（分析化学专业论文）烟草中结合态香味成分研究.pdf

中国科学技术大学硕士学位论文摘要 摘要 本论文根据大量调研和实验研究，探索了复杂体系一一烟草中游离态和结 合态香味成分的分离与分析新方法及其可行合成路线。建立了一套分离效果 好、有实用价值的游离态和结合态香味成分同时分离分析新方法以及糖苷合成 方法。 本文由两部分组成。第一部分是烟草中香味成分分离新方法的研究。在研 究了普通同时蒸馏萃取( s d e ) 分离游离态香味成分的基础上，发展了s d e 在 分离烟草中结合态香味成分中的应用，建立了两步s d e 法同时分离游离态、结 合态香味成分。第二部分是糖苷前体物溴代乙酰葡萄糖的合成与表征。目 前合成糖苷最常用的方法是k o e i g n s - k n o r r 法，为提高糖的半缩醛羟基的选择性 及产率，通常选用一些取代基将其保护起来，溴代乙酰葡萄糖是其中最常用的 一种，因此，本文研究了溴代乙酰葡萄糖的合成路线，并用红外光谱和质谱进 行了表征。 论文主要研究成果归纳如下： 1 在普通s d e 法分离游离态香味成分的基础上，发展了s d e 法在分离烟 草中结合态香味成分中的应用，建立了分离烟草中结合态香味成分的新方法一 一两步同时蒸馏萃取法( t w o s t e ps d e ) 。并对两步同时蒸馏萃取法的萃取时 间、萃取p h 值进行了优化。结果证明，两步s d e 法中，在p h 5 5 9 和p h 2 5 的 条件下，分别s d e4 h ，可分别分离出游离态和结合态香味成分。用两步s d e 法分离烟草中的结合态香味成分，不仅简化了分离步骤，对结合态香味成分的 萃取效率也比用传统的分离方法高。 2 采用一步法合成了溴代乙酰葡萄糖，首先葡萄糖在高氯酸的催化下和乙 酸酐反应，生成的乙酰化葡萄糖，无需分离直接加入溴代试剂三溴化磷，加一 定量的水，使三溴化磷水解，释放出溴化氢和乙酰化的葡萄糖作用，得到溴代 乙酰化葡萄糖。产物用红外光谱和质谱进行了表征。该研究结果为糖苷的合成 奠定了初步实验基础。 a b s t r a c t t h es t u d y0 fb o u n da r o m ac o m p o u n d s t h eb o u n da r o m aw a si m p o r t a n ta r o m ap r e c u r s o r s b o u n da r o m aa l s oe x i s t si n t o b a c c oa n di tw a si m p o r t a n tt ot h ef l a v o ro ft h ec i g a r e t t e b e c a u s eo ft h es t a b i l i t ya n d p o t e n t i a lc o n t r i b u t i o nt ot h ef l a v o r ，b o u n da r o m aw a sc o n s i d e r e da san e wa r o m a m a t e r i a l sa p p l i e di ni n d u s t r y w h i l et h ew i l d l yu s e di s o l a t i o nm e t h o dw a sc o m p l e x s i m p l ea n df a s tm e t h o d sw e r es t i l ll a c k i n g t h ed e v e l o p m e n to fi s o l a t i o nm e t h o da n d f e a s i b l es y n t h e t jcm e t h o dw a s n e c e s s a r y t h ep o i n to ft h i st h e s i sw a st o e x p l o r en e wa n a l y s i sm e t h o d so fb o u n da r o m ai n t o b a c c o o nt h eb a s i so fi n v e s t i g a t i o na n ds t u d yal o to fl i t e r a t u r e ，ap r a c t i c a la n d e f f e c t i v es e p a r a t i o na n ds y n t h e s i sm e t h o do fb o u n da r o m ah a db e e nd e v e l o p e d t h i s t h e s i sw a sm a d eu po ft w op a r t s 1 ) o n ew a st h es t u d yo fi s o l a t i o nm e t h o do fb o t h f r e ea n db o u n da r o m a b ya p p l i c a t i o no ft w o s t e ps i m u l t a n e o u ss t r e a md i s t i l l a t i o na n d s o l v e n te x t r a c t i o n ( t w o s t e ps d e ) ，b o t hf r e ea n db o u n da r o m ac o u l db ei s o l a t e da n d d e t e r m i n e d 2 ) t h eo t h e rw a st h es y n t h e s i so fa c e t o b r 0 9 1 u c o s e t h es y n t h e s i z e d a c e t o b r o g l u c o s ew a ss t u d i e du s i n gi ra n dn m r t w om a r ea s p e c t sw e r ei n c l u d e di nt h et h e s i s 1 o nt h eb a s i so fi s o l a t i o no ff r e ea r o m ab yt h en o r m a ls d e t w o s t e ps d e m e t h o df o ri s o l a t i o no fb o u n da r o m ai nt o b a c c oh a db e e nd e v e l o p e d t w e l v ec o m m o n a r o m ab e n z y z a l c o h o l ，b e n z a l d e h y d e ，n a p h t h a l e n e ，1 , 2 ，3 ，4 一t e t r a h y d r o 一1 ，1 , 6 ，t r i m ， s o l a n o n e ，d a m a s c o n e ，f a r n e s o l ，g e r a n y l a c e t o n e ，n o r s o l a n o n e ，m e g a s t i g m a t r i n o n e1 ， m e g a s t i g m a t r i n o n e 2 ，m e g a s t i g m a t r i n o n e 3 ，m e g a s t i g m a t r i n o n e 4w e r eu s e da si n d e x t h ei s o l a t i o ne f f e c to ft r a d i t i o n a lm e t h o da n dt w o - s t e ps d ew a sc o m p a r e d c o n d i t i o n si nt w o s t e ps d ew e r eo p t i m i z e d e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tf o r i s o l a t i o no fb o u n da r o m a ，t w o s t e ps d ew a sm o r ee f f e c t i v ea n ds i m p l e r 2 a c e t o b r o g l u c o s ew a ss y n t h e s i z e d t h ei m p r o v e dk o e i g n s k n o t tm e t h o dw a s a p p l i e d c a t a l y z e db yp e r c h l o r i ca c i d ，g l u c o s er e a c t e dw i t ha c e t i ca n h y d r i d e a f t e r b r o m i n er e a g e n tw a s a d d e d ，a c e t o b r o g l u c o s i d ew a so b t a i n e d t h ep r o d u c tw a ss t u d i e d u s i n gi ra n d n m r ， 2 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 第一章植物香味成分的研究进展 1 1 引言 有关植物中香味成分的研究早在2 0 世纪初就开始了。但在2 0 世纪7 0 年代 以前，人们主要关注的是挥发性的游离态香味成分。直到1 9 6 9 年，f r a n c i s 等在 研究玫瑰香味成分时，首次发现了某些挥发性香味成分和糖结合，以糖苷形式 存在【l 】。随后，c o r d o n n i e r 等在研究葡萄中的萜烯类化合物时，发现单萜类化 合物不仅以游离的形式存在，也和糖结合以糖苷形式存在 2 。这种糖苷结合态 在酸或酶的作用下可以水解释放出游离态的单萜化合物，对葡萄香味产生贡 献。这些发现为香味成分的研究开辟了新的领域，结合态香味的成分的研究日 益受到重视。 挥发性有机物的前处理技术发展，如顶空法( h e a ds p a c e ，h s ) 、同时蒸馏 萃取( s i m u l t a n e o u ss t r e a md i s t i l l a t i o na n ds o l v e n te x t r a c t i o n ，s d e ) 、和固相微 萃取( s o i l dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n ，s p m e ) 等，为游离态香味成分的分离提供了 简便、可靠的方法。各种分析仪器特别是色谱的发展，使准确测定复杂生物样 品中痕量游离态香味成分成为可能。 结合态香味成分属于不挥发性或挥发性低的物质，是挥发性香味成分和单 糖、二糖及多糖以苷键、酯键连接，以糖苷、糖酯等结合态的形式存在，这种 结合态香味在遇到酸或酶时，会水解释放出挥发性的香味成分，具有潜在致香 性，因此又被称为潜香物质或香味前体【3 】。对植物中香味成分的研究结果表 明，以糖苷结合态形式存在的香味成分在植物中的含量一般为其游离形式的2 8 倍，且种类繁多，结构复杂 4 5 。而以糖酯结合态形式存在的香味成分很少， 并且一般为葡萄糖四元酯，对植物香味的贡献小 3 。因此，现在研究的结合态 香味成分的主要是糖苷结合态香味成分。 自从1 9 6 9 年首次在植物中发现糖苷结合态香味成分以来的研究表明，糖苷 结合态香味成分广泛的存在于植物特别是水果及香料植物中。如芒果、菠萝、 山楂、茉莉花、茶叶和烟草等 6 11 。现在，对糖苷的研究日益深入，已经从 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 1 7 0 多种植物体内分离出各种糖苷 1 2 。并且由于它们相对稳定，具有潜在致香 作用，因此在香料工业中具有广泛应用前景。目前获得糖苷结合态香味成分的 方法主要有三种：从植物中分离纯化、化学法合成和生物酶促法合成。植物体 内所含的糖昔含量低，分离过程复杂，费时、费力、不经济，很难用于工业生 产。在化学法合成方面，最早的合成方法是费歇尔苷化反应，得到的是q 一、 1 3 一两种构型异构体的混合物，且以q 一构型为主 1 3 。现在最为常用的是 k o e i g n s k n o r r 法，经过几十年的完善，现已成为最成熟的化学合成方法。本章 针对植物中游离态香味成分和结合态香味成分，从样品前处理方法、色谱分析 技术、和糖苷的合成表征三个方面进行综述。 ，_一 ； “ 1 2 游离态香味成分的分离方法 1 2 1 液一液萃取法( 1 i q u i d 1 i q u i de x t r a c t i o n ，l l e ) 液一液萃取法是种传统的分离方法，又称溶剂萃取分离法，简称萃取分离 法。这种方法是利用与水不相混溶的有机溶剂同试液一起振荡，使不互溶的两 液体( 溶剂与被萃取物) 作暂时的混合与接触，接触后的液体再度分离成两相， 从而达到分离富集的目的。液液萃取的优点是设备简单，操作快速。缺点是费 时，工作量较大，且萃取溶剂常是易挥发、易燃和有毒的物质，所以应用上受 到5 l 曼锘l j 1 4 。 1 2 2 静态顶空法( h e a d s p a c e ，h s ) 和动态吹捕法( p u r g e & t r a p ，p & t ) 项空法作为挥发性物质的提取方法的优越性早已为人们所发现。j e n n i n g s 等人1 9 7 2 年首次报道了顶空气体捕集法。项空法用空气、氮气、氦气或其他气 体将被测物从样品中抽提出来的方法。它又分为静态顶空法( h e a d s p a c e ，h s ) 和 动态的吹捕法( p u r g e & t r a p ，p & t ) 两种。适于从液体中或固体样品中萃取沸点 低于2 0 0 。c 的挥发性成分，被广泛应用于食品与环境监测等部门 1 5 2 0 。h s 法 将样品至于顶部带有橡皮塞或其它弹性材料的密闭容器中，样品上方留有一定 空间。当样品中的挥发性成分逸出，系统达到平衡后，取出项部的气体样品进 行气相色谱分析。根据事先做出的矫正曲线及被测物在气液两相中的分配系 数，从顶空气体中挥发物的含量可以计算出样品中被测物的含量。因此，h s 是 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章 一种处于平衡状态的气相萃取过程。这种方法的优点是操作简便，是与萃取液 体样品、粘稠体甚至固体中的挥发性物质，尤其是沸点低于1 2 5o c 的化合物最 有效。缺点是对挥发性成分不能浓缩，因而方法的灵敏度低，只适于挥发性高 的成分；此外，由于萃取在静态平衡条件下进行，不能将样品中的挥发性成分 全部萃取出，因此对不同物质它们所处的不同基质须要仔细校正后才能进行定 量。但定量的重现性不好。 p & t 与h s 不同，它使气体连续的通过样品将其中的挥发性成分萃取后在 吸附剂或冷阱中捕集，再进行分析测定，因而是一种非平衡态的连续萃取【2 1 2 3 1 。这种方法几乎能全部定量的将被测成分萃取出来。与h s 相比，不但萃取 效率高，而且萃取物可以被浓缩，使方法的灵敏度大大提高。缺点是设备复 杂，并且对吹洗气的纯度要求较高，否则易引起交叉污染。此外，吹捕过程中 易起泡沫，给在线测定带来一定困难。顶空法虽然操作方便，但相对而言较费 时、费力，溶解固体样品溶剂的纯度要求较高，否则将影响结果的重现性。 1 2 3 同时蒸馏萃取( s d e ) 蒸馏是一种广泛采用的分离方法，根据液体混合物中液体和蒸汽之间混合 组分的分配差别进行分离。蒸馏技术是挥发性和半挥发性成分制备的第一选 择。蒸馏的主要目的是从混合液体样品中分离出挥发性和半挥发性成分。一种 材料在不同温度下的饱和蒸气压变化是蒸馏分离的基础。大体说来，如果液体 混合物中两种组分的蒸气压具有较大差别，就可以富集气相中更多的挥发性和 半挥发性成分。两相液相和蒸气相可以分别被回收，挥发性和半挥发 性的成分富集在气相中而不挥发性成分被富集在液相中。 除烃类混合物和少数其他例子外，r a o u l t 定律和d a l t o n 定律可用于理想混 合物体系 3 0 。应用这两个定律可以得到一个二元体系的两种组分的挥发性比 ( a a b ) ： a 7 b a a b = = = 了= i 0 a p o b ( 1 ) x b x a 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 式中，y a 和y b 分别是平衡是气相组分a 和b 的摩尔分数，x a 和x b 分别是平衡 时液相组分a 和b 的摩尔分数，p o a 和p o b 分别是平衡时组分a 和b 的蒸气 压，均服从r a o u l t 定律。随着a a b 增大，富集程度也增大。 在实际的样品中，常常是非理想的混合物，各组分之间由于结构的差异使 它们的挥发性差别很大。在整体回流的条件下，蒸馏瓶中某一组分的蒸气相与 液相达到平衡，这一组分的富集参数或者相对挥发性可通过蒸馏测定。一步蒸 馏的理论塔板数是一，每一个塔板代表一个气液平衡。为获得较好的分离结 果，常需要多于一个理论塔板数，通常宽范围的改变样品的挥发性可以应用蒸 馏方法制备大量的挥发性有机物。 s d e 是n i c k e r s o r i 和二l i k e a s 等在19 6 4 年发展起来的一种挥发性成分的提取 方法1 2 4 1 ，图1 1 a 是传统的s d e 装置。近年来出现的新型的薄型s d e 装置， 如图1 1 b 所示，具有截面积大，不易堵塞，处理时间短等特点。s d e 将样品的 水蒸气蒸馏和馏出物的有机溶剂萃取两步合二为一，可把m g l 级的挥发性有 机成分从固体或液体介质中浓缩数千倍，此法得到了迅速的发展 2 5 2 6 1 。由于 s d e 法所获得的是挥发性物质在有机溶剂中的溶液，体积较小，便于操作，同 时避免了通常蒸馏法提取时在器壁上的吸附损失及转移时的操作困难 2 7 2 9 。 a 图1 1 传统的s d e 装置( a ) 和微型s d e 装置( b ) 在常规蒸馏中，分离程度取决于液相混合物中这些组分的物理特性，还取 决于所使用的蒸馏器的类型与结构、蒸馏方法等。在复杂体系中纯化或样品制 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 备时很少使用简单蒸馏，常需要更多的理论塔板数。因此，分离复杂样品中的 挥发性成分常用水蒸气蒸馏、真空蒸馏等，其中s d e 是分离挥发性物质最常用 的方法。s d e 与其它分析技术的联用拓宽了s d e 在分离复杂样品中挥发性成分 中的应用，文献也有不少报道，如s d e h p l c 3 1 ，3 2 1 ，s d e g c 3 3 3 5 ，s d e c e 3 6 3 9 ，s d e g c m s 4 0 ，4 1 ，在临床与医药分析及挥发物分析中得到了广泛 的应用。 1 2 4 固相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) s p e 是结合物质相互作用的相似 相溶机理和h p l c 、g c 固定相基本原理发展起来的。s p e 根据相似相溶机理可 分为四种：反相s p e 、正相s p e 、离子交换s p e 、吸附s p e 。s p e 主要处理液 体样品，萃取、浓缩和净化其中半挥发性和不挥发性化合物，也可用于固体样 品，但必须处理成液体。目前主要应用于水中多环芳烃和多氯联苯等有机物质 分析，水果、蔬菜及食品中农药和除草剂残留分析，抗生素分析，临床药物分 析等。s p e 具有溶剂用量少、便捷、安全、高效等特点。 1 2 5 固相微萃取( s o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n ，s p m e ) 固相微萃取技术是8 0 年代末由加拿大w a t e r l o o 大学p a w l i s z y n 教授领导的 研究组首先发展起来的。固相微萃取原理是与固相萃取原理相似 4 2 4 8 。这种 方法的原理是采用熔融石英光导纤维为固相吸附剂，或在其表面涂渍了类似于 色谱固定相的聚二甲基硅氧烷或其它有机固定液薄层。 固相微萃取技术可以用于萃取水中痕量挥发物，也可用于萃取其它流体介 质的挥发物如有机溶剂、气体、超临界流体中的痕量物质，甚至固体中的挥发 性物质。在烟草化学的挥发性成分分析、环境样品的制备和前处理、临床、刑 事鉴定、天然产物、生命科学等领域中得到广泛的应用【4 9 5 3 。与许多经典的 样品制备与前处理方法如液一液萃取等相比，固相微萃取技术不但简便、省时、 省力、无需溶剂，而且可以直接萃取挥发性样品，如顶空固相微萃取法；与吹 气捕集法相比，它又可处理挥发性低的样品，而且设备小巧，不需额外面积与 空间。但与顶空法相同，它在分析定量的分析方面不如蒸馏法准确。 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 1 3 糖苷结合态香味成分的分离方法 1 3 1 提取净化 植物中的糖苷结合态香味成分种类繁多，结构复杂。和香味成分结合的糖 有d 一葡萄吡喃糖和多种二糖：6 o o l 阿拉伯呋哺糖苷基一1 3 一d 一葡萄吡喃糖 ( 葡萄糖苷) ，6 - 0 一q l 阿拉伯吡嘀糖苷基1 3 d 葡萄吡哺糖( 巢菜糖苷) ， 6 o q 吡喃鼠李糖苷基b d 葡萄毗喃糖( 芸香苷) ，6 一o q 一毗喃木糖苷基一 1 3 一d 一葡萄吡哺糖( 樱草糖苷) 等 5 4 1 。以糖苷结合态存在的香味成分有：萜烯 醇；芳樟醇氧化物；萜烯二醇；萜烯三醇；直链醇和环状醇，如己醇、苯甲 醇、苯乙醇等；、挥发性酚等o - 一这些香味成分和糖上的半缩醛羟基形成苷键，变 成糖苷后不再具有挥发性，在中性、碱性条件下稳定。在酸或酶的作用下水 解，苷键断裂，香味成分被释放 3 】。从已分离出的糖苷结合态香味成分中发 现，植物中的糖苷大部分是d 葡萄糖苷和二糖苷，其中以樱草糖苷居多。并且 这些二糖苷都无例外存在1 3 d 一吡喃型葡萄糖，而挥发性的香味成分都是连在 葡萄糖的c l 半缩醛羟基上。 植物中的糖苷结合态香味成分被水、甲醇等极性溶剂提取后，共存的干扰其 测定的成分主要有：水溶性糖、游离态香味成分、有机酸、氨基酸、生物碱、 色素、蜡质等 5 4 】。采用固相吸附剂后，利用不同极性的有机溶剂洗脱，可达 到除去干扰成分，分离糖苷结合态香味成分的目的。糖苷结合态香味成分和共 存的干扰物被吸附在层析柱上后，先用水洗去水溶性糖、有机酸、生物碱、氨 基酸等极性大的干扰物，再用非极性的有机溶剂洗去对测定糖苷结合态香味成 分干扰最大的游离态香味成分，最后用甲醇洗脱糖苷结合态香味成分。得到的 结合态香味成分可直接或浓缩后用液相色谱测定，或水解后用气相色谱测定。 最先被用于糖苷结合态香味成分分离的固相吸附剂是c 1 8 。1 9 8 2 年， w i l l i a m s 在分离葡萄汁中糖苷结合态香味成分时，最先用c 1 8 填充玻璃柱，用水 和2 0 醋酸水溶液分别洗去水溶性糖、有机酸、生物碱、氨基酸和游离态香味 成分。糖苷部分用3 0 的醋酸溶液和甲醇洗脱 5 5 1 。1 9 9 1 年，d is t e f a n o 改进了 w i l l i a m s 的方法。用填有c 1 8 的固相萃取柱分离葡萄中的糖苷：水溶性糖、有机 酸、生物碱、氨基酸用水洗去，游离态香味成分用二氯甲烷洗去，糖苷部分用 中国科学技术大学硕士学位论文 第章 甲醇洗脱 5 6 。它的不足在于，采用不同来源的商品固相萃取柱，样品分析结 果差异大，结果重现性差。 采用大孔型吸附剂a m b e r l i t ex a d 2 树脂分离植物中糖苷结合态香味成分 的设想最早由法国蒙彼利埃的研究人员提出。a m b e r l i t ex a d 一2 曾成功的分离出 葡萄中游离态的萜烯醇。它是一种弱极性的树脂，适合分离生物体内弱极性的 化合物。游离的挥发性香味成分本来属于非极性或极性很弱的物质，与糖结合 后，由于糖基中含有多个羟基，极性会增大，但仍是弱极性物质。因此， a m b e r l i t ex a d 2 适合糖苷结合态香味成分的分离。1 9 8 5 年，g u n a t a 等在分离 葡萄汁中糖苷结合态香味成分时首次用a m b e r l i t ex a d 一2 填充玻璃柱，用水、 二氯甲烷洗柱后，糖苷结合态香味成分用甲醇洗脱。c 1 8 吸附剂是硅胶表面键合 了一层十八烷基，它是根据相似相溶的原理，通过将非极性或弱极性化合物吸 附在硅胶表面，达到与极性化合物分离的目的。a m b e r l i t ex a d 一2 是一种弱极性 大孔型树脂，依靠范德华力进行吸附，其孔结构对吸附起着重要作用。与c 1 8 吸附剂相比，用a m b e r l i t ex a d 一2 游离态香味成分去处的更彻底，分离效果更 好。 在a m b e r l i t ex a d 一2 大孔树脂净化基础上建立起来的前处理方法己被广泛 用于糖苷结合态香味成分的分离中。这种前处理方法为研究糖苷结合态香味成 分的结构、理化性质、在植物体中转化的途径，合成及应用打下了基础。但是 这种前处理方法仍然存在缺陷。w i l l a m s 等研究发现虽然用a m b e r l i t ex a d 一2 大 孔树脂从糖苷结合香味成分中去除游离态香味成分比用c 1 8 彻底，但仍有残留 的游离态香味成分不能被有机溶剂从树脂上完全洗去。在洗脱步骤中，会和糖 苷结合香味成分同时被甲醇洗脱，对糖苷结合态香味成分的测定产生干扰 5 7 】。因此现在分离糖苷结合香味成分时，在用a m b e r l i t ex a d 一2 柱净化后，还 要进一步用多次液液萃取来除去残留的游离态香味成分。 1 3 2 水解 如前所述，糖苷结合态香味成分种类多、结构复杂。现有的已合成出的糖 苷标准物质有限，因此从植物中分离出的糖苷结合香味成分能直接或浓缩后用 于液相色谱测定的很少。常将糖苷水解成挥发性香味成分和糖两部分分别研 究。糖苷结合态香味成分水解的方法有两种：酸水解和酶水解。 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 1 3 2 1 酸水解 酸水解是一种通用的水解方法。对所有的糖苷结合香味成分，无论是葡萄 糖苷、二糖苷或多糖苷都适用。苷键属于缩醛结构，极易为稀酸催化水解。酸 水解一般在水或稀醇溶液中进行。水解反应发生时，苷原子先质子化，再断裂 生成阳碳离子或半椅式中间体，在水中溶剂化而成糖 5 8 1 。因为五元呋喃环的 平面性使各取代基处于重叠位置，形成水解中间体可使张力减小，故易水解。 一般，呋哺糖苷较吡哺糖苷水解速率大5 0 1 0 0 倍：芳香族苷如酚苷，因苷元部 分有供电子结构，水解时比脂肪族苷如萜苷、淄苷容易。糖苷结合态香味成分 中糖的部分在酸的作用下，二糖、多糖都会被水解成相应的单糖。此外，某些 香味成分在酸作用下会产生异构化：如芳樟醇氧化物和茄尼醇在p h i 0 时会变 成o c i m e n o l 异构体 5 9 。为了防止水解时发生结构变化，可采用两相水解反 应。糖苷结合态香味成分在用酸水解时，一开始就加入一定量的有机溶剂，糖 苷结合态香味成分一经水解，释放出的挥发性香味成分立即从水相转入有机 相，避免了苷元结构的变化 6 0 6 3 】。 1 3 2 2 酶水解 酶水解具有选择性高、温和等特点。糖苷酶对底物的要求主要有三个方面 的内容。如图1 2 所示：糖基一侧的专一性：糖苷键的q 、1 3 一异头专一 性；和糖相连的配基的专一性。糖苷酶对q 一、1 3 一异头专一性的要求最为严 格。至今还没有一个糖苷酶既可水解q 糖苷键，又可水解1 3 糖苷键。糖苷酶 对糖基一侧的专一性要求亦是严格的。如1 3 d 甘露糖苷酶水解1 3 d 一甘露糖 苷，b d 葡萄糖苷酶水解1 3 d 葡萄糖苷。糖苷酶对和糖相连的配基一侧的专 一性要求不严格。对配基专一性主要是通过酶活性的差量来表现。不同的配基 用同一个糖苷酶作用，酶可以表现出不同的活性。 水解糖苷的酶一般都是基因特异性酶，即只需底物分子的一部分构造适合 ( 如同种构型、同种糖基) ，就可起反应。由于分离纯化酶很困难，目前使用 的酶多数为混合酶。糖苷酶在水解二糖苷、多糖苷时通常是分段进行的。二糖 苷、多糖苷先水解成单糖的糖苷后，再水解成单糖与相应的配基。如用苦杏仁 苷酶水解苦杏仁苷时，1 3 葡萄糖苷酶首先水解端点的葡萄糖，得到野樱苷，再 由另- - l e e 酶水解野樱苷得到苯羟乙腈 6 4 。 1 0 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 影 一r 图1 2 糖苷酶对底物的专一性 糖基一侧的专一性 ，糖苷键的q 一d 异头专一性 糖苷配基- n 的专一性 由于糖苷种类繁多，水解各种植物中糖苷所需要酶的种类还未研究透彻。 因此用酶水解不能全面反映植物中糖苷结合态香味成分的种类和含量。现在酶 水解一般用于植物中某一类的糖苷的研究，如：用b d 葡萄糖苷酶研究0 d 葡萄糖苷：用b 樱草糖苷酶研究b 樱草糖苷等。 1 4 香味成分的色谱分析技术 1 4 1 气相色谱( g c ) 技术 气相色谱( g c ) 技术的发展已有5 0 多年的历史，它现在是一种相当成熟 的复杂混合物的分离分析方法，是目前烟草挥发性香味成分分析中应用最为广 泛的重要手段。近年来，柱效高、分离能力强、灵敏度高的毛细管气相色谱有 了很大发展，尤其是毛细管柱和进样系统的不断完善，使毛细管气相色谱的应 用更加广泛 6 5 ，6 6 】。尽管样品前处理的净化效果越来越好，但样品中的干扰物 是不可避免的，所以现代气相色谱一般采用只对“目标”响应，而对其他物质 无响应选择性检测器。目前，最常用的检测器有质谱( m s d ) 、电子捕获检测 器( e c d ) 、氮磷检测器( n p d ) 、火焰离子化检测器( f i d ) 等。 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 1 4 2 气相色谱质谱联用( g c m s ) 技术 色一质联用已成为一种发展相对成熟的检测手段，质谱法的优点是能在多种 组分同时存在的情况下对其进行定性定量分析，仅用气相色谱法检测需要多个 检测器，而色质联用一般只需一次g c m s 检测即可。 b o y l d 6 7 等用气相色谱一质谱( g c m s ) 联用来检测邻苯基苯酚、二苯胺等。 用乙腈提取，再转移至丙酮中，邻苯基苯酚、二苯胺的检出限分别为1 0 、8u g k g ，且回收率比较高。p a p a d o p o u l o um o u r k i d o u 6 8 报道说，气相色谱一离子捕 获质谱法( g c i t m s ) 是一种多组分的检测方法，可用来检测三嗪、苯脲、乙酰 苯胺、及其他一些污染物。样品用乙腈一水提取，再溶到石油醚一乙醚中以在 g c i t m s 上直接分析，。质谱在电子轰击电离( e i ) 模式下运行。当样品中挥发 性有机物的含量在2 0 1 0 0 0pg k g 时，其回收率一般大于8 0 。对绝大多数挥 发性有机物来说其检出限为1 101 - tg k g 。该法可用来检测痕量农药适合于研究 污染源在环境中的行为。气相色谱化学电离质谱法( g c c i m s ) 可用来分析多种 致癌挥发性有机物 6 9 】，样品前处理采用s p m e 法。 1 4 3 高效液相色谱( h p l c ) 技术 h p l c 常用于分析高沸点和热不稳定的非挥发性有机物( 如糖苷) 。 h p l c 分析一般采用c 1 8 或c 8 的填充柱，以甲醇、乙腈等水溶性有机溶剂作流 动相的反相色谱，选择紫外吸收 7 0 ，7 1 】、质谱 7 2 ，7 3 1 或荧光 7 4 ，7 5 或二极管阵 列检测器。与g c 相比，h p l c 的流动相参与分离机制，其组成、比例和p h 值 可灵活调节，可以采用离子对试剂，使之得到良好分离 7 6 7 9 1 。 1 4 4 液相色谱质谱联用( l c m s ) 技术 大部分挥发性有机物可用g c m s 检测，但对极性或热不稳定性太强的农药 ( 及其代谢物) 不适用，可采用高效液相色谱质谱法( h p l c m s ) 来检测。据统 计，液相色谱可以分析的物质约占世界上已知化合物的8 0 以上，内喷射式和 粒子流式接口技术可将液相色谱与质谱连接起来，己成功地用于分析一些对热 不稳定、分子量较大、难以用气相色谱分析的化合物。且具有检测灵敏度高、 选择性好、定性定量同时进行、结果可靠等优点。如果对种用于毛细管电泳 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 的新型电喷射接口加以改进使其适用与液质联用仪，将可大大提高分析灵敏 度。另外，研究开发毛细管液相色谱与离子捕获检测器的配合将会大大拓宽液 相色谱用于高灵敏度分析的范围。虽然液质联用对分析技术和仪器的要求高， 但它是一种很有利用价值的高效率、高可靠性分析技术。 1 4 5 超临界流体色谱( s f c ) 技术 超临界流体色谱( s f c ) 是以超临界流体作为色谱流动相的色谱。超临界流体 本质上是处于临界温度以上的高密度气体，既具有气体粘度小、扩散速度快、 渗透力强的特点，又具有液体对样品溶解性能好、可在较低温度下操作的特 点。s f c 可在较低温度下分析分子量较大、对热不稳定的化合物和极性较强的 化合物，可与各种气相、液相色谱检测器匹配；还可与红外、质谱联用，它能 通过调节压力、温度、流动相组成多重梯度，选择最佳的色谱条件，它综合了 气相色谱和高效液相色谱的优点，克服了各自的缺点，成为一种强有力的分离 和检测手段。 1 5 糖苷的合成与表征 1 5 1 糖苷的合成 由于糖苷结合态香味成分是植物中普遍存在的香味前体物，具有对热稳 定，在一定条件下释放香味物质的特点。从2 0 世纪8 0 年代开始，开始了糖苷 结合态香味成分在香料工业中的应用研究。 糖苷结合态香味成分应用于香料工业，可以克服传统香料存在挥发性强、 易升华和留香不持久等缺点。因此作为一种新型的香料在食品、烟草等行业中 有广泛的应用前景。目前已经筛选合成出一些糖苷结合态香味成分，如乙基香 兰素b d 吡喃糖苷，香叶醇b d 一葡萄吡喃糖苷等 8 0 ，8 1 ，并开始研究这些糖 苷结合态香味成分的热解情况，以实现其在食品、烟草加香中的应用。目前， 合成糖苷结合态香味成分的方法主要有k o e i g n s k n o r r 合成法、直接苷化法和酶 促合成法。 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 直接合成法多用于直链烷基糖苷的合成，反应温度都在1 0 0 以上 8 2 8 5 1 。香味成分常含有芳香基，结构复杂，糖分子中含有多个羟基，它们都具有 较高的活性，直接用香味成分和糖合成葡萄糖非常困难，反应中生成的糖苷不 仅会继续和糖反应生成二糖苷、三糖苷，糖自身也会聚合。因此直接合成法不 适用于糖苷香味前体的合成。 酶法合成是最新的合成方法。在酶催化糖苷的合成中，生成糖苷的速率及最 终的产率和糖苷酶的活性有很大关系。影响糖苷酶活性的因素复杂。不同来源 的b 葡萄糖苷酶在氨基酸序列、分子量、最适p h 值等方面差异很大，因此酶 的活性差异也很大 8 6 9 0 】。此外，酶的活性还和温度、反应中的溶剂等因素有 关。目前，酶促合成糖苷结合态香味成分是糖苷合成领域内的研究热点。 1 9 0 1 年k o e i g n s k n o r r 等人用重金属盐氧化银催化合成烷基和芳基糖苷 1 3 】。该方法已发展为合成糖苷的最成熟的方法。烷基糖苷和芳苷的合成都分 三步进行糖羟基的保护苷化保护基的脱保护。路线如下式所示： 糖堡茎兰坠保护糖! 些未脱保护的芳苷二坚生芳苷 由于糖分子上每个羟基都具有较高的活性，因此，必须在苷化前将糖分子 上的羟基有选择的保护起来。较常见的有酰溴保护、酰氟保护、乙酰基保护、 苄基保护、甲氧基保护、三甲基硅保护，还有s 、n 一甲基乙腈等不常见的保护 基团 9 l ，9 2 。无论用何种保护基保护的糖，它们都将在糖的1 位进行苷化反 应。其反应历程如图1 3 。但不同保护基团的糖反应活性不同，受糖苷的受体、 给体及反应条件的制约。并且得到的产物各有差异。 卤代乙酰葡萄糖是目前最常用的保护糖。糖中除c 1 键被卤素取代，其他位 的葡萄糖羟基可以被苄基、酰基、亚苄基取代。自1 9 0 1 年k o e i g n s k n o r r 提出 溴代糖作为糖基供体，金属盐( 如硫酸银、氧化银、铬盐) 做催化剂合成烷基 和芳基糖苷。m i c h a e l 最早成功合成的芳基糖苷是用酚盐与氯代四o 一乙酰基 q d 一吡喃葡萄糖反应而成 9 3 1 。19 8 8 年，h e r r o n 等人采用上述方法合成了乙基 香兰素四一o 一乙酰基q d 吡哺葡萄糖苷【9 4 。1 9 9 0 年，a n n ip a b s t 等人用 k o e i g n s k n o r r 法合成了覆盆子酮四o 乙酰基一p d 一吡喃葡萄糖苷 9 5 。 1 4 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 甑h 与 o s i ( c r l , 1 ) ， l e 是l _ 奠l 惑。r帆；_ 奠l 甑。r 影遗。二随 图1 3 糖苷的反应历程 经过几十年的发展，k o e i g n s k n o r r 法已取得了很大的进展。生成的糖苷不 但产率大大提高，而且以1 3 型为主。合成溴代糖的条件复杂苛刻。要制得溴代 糖需先制备溴代试剂。糖上的羟基先被完全乙酰化，再和溴代试剂反应，葡萄 糖中1 位上的乙酰基被溴取代。经过多步反应得到的溴代葡萄糖产率很低只有 6 0 ，且溴代糖的热稳定性差，超过4 0 c 就会分解 9 6 】。一步法合成溴代糖的 出现不仅大大简化了合成步骤，溴代糖的产率也得到提高，可达到9 9 。溴代 葡萄糖的合成方法被改进后，溴代糖成为最常用的一种保护基团 9 7 1 0 2 】。与 b r 、c l 相比，f 电负性最强，离去活性最低，因此氟代糖的选择性最好。经研 究，室温下氟代糖在b f 3 o e t 2 和1 ，l ，3 ，3 四甲基鸟嘌呤的甲腈溶液反应三 小时，得到的芳苷以b 型为主( 6 8 1 0 0 ) ，而仅在b f 3 o e t 2 甲腈溶液中反 应三小时得到的芳苷以1 3 型为主( 5 1 8 7 ) 【1 0 3 。但对苯环上含有与羟基相 邻较近并形成氢键的基团，这种方法得不到所要得芳苷。 1 5 2 糖苷的光谱表征 常用于糖苷表征的光谱方法包括红外、核磁和质谱。光谱分析法的表征是 针对于纯物质。 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章 红外光谱法是确定物质结构的一种普遍而又最简单的分析方法。每一种化 合物都有自己特征的红外吸收，在确认化合物中存在的官能团和官能团周围环 境方面，红外光谱优于任何一种结构分析手段。k o e i g n s k n o r r 法中有两种中间 体和一种最终产物，它们的官能团存在很大差异，如从最开始的糖生成溴代乙 酰糖，糖上的羟基全部被乙酰基取代，红外图中羟基峰会消失，羰基峰、c o c 的吸收峰等会出现。而香味成分和溴代乙酰糖生成苷时，会增加香味成分某 些特征的吸收，变为最终产物时，乙酰基被全部还原，红外图中应重新出现宽 的羟基峰，羰基峰消失，同时还应有香味成分的特征吸收。 常用的两种核磁共振波谱法，1 h - n m r 和c - n m r ，均可用于糖苷的定性 分析。现在n m r 发展最成熟：应用范围最广的是氢核共振，它可以提供糖苷 结构中氢原子所处的位置、化学环境、在各功能团或碳骨架上氢原子的相对数 目，以及分子构型等信息，为分析糖苷结构提供了重要依据。通过1 3 c n m r 谱 图，还可以计算c 【一和b 立体异构体的比值。由于 c n m r 谱能找出不同碳原子 特征峰，根据糖环上c l 一0 【和c 1 b 位上碳原子所对应的锋面积可计算出糖苷异构 体a ：b 的值。有多种质谱( m s ) 技术可以分析糖苷。常用的是电子轰击质谱 ( e i m s ) 由于轰击电子的能量较高( 一般7 0 e v ) ，不利于出现分子离子峰。除 此之外，用具有软电离设备的质谱分析糖苷可获得高的分子离子峰，少的碎片 峰。这些质谱有：基质辅助激光解析飞行时间质谱( m a l d i t o f m s ) 、热喷 雾质谱( t s p m s ) 、电喷雾离子化质谱( e s i m s ) 等。但应注意，糖菅中由 于糖上有多个羟基，在气化进样时会发生聚合，必须加以保护。 1 6 论文的研究思路和主要工作 烟草中游离态香味成分最常用的分离方法是s d e 法。烟草中糖苷结合态香 味成分的分离方法是基于a m b e r l i t ex a d 2 大孔树脂净化的前处理方法。考虑 到s d e 在分离富集游离态香味成分的同时，不挥发性的糖苷结合态香味成分在 水溶液中也被富集，并且糖苷水解前后挥发性会发生改变，由不挥发的结合态 水解释放出挥发性的香味成分，而其它与糖苷共存的杂质挥发性不变，仍是不 挥发物质。可利用这一点，将s d e 用于糖苷结合态香味成分的分离。本文中， 首先研究了s d e 分离烟草中游离态香味成分的条件。在此基础上，对结合态香 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 味成分的分离作了改进，建立了两步s d e 法同时分离了烟草中游离态和结合态 香味成分。 糖苷普遍存在与植物体内，性质稳定，在酸、酶或高温作用下会释放出香 味，是一种非常有应用前景的新型香料。合成糖苷最常用的方法是k o e i g