（内科学专业论文）原发性肝癌血清蛋白质谱图人工神经网络诊断模型研究.pdf

原发性肝癌血清蛋白质谱图人工神经网络诊断模型研究 摘要 目的：原发性肝癌是由肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌肿，是我国常 见的恶性肿瘤之一，其死亡率在消化系统肿瘤中列第三位，仅次于胃癌和 食道癌，临床上以肝细胞癌( h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ，h c c ) 最为多见。 肝细胞癌是世界上最常见恶性肿瘤之一，总的5 年生存率低于5 。目前 h c c 发病率在我国呈日渐上升趋势，造成其高病死率的主要原因是目前尚 缺乏特异性高的早期诊断方法，由于h c c 病人早期常无症状，发现时已属 中、晚期，丧失了治疗的最佳时机。因此，迫切需要探索一种快速、简单、 灵敏度高、特异性好的早期诊断方法。在众多的检测手段中，表面增强激 光解析电离飞行时间质谱技术( s u r f a c ee n h a l l c e dl a s e rd e s o 印t i o ni o n i z a t i o n t i m eo f n i g h tm a s ss p e c t r o m e 时，s e l d i t o f m s ) 无疑是当今报道最前沿、 最热门、检测敏感度和特异度最高的技术。任何疾病在出现病理变化之前， 细胞内的蛋白质在成分和数量上都会有相应改变，并通过血清中的蛋白质 模式反映出来。因此，通过比较不同疾病人群血清中差异蛋白质的表达， 可能筛选出肿瘤相关的标志分子。本研究采用差异蛋白组学的方法，利用 s e l d i t o f m s 技术检测乙肝、肝硬化、原发性肝癌患者、其他消化系统 肿瘤与健康人血清蛋白指纹图谱，并筛选原发性肝癌患者特异表达的血清 蛋白标志物，结合人工神经网络技术( 叭i f i c i a ln e u r a ln 咖o r k ，a 1 蝌) 建立 预测模型，探索其用于原发性肝癌实验诊断的临床价值，以建立早期有效 检测原发性肝癌的客观实验指标。方法：利用s e l d i t o f m s 技术及其配 套的金芯片( g o l dc h i p ) 检测4 3 5 份血清标本得到相应的蛋白指纹图谱， 经b i o m a r k e rw i z 莉分析软件找出差异蛋白，采用人工神经网络，建立诊 断原发性肝癌实验诊断模型。将其中7 5 例乙肝和6 8 例肝硬化、1 0 0 例原 发性肝癌、9 1 例其他消化系统肿瘤和1 0 1 例健康人血清随机分为训练集( 乙 肝3 5 例，肝硬化3 3 例，原发性肝癌5 0 例，其他消化系统肿瘤4 1 例，健 康人5 1 例) 结合到金芯片上，检测血清蛋白质谱数据，将获得的蛋白质谱 图用c i p h e 唱e np r o t e i n c h i p3 0 软件进行数据的校正和分析，采用 c i p h e 玛e nb i o m a k e rw i z a r d3 1 软件筛选肝炎、肝硬化、原发性肝癌和其 他消化系统肿瘤的差异蛋白。此数据将用于筛选肝癌的差异蛋白标志物并 建立人工神经网络诊断模型。验证集( 乙肝4 0 例，肝硬化3 5 例，原发性肝 癌5 0 例，其他消化系统肿瘤5 0 例，健康人5 0 例) 进行相同的处理后数据 用于模型诊断效度的盲法验证。结果：原发性肝癌患者与对照组血清蛋白 指纹图谱筛选出7 5 个差异表达的蛋白质荷比峰( 尸 o 0 5 ) ，利用其中7 个有明显表达差异的标志蛋白( 尸 o 0 1 ) 建立人工神经网络诊断模型，其 质荷比( i i 比) 分别为4 2 0 7 、6 6 0 4 、7 7 3 4 、8 1 0 6 、8 5 4 5 、8 5 9 9 、8 8 9 4 。经 s w i s s p r o t 蛋白数据库检索，初步鉴定为p e p t i d ey y 1 i k e ，5 0 sm o s o m a l p r o t e ml 3 0 ，5 0 sr i b o s o m a lp r o t e i nl 3 5 ，n e u t r o p m l a c t i v a t i n gp e p t i d e2 ( 7 4 ) ， a c y lc a r r i e rp r o t e i i l ，3 0 sr i b o s o m a lp r o t e i ns 21 ，u p f 0 3 3 0p r o t e i nt k l 7 5 2 。 利用该模型对原发性肝癌进行盲法预测，对原发性肝癌的诊断灵敏度和特 ，异度分别为8 4 o o 和8 1 2 5 ，受试者工作特征曲线( i 的c 曲线) 下面积 ( 彳) 为o 8 4 7 ，阴性预测值9 4 2 0 ，阳性预测值5 8 3 3 ，准确度为 8 1 9 0 。结论：原发性肝癌患者血清具有明显表达差异的特征蛋白，建立 的人工神经网络模型为原发性肝癌的诊断提供了的新方法，对原发性肝癌 的鉴别诊断、治疗和基因研究具有重要意义。 关键词：原发性肝癌；表面增强激光解析电离飞行时间质谱；人工神经网 络；蛋白标志物；受试者工作特征曲线 棘4 “ as e r u mp m t e i np r 0 6 i i n gs t u d yo np r i m a r yh e p a t i cc a r c i n o m aw i t h a r t i f i c i a in e u r a ln e t w o r kd i a g n o s i sm o d e i a b s t r a c t o b j e c t i v e ：p r i m a 巧h 印a t i cc a r c i n o m a ( p h c ) i s t 1 1 ec a n c e ro fh e p a t o c y t eo r i n 细a h e p a t i cb i l ed u c t ，w h i c hi s6 e q u e n tm a l i 印a n tt u m o ra n dh a sm et h i r d d e a t hr a t ei na l i m e n t a 巧s y s t e mt u m o r ，a n ds e c o n do n l yt 0g a s t r i cc a n c e ra n d e s o p h a g e a lc a n c e r h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ( h c c ) i s t h em o s tn e q u e n t o c c u r r e n c ei np h c a n dt o t a lf i v es i v a lr a t ei sl o w e rt h a n5 i i lt h ew o r l d w i d e b e c a u s eo fl a c k i n go fe a r l yd i a g n o s i sm e t h o d s ，t h ec a s ef i a t a l i 够r a t e b e c o m e sm o r ea n dm o r eh i 曲l yi nc h i n a m 甜l yp a t i e n t sl o s s t h e i rb e s t o p p o n m l 时t oc u r e w en e e de x p l o r i n g an e wq u i c k ，s i m p l e ，h i 曲s e n s i t i v 时， p r e d i “o nm o d e lf o rp r i m a 巧l i v e rc a n c e ra l l de x p l o r e d l ec l i i l i c a lv a l u eo f l a b o r a t o 巧d i a g n o s i s i i lo r d e rt 0e 妇b l i s h 觚e f f e c t i v ee a r l yd e t e c t i o no f h 印a t o c e l l u l a rc a r c 试o m ao b j e c t i v ee x p e r i m e n t a li n d e x m e t h o d s ：t h e4 3 5 s e m ms a i = 叩l e sw e r et e s t e db ys e l d i 一1 o f m sm a t c h e dw i t hg o l dc h i pa n d f i n d e dd i f f e r e n tp r o t e i n st 1 1 r o u g hb i o m a r k e rw i z a r ds o f h a r e u s i n ga n n 协 d e v e l o pam o d e lo fd i a g n o s i so fp h c 7 5p a t i e n t sw i t ht y p ebh e p a t i t i s ，6 8 p a t i e n t sw i t hh e p a t i cc i r r h o s i s ， 1o op a t i e n t sw i t l lp h c ，91p a t i e n t sw i t ho t h e r a l i m e n t a 巧s y s t e mt u i n o ra n d1o 1h e a l t hc o n t r o l s 、r ei l l c l u d e d s a m p l e sw e r e r a n d o m l ya s s i g n e di n t ot w os u b s e t s ，t h e 仃a i n i n gs e t ( 3 5p a t i e n t sw i t ht y p eb h e p a t i t i s ，3 3p a t i e n t sw i t l lh e p a t i cc i r r h o s i s ，5 0p a t i e n ：t sw i t hp h c ，4 1p a t i e n t s w i t ha l i m e n t a 巧s y s t e ma n d51h e a l t hc o n t r o l s ) ，a n dt h et e s t i n gs e t ( 4 0p a t i e n t s w i m t y p ebh e p a t i t i s ，35p a t i e n t sw i t i lh 印a t i cc i n h o s i s ，5 0p a t i e n t sw i t hp h c ， 5op a t i e n t sw i t ha l i m e n t 叫s y s t e m 距d5oh e a l mc o n t r o l s ) t h es e r u ms 锄p l e s 、r eb i n d e dt ot h eg o l dc h i pa n dd e t e c t e ds e r u mp r o t e mp r o f i l i n gd a t a ，a n d c o r r e c t e da n da n a l y s e dp r o t e i np r o f i l i n gd a t ab yc i p h e 唱e np r o t e i n c h i p3 o s o f t 、 ，a r e t h et r a i n i n gs e tw a su s e df o ri d e n t i 矽i n gm es t a t i s t i c a l l ys i 鲥f i c a m p e a k s 嬲w e na sf o rd e v e l o p i n ga n n m o d e1 a n dt h et e s t i n gs e tw a su s e df o r b l i n dt e s tt ov a l i d a t et h ed i a g n o s t i ce m c i e n c yo fa n nm o d e1 r e s u l t s ：s e r u m p r o t e i nf i n g e 印r i n ts e l e c t e d7 5d i f | 陌r e n t i a l l ye x p r e s s e dp r o t e i n st h 锄t h ep e a l ( 1 0 a dp o 0 5 ) i np h ca i l dc o n t r o lg r o u p s 1 1 1 eu s eo f 计l i c h7a r es i g n i f i c a m d i f r e r e n c e si nt h ee x p r e s s i o no fm a r k e rp r o t e i n s ( 尸 o o1 ) t 0e s t a b l i s ha r t i f i c i a l n e u r a ln e t w o r k s d i a g n o s i sm o d e l ， t h em a s s c h a r g e r a t i o ( m z ) w e r e 5 ￥ 毒 1 4 2 0 7 ，6 6 0 4 ，7 7 3 4 ，8 l0 6 ，8 5 4 5 ，8 5 9 9 ，8 8 9 4 a n d t h e yc o r r e s p o n d t o p 印t i d e y y l i k e ，5 0 sr i b o s o m a lp r o t e ml 3 0 ，5 0 sr i b o s o m a lp r o t e 洫l 3 5 ， n e u t r o p l l i l a c t i v a t i n gp e p t i d e2 ( 7 4 ) ，a c y lc a m e rp r o t e i l l ，3 0 sr i b o s o m a lp r o t e i n s 21 ，u p f 0 3 3 0p r o t e mt k l 7 5 2r e s p e c t i v e l yb ys w i s s - p r o tr o u g h l y u s i n gb l m d m e t h o dt op r e d i c tt h em o d e lo fp h c ，、c o u l dg e tt h es e n s i t i v i 够a n d s p e c i f i c i t y 、r e8 4 o o 狮d81 2 5 r e s p e c t i v e l y ，a n dt h ea r e au n d e r ( a u c ) o f r e c e i v e ro p e r a t i n gc h a r a c t e r i s t i cc u r v e ( i 的cc u r v e ) w a so 8 4 7 ，n e g a t i v e p r e d i c t i v ev a l u e ( n p v ) w a s9 4 2 0 ，p o s i t i v ep r e d i c t i v ev a l u e ( p p v ) w 嬲 5 8 3 3 ，a c c u r a c y ( a c c ) w a s81 9 0 c o n c l u s i o n s ：1 1 1 e r ew e r es i 鲥f l c 觚t l y d i 伍；r e n tp r o t e i n si 1 1p h c ，觚dt h ea n nm o d e lp r o v i d e san e wm e t h o do f d i 虢r e n t i a ld i a g n o s i so fp h c 1 1 1 em e t h o di si m p o r t 锄f o rd i 雎r e n t i a l d i a g n o s i sa n dt r e a t i n gp h c k e y w o r d s ：p r i m qh 印a t i cc a r c i n o m a ( p h c ) ；s u r f a c e e r d l a n c e dl a s e r d e s o 印t i o ni o n i z a t i o n t i m eo ff l i g h tm a s ss p e c t r o m e t 叮( s e l d i - t o f - m s ) ； a n i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k ( a n n ) ；p r o t e i l lm a r k e r s ； r e c e i v e r o p e r a t i n g c h a r a c t e r i s t i cc u r v e ( r o cc u r v e ) i一 6 釜 刖吾 原发性肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，发生发 展迅速，病人预后差，严重的影响了人类的生存和健康。我国是世界上的 肝炎大国，尤以江苏启东和广西扶绥的发病率最高，全世界每年新发原发 性肝癌约2 5 万余例，其中4 5 发生在中国。本病可发生于任何年龄，以4 0 4 9 岁为多，男女之比为2 5 ：l 。原发性肝癌的病因迄今尚未确定，可 能与多种因素综合作用有关，近年来研究着重于肝炎病毒等病毒类因素和 肝硬化及其他化学致癌物质上。原发性肝癌患者中约有1 3 有慢性肝炎史， 流行病学调查发现原发性肝癌高发区人群的皿s a g ( 乙型肝炎病毒表面抗 原) 阳性率较低发区高，而原发性肝癌患者血清乙型肝炎病毒标志的阳性率 可达9 0 ，显著高于健康人群，提示乙型肝炎病毒与原发性肝癌高发有关。 各种资料和手段证实原发性肝癌与乙、丙型病毒性肝炎后的大结节性肝硬 化关系最为密切。因此慢性病毒性肝炎及其引起的肝硬化、原发性肝癌等 一系列肝病极大危害我国人民健康。经证实，绝大多数癌症都与基因的改 变或表达异常有关，相应的其调控生成的蛋白质在成分和数量上都会有相 应改变，这些蛋白或表达于细胞和组织内，或释放入血，都能成为人们检 测疾病的对象( 如甲胎蛋白a f p ) 。 除了肝组织病理活检作为原发性肝癌诊断的金标准以外，目前临床上 常用a f p 作为原发性肝癌的辅助诊断指标，但a f p 对原发性肝癌诊断阳 性率低，且在原发性肝癌诊断中也存在假阳性，因此缺乏可靠的早期诊断 指标是原发性肝癌预后较差的主要原因乜1 。而即使作为诊断金标准的肝组 织病理活检也因为其创伤性并有一定风险而不易被患者接受，不宜作为常 规检查。目前还没有任何一种优良的原发性肝癌血清肿瘤标志物可用于临 床作为检测区分标准1 。 蛋白组学( p r o t e o m i c s ) 是近十几年来出现的一门新兴科学，以基因表 达的最终产物蛋白质作为研究对象，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐 明生命在生理或病理条件下的变化机制。其本质是在大规模水平上研究蛋 白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作 用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而 全面的认识。而临床蛋白组学技术一表面增强激光解析电离( s e l d i ) 是 随着蛋白质组学兴起的一种新技术，常与时间飞行一质谱( t o f m s ) 联 用，可直接对血液、尿液、脑脊液、腹水、细胞裂解液等样品进行检测。 通过对各种疾病特异性蛋白质动态的分析，绘制出蛋白质指纹谱图，并显 示样品中各种蛋白质的分子量、含量、等电点、磷酸化位点、糖基化位点 等信息。将该图谱与正常人或蛋白指纹库中的谱图对照比较，可发现和捕 获新的特异性疾病相关蛋白，从而探索疾病早期最微小的指标和征兆。近 几年，临床实验室对s e l d i 技术的应用得到了快速增长，尤其是对肿瘤标 记物的筛选和鉴定的研究中，如原发性肝癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、 食道癌、胃癌等“q 们，发现了大量的与肿瘤相关的标志蛋白，为早期诊断肿 瘤提供了一种具有高敏感性和高特异性的新技术。p a r a d i s 等n 为了寻找肝 细胞癌( h c c ) 患者的生物标志物，他们运用s e l d i 技术对4 4 例已确诊 患h c c 的肝硬化患者和3 8 例未患h c c 的肝硬化患者的血清进行分析， 结果发现有3 0 个蛋白峰在两组患者之间有不同的表达。此外，f u n g 等n 2 1 运用s e l d i t o f m s 蛋白质芯片对4 0 例h c c 患者与2 0 例慢性肝病患者 的1 5 1 个潜在生物标志进行比较，结果发现它们之间有8 8 个( 5 8 ) 标志存 在显著的差异。与传统应用a f p 诊断h c c 的方法相比本法的敏感度和特 异度都比较高，分别达到了9 2 1 5 和9 0 。 s e l d i t o f m s 系统的原理( 图1 ) ：将需要检测的含有蛋白质的标 本如血清、尿液、脑脊液等按一定程序做好前处理。根据样本要求，分别 采用化学或生物学的方法在蛋白芯片载体表面制作成点状芯池，每个芯池 用探针修饰，形成化学表面芯片探针或生物表面芯片探针。目前的化学表 面芯片探针主要分为亲水型、疏水型、阴离子型、阳离子型、金属离子型， 分别可结合某些亲水或疏水物质，阴离子或阳离子的化学基团、金属离子 螯合化学基团，检测未知蛋白并获取指纹图谱( 图2 ) 。在每个芯池内加 入待测样品，样品中的蛋白与特定的探针结合后，在原位洗去非特异性结 合及未结合的物质，再加入能量吸收分子( e 舢订) ( 对分子量 1 5 k d a l t o n 的小分子进行检测时e a m 常用c h c a ，而大分子蛋白的检测多用s p a ) 。保留在芯片上的蛋白与能量吸收分子形成混合结晶，即可直接上机 进行质谱检测。检测的原理是芯池中的分析物经激光脉冲辐射解析形成荷 电离子，不同质荷比的离子在仪器漂移管中飞行的时间长短不同。质量越 轻，相对所带电荷越多，其质荷比( m z ) 也就越小，飞行时间越短，检 测器将其最先检测到，并捕获绘制成质谱图，经计算机软件处理后形成模 拟图n 驯。这些模拟图类似于指纹图谱，其横坐标代表质荷比( m z ) ，纵 坐标代表此质荷比对应的蛋白质含量的高低。这些指纹图谱再经软件自带 的b i o m a r k e rw i z 2 u r d 分析软件挑选出差异蛋白，采用人工神经网( a r t i f i c i a l n e 嗽ln e t w o r k ，a 1 州) 络建立诊断模型。再对模型的诊断效能进行验证。 岛一日 图1s e l d i 1 o f m s 系统的原理 f i g u r elt h ep i i n c i p l eo fs e l d i t o f m ss y s t e m 化学表面： 逊毯恧总 疏水的亲水的阴离子的 阳离子的 生物表面： 逍坠 抗体 也 受体 图2 蛋白质芯片表面( 化学表面和生物表面) 示意图 药物 f i 舒l 托2p r o t e i i lc l l i ps u r f a c e ( c h e m i c a l 孤db i o l o 西c a l 驯i r f i a c e ) s c h e m a t i cd i 触即衄 人工神经网络的工作原理：人工神经网络( 矾i f i c i a ln e 删 o r k ，a 1 蝌) 是一种新的生物信息学方法，在近年来得到了飞速的发展。 出粼 竖晦 ，0粤 蔓奠曩函a 墨峨m挚 它结合了神经学、计算机科学、信息学、工程学等处理数据的特点，可以 区分包含有不同生物信息的两个甚至更多的组别，同时提供某一种运算方 法进行预测。人工神经网的运算是非线性的，因此能够处理相互错容的复 杂数据，并且通过这些可能有噪音、模糊的、不完善的数据建立诊断模型。 它在处理非线性多元问题时具有拟合预测精度高、容错能力强和预测速度 快的特点。用于生物医学问题的研究，还能保证结果的一致性，不受医生 心理与情感因素的影响n 引。人工神经网络的优势在于对大量看似杂乱无序 数据的提取和储存功能；对错误信息的优化和包容；能够进行平行和强大 的程序操作以实现自我管理，自我学习以及自动适应形势的改变，所以能 够应用于肿瘤的预测n 引。人工神经网络的种类很多，原理都大同小异，本 研究采用基于误差反传原理( e n o rb a c k p r o p a g a t i o na l g o r i t h m ) 的多层前 馈( m l p ) 神经网络n 引，设置好输入层、隐含层、输出层的节点。每一层一 运算方式都采用正切s 形传递函数并随机初始化。采用反向传播 ( b a c k p r o p a g a t i o n ) 算法n 刀，建立并存储人工神经网络诊断模型( 图3 ) 。套4 7 图3 采用反向传播算法的多层前馈神经网络结构图 1 1 l cm u r a ln e 铆o r kt o p o l o g yo fm l p 砌l b a c k p r o p a g a t i o na l g o r i t h m 1实验材料与仪器 材料与方法 1 1 研究对象 来自2 0 0 7 年1 1 月至2 0 0 9 年1 1 月泸州医学院附属医院消化内 科、肝胆外科及传染科的住院患者和门诊体检标本。所有癌症的纳入标准 均以病理活检作为诊断的“金标准”，其他疾病以相关的诊断标准为纳入 标准。所有病例均未治疗干预前采集标本。乙肝7 5 例，其中男性4 5 名， 女性3 0 名，年龄分布2 0 4 0 岁，平均3 1 2 岁；肝硬化6 8 例，其中男性 4 0 名，女性2 8 名，年龄分布3 5 5 3 岁，平均4 5 7 岁；原发性肝癌1 0 0 例，其中男性6 5 名，女性3 5 名，年龄分布4 5 7 0 岁，平均5 8 1 岁；其 他消化系统肿瘤9 l 例( 食道癌2 6 例，结肠癌2 5 例，直肠癌1 5 例，胃癌 2 5 例) ，其中男性5 0 名，女性4 1 名，年龄分布4 3 7 6 岁，平均6 3 5 岁； 健康人1 0 1 例，其中男性5 1 名，女性5 0 名，年龄分布1 8 4 5 岁，平均 3 4 9 岁。 1 2 试验设备和耗材 1 2 1 a u 蛋白芯片( c i p h e 唱e n 公司，美国) 1 2 2蛋白指纹图谱分析仪( p b si i c ) ( c i p h e 玛e n 公司，美国) 1 2 3 9 6 孔细胞培养板( c i p h e 唱e n 公司，美国) 1 2 4 e p p e n d o r f 管( b d 公司，美国) ：0 2 m l ，0 5m l ，1 5m l 1 2 5佴b 型多动摇床( 上海新波无线电厂) 1 2 6真空抽血管( 不含有抗凝剂) ( 砒c h 公司) 1 2 7医用超低温冷冻冰箱( - 8 0 ) ( 海尔公司) 1 2 8医用低温高速离心机( 白洋离心机厂) 1 2 9低速离心机( 白洋离心机厂) 1 2 1 0 加样枪( e p p e n d o r f 公司，美国) ：1 0 p l 、2 0 p l 、2 0 0 山、1 0 0 0 p l 1 2 1 1 普通冰箱( 海尔公司) 1 2 1 2a l li no n ep e p t i d e 和a l li no n ep r o t e i n 芯片各l 根 1 3 试验试剂 1 3 1唧l ch 2 0( f l u k a u s a ) 1 3 2 磷酸缓冲液p b sb u 仃e r ( 1 0 ) ( s i g m au s a ) 1 3 3 芥子酸s i n a p i n i ca c i d ( s i g m au s a ) 1 3 4 乙腈a c e t o n i t r i l e( f l u k au s a ) 1 3 5 三氟乙酸n a ( s i g m a u s a ) 1 3 6 盐酸t r i s h c l ( s i g m a u s a ) 1 3 7 甲酸f o m i ca c i d ( s i g m a ) 1 3 8 丙酮a c e t o n e ( s i g m a ) e r a d i c a t o r 1 3 9 甲醇c a r b i n o l ( s i g m a ) 1 3 1 0 去污剂e r a d i c a t o r ( a m w a y ) 1 3 1 1 人工合成的内标物质：促肾上腺皮质激素a c t h ( 分子量分别为 2 4 6 5 8d a ，北京中科亚光生物工程公司，氨基酸序列为： n h 2 一a 唱- p r o 一、厂a l - l y s v ，a l t y r - p r o - a s n - g l y a l a - g l u - a s p g l u s e 卜a l a - g l u a l a - p h e p r o l e u g l u p h e c o o h ) 1 3 ， 1 4 研究技术路线( 图4 ) 4 3 5 例血清样本 i r 1r1r1r 1r 7 5 例6 8 例1 0 0 例9 1 例 1 0 1 例 乙肝肝硬化原发性肝癌其他消化系统肿瘤健康人 土上 上上上 上 上土 随机抽取乙肝( 3 5 例) 、肝硬化( 3 3 例) 、剩余乙肝( 4 0 例) 、肝硬化( 3 5 例) 、 原发性肝癌( 5 0 例) 、其他消化系统癌原发性肝癌( 5 0 例) 、其他消化系统癌 症( 4 1 例) 、健康人( 5 l 例) 建立预测症( 5 0 例) 、健康人( 5 0 例) 作为验证 模型 模型 l 一 l t 1r l - 。 i 一 i 一 。i 一 检测血清蛋白质谱数据 1 i i j l 一 “ ii 1r 数据校正及统计学分析 上 li 模型的建立和训练模型的盲法验证 上 诊断试验效能评价 图4 课题研究技术路线图 f i g u r e4 r e s e a r c ht e c h n o l o g yr 0 a m n a p 1 5 实验方法 1 5 1 收集标本 清晨采集受试者空腹静脉血3i i l l ，3 0m i n 内放于4 冰箱中，静 1 4 置1h 待分出血清后4 3 0 0 0 印m 离心5m i l l ，将分离的血清转入 e p p e n d o r f 管，再次4 3 0 0 0 叩m 离心5 “n ，血清分装5 0 山管，冻 存于一8 0 冰箱中备用。期间所有操作均在4 以下操作，所有样本保证 只冻融一次。样本不能有溶血，不能将下层的细胞吸入，不能吸入上层油 脂。 1 5 2 能量吸收分子( s p a ) 的配制 1 5 2 11 三氟乙酸( 吓a ) 溶液 取5 p l ，n 1 a 溶液，加入4 9 5 p l 玎p l ch 2 0 中，立即混匀，封口，避光， 4 保存，使用周期不超过3 天。 1 5 2 2 乙腈( a c n ) 溶液的配置 取4 0 0 “la c n 与上步配置好的1 的耵a 4 0 0 p l 充分混匀，用锡纸包严， 避光。 1 5 2 3 半饱和s p a 的配制 敏 取出s p a 粉适量，加入上步配置好的乙腈溶液4 2 0 “l ，配置成饱和的 s p a 溶液，震荡溶解后离心l o o o o 印m 离心3 分钟，取上清液3 5 0 p l 于 新的1 5m le p p e n d o r f 管内避光。另将剩下的3 8 0 l 乙腈溶液汲取3 5 0 p l 于此e p p e n d o r f 管内二者充分混匀制成半饱和s p a 溶液。 1 5 3 样品准备 取出冻存的血清标本，置于冰上融解后4 1 0 0 0 0 印m 离心2m i n ， 将分离的血清与1 0 p lp b sb u 虢r ( 1 0 ) 按一定比例混合，混匀。吸取2 倍体积的半饱和s p a 加入样品混合管，充分混匀，静置5 1 0 分钟。吸取 待测混合血清样品2 肛l ，于活化的金芯片上点样，并预留出一个空白点做空 白对照，晾干。再每点点加l p l 半饱和s p a ，晾干，待检。 l 弋 1 5 4 活化芯片 样品制备的同时进行芯片活化。记下芯片号，用排枪加5 0 “l 丙酮，在 层析柜中6 0 0 巾m ，5 分钟，拍干。用排枪加5 0 p l 盐酸，在层析柜中6 0 0 印m ， 5 分钟，拍干。用排枪加5 0 山盐酸甲醇液，在层析柜中6 0 0 印m ，5 分钟， 拍干。用排枪加5 0 p l 甲醇液，在层析柜中6 0 0 印m ，5 分钟，拍干，下架， 空气中晾干待用，1 0 分钟以内点样。 1 5 5 上样 将处理好的样品2 山点样于芯池中央。干后用半饱和的s p a1 山，5 m i n 后再点1 l 。 1 5 6 预实验 1 5 6 1 确定芯片 、 采用3 种芯片( c m l o 、a u 、m 队c 3 c u ) 对4 例乙肝患者、4 例肝 硬化患者、4 例原发性肝癌患者、4 例正常对照血清进行检测，筛选比较选 出得到蛋白质峰多、蛋白质分离效果好、差异最明显的芯片用于本实验。 结果表明，a u 芯片用于本实验效果最好，两组间蛋白质峰差异最明显， 且操作最简便耗材最低。 1 5 6 2 确定仪器参数 通过确定的a u 蛋白芯片，利用预试验中结合的血清样品，调整高、 中、低不同的仪器参数，寻找得到蛋白质峰最多，效果最好( 基质峰a v e r a g e i n t e n s 时为6 0 左右) 的仪器参数作为本课题血清样本的检测参数。最终确 定仪器检测参数如下： 分子量范围：1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 优化范围：2 0 0 0 2 0 0 0 0 数据收集方法：s e l d iq u a m i t a t i o n 检测激光强度：1 9 0 检测敏感性：9 收集位置：2 0 8 0 预热位置：2 ( 数据收集不包含预热点) 预热激光强度：1 9 5 - 平均每点收集次数：2 0 收集总点数：1 4 0 信噪比( s n ) ：两次分别为5 ，2 蛋白质峰频率阈值：1 0 1 5 7 重复性实验 诎 我们建立了s e l d i t o f m s 二维内标校准( t w o d i m e n s i o n a lc a l i b r a t i o n s t a n d a r d s ) 方法，对金芯片采集质谱图的分子量和质谱峰高度进行批内和嚣 批间重复性实验n 刖。即采用人工合成并纯化的特定多肽分子作为内标物质， 加入待测样品中进行s e l d i t o f m s 检测，通过内标物质在质谱图中横坐 标( 质荷比) 和纵坐标( 强度) 响应值校准，消除出于操作条件的波动而 对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度和重复性。 首先随机选取l 例标本( 血清量要足够，符合s e l d i 标本收集要求) ， 然后将此标本进行两种处理：一是完全按照a u 芯片的操作过程处理此标本 不添加任何物质；另一种则是将人工合成的a c t h 和血清以1 ：1 的比例混 合，其余再按a u 芯片的操作过程处理此混合物。没有添加a c t h 的组别称 作外部组，加了a c t h 的组别称作内部组。测外部组的血清指纹图谱时只 需要用a l li no n e 芯片校准，测内部组的血清指纹图谱时先用a ni 1 1o n e 进行外 部校准，然后再用已知的a c t h 进行分子量和峰强度的内部校准。 将外部组和内部组进行同样的处理：在同一天内用飞行质谱仪连续检 测1 0 次( 批内) ，在1 0 天内分别检测1 0 次( 批间) 。最后将检测到的指纹 图谱的分子量和峰强度的变化( 变异系数，c y ) 作出分析。 1 5 8 血清蛋白质谱检测 1 5 8 1 采集数据 采用a u 芯片检测4 3 5 例肝炎、肝硬化、原发性肝癌、其他消化系统肿 瘤和健康人血清蛋白质谱。利用p b si i c 型蛋白质指纹图谱仪对结合在 蛋白芯片表面的血清蛋白质进行检测，设定优化范围为2 0 0 0 2 0 0 0 0 质荷 比( r 吡) ，最高检测分子量为l o o o o o 毗，激光强度1 9 0 ，检测敏感度9 。 仪器采用c i p h e 唱e n 公司提供的a l l i n - o n e 蛋白质标准分子芯片进行校正，确 定系统的质量偏差o 1 ，再进行内标校准。采用c i p h e 唱e np r o t e i n e h i p 软 件自动采集实验数据并备份原始检测图谱。对获得的血清蛋白质谱图，进 行降低基线和均一化等前期处理。 1 5 8 2 统计学处理 利用c i p h e r g e np r o t e i n c h i p 软件对获得的混合对照血清图谱进行分析 并计算其差异性，以变异系数( c 功值表示，设定c 以1 5 时，不同芯片 之间的实验误差为可接受范围。采用b i o m a d k e rw i z 砌3 1 软件分析病例 组和对照组血清蛋白指纹图谱，设定有意义的蛋白质峰出现频率阂值为1 0 ，分别设定5 ，2 两次信噪比( s n ) 过滤。确定两组间蛋白质峰值比较 ， l 冀 时，对初步筛选的蛋白质峰进行聪验，尸 o 0 5 的蛋白质峰差异具有统计 学意义。 、1 5 8 3 建立诊断模型 采用多层前馈( m l p ) 神经网络，将其输入层、隐含层1 、隐含层2 、 输出层的节点分别设置7 、3 、2 、1 。设定训练集原发性肝癌患者的目标输 出值为1 ，其他对照的目标输出值为o ，训练次数为1 0 0 0 ，学习率为o 0 1 ， 采用动量反向传播( b a c k p r o p a g a t i o n ) 算法呦1 ，建立并存储人工神经网络 诊断模型。 1 5 8 4 盲法模型验证 利用双盲的方法，将验证集中原发性肝癌和其他对照血清蛋白标志物 质谱数据输入模型进行模拟仿真计算，设定c 甜乒动值为o 3 。当输出值在o 3 ( 含o 3 ) 1 时，归为原发性肝癌；当输出值在o o 3 时，归为非原发 性肝癌。通过模拟计算的结果，对实验预测模型的诊断效能进行评价。 藩： 结果 1 重复性试验结果 对获得的血清蛋白质谱数据进行分析，首先看加入a c t h 进行内标校 准时，外来物质对血清指纹图谱是否有影响( 图5 ) 。结果显示，加入a c t h 对血清指纹图谱的分子量和峰强度均没有影响。然后分别在外部组和内部 组的指纹图谱中找出表达较强且分子量分布在指纹图谱的高、中、低三个 区域的3 个蛋白质峰( 5 9 0 0 毗、7 7 4 9 毗、9 2 5 7i i 泥) 进行统计分析( 表1 ) ， 3 个质谱峰的分子量平均变异系数( c 批内值为o 0 6 5 ，批间值为o 0 8 ； 3 个质谱峰的强度检测的平均变异系数( c y ) 批内值为1 1 0 8 ，批间值为 1 8 3 2 ，说明具有良好的重复性。 1 0 啪 图5 血清加入内标物a c t h 终浓度4 0 5 5 阻。价只比未加入内标物多1 个质谱峰， 那就是n 比( 横坐标) 为2 4 6 5 8 d a 的a c t h ；血清中加入内标物a c n i ( 0 2 0 2 8 1 1 岬o l 1 ) 对所有质谱峰强度( 纵坐标：硫e 潞时) 没有影响。 f i g u 5c o m p a r i s o n m 鹤ss p e c n o 舯a mi nt 量圮s 锄es e m ms 锄1 p l e s 、) i ，i t l l a c t h i r i t e m a ls t a n l i a r dm a t e r i a l ( 4 0 5 5 眦o l l ) 锄dw i t h o u ti i l t e 删s t a i l d a r dm a t e r i a l ，t l l e 代w e 心 n 0i m p t s0 ni 1 1 t e 璐i t i e so fa l lt l l cm 髂ss p e c 恤p e a k sw h c na d d i i l ga c t hm a l 鼬m d a r dm a t e r i “( o 2 0 2 8 1l0 眦o 。) i ns e m m 2 0 表ls e l d i t o f - m s 金芯片检测血清蛋白质谱指纹图的重复性 t a b l e1c o m p a r i s o no nr e p r o d u c i b i l 时o f m 勰s s p e c 们伊锄g o l d c