（水生生物学专业论文）南方鲇stra8分子克隆、表达和转录调控的初步研究.pdf

、 一 理学硕士学位论文 一溉 南方鲇s t r a 8 分子克隆、表达和转录调控的 初步研究 水生生物学专业硕士研究生焦静 指导教师王德寿教授 本研究受高等学校博士学科点专项科研基金( 2 0 0 9 0 1 8 2 11 0 0 0 8 ) 、 9 7 3 计划前期研究专项( 2 0 1 0 c b l 3 4 4 0 5 ) 和国家自然科学基金重点项 目( 3 1 0 3 0 0 6 3 ) 的资助。 西南大学生命科学学院 二零一一年五月 一苓一一，平直月 中国重庆 一 m a s t e rd i s s e r t a t i o n m o l e c u l a rc l o n i n g ，g e n ee x p r e s s i o na n d t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o no f s t r a 8i n s o u t h e r nc a t f i s h m a jo r ：h y d r o b i o l o g y a u t h o r ：j i a oj i n g s u p e r v i s o r ：w a n g d e s h o u t h i sw o r kw a ss u p p o r t e db yt h es p e c i a l i z e dr e s e a r c hf u n df o rt h e d o c t o r a lp r o g r a mo fh i g h e re d u c a t i o no fc h i n a ( n o 2 0 0 9 0 18 2110 0 0 8 ) ， t h en a t i o n a lb a s i cr e s e a r c hp r o g r a mo fc h i n a ( n o 2 0 10 c b13 4 4 0 5 ) a n d t 1 1 e ( 打a n t s 舶mt h en a t i o n a ln a t u r a l s c i e n c ef o u n d a t i o no fc h i n a ( 31 0 3 0 0 6 3 ) s c h o o lo fl i f es c i e n c e ，s o u t h w e s tu n i v e r s i t y c h o n g q i n g c h i n a m a y1 0 ，2 0 1 1 l 挣 目录 摘要 a b s t r a c t 第l 章文献综述 1 减数分裂机制研究现状 2 减数分裂过程中的关键因子 2 1s t r a 铲诫数分裂前的标志基因 2 2 视黄酸( r e t i n o i ca c i d ，r a ) ，咖8 的诱导者 3 本研究的立项依据和目的意义 第2 章南方鲇s t r a 8 的分子克隆和表达模式研究 1 引言 2 材料与方法 2 1 实验动物 2 2 试剂、耗材和仪器 2 3 有关试剂的配制 2 4 实验方法 3 结果 3 1 南方鲇s t r a 8 的序列和系统发生分析 3 2 南方鲇s t r a 8 的组织分布 4 讨论 4 1s t r a 8 的序列分析 4 2 南方鲇s t r a 8 的表达模式分析 第3 章南方鲇s t r a 8 的原核表达、抗体制备和免疫组化 1 引言 2 材料和方法 2 1 实验动物 2 2 试剂、耗材和仪器 2 3 有关试剂的配制 2 4 方法 3 结果 4 讨论 第4 章南方鲇s t r a 8 的转录调控研究。 l 1 l 2 4 5 7 7 7 7 7 8 8 5 5 7 8 暑 9 o m m m m m 3 厅 叮 田 j j j 以一 j j j j j j 一 矗 ：2 ：2 墙 螺 侈加 加 加 加 加 加 筋 ” ”如 ： ， 1 前言3 0 2 材料和方法3 0 2 1 材料 2 2 方法 3 0 3 1 3 结果3 3 4 讨论3 6 结论 参考文献二 3 7 3 8 致谢。4 3 在校期间发表的文章4 4 在校期间参加的科研4 4 n - 西南大学硕七学伊论文 中文摘要 南方鲇s t r a 8 分子克隆、表达和转录调控的初步研究 水生生物学硕士研究生：焦静 指导教师：王德寿教授 摘要 行有性生殖的生物在配子形成过程中都需要经历减数分裂。因此，减数分裂 调控机制是最基础的生物学问题之一，也是水生生物学、细胞生物学、遗传学、 生理学、发育生物学、分子生物学等多门学科研究的重点、热点和难点问题。 近年来，哺乳类和鸟类减数分裂调控机制研究取得了重大进展。r a 减数分 裂启动过程中起着决定性作用，而s t r a 8 ( s t i m u l a t e db yr e t i n o i ca c i dg e n e8 ) 在 减数分裂启动中起着关键作用，是生殖细胞由有丝分裂转变为减数分裂前特异表 达的基因。然而，到目前为止，s t r a 8 仅在哺乳类和鸟类报道。尽管在两栖类也 发现r a 在减数分裂过程中起关键作用，但并未从两栖类分离到s t r a 8 。并且目 前，硬骨鱼类的减数分裂机制研究还是一片空白。 本研究通过生物信息学的方法，得到3 种鱼类( 沟鲇、虹鳟；大马哈鱼) 的 s t r a 8 同源基因。通过r t - p c r 和r a c e 相结合的方法从南方鲇( s i l u r u s m e r i d i o n a l i s ) 成功克隆了s t r a 8 全长c d n a 序列；用r t - p c r 的方法对s t r a 8 在南方 鲇各组织的表达模式进行了研究；用p c o l di 载体在大肠杆菌对南方鲇s t r a 8 进行 了原核表达、重组蛋白的纯化以及在小鼠中进行了抗体制备；采用荧光素酶报 告基因系统研究了雌激素和一系列在性别分化中起重要作用的转录因子，如s f l 、 f o x l 2 、d m r t l 、w t l 等对s t r a 8 的转录调控作用。结果如下： 本研究克隆了南方鲇s t r a 8 的e d n a 序列全长为1 6 0 6b p ，包括5 端非编码 区1 6 3b p ，3 端非编码区4 5 6b p ，开放阅读框9 8 7b p ，编码3 2 8 个氨基酸。通过 序列比对发现，南方鲇s t r a 8 与哺乳类和鸟类的相似性很低( 与人相比仅为3 2 o ， 与鸡相比仅为2 7 4 ) ，表明了s t r a 8 的保守性较差，这暗示了它们在功能上可能 有一定的差异。 组织分布研究发现，s t r a 8 特异地表达于性腺，暗示了s t r a 8 可能参与减数分 裂的启动；并且在成体雌雄性腺表达没有明显性差，这与哺乳类成体仅在雄性精 巢表达不同。 两南大学硕七学位论文中文摘要 原核表达得到重组蛋白h i s s t r a 8 分子量约为4 3 k d ，n 端带有h i s - t a g 标签， 并纯化了h i s s t r a 8 重组蛋白，免疫小鼠后，制备了抗体。由于南方鲇s t r a 8 表达 量较低，我们通过原位杂交的方法没有检测其m r n a 信号。因此，制备抗体的 目的就是为研究s t r a 8 表达的细胞类型提供方法。 通过g e n o m i ew a l k i n g 方法，从南方鲇基因组克隆了s t r a 8 的启动子，约 1 4 k b ，并将其亚克隆到荧光素酶报告基因p g l 3 载体中，同时将s j 7 、f o x l 2 、2 种d m r t l 选择性剪接体( d m r t l a 和d m r t l b ) 、w t l 等转录因子以及3 种雌激素 受体亚克隆到真核表达载体p c d n a 3 1 中。在c h o 细胞中，南方鲇d m r t l a 增强 了s t r a 8 的转录活性；而d m r t l b 抑制了s t r a 8 的转录活性；并且d m r t l a 和d m r t l b 对s t r a 8 的调控作用具有剂量依赖性。然而已检测的其他转录因子对s t r a 8 转录 活性具有微弱的抑制作用，这暗示了s t r a 8 除受这些因子的调控外，一些未知因 子可能影响s c - s t r a 8 的表达。 综上所述，本研究从3 种硬骨鱼类的e s t 序列中分离了仅在高等脊椎动物 报道的s t r a 8 同源基因，并从南方鲇将其克隆。这是首次从低等脊椎动物分离到 s t r a 8 。组织分布研究发现，s t r a 8 仅在雌雄性腺表达，暗示了其可能参与减数分 裂的启动；启动子分析发现，在检测的多种转录因子中，s t r a 8 主要受到d m r t l 的调控，这与在哺乳类的研究类似。 关键词：南方鲇；s t r a 8 分子克隆；组织分布；原核表达和抗体制备；启动子 分析 两南大学硕+ 学位论文 英文摘要 量| 曼量鲁曼曼皇曼曼曼曼曼曼皇皇量皇量墨量曩皇罾曼量i i i 一, , 一一 i 鲁量皇鼍 m o l e c u l a r c l o n i n g ，g e n ee x p r e s s i o na n d t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o no fs t r a 8i ns o u t h e r nc a t f i s h m a jo r ：h y d r o b i o l o g y a u t h o r ：j i a oj i n g s u p e r v i s o r ：p r o f w a n gd e s h o u a b s t r a c t a l lo g a n i s m sw i t hs e x u a lr e p r o d u c a t i o nu n d e r g om e i o s i si no r d e rt op r o d u c e m a l ea n df e m a l eg a m e t e s t h e r e f o r e ，t h em e i o t i cm e c h a n i s mi so n eo ft h em o s tb a s i c b i o l o g i c a li s s u e s m e i o s i si sa l s oa ni m p o r t a n t ，i n t e n s i v e l ys t u d i e da n dm o s td i f f i c u l t a r e ai na q u a c u l t u r e ，c e l lb i o l o g y , g e n e t i c s ，p h y s i o l o g y , d e v e l o p m e t a lb i o l o g ya n d m o l e c u l a rb i o l o g y i nr e c e n ty e a r s ，g r e a tp r o g r e s sh a sb e e na c h i e v e di nt h ei n i t i a t i o no fm e i o s i si n m a m m a l sa n db i r d s r e t i n o i ca c i d ( r a ) w a sf o u n dt o p l a yd e c i s i v er o l e si nt h e i n i t i a t i o no fm e i o s i s ，a n ds t r a 8 ( s t i m u l a t e db yr e t i n o i ca c i dg e n e8 ) ，w h i c hi s s p e c i f i c l ye x p r e s s e di ng e r mc e l l sw h i l et r a n s f o r m i n gf r o mm i t o s i st om e i o s i s ，p l a y k e yr o l e si nt h er as i g n a lp a t h w a y u pt on o w , s w a 8w a so n l yr e p o r t e di nm a m m a l s a n db i r d s t h o u g hr aw a sa l s of o u n dt o p l a yac r u c i a lr o l ei n t h em e i o s i so f a m p h i b i a n s ，s t r a 8w a sn o ti s o l a t e df r o mi t v e r yl i t t l e i sk n o w na b o u tt h em o l e c u l a r m e c h a n i s mg o v e r n i n gm e i o s i si nf i s h i nt h ep r e s e n ts t u d y , t h eo r t h o l o g o u sg e n eo fs t r a 8w a si d e n t i f i e df r o mt h r e e s p e c i e so ff i s h ( c h a n n e lc a t f i s h ，r a i n b o wt r o u ta n ds a l m o n ) u s i i 培b i o i n f o r m a t i c s s t r a 8 ( s c - s t r a 8 ) w a sc l o n e df r o ms o u t h e r nc a t f i s hc s i t u r u sm e r i d i o n a l i s ) b yr t p c ra n d r a c e ；t i s s u ed i s t r i b u t i o na n a l y s i sw a sp e r f o r m e db yr t - p c r t h er e c o m b i n a n t p r o t e i no fs c - s t r a 8w a se x p r e s s e dw i t hp c o l dii ne c o l i ，p u r i f i e da n dt h ea n t i b o d y w a sp r o d u c e di nm o u s e l u c i f e r a s ea s s a y sw e r ep e r f o r m e dt os t u d yt h ee f f e c t so f e s t r o g e na n dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ，i n c l u d i n gs f ，f o x l 2 ，d m r t la n dw t l ，o nt h e t r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yo fs c - s t r a 8 t h er e s u l t sa r e2 u sf o l l o w s ， i i i 西南大学硕十学伊论文英文摘要 一l i l l i ,i 量曼量皇曼皇曼量曼量皇量喜皇皇置曼量鼍奠量量量舅量皇量皇曼量量曼曼量| 量量量舅舅曼曼曼曼皇詈鼍暑量皇鼍罾曩| 置量罾喜量曼量 t h ec l o n e ds c - s t r a 8e d n as e q u e n c e si n c l u d e16 3b p5 - u t r ( u n t r a n s l a t e d r e g i o n ) ，4 5 6b p3 - u t r ，a n da no r f ( o p e nr e a d i n gf l a m e ) o f9 8 7b p ，e n c o d i n ga p o l y p e p t i d eo f3 2 8a a s e q u e n c ea l i g n m e n ts h o w e dv e r yl o ws i m i l a r i t yb e t w e e n s c - s t r a 8a n dt h es t r a 8o fm a m m a l sa n db i r d s ，3 2 o a n d2 7 4 ，r e s p e c t i v e l y t h e l o wc o n s e r v a t i o no fs t r a 8s u g g e s t e dt h e i rd i f f e r e n c e si nf u n c t i o n t i s s u ed i s t r i b u t i o na n a l y s i ss h o w e dt h a ts c - s t r a 8i s e x p r e s s e ds p e c i f i c l yi n g o n a d s ，s u g g e s t i n gi tp o s s i b l ep a r t i c i p a t i o ni nt h ei n i t i a t i o no fm e i o s i s n oa p p a r e n t s e x u a ld i m o r p h i s mw a sd e t e c t e db e t w e e nt h et e s t i sa n do v a r yo ft h ea d u l tc a t f i s h t h i s r e s u l tw a sd i f f e r e n tf r o mt h em a m m a l i a ns t r a 8w h i c hw a sf o u n dt ob es p e c i f i c a l l y e x p r e s s e di nt h et e s t i so f t h ea d u l tm o u s e t h es c - s t r a 8r e c o m b i n a n tp r o t e i n 、析廿lh i s - t a ga tt h en - t e r m i n a lw a so b t a i n e db y p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n t h em o l e c u l a rw e i g h to fs c s t r a 8r e c o m b i n a n tp r o t e i nw a s 4 3 k d ( k i l o d a l t o n ) t h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw a sp u r i f i e da n dt h ea n t i b o d yw a s p r e p a r e di nm o u s e b e c a u s eo ft h el o we x p r e s s i o no fs c - s t r a 8 ，i t sm r n as i g n a lw a s n o td e t e c t e db y 加s i t uh y b r i d i z a t i o n t h e r e f o r e ，a n t i b o d yp r e p a r a t i o np r o v i d e saw a y t os t u d yt h ec e l lt y p eo fs t r a 8 t h e1 4k bp r o m o t e ro fs c - s t r a 8w a sc l o n e db yg e n o m ew a l k i n g ，a n di tw a s s u b c l o n e di n t op g l 3p r o m o t e r - l u c i f e r a s er e p o r t e rv e c t o r m e a n w h i l e ，s f l ，f o x l 2 ， d m r t l ( t w oa l t e r n a t i v e l ys p l i c e dv a r i a n t sd m r t l aa n dd m r t l b ) ，w t la n dt h r e e e s t r o g e nr e c e p t o r ( e l l s ) w e r es u b c l o n e di n t op c d n a 3 1v e c t o r l u c i f e r a s ea s s a y s w e r ep e r f o r m e di nc h oc e l l s d m r t law a sf o u n dt oe n h a n c et h et r a n s c r i p t i o no f s c - s t r a 8 ；w h i l ed m r t l bs u p p r e s s e dt h et r a n s c r i p t i o no fs c - s t r a 8i nad o s e - d e p e n d e n t m a n n e r t h eo t h e rt r a n s c r i p t i o nf a c t o r st e s t e da l s os h o w e dl i a l es u p p r e s s i o ne f f e c to n t h es c - s t r a 8 , s u g g e s t i n gt h a ts o m eu n k n o w nf a c t o r sm a y b er e s p o n s i b l ef o rs c - s t r a 8 e x p r e s s i o n i ns u m m a r y ，t h eo r t h o l o g o u sg e n e so fs t r a 8o fh i g h e rv e r t e b r a t e sw e r ei s o l a t e d f r o mt h ee s t s e q u e n c e so f t h r e ef i s hs p e c i e sa n di tw a sc l o n e df r o ms o u t h e r nc a t f i s h t h i si sf o rt h ef i r s tt i m ew h e r es t r a 8w a si s o l a t e di na n yl o w e rv e r t e b r a t e s t i s s u e d i s t r i b u t i o n a n a l y s i ss h o w e dt h a ts t r a 8 w a se x p r e s s e di ng o n a d s e x c l u s i v e l y , s u g g e s t i n gi t sp o s s i b l ei n v o l v e m e n ti nt h ei n i t i a t i o no fm e i o s i sa sr e p o r t e di nh i g h e r v e r t e b r a t e s p r o m o t e ra n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a ti nv a r i o u st r a n s c r i p t i o n a lf a c t o r s t e s t e d ，s t r a 8w a sm a i n l yr e g u l a t e db yd m r t l ，s i m i l a rt ot h a tf o u n di nm a m m a l s k e y w o r d s ：s o u t h e r nc a t f i s h ；s t r a 8 ；m o l e c u l a rc l o n i n g ；t i s s u ed i s t r i b u t i o n ； r e c o m b i n a n tp r o t e i na n da n t i b o d yp r o d u c t i o n ；p r o m o t e ra n a l y s i s ； i v 两南大学硕+ 学何论文第1 章 第1 章文献综述 1 减数分裂机制研究现状 行有性生殖的动植物在配子形成过程中都需要经历减数分裂，产生单倍体配 子( 精子和卵子) ，雌雄配子再结合发育成正常的个体。因此，减数分裂保证了 遗传信息由亲代向子代的稳定遗传。 近年来，哺乳动物减数分裂分子机制研究取得了重大进展，其分子机制为： s t y ( s e x d e t e r m i n i n gr e g i o no nyc h r o m o s o m e ) 是哺乳动物性别分化的总开关 ( s i n c l a i re ta 1 ，1 9 9 0 ；p o l a n c oa n dk o o p m a n , 2 0 0 7 ) ，也决定着减数分裂的起始时间， 在雄性，由于s o , 的作用- c y p 2 6 b l 开启一r a 降低一& 阳8 关闭一减数分裂延迟 到出生后，而在雌性，由于没有s r y 的作用一。夕2 的j 关闭一r a 升高一m 8 开 启一减数分裂始于胚胎期( b o w l e se ta 1 2 0 0 6 ；k o u b o v ae ta 1 ，2 0 0 6 ；s w a i n ，2 0 0 6 ) 。 对鸟类减数分裂分子机制研究也得到了相似的结果( s m i t he ta 1 ，2 0 0 8 ) 。其中， 勋稍是生殖细胞由有丝分裂转变为减数分裂前特异表达的基因，在调控哺乳类 和鸟类减数分裂的起始过程中起到关键作用，s t r a 8 一旦缺失，生殖细胞将不能 完成减数分裂( a n d e r s o ne ta 1 ，2 0 0 8 ；m a r ke ta 1 ，2 0 0 8 ；s m i t he l ；a 1 ，2 0 0 8 ；韩飞等， 2 0 0 8 ；米美玲等，2 0 0 9 ) 。然而，在除哺乳类和鸟类以外的其他所有脊椎动物都 未见s t r a 8 的报道。r a 是诱导s t r a 8 表达的诱导剂，r a 通过对& 阳8 的表达的 调控来实现对雌雄特异的减数分裂启动时间的控制( w a l l a c i d e se ta 1 ，2 0 0 9 ) 。 c y p 2 6 b l 是编码细胞色素氧化酶p 4 5 0 ( c y p ) 超家族成员之一，它通过控制r a 的水平来调控生殖细胞砌稍的表达，从而实现对减数分裂启动的控制。 目前，对鱼类减数分裂分子机制研究还是一片空白。有学者对已完成基因组 测序的几种鱼类( 青鲻、斑马鱼、红鳍东方纯、黑青斑河鲍等) 的基因组序列进 行分析，没有发现s t r a 8 的同源基因，并因此认为，鱼类的减数分裂调控机制可 能与哺乳类、鸟类很不相同( s w a i n , 2 0 0 6 ；韩飞等，2 0 0 8 ) 。 2 减数分裂过程中的关键因子 2 1 勋馏卜减数分裂前的标志基因 m 8 作为一个受r a 诱导表达的基因，首先是在胚胎癌细胞、胚胎干细胞 的培养中认识到的。b o u i l l e t 等用r a 处理小鼠全能的p 1 9 胚胎癌细胞，筛选出 5 0 个受r a 诱导表达的基因，其中s t r a 8 是一个新发现的基因( b o u i l l e te ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。后来发现s t r a 8 在小鼠胚胎卵巢和出生后至成体的精巢中也有表达 ( o u l a d a b d e l g h a n ie ta 1 ，1 9 9 6 ；z h o ue ta 1 ，2 0 0 8 ) 。在e 1 2 5 时首先在卵巢的前半 部分检测到s m a 8 的表达，到e 1 4 5 时s t r a 8 阳性细胞遍布整个卵巢，在e 1 5 5 时 西南大学硕十学位论文第1 章 s t r a 8 主要卵巢后半部分表达，在e 1 6 5 时仅有少量的s t r a 8 阳性细胞，并且主要 位于后极区，到e 1 7 5 时以及出生后的卵巢都不能检测到s t r a 8 表达( m e i l k ee ta 1 ， 2 0 0 3 ) 。然而，在雄性胚胎期没有检测到s t r a 8 的表达，s t r a 8 开始在雄性睾丸表 达是从出生后5 d 开始，直到成体均有表达( z h o ue ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 在小鼠胚胎卵巢，s t r a 8 表达一段时间后，d m c l ( 减数分裂过程中所需的重组 酶) 的表达从前向后波形增加，而维持多能干细胞所需的o c t 4 的表达也在s t r a 8 表达后从前向后波形丧失。这表明s t r a 8 是生殖细胞由有丝分裂转变为减数分裂前 特异表达的基因( b o w l e se ta 1 ，2 0 0 7 ) 。在s t r a 8 缺失小鼠的研究中发现，s t r a 8 缺 失的雌雄小鼠都是不育的。在雌性，s t r a 8 缺失后，卵巢较对照小，生殖细胞也没 有出现进入减数分裂的一系列特征，包括减数分裂前的d n a 复制、减数分裂前 期的染色体凝聚、联会、重组，也不表达d m c l 。出生时生殖细胞大量消失，导 致出生后8 周卵巢既没有卵母细胞，也没有卵泡，这表明s t r a 8 对减数分裂前d n a 复制和随后的减数分裂前期事件的发生是必需的：s t r a 8 缺失的雄鼠，睾丸较对照 小，出生后精原细胞可以正常进行分裂，在出生后第7 或第8 d 也和正常小鼠一样 出现减数分裂前的精母细胞，但这些精母细胞发育停滞，不能进入减数分裂前期， 大多数精母细胞凋亡，导致出生后8 周睾丸生精细胞数量明显减少，几乎全部为 减数分裂前的生精细胞。这表明s t r a 8 不论是对雄性还是雌性均是诱发减数分裂和 正常减数分裂前期进行的关键( b a l m se ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 除了r a 的合成、降解变化可以调节s t r a 8 的表达外，其他一些基因也能对 s t r a 8 的表达起到调控作用，如p i w i l 2 和s h p 等( 米美玲等，2 0 0 8 ) 。 哺乳动物性别决定与减数分裂的启动是密切相偶联的( m e n k ee ta 1 ，2 0 0 3 ； k o u b o v ae ta 1 ，2 0 0 6 ；s w a i n , 2 0 0 6 ；米美玲等，2 0 0 9 ) 。在雌性，s t r a 8 在e 1 2 5 就开 始表达，s t r a 8 表达开始后1 d ，减数分裂启动，并长期停滞在减数分裂的前期；在 雄性，由于性别决定基因蹄表达后，雄性睾丸c y p 2 6 8 1 表达增加，无s t r a 8 表达， 生殖细胞在1 3 5d p c 时停滞在有丝分裂的g 0 或g 1 期，出生后恢复有丝分裂，在出 生后至成年睾丸表达_ _ s t r a 8 ，减数分裂随后启动。这表明哺乳动物生殖细胞进入减 数分裂的时间决定了性腺是朝雌性或是雄性方向发育，如果减数分裂发生在胚胎 期，生殖细胞将发育为卵母细胞；如果减数分裂推迟到出生后，则发育为精原细 胞( m e n k ee ta 1 ，2 0 0 3 ；k o u b o v ae ta 1 ，2 0 0 6 ；s w a i n ，2 0 0 6 ；米美玲等，2 0 0 9 ) 。 2 2 视黄酸j 溉8 的诱导者 视黄酸( r e t i n o i ca c i d ，r a ) 又称维生素a 酸，是一种类固醇激素，属于维 生素甲类化合物( r e t i n o i d s ) 家族。分子式为c 2 0 h 2 9 0 2 ，由环已烯、侧链及极性 基团三部分组成，是维生素a 在体内代谢后的主要活性产物，基本结构和生物活 性均类似于维生素a ( t o m ae ta 1 ，1 9 9 7 ) 。由于侧链及极性基团部分不同，r a 又 2 西南大学硕士学位论文第1 章 有多种同分异构体。其中因为羧基方向不同而分为顺式r a ( c i s - r a ) 和全反式 r a ( a l l - t r a n sr e t i n o i ca c i d , 胁) 两种异构体。已有研究表明，r a 对脊椎动物 的生长发育( l o e s e r , 1 9 9 4 ；m o r a l e s , 1 9 9 4 ；n u g e n ta n dg l 龇，1 9 9 4 ) 、免疫功能 ( s z a b oe ta 1 1 9 9 4 ) 等方面具有重要的调节作用，并在细胞增殖与分化( t a k a t s u k a 甜a 1 ，1 9 9 6 ；g i a n n ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 以及细胞凋亡( 韩锐等，1 9 9 1 ) 等过程中起重要 作用。r a 的生物活性是通过r a 受体( r e t i n o i ca c i d 崩蝴r a r ) 和r a x 受体 ( r e t i n o i dxr e c e p t o r , r x r ) 的激活而介导的( l e i de ta l l 9 9 勿r e i j n t j e se te 1 ， 2 0 0 7 r a r s 和r x r s 都具有由不同基因编码的a 、b 、t 三种亚型黜蛐闻r x r 与配体r a 结合后，以二聚体的形式结合到靶基因启动子上一段被称为r a 反应元 件( r e t i n o i ca c i dr e s p o n s ee l e m e n t s 。r a r e ) 的特定d 1 怕序列上，从而调控靶基因 的转录( b e n b r o o ke t 以1 9 8 8 ；n a l x ) f i 1 9 9 9 ) 。总之，进入生物体内的维生素刖登过两 步氧化反应，即分别在合成酶a d h ( 乙醇脱氢酶) 或r d h ( 视黄醇脱氢酶) 和 r a l d h ( 视黄醛脱氢酶) 的催化作用下生成了r a ，r a 与受体结合后，以二聚 体的形式与靶基因启动子上的r a r e 结合，从丽实现对靶基因的转录调控( 图 1 1 ) ；另外，r a 在降解酶c y p 2 6 的作用下降解为非活性物质( d u e s t e r , 2 0 0 8 ) 。 v i 协m i n a 嗍卜 1 i r 一 、 p ! r e t i n o i ；足 c r b p ，v r e t i n y l e s t e r “蛐岫_ _ _ ” c y p 2 6 图1 1 视黄酸合成途径及信号通路( d u e s t e r , 2 0 0 8 ) f i 9 1 1r e t i n o i c a c i ds y n t h e s i sa n ds i g n e n n g ( d u e s t e r , 2 0 0 8 ) 在对小鼠的研究中发现，生殖细胞由有丝分裂转变为减数分裂过程中，r a 是生殖细胞性分化的环境因素，r a 诱导生殖细胞表达_ s t r a 8 ，只有在鼬喇液达后， 生殖细胞才能进入减数分裂。因而，l 山匝过对s t r a 8 的调节来控制两性特异的减 3 两南大学硕十学伊论文第1 章 数分裂启动时间( k o u b o v ae ta 1 ，2 0 0 6 ；b o w l e se ta 1 ，2 0 0 7 ；a n d e r s o ne ta 1 ，2 0 0 8 ) 。 对鸟类的减数分裂机制研究得到同样的结果( s m i t he ta 1 ，2 0 0 8 ) 。最近，对两栖 类的研究发现，r a 在减数分裂过程中起着重要作用，这暗示r a 可能在整个脊椎 动物减数分裂过程中的作用是保守的( w a l l a c i d e se ta 1 ，2 0 0 9 ) 。 2 3 o 舶劬j 一a 的分解者 c y p 2 6 属于编码细胞色素氧化酶p 4 5 0 ( c y p ) 超家族成员。c y p 2 6 首次是在斑 马鱼( d a n i or e r i o ) 的再生成体尾鳍中分离出来的( w h i t ee ta 1 1 9 9 4 ) 。随后，在 人类( h o m os a p i e n s ) 、小鼠( m u sm u s c u l u s ) 、鸡( g a l l u sg a l l u s ) 以及爪蟾( x e n o p u s l a e v i s ) 等物种中均有发现( w h i t ee ta ，1 9 9 8 ；a b u - a b e de ta 1 ，1 9 9 8 ；s w i n d e l le ta 1 ， 1 9 9 9 ；h o l l e m a n ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。迄今为止，在脊椎动物中，共发现了4 个c y p 2 6 成 员，即c y p 2 6 a l 、c y p 2 6 b l 、c y p 2 6 c l 和c y p 2 6 d l ，均为编码特异降解r a 的水解酶。 其中，在哺乳动物基因组发现了3 个c y p 2 6 基因：c y p 2 6 a l ，c y p 2 6 b l 和c y p 2 6 c l ： 鱼类中发现y c y p 2 6 a l 、c y p 2 6 b l 以及仅在斑马鱼中发现的c y p 2 6 d l ( w h i t ee ta 1 ， 1 9 9 6 ；z h a oe ta 1 ，2 0 0 5 ；g ue ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 在所有c y p 2 6 基因中，c y p 2 6 b l 降解r a 最有效，并且只有c y p 2 6 b l 在胚胎性 腺有表达( k o u b o v a e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。在对小鼠的研究中发现，小鼠胚胎性腺细胞不 合成r a ，此时r a 在中肾管细胞中合成，而中肾和性腺通过中肾管开口相连，使 得中肾产生的r a 从开口扩散到性腺前端。在雌性，由于在1 2 5 d p e 后没有r a 的降 解酶c y p 2 6 b l 的表达( c y p 2 6 b l 在11 5 d p c 时在雌雄胚胎性腺都有表达，但在1 2 5 d p e 以后成为雄性特异表达) ，因此从1 2 5 d p e 开始则引起此处生殖细胞首先表达 s t r a 8 ，随着r a 从性腺前端向后端扩散，形成s t r a 8 从前向后的先后表达，从而使 减数分裂在胚胎期启动；而在雄性，由于s t y 基因的表达，引起胚胎性腺s e r t o l i 细胞表达c y p 2 6 b l ，因而没有s t r a 8 的表达，从而使雄性在胚胎期不启动减数分裂 ( k o u b o v ae ta 1 ，2 0 0 6 ：b o w l e se ta 1 ，2 0 0 6 ) 。出生后，由于c y p 2 6 b l 在雄性睾丸 生精小管外面的管周肌样上皮细胞表达，阻止了血液循环中的r a 进入生精小管 内，然而，此时s e r t o l i 细胞合成的r a 为生精小管内精原细胞表达s t r a 8 提供了所 需，从而使减数分裂在出生后启动( k o u b o v a e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。以后精原细胞分化所 需的r a 可能来源于粗线期晚期和双线期的精母细胞。对c y p 2 6 b l 基因敲除小鼠研 究中发现，c y p 2 6 b l 基因敲除小鼠的生殖细胞在e 1 3 5 时就提前进入减数分裂，并 停滞在粗线期；而且，在e 1 3 5 天后，胚胎的生殖细胞凋亡快速增加，这表明 c y p 2 6 b l 除了阻止雄性生殖细胞进入减数分裂外，还是胚胎精巢生殖细胞幸存的 关键( m a e l e a ne ta 1 2 0 0 7 ) 。 。 4 西南大学硕十学位论文第1 章 3 本研究的立项依据、目的意义 南方鲇( s i l u r u sm e r i d i o n n a l i s )