的粒子越小，取样时间则越短；考察的散射角越大， 取样时间也越短。测定时，须把样品置于干净和薄壁的样品管中，当激光束通过 样品时，要求溶液中的光束界面清晰且没有辉光出现。散射光的强度正比于n m 2 ， 其中，n 为粒子的数目，m 则正比于粒子的体积，因此粒子较大时要求浓度较稀， 例如直径为0 1 9 m 的胶粒，浓度一般选择2 0 g m l 一以下。当粒子的尺寸大于波长 5 6 山东大学博七学位论文 时，在大散射角区测定粒子的干涉需要较高的浓度，而浓度过高时，大粒子间的 相互作用不可忽略。 图2 1 5 散射光检出装置示意图 在动态光散射中，测定了强度一强度自相关系数g 2 ( t ) ，它通过s i e g e r t 关联与 规格电场自相关函数g l ( t ) 联系起来。参数g k t ) 可以写为弛豫率f ( f = t - 1 ，这里 t 是弛豫时间) 分布的拉普拉斯转换。弛豫率与相互扩散系数d m 有关： d m = w ( q o ) ( 2 - 1 6 ) q = 4 m s i n ( 0 2 ) ，n s 为溶液折射率，为真空中发射光波长，0 为散射角。 在无限冲淡溶液中的散射系数，d o 可以用下式表达： d m ( c ) = d o ( 1 + 肠c ) 0 _ o ) ( 2 1 7 ) c 是粒子浓度，k d 是一个常数。d o 通过s t o k e s e i n s t e i n 方程与水动力学半径 凰联系起来。 d o - 器 沼 是b o l t z m a n n 常数，t 是绝对温度， 1 是溶剂的粘度。 动态光散射的测量样品没有经过渗析，动态光散射的测量都是在b s a 浓度 很低，( 1 0 。5 m ) 的状态下，在这种状态下k c 1 ，也就说非相互作用粒子，此时 d o d m 。 由于水动力学半径表现对散射角没有依赖性，所以测量只选择一个角，也就 是9 0 0 s 4 】。 1 4 负染色透射电镜 5 7 山东人学博十学位论文 负染色技术也叫阴性反差染色，该技术具有分辨率高、简单易行和快速方便 等优点，在生物学研究中广泛应用。这种方法可以显示大分子、细菌、病毒、原 生动物、分离的细胞器及蛋白质晶体等样品的形状、大小和表面结构特征。尤其 是在病毒学领域，有关病毒的分类及病毒亚单位结构的显示、病毒与抗体的相互 作用等的研究中，负染色更是不可缺少的实验技术1 5 5 1 。但在研究蛋白质与表面 活性剂相互作用的工作中尚未有报道使用此技术。作者所在的课题组长期使用负 染色电镜方法研究囊泡结构1 s 6 4 8 ，技术相对成熟，本论文尝试使用负染色电镜 技术研究了不同浓度表面活性剂存在下蛋白质结构的变化，取得了较好的效果。 2 实验部分 2 1 实验药品 蔗糖葡萄糖6 羧酸钠果糖6 羧酸钠1 ( n 十二烷基甲酰胺) 由德国h h o f f m m a n 赠送，使用前未经处理；s d s 购自s i g m a 公司；牛血清蛋白( b s a ， f r a c t i o nv ) 购自r o c h e 公司；实验用水为三次蒸馏水。 2 2 实验仪器 e o l ，sj e m1 0 0 c x 型透射电子显微镜( t e m ，日本) ；h i t a c h if - 4 5 0 0 荧 光光度计( 日本) ；j a s c oj - 8 1 0 圆二色光谱仪( 日本) ：激光光散射仪( 美国 b r o o k h a v e n 实验室制作对应相关器为b i 9 0 0 0 a t ) 。 2 3 实验方法 2 3 1 溶液配制 b s a 溶液配制同第一节。 b s a 表面活性剂混合体系配制：先取定量的配制好的b s a 溶液于一系列的 1 0 m e 的试管中，然后根据计算结果，加入不同体积的表面活性剂溶液，用三次 水定容，配制一系列不同浓度的表面活性剂溶液，摇匀后待用。溶液配制于每次 测试之前。 2 3 2 荧光测定 于1 0m l 比色管中加入一定量的蛋白质或蛋白质表面活性剂溶液，用三次 蒸馏水定容摇匀后，固定激发波长为2 8 0n n l ，在2 9 0 4 5 0n m 扫描蛋白质或蛋 5 8 山东人学博 ：学位论文 白质表面活性剂体系的荧光光谱图。 2 3 3c d 光谱测定 于1 0m l 比色管中加入一定量的蛋白质或蛋白质表面活性剂溶液，用三次 水定容摇匀后，在圆二色光谱仪上测定其光谱曲线。远紫外c d 光谱采用0 1m m 的圆形石英池，带宽2r l i i l ；而近紫外c d 光谱则采用1 0m m 的圆形石英池，带 宽la m 。用c d 的方法计算二级结构的基本原理是将蛋白质中四种主要的二级 结构( 仅螺旋、卢折叠、户转角和无规蜷曲) 含量之和定为1 0 0 ，进而用不同 的计算公式和拟合方法求出各种二级结构的含量。本章通过仪器自带的 s e c o l l d a r ys t r u c t u r e 软件计算了不同条件下弘螺旋、卢折叠和无规蜷曲的含量。 2 3 4 动态光散射( d l s ) 的测定 激光器是采用最大功率为1 0 0 毫瓦，波长为4 8 8 m 的激光光源，在本文的实 验中，激光光源的功率被设定在最大值为1 0 0 毫瓦，光圈的狭缝设置在1 0 0 r u n 处。将待测样品移至用丙酮蒸气清洗过的玻璃瓶中，光散射结果所得的一次相关 函数g ( 1 ( 下) 采用c o n t i n t 5 9 - 6 1 1 软件进行分析，最后获得的动态光散射结果，并给 出f g ( r ) 与水动力学半径风的关系图，从而可以推断颗粒( 聚集体) 在溶液 中的尺寸分布信息，本文用该方法得到了蛋白质颗粒的水动力学半径凰。 2 3 5 负染色透射电镜实验 将一滴待测溶液滴于铜网上( 直径3 0 2 m m ，2 0 0 目) ，用吸水纸吸干多余溶 液，用磷钨酸进行染色l m i n ，然后在j e o u s 厄m1 0 0 c x i i 型透射电镜下观察， 操作电压为1 0 0 k v 。 3 结果与讨论 3 1 表面活性剂蛋白质混合体系荧光光谱 3 1 1s d s b s a 混合体系的荧光光谱 从图2 1 6 可以看出，加入表面活性剂s d s 会导致蛋白质的荧光强度降低， 同时伴随着蛋白质荧光峰发生蓝移，到表面活性剂浓度达到2 m m 时，蛋白质荧 光峰从3 4 8 n m 左右变化到3 2 6 n m 左右，这表示蛋白质的t r p 残基暴露在更加疏 水的环境中。这种蓝移主要因为s d s b s a 复合物的形成。s d s 浓度大于2 m m 山东人学博j j 学位论文 后，随着表面活性剂的浓度的提高，蛋白质的荧光强度继续降低，但荧光峰维持 在3 2 6 n m 左右，这说明表面活性剂继续吸附在蛋白质上，导致蛋白质t r p 残基 荧光的淬灭，引起了蛋白质的部分变性。当加入的表面活性剂的浓度大于6 m m 左右时，蛋白质的荧光强度趋于稳定，这说明蛋白质吸附表面活性剂的量逐渐达 到饱和。 k i n t o ) 图2 1 6s d s b s a ( 0 5 9 l 1 ) 混合体系荧光光谱 为更好说明蛋白质荧光强度随加入的表面活性剂的浓度的变化趋势，我们利 用i i o 与加入的表面活性剂的浓度作图，结果见图2 1 7 。i 为未加入表面活性剂 时蛋白质的荧光强度，i o 为加入表面活性剂以后蛋白质的荧光强度。 c m ( r a m ) 图2 1 7i i o 随s d s 浓度变化曲线 从图2 1 7 发现，i i o 随s d s 的浓度变化曲线与蛋白质存在下s d s 表面张力 山东人学博， ：学位论文 变化等温线( 图2 9 ) 存在一定的相似性。该曲线在表面活性剂浓度为2 0 r a m 附 近出现一个平台，说明在此浓度附近蛋白质荧光强度变化不大，表现在图2 1 6 中应该在此位置光谱曲线比较密集( 为使图2 1 6 更加清晰，我们忽略了一些数 据) 。我们认为此时的荧光应该是蛋白质表面活性剂复合物的荧光光谱。当表面 活性剂浓度大于6 0 m m 后，蛋白质的荧光强度趋于稳定，我们认为此时的荧光 是完全变性的蛋白质的荧光光谱。 通过荧光实验，我们可以得出结论，s d s 的存在使蛋白质内部的t r p 残基暴 露在更加疏水的环境中，并且导致了其荧光淬灭。这种情况是由于蛋白质