（动物学专业论文）光合细菌的培养与应用.pdf

中文摘要本文采用新研制的光生物反应器对光合细菌进行了生产动力学和生产生长的研究，并对光合细菌在重金属离子处理和抗疲劳作用方面进行了研究。主要研究结果如下：1 、分别采用4 0 l 光生物反应器、1 0 l 光生物反应器和1 0 l 发酵罐3 种方式对光合细菌进行了通气培养，测定了3 种培养方式下光合细菌的生长曲线并比较了三者之间的差异；研究了通气量和盐度对光合细菌生长速率的影响。4 0 l 与1 0 l 新式光生物反应器和1 0 l 发酵罐中光合细菌的生长速率无明显的差别，表明新式光生物反应器在原来1 0 l 的基础上不用作参数和比例的更改即可进行进一步的放大；为这种新式光生物反应器的中试和产业化应用提供了实验依据。该种新式光生物反应器与发酵罐相比，在相同培养条件下，达到光合细菌最大生长密度和最大产量所耗费的成本将大大降低，从而为光合细菌的产业化生产提供可能性，进而为光合细菌的大规模生产提供广阔的前景。2 、用褐藻酸钠固定光合细菌，通过正交实验确定了褐藻酸钠和c a c l 2 的最佳浓度依次为2 5 、4 ；初步探讨了固定化光合细菌对n i 2 + 和p b 2 + 的生物吸附规律，固定化的光合细菌对p b 2 + 、n i 2 + 的吸附是一个快速过程，在最初的5 、2 0 分钟内对n i 2 + 、p b 2 + 的吸附率分别达3 0 和4 0 ，在2 0 m i n 内即达到吸附平衡，为工业化处理重金属废水提供了理论依据。3 、对光合细菌的抗疲劳作用进行了研究。将小鼠按体重随机分为对照组和光合细菌高( 5m l k g b w ) 、中( 2 5m l k g b w ) 、低( 1 2 5m l k g b w ) 三个剂量组。小鼠每天灌喂5i i l l 样品，连续给样2 3 天，然后测定小鼠的负重游泳时间、血尿素氮含量、肝糖原含量和血乳酸含量。经单因素方差分析和t 检验，光合细菌能显著延长小鼠负重游泳时间，增加小鼠肝糖原含量，降低小鼠血尿素氮和血乳酸含量的作用。因而，光合细菌具有增强小鼠抗疲劳的作用。4 、以光合细菌为材料，进行了透射电镜观察，获得了清晰的细胞超微结构图像。关键词：光合细菌；光生物反应器；固定化；吸附作用；抗疲劳；透射电镜a b s t r a c tp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i aw e r es t u d i e df r o mf o l l o w i n gf o u ra s p e c t s ：c o m p a r i s o no fs e v e r a lc u l t i v a t i o nm e t h o d sf o rp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ；a d s o r p t i o no fn i c k e li o na n dl e a di o nb yi m m o b i l i z e dp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ；t h ea n t i - f a t i g u ee f f e c to fp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i ai nm i c e ；o b s e r v a t i o no fp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i ab yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p i c p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i aw e r ec u l t i v a t e di nt h r e ec u l t u r es y s t e m s t h eg r o w t hr a t e so fp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i ai nt h et h r e ec u l t u r es y s t e m sw e l ea l m o s ts a m e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg l a s sb i o r e a c t o rm a yf u r t h e rm a g n i f y t h e r ew a sn od i f f e r e n c ei nt h em a x i m a lc e l ld e n s i t yo fp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i ac u l t i v a t e db e t w e e nt e nl i t e rf e r m e n t o ra n di nio l ，4 0 lg l a s sp h o t o - b i o r e a c t o ru n d e rt h es a m ec o n d i t i o n s s oi tw o u l dh a v eag r e a tp o t e n t i a lu s i n gp r o s p e c tf o ri n d u s t r yu t i l i z a t i o nd u et og r e a t l yr e d u c e dc o s t t h ee n t r a p p e dp r o c e s so fp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i aw a so p t i m i z e db yo r t h o g o n a lt e s to fc o n t e n to fa l g i n a t es o d i u ma n dc a l c i u mc h l o r i d ，a n dt h eo p t i m a lc o n t e n tw a s2 5 a n d4 t h ea d s o r p t i o no fn i c k e li o na n dl e a di o nb yi m m o b i l i z e dp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i aw a ss t u d i e d t h ec o n t e n to fn i c k e li o na n dl e a di o nw a sd e t e r m i n e db ya t o m i ca b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r y ( a a s ) a n a l y s i s i ts h o w e dt h a ta d s o r p t i v ep r o c e s sw a sr a p i da n dt h ea d s o r p t i v er a t eo fn i c k e li o na n dl e a di o nw a sa p p r o x i m a t e l y3 0a n d4 0p e r c e n tw i t h i n2 0m i n u t e s t h ea b s o r p t i v ee f f e c t so nn i c k e li o na n dl e a di o nw e r eo b v i o u sb yi m m o b i l i z e dp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a , w h i c hp r o v i d e dt h e o r e t i cb a s i sf o ri n d u s t r i a l i z e dt r e a t m e n to fw a s t e w a t e r t h ea n t i - f a t i g u ee f f e c to fp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i aw a se v a l u a t e di nt h i sp a p e r t h em i c ew e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ot h ec o n t r o lg r o u pa n dt h r e ee x p e r i m e n t a lg r o u p sa c c o r d i n gt ot h ed o s a g eo fp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i at a k e nb yt h em i c e a f t e re v e r ym o u s ew a sf e e dp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i ac o n t i n u o u s l yf o r2 3d a y s ，t h et i m eo fl o a d e ds w i m m i n g ，l e v e l so fg l y c o g e ni nl i v e ra n db l o o dl a c t i ca c i dw e r ed e t e r m i n e di nt h em i c e t h et i m eo fs w i m m i n gw a ss i g n i f i c a n t l yl o n g e r , t h ec o n t e n to fg l y c o g e ni nl i v e rw a sh i g h e r , a n dt h ec o n t e n to fb l o o du r e an i t r o g e na n db l o o dl a c t i ca c i dw a sl o w e ri np h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i aa d m i n i s t e r e dg r o u p st h a nt h ec o n t r o lg r o u p sb ys i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i ah a dt h ea n t i - f a t i g u ee f f e c t so b v i o u s l y 英文缩写p s bo db u nl a cd oc o da a s符号说明英文全称p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i ao p t i c a ld e n s i t yb l o o du r e an i t r o g e nl a c t i ca c i dd i s s o l v e do x y g e nc h e m i c a lo x y g e nd e m a n da t o m i ca b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r y中文名称光合细菌光密度血尿氮乳酸溶解氧化学需氧量原子吸收光谱鲁东大学学位论文原创性声明和使用授权说明学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：箍王莉日期：拊月i 否日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权鲁东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于保密口，在年解密后适用本授权书。不保密囹。( 请在以上相应方框内打“)作者签名：雄王、翻导师虢却寻日期：忡月用e 1日期：喝年厂月耶日鲁东大学硕士学位论文引言光合细菌( p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ，简称p s b ) 是一群能在厌氧光照或好氧黑暗条件f 利州有机物作供氧体兼碳源，进行不放氧光合作用的细菌，广泛分布于水田、湖沼、江河、海洋、活性污泥和土壤中，依据伯杰细菌罄定手册( 第九版) 可分为6 个类群，2 7 个属。不产氧光合作用的红螺苗目分为紫细菌( p u r p l eb a c t e r i a ) 、绿细菌( g r e e nb a c t e r i a ) 和同光杆菌属( h e l i o b a c t e r i a ) 、红色牛t 菌属( e r y b r o b a c t e r ) 。其中紫细菌中包含有红螺菌科( r h o d o 如i r i l l a c e a e ) 、着色菌科( c h r o m a t i a c e a e ) 、外硫红螺苗科( e c e o t h i o r h o d o s p i r a c e a e ) ，包含1 6 属4 9 种，其中在生产上有意义的红螺菌科包括红螺菌属、红假单胞菌属和红微茼属。p s b 均为革兰氏阴性细菌，一股为球型、卵形、杆形、弧形、螺旋形、环形、半环形丝形，也可随培养条件和生长阶段而改变，大部分单个存在，光合细菌的显微照片如图1 所示。y 一_ 图i 光合细苗的显微观察( i ，i i4 0 0 x ；j 1 1 ，i v1 0 0 0 x )f i glm i c r o s c o p o i co b s e r v a t i o no f p h o t 0 8 y n 山e t i cb a c t e r i a鲁东大学硕士学位论文p s b 的一般菌体组成及营养成分见表1 【2 】表1 光合细菌菌体的组成与小球藻等比较t a b l e 1c o m p o n e n t sc o m p a r i s o nb e t w e e np h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i aa n dc h l o r e l l a种类( 嵋g 。1 )粗蛋白粗脂肪可溶性糖粗纤维灰分v b lv b 2v b 6 v b l 2 烟酸叶酸生物素光合细菌6 5 1 57 1 82 0 3 12 7 84 2 81 25 052 11 2 53 06 5小球藻5 3 7 66 3l1 9 2 81 0 2 21 5 22 41 9 61 55 21 4 01 81 8 - 2 5大豆3 0 9 91 9 3 33 0 3 37 115 6 81 4 52 36 4 2 22 30 6p s b 含有较高的优良蛋白质，粗蛋白含量为6 5 4 5 ，含有1 7 种氨基酸而且消化率较高；粗脂肪约7 ；可溶性糖类约2 0 ；粗纤c 维约3 1 1 ；维生素b 1 2 含量是酵母的2 0 0 倍、小球藻的4 倍【2 l ，生物素含量也比较丰富；菌体的脂类成份含有大量的叶绿素、类胡萝卜素和辅酶q ( 泛醌) ，迄今已从p s b 中分离出8 0 种以上的类胡萝卜素。叶绿素和类胡萝卜素对养殖生物的健康生长，增强对疾病的抵抗力有很大的益处。辅酶q 是与生命活动有重大关系的生理活性物质，p s b 中的含量特高，是酵母的1 3 倍。以上特点决定了p s b 可做为畜禽、鱼虾的饲料，但p s b 中缺乏3 系列2 0 碳以上的高度不饱和脂肪酸，单独作为仔鱼的初期饵料时，需与其它富含高度不饱和脂肪酸的饵料同时使用。目前，在海参育苗过程中，由于集约化育苗的密度大，水温高，周期长、加上排泄物以及残饵的积累，往往造成微生物大量繁殖，溶解氧下降，p h 值、c o d 、氨氮上升，导致疾病频频发生，影响参苗的生长和发育，甚至造成幼参大量死亡，带来严重的经济损失。以前，主要通过采用换水和倒池两种方法解决这一问题，但是这两种方法造成的机械损伤和环境条件变化太大。在海参育苗过程中，它能改善水质，作生物饵料和提高动物免疫力，还具有成本低，无毒副作用，不污染生态环境等特点。因此，光合细菌的大规模培养，可以更好地为农业或水产养殖业服务。本文以光合细菌为材料，用一种新式的生物反应器对光合细菌进行培养并与其它反应器进行比较，优化光合细菌培养的生长条件，通过比较得出光合细菌在几种反应器培养时的生产效果和最高生产效率，探索进行大规模生产的可行性，为光合细菌的大规模培养提供新的方法。用褐藻酸钠固定光合细菌，通过正交实验确定了褐藻酸钠和c a c l 2的最佳浓度；初步探讨了固定化光合细菌对n i 2 + 和p b 2 + 的生物吸附规律，为工业化处理重金属废水提供了理论依据。将小鼠按体重随机分为对照组和光合细菌高、中、低三个剂量组，小鼠每天灌喂5 m l 样品，连续给样2 3 天，然后测定小鼠的负重游泳时间、血尿素氮含量、肝糖原含量和血乳酸含量等生理指标。通过单因素方差分析和t 检验，分析了光合细菌的抗疲劳作用，探讨光合细菌的应用。运用透射电镜技术，经过取材、漂2鲁东大学硕士学位论文洗、固定、漂洗、固定、漂洗、脱水、浸透与包埋、修块与定位、切片和染色后，对光合细菌的亚显微结构进行观察，与通气状态或者用钨灯照射培养的光合细菌对比，比较不同的培养方式对光合细菌形态结构的差异，以及色素体的变化，为光合细菌的进一步研究提供理论依据。3鲁东大学硕士学位论文第一章文献综述1 帚一早义陬琢尬1 光合细菌的培养概况国内外大量培养光合细菌的方式主要有两种，一种是全封闭式的厌气光照培养方式，另一种是开放式的微气光照培养方式。全封闭式的厌气光照培养是采用无色透光的玻璃容器或塑料膜袋，经消毒后，装入消毒好的培养液，接入2 0 - 5 0 的菌种母液，使整个容器均被充满液体，造成厌气的培养环境，置于有阳光的地方或用人工光源进行培养，定时进行人工搅动，在适宜的温度条件下，一般经几天的培养，即可达到指数生长高峰。开放式的微气光照培养方式，一般采用1 0 0 , - - 一2 0 0 l 塑料桶或5 0 0 l 卤虫孵化桶为培养容器，在底部装一气石，培养时微充气，使桶内光合细菌呈上下缓缓翻动。在桶上方距桶面3 0 e r a 左右装一有罩的白炽灯泡，在适宜的温度条件下，一般经5 , - - 一1 0 d 的培养，即可达到指数生长高峰1 3 4 】。水产养殖市场对p s b 活体菌的需求缺口很大，为了满足水产养殖对p s b 活体菌的需求，p s b 的生产方法有很多，但是到目前为止，产业化生产p s b 的还很少。冯云等 5 1用5 0 l 的塑料桶厌氧培养p s b ，使培养密度达到2 1 1 0 9d m l ；杨绍斌 6 1 在塑料大棚内建大小2 0 0 0 - 5 0 0 0 l 的水池使其厌氧发酵富集扩大培养，培养液中含p s b 活菌数可达5x1 0 6 个讪；鄂春宇【刀用塑料薄膜袋培养p s b ，培养密度达到2 5 - - 3 1 0 5 个m l ，2 个月生产5 0 多吨，但是在p s b 的密度检测时，很容易染菌。由中科院开发的p s b 的生产工艺，产品含菌量达到5x1 0 1 0 个面，保质期3 个月以上【8 】。1 1 菌种菌种可从采集的池塘底泥或海水中重复富集、分离纯化获得。若用保存下来的菌种，在培养前必须提纯复壮，才能有效地进行扩大培养阴。1 2 培养基及培养条件1 2 1 培养基p s b 培养中除碳、氮、磷等主要营养元素外，还需要一定量的镁、钙、钠和有关的微量元素，将所需的营养元素按一定的比例配成适于菌体生长繁殖的培养基。目前应用的光合细菌培养基有多种配方，但培养红螺菌常用的是酵母膏、蛋白胨培养基，用于红螺菌的富集、分离和培养。4鲁东大学硕士学位论文酵母膏、蛋白胨培养基的基本配方：c a c l 20 3g ，m g s o a - 7 h 2 0酵母膏3 og蛋白胨p h6 8蒸馏水如需制成固体培养基则需加o 8 的琼脂。1 2 2 培养条件培养温度2 5 - 3 0 cp h6 5 - - 7 50 5g3 0g1 0 0 0m l光照强度3 0 0 0 l u x - - 一5 0 0 0 l u x通气量3 3 0 l h ( 4 0 l 反应器) 9 0 l h ( 1 0 l 反应器)由于各种光合细菌所含细菌色素不同，它们对光的利用也不同。在供给光照的条件下，光合细菌的活性随着光照强度的增加而增加，光照强度不足会强烈抑制光合细菌的生长，而光照强度过高会导致光饱和效应。在高光照强度下，细胞色素吸收了超过光合作用所需要的光能，多余的光能会转化为热能从而导致微生物细胞的腐烂。因此，采用3 0 0 0 l u x - - - 5 0 0 0 l u x 的光照强度用于红螺菌的培养生长。1 3 光合细菌的培养培养光合细菌的主要容器是塑料桶、塑料袋、开放式大池和发酵罐等，用塑料桶对光合细菌进行厌气培养，光照强度较弱，小规模进行培养比较方便，但难以大规模进行生产。开放式大池对光合细菌进行培养，能够大规模培养光合细菌，但菌液的密度较低，生长较缓慢，不能进行连续生产。发酵罐培养的菌液密度较高，能连续生产，但设备比较复杂，生产成本太高。新式的光生物反应器对光合细菌进行微气培养，生产的菌液密度较高，成本较低，生长速度快，能够进行连续生产，因此，微气培养是光合细菌大规模培养的发展趋向。容器的灭菌方法主要有酒精消毒法，次氯酸方法和蒸汽高温灭菌法。塑料桶常用7 5 的酒精来消毒；发酵罐常用高温蒸汽来消毒；而次氯酸法主要用于大规模生产光合细菌的工艺中，每l 水体中加入l m l 次氯酸，消毒2 4 小时后，加入1 5 0 m g 硫代硫酸钠来中和。5鲁东大学硕士学位论文2 光合细菌的应用概况光合细菌作为一种微生物，不仅具有一般微生物的共性还具有其独特之处。p s b 含有较高的优良蛋白质，总蛋白含量达6 5 ，约7 ；可溶性糖类约2 0 ；粗纤维约3 ；含有1 7 种氨基酸而且消化率较高；总脂肪维生素b 1 2 含量是酵母的2 0 0 倍、小球藻的4 倍，生物素含量也比较丰富；菌体的脂类成份中还含有大量的叶绿素、类胡萝卜素和辅酶q ( 泛醌) ，迄今已从p s b 中分离出8 0 种以上的类胡萝卜素。叶绿素和类胡萝卜素对养殖生物的健康生长，增强对疾病的免疫力有很大的益处。辅酶q 是与生命活动有重大关系的生理活性物质，p s b 中的含量特别高。目前，海水养殖上主要用来净化水质；环保上用来处理废水；种植业上利用p s b 的固氮能力来提高土壤的氮素水平，促进有害物质的转化；新能源上可以用来生物制氢；污水处理上可以用来吸附重金属离子，医药保健上还可以起到抗疲劳作用。2 1 光合细菌在水产养殖中的应用目前国内外水产养殖方式以高密度集约化养殖为主，大量鱼虾贝等水产动物的排泄物及残饵积聚池底，使养殖水环境恶化，养殖动物的生长受到抑制。传统上采用换水来解决此类问题，但频繁换水不易保持水中最适生物区系，而且成本较高，不利于水产养殖的持续发展。现已普遍采用p s b 广泛用为海水、淡水鱼类、虾类和贝类等的养殖和育苗的饵料和水质净化和保持剂f 1 0 1 ，无论是成活率还是产量和质量上都有显著提高【儿】。p s b 菌体无毒，营养非常丰富( 见表1 ) 。p s b 是一类营养成分高且种类比较全的微生物，作为水产养殖生物的开口饵料和饵料添加剂，具有明显的增产效果f 1 2 1 。孵化后第二天的鲤鱼苗，只投给p s b 的冻结品和活菌饲育，2 周后体长增加了1 2 - 1 7 m m ，约为投喂干松鱼和面粉组的3 倍【1 3 】。p s b 能吸收利用有机质和水体中的氮磷等物质f l o 】，降解硫化物，减少水体污染物，减少有毒物质分解的机会。p s b 能够改善水产养殖体系的水质，提高溶氧。防治病害，提高产品的质量，生产无公害的绿色水产品，因此光合细菌在水产养殖中的应用越来越广泛。沈修俊在扣蟹养殖池中，每隔1 5 - 2 0 天以1 0 - 1 5 m l m 3 的量向池中泼洒p s b 水剂。这样极大的改善了水中的微生物的种群结构，改变池底的溶氧状况，降低池塘水质氨、氮的含量，保持水池的清新【1 4 1 。p s b 能够防治病害，主要采取预防为主防治结合的原则。传统的方法是通过向池塘中泼洒生石灰来消毒( 每1 5 - - 2 0 天一次) ，在饵料中要加拌土霉素进行预防【1 4 1 ，化学品容易残留在环境中，抗生素容易使病原菌产生抗药性。与化学药品和抗生素相比，p s b6鲁东大学硕士学位论文中含有q 和抗病毒物质，能提高动物的免疫力。2 2 光合细菌在废水处理中的应用，-p s b 能有效的去除废水中的有机物，氮、磷和硫化物，具有工艺简单，处理成本低，运行稳定，作为副产物的菌体还可综合利用等优点。现在，p s b 已成功应用于2 0 多种废水处理，少数已经进入工业化运转，大量的工作仍处于实验阶段的研究【1 5 1 。处理无毒有机废水中的菌体可作为一种天然色素的资源，淀粉废水经p s b 处理后c o d 去除率大于7 0 ，同时菌体可用于提取类胡萝卜素【1 6 1 ，红螺菌对废水中的c u 2 + ，p b 2 + ，n i 2 + 和c r a具有吸附作用【1 7 - 1 9 1 ，但固定化光合细菌对重金属离子吸附作用的研究还没有报道。2 3 光合细菌在种植业中的应用近年来，由于大量的无机肥料和化学农药的使用，造成土壤残留农药的毒害，土壤盐化、板结现象比较严重，土壤肥力趋于衰竭。p s b 被证明是一种优质的有机肥料，又能增强植物的抗病能力。首先，它能促进土壤物质的转化，改善土壤结构，提高土壤肥力，促进作物生长。p s b 大多具有固氮能力，能提高土壤的氮素水平，并促进有害物质的转化。此外，p s b 还具有抗细菌、抗病毒的物质，这些物质能钝化病原菌的致病能力，抑制病原体的生长，增强植物的抗病能力【2 们。p s b 既是一种优质的生物肥料，又能增强植物的抗病能力。光合细菌喷洒到苹果树、梨树和葡萄树上，不仅果实鲜艳，而且坐果率和产量大增，同时还提高了果实的糖分、维生素b 和维生素c 的含量【2 m 2 1 。光合细菌作为生物肥料使用可以提高番茄、黄瓜的产量，改善作物品质，提高作物叶绿素、v c的含量，降低蔬菜中亚硝酸盐的含量，延长作物的保存期2 3 埘】。2 4 光合细菌在畜养业中的应用p s b 可作为畜禽饲料的添加剂，不仅能够提高产品的产量，而且能够提高产品的质量【2 5 1 。p s b 可处理畜禽的粪尿，净化环境 2 1 。p s b 中的荚膜红假单胞细胞壁中含有的多糖类物质，是广谱的非特异性免疫激活剂，能提高畜禽血清中免疫球蛋白的含量，增强畜禽对外来病源侵扰的应答反应，起到防治病害的作用【2 6 】。2 5 光合细菌在新能源生产中的应用能源问题已成为全球性问题，世界各国都在研究开发新能源，氢作为一种理想而又无污染的新能源，日益受到关注。生物制氢是开发新能源的一个方向，许多p s b 在代谢过程中都能释放氢气，且具有产氢速率高、产氢纯度高等特点1 2 7 1 。p s b 只含有光合色素7”鲁东大学硕士学位论文系统i ，电子供体或氢供体是有机物或还原态硫化物，因此光合作用不产生0 2 ，故工艺简单。它可利用太阳能，降解转化有机物或有机污染物生产氢，且副产物可迸一步开发为诸如生物可降解塑料等高附加值产品，不会造成二次污染【2 引。2 6 光合细菌在色素和饵料方面的应用随着人们认识到合成色素对人具有致癌性，天然色素的开发已备受关注。p s b 菌体细胞含有丰富的菌绿素和类胡萝b 素，这两类色素无毒，容易提取，是天然色素的新资源，提取的色素可用于黄油、冰淇淋、干酪的着色及作为食品的添加剂等【1 6 1 。p s b 可以作为生物的开口饵料，广泛应用于水产养殖，也可以作为饲料添加剂来增强生物的抗病性。p s b 和微藻混合培养轮虫，轮虫增殖率明显高于藻类、酵母单独作为饵料培养轮虫的速度；p s b 还可提高卤虫卵的孵化率；用p s b 培养的水蚤、轮虫，其氨基酸、蛋白质的含量都明显提高【2 9 】。2 7 固定化光合细菌对几种金属离子吸附作用近年来大量的研究表明，一些微生物如细菌、霉菌、酵母、藻类等对重金属具有强的吸附能力【3 0 。4 1 。利用微生物吸附水中的重金属，由于其价廉、节能和去除效率高等优点而成为该领域的研究热点。但国内很少有关于红螺菌作为生物吸附剂吸附水中重金属的研究报道。黄富荣等 3 5 1 研究了红螺菌吸附c u 2 + 的影响因素，包括p h 值、时间、温度、初始c u 2 + 浓度、光强及供氧等，并用l a n g m u i r 吸附模型和f r c u n d l i e h 吸附模型描述了红螺菌对c u 2 + 的生物吸附行为 3 6 - 4 0 。12 7 1 细胞固定化的优点利用游离菌体吸附金属的特性，虽然可以从含金属的废水、废液中回收或去除贵、重金属【4 1 1 ，但用游离菌体作吸附剂存在许多缺点，例如颗粒小、机械强度低，菌体与排出水难以分离等。用固定化技术使菌体固定化，就可以克服上述缺点。与游离菌体比较，固定化细胞作为生物吸附剂还具有许多优点 4 2 - 4 3 ：( 1 ) 能在生物处理装置内维持高浓度的生物量，提高处理负荷；( 2 ) 污泥产量小；( 3 ) 固液相易分离；( 4 ) 可选择性地固定优势菌种，提高难降解有机物的降解效率；( 5 ) 抗毒物毒性强；( 6 ) 对水质及p h 值的变化有较好的稳定性；r鲁东大学硕士学位论文( 7 ) 延长吸附剂使用的期限，降低成本。固定化光合细菌组优于游离菌组，前者不受流水和换水的影响，在使用前可清洗，消除了培养基影响水质的问题。光合细菌被包埋载体固定化后，在微环境中占绝对优势，固定化光合细菌在水产养殖上具有十分广泛的应用前景。2 7 2 细胞固定化方法简介细胞固定化方式有多种多样，任何一种限制微生物细胞自由移动的方法都可用于制各固定化微生物吸附剂。一般可分成吸附法、结合法、交联法和包埋法等四大类【似5 1 。( 1 ) 吸附法吸附法可分为物理吸附和离子吸附法。前者是用具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附将细胞吸附到其表面上使之固定化。后者是在解离状态下因静电引力而固着于带有相异电荷的离子交换剂上，如d e a e 纤维素、d e a e s e h p a d e x 、c m 纤维素等。吸附法操作简单，反应条件温和，载体可以反复利用，但结合不牢固，细胞易脱落。( 2 ) 结合法结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。前者依靠离子键使菌体和载体结合而固定化，载体有d e a e 纤维素、t e a e 纤维素、d e a e s e h p a d e x 等，离子键结合法条件温和，操作简单，但结合力弱，菌体易脱落。后者是微生物细胞表面上的功能团与固相支持物表面的反应基团之间通过化学共价键而结合。用该方法制备的固定化细胞结合键牢固，不易脱落，稳定性良好，但反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻，细胞多死亡。( 3 ) 交联法通过双功能试剂将微生物细胞彼此发生交联作用，制成具有网状结构的固定化菌体。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。采用交联法制备的固定化细胞结合牢固，但颗粒小，使用不方便，通常将交联法和吸附法或包埋法结合使用，效果较好。( 4 ) 包埋法包埋法是将菌体细胞以物理的方法包埋在各种载体中，常用的载体有琼脂、海藻酸钠、卡拉胶、聚丙烯酰胺和明胶。该方法操作简单，固定化菌体机械强度高。受包埋剂价格的限制，包埋法仅限于实验室研究和小规模的应用。表2 总结了目前常用的包埋剂和包埋效果1 4 6 】。9鲁东大学硕士学位论文表2 各种包埋剂的包埋效果比较t a b l e2c o m p a r i s o no fd i f f e r e n te m b e d d i n gm e d i u m s2 8 光合细菌的抗疲劳作用日本成功研制了具有延缓衰老的作用的p s b 饮料，而且这种饮料还能有效防止心脏病、脑梗死、癌症等疾病的发生。国内，也已经研制出了多种富硒p s b 制剂，并申请了国家专利，通过试验表明，富硒p s b 制剂具有延缓衰老、抑制肿瘤、免疫调节等多种功效即- 4 9 1 。刘继彪等【5 0 】用p s b 菌液发酵中药，制成了口服液、冷冻干燥产品等中药制剂，该制剂能够纠正机体内环境微量元素平衡紊乱，促使癌细胞向正常细胞转化并最终全部恢复成正常细胞，对恶性肿瘤治疗有较显著的疗效，并申请了国家专利。2 8 1 抗疲劳作用研究概述疲劳( f a t i g u e ) 是一个涉及许多生理生化因素的综合性的生理过程，是人体脑力或体力活动到一定阶段时必然出现的一种正常的生理现象，它既标志着机体原有工作能力的暂时下降，又可能是机体发展到伤病状态的一个先兆。所谓抗疲劳，就是延缓疲劳的产生和( 或) 加速疲劳的消除。能延缓疲劳的产生和( 或) 加速疲劳消除的物质称抗疲劳活性物质( a n t i f a t i g u e a c t i v i t ys u b s t a n c e s ) 。机理明确、结构确定的抗疲劳活性物质包括有：糖、脂肪、蛋白质、氨基酸、b 族维生素、v c 、v e 和钙、磷、钾、钠、铁、硒、锌等【5 1 1 。光合细菌中含有1 7 种消化率较高的氨基酸、可溶性糖类、丰富的b 族维生素和矿物质，而且菌体的脂类成份含有大量的叶绿素、类胡萝b 素和辅酶q 。辅酶q 是与生命活动有重大关系的生理活性物质，具有抗衰老、增强机体免疫功能和提高机体耐力的作用，许多学者对光合细菌的抗氧化作用进行了报道【5 2 5 5 1 ，但是对光合细菌抗疲劳方面的研究还有待于进一步研究。长时间剧烈运动后，体内产生大量乳酸，过量的乳酸堆积是引起运动性疲劳的一个重要原因【5 6 - s 9 。小鼠经过长时间的运动，通过糖、脂肪分解代谢的能量不能满足机体的需要，蛋白质与氨基酸分解代谢就会加强，肌体血清尿素氮含量随运动负荷的增加而增加，血清尿素氮的增加就越明显。糖原是运动能量的重要来源，提高糖原储备量有助于1 0鲁东大学硕士学位论文提高耐力和运动能力，有利于抵抗疲劳的产生。2 8 2 抗疲劳作用研究方法抗疲劳作用研究的方法主要有测量体重、负重游泳、血尿氮含量、葡萄糖氧化酶、血乳酸和肝糖原含量变化等 6 0 - 6 1 】：l 、测量体重2 、负重游泳试验在最后一次给小鼠灌喂光合细菌3 0r a i n 后，置小鼠在游泳箱中游泳，水深3 0e r a ，水温( 3 0 士0 5 ) ，鼠尾根部负荷5 体重的铁皮( 我们采用玻璃珠) 。记录小鼠自游泳开始至头部全部沉入水中8s 不能浮出水面的时间作为小鼠游泳时间。3 、血尿氮法在加热和强酸条件下，尿素氮与二乙酰缩合成红色的联吖嗪称之f e a r o n 反应。根据色泽的深浅可以计算出尿素氮的含量，用波长5 2 0 n m ，l c m 光径玻璃比色皿，蒸馏水调零，测定各管o d 。4 、葡萄糖氧化酶法样本中的葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶的作用下，将4 氨基安替比林与酚偶联缩合可被分光光度计测定的醌类化合物。用波长5 0 0 n m 、比色杯光径1 0 c m ，以空白管调“零点，测定各管o d 。5 、血乳酸测定以n a d + 为供氢体，l d h 催化乳酸脱氢产生丙酮酸，n a d + 转化成n a d h 其中p m s递氢使n b t 还原为紫色呈色物，呈色物的吸光度在5 3 0 n m 时与乳酸含量呈线性关系，5 3 0 n m 、比色杯光径1 0 c m ，蒸馏水调零，测定各管o d 。6 、肝糖原测定糖原在浓硫酸的作用下可脱水生成糖醛衍生物，后者再与葸酮作用形成蓝色化合物，与同法处理的标准葡萄糖溶液比色定量。糖原在浓碱液中非常稳定，故在显色之前先将组织放入浓碱中加热以破坏其他成分而保留糖原。显色后于6 2 0 n m 波长，l c m 光径玻璃比色皿，蒸馏水调零，测定各管o d 。7 、数据统计处理方法实验数据用s p s s 统计软件包中的单因素方差分析进行各实验组问的比较，用t 检验进行各试验组与对照组的比较。鲁东大学硕士学位论文3 光合细菌的应用展望在生产实践方面，自2 0 世纪7 0 年代以来，日本、美国、德国、英国等广泛开展了光合细菌的研究开发，由于p s b 的安全无毒且其中的有效成分对超氧阴离子具有良好的猝灭活性，近年来人们还利用其特性开发具有免疫调节1 6 2 ，抗衰老，抗辐射等多种功能的医药、保健品【6 3 】。在理论研究方面，p s b 是实验模型的理想材料，瑞典生物学家h u b e r h m i c h e l 以光合细菌为材料，研究细菌细胞膜的光合作用反应中心三维结构而获得1 9 8 8 年的诺贝尔奖。我国学者张纯喜等利用光合细菌对光合作用的原初反应提出了新模型，并利用该模型对动力学和定点突变结果给予了解释。随着基因组计划的展开及现代生物技术的快速发展，以p s b 为模型，对生物光合作用机理、光合作用反应中心的结构、生物固氮机理及生物的进化与起源等的解释可能有较大应用前景。1 2鲁东大学硕士学位论文第二章光合细菌几种培养方法的比较 。j -刖罱国内外大量培养光合细菌的方式主要有两种，一种是全封闭式的厌气光照培养方式，另一种是开放式的微气光照培养方式。培养光合细菌的主要容器有塑料桶、塑料袋、开放式大池和发酵罐等，用塑料桶对光合细菌进行厌气培养，光照强度较弱，小规模进行培养比较方便，但难以大规模进行生产。开放式大池对光合细菌进行培养，能够大规模培养光合细菌，但菌液的密度较低，生长较缓慢，不能进行连续生产。发酵罐培养的菌液密度较高，能连续生产，但设备比较复杂，生产成本太高。本章通过用不同的反应器对光合细菌进行培养并进行比较，研究了光生物反应器对光合细菌大规模培养的可行性，并研究了在该反应器中不同的通气量、盐度对光合细菌生长的影响。1 材料与方法1 1 材料光合细菌( 红螺菌) 由鲁东大学生命科学学院藻类生物技术研究室提供。1 2 仪器设备4 0 l 光生物反应器：8 0 c m x l 0c m x 5 5 c m ，采用8 m m 厚的玻璃；1 0 l 光生物反应器：5 0 e m x 5e m x 3 9 e m ，采用4 m m 厚的玻璃；1 0 l 发酵罐：镇江东方生工有限公司制造；v s 8 4 0 k 型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；u v - 2 0 0 0 型紫外可见分光光度计，尤尼柯( 上海) 仪器有限公司；1 0 1 a 1 e 电热鼓风干燥箱，上海安亭电子仪器厂；d z x - 3 5 座式自动电热蒸汽压力灭菌器( b 型系列) ，上海富汇机械配件有限公司；f c 2 0 4 型电子天平，上海精科天平厂；t g l 1 6 c 台式离心机，上海安亭科学仪器厂制造；a c o 0 0 8 a 电流式空气泵，广东日生集团有限公司；1 3 培养方法1 3鲁东大学硕士学位论文1 3 1 反应器的消毒光生物反应器采用次氯酸法：将光生物反应器清洗干净后装满水，放入通气管，用保鲜膜封口，加入次氯酸，每l 水体中加入l m l 次氯酸，杀菌2 4h ，加入1 5 0 m g 硫代硫酸钠来中和。发酵罐采用高温蒸汽灭菌：10 l 发酵罐先空罐灭菌3 0 r a i n ，然后加入培养基后在位实罐灭菌3 0 m i n 。1 3 2 培养基的配制采用酵母膏、蛋白胨培养基：酵母膏3g l ，蛋白胨3g l ，m g s 0 4 7h 2 0o 5g l ，c a c l 2 2 h 2 0o 3g l ，蒸馏水1 l ，p h6 8 。称量培养基中的各种物质，逐一溶解，混合，配成培养基。然后放在高温灭菌锅灭菌，1 2 1 ，3 0 r a i n 。1 3 3 接种计算好光生物反应器中放出水的体积，将已灭菌的培养基加入到反应器中，接种，接种量2 5 ，使各反应器中的接种密度相同。1 3 4 培养光合细菌培养过程中严格控制各种参数，加强日常管理，及时进行生长情况的观察。培养条件为：温度( 2 8 士1 ) ，p n7 0 - 7 5 ，光照强度3 0 0 0 l u x 。1 4 测量分析通过测定培养物的o d 值监测光合细菌的生长状况。用分光光度计在6 5 0n n l 处测量o d ，每天测量两次；用p h 计来测量培养液的p n ：用光强计来测量光强。2 实验结果2 1 不同反应器中光合细菌的生长状况的比较。图2 表明，在相同时间、相同接种量和相同通气量下，1 0 l 与4 0 l 的光生物反应器中光合细菌的生长速率无明显的差别。随反应器宽度增加，光的强度会减少，但对光合细菌的生长速度影响略微下降，进而说明反应器在一定范围内可进一步放大。但是随着反应器的放大，光照会减弱，搅拌不充分，营养的吸收变弱，对光合细菌的生长有影响。1 4鲁东大学硕士学位论文32 521 51o 50- 一4 0 l 反应器- - - - a - - - - i o l 反应器入f 夕弋心奎7一io |扩盈i051 01 5t d图2 不同的体积的光生物反应器对光合细菌生长速率的影响f i g 2e f f e c to fd i f f e r e n tv o l u m ep h o t o - b i o r e a c t o ro np h o t o s y n t h e t i cb a c t e d ag r o w t h在相同培养条件下，1 0 l 玻璃光照发酵罐与4 0 l 光生物反应器相比，生长速率相差不大( 见图3 ) 。发酵罐的价格非常昂贵，放大困难，需要的动力费用也比较高；而新式光生物反应器的成本非常低廉，操作简便，培养密度高达1 o x l 0 1 0 个枷，达到最大密度耗费的成本大大降低，从而为采用新式光生物反应器进行光合细菌的产业化生产提供了可能。32 5笛2皇曼1 5o自1o1o 5o_ j 麓多一j | dio2345t d图3 不同种类的反应器对光合细菌生长速率的影响f i g 3e f f e c to fd i f f e r e n tr e a c t o r so np h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i ag r o w t h1 5鲁东大学硕士学位论文2 2 不同通气量对光合细菌生长的影响在4 0 l 的反应器中，采用3 种不同的通气量对光合细菌进行培养，结果见图4