（生物化学与分子生物学专业论文）人趋化因子受体ccr5胞外结构域的重组表达、纯化、免疫学构象分析及其亲和短肽的筛选.pdf

中山大学硕十学位论文吴英萍 人趋化因子受体c c r 5 胞外结构域的重组表达、纯化、免疫学构象分析及其亲和短肽的筛选 人趋化因子受体c c r 5 胞外结构域的重组表达、纯化、 免疫学构象分析及其亲和短肽的筛选 专业：生物化学与分子生物学 硕士生：吴英萍 指导教师：吴文言副教授 摘要 本研究针对具有七次跨膜结构域的趋化因子受体c c r 5 ，构建c c r 5 胞外片段 的重组蛋白，并进一步进行体外构象鉴定，分析其与天然c c r 5 胞外结构域构象 的相似性，使之可作为靶分子筛选多肽拮抗剂和抗体，还可应用于直接封闭与 乳腺癌进展相关的趋化因子c c r 5 的天然趋化因子配体c c l 5 ( r a n t e s ) 的拮抗 剂。 为了获得天然趋化因子受体c c r 5 胞外结构域的模拟重组蛋白，本实验采用 不同的构建方法，将c c r 5 分子中与h i v 侵染相关的胞外结构域，如n 端胞外结构 域、第一个胞外环或第二个胞外环部分，进行不同形式组合构建出能应用于后 续研发的c c r 5 重组蛋白。主要构建了四种重组蛋白：( 1 ) 重组蛋白c c r 5i i l n e 卜 e 2 ：( 2 ) 重组蛋f h c c r 5n - l i n k e r e 2 ；( 3 ) 线性重组蛋白c c r 5e 2 - l - e 2 与环状 重组蛋白c c r 5c e 2 。实验中分别构建了p t w i n i - c c r 5f i l n e 卜e 2 、p t w i n i - c c r 5 n - l i n k e r e 2 、p t w i n i c c r 5e 2 一l i n k e r e 2 和p t w i n i c c r 5c e 2 五个原核表达质 粒。它们在原核系统中都得到高效表达，其中重组蛋白c c r 5m n - e 1 一e 2 与c c r 5 n - l in k e r e 2 通过纯化条件的优化，均获得9 5 和9 0 的高纯度样品。而重组蛋白 c c r 5e 2 一l i n k e r e 2 通过表达摸索也已确立了最佳条件，可用于后续的纯化研 究。 此外，为了鉴定上述重组蛋白的构象是否接近天然细胞表面的c c r 5 胞外结 构，采用w e s t e r nb l o t t i n g 、免疫沉淀法( i p ) 、酶联免疫吸附试验( e l i s a 法) 等免疫学方法进行构象鉴定。主要针对重组蛋白与c c r 5 单克隆抗体2 d 7 、 3 a 9 ，重组蛋白与c c r 5 天然趋化因子m e t r a n t e s ，重组蛋白与h i v - ig p l 2 0 分子 之间的结合力进行亲和鉴定。最终结果证明，上述两个纯化后的重组蛋白均具 备与天然c c r 5 高度相似的抗原表位，可用于以c c r 5 为靶分子的多肽拮抗剂筛选 中山大学硕士学位论文吴英萍 人趋化因子受体c c r 5 胞外结构域的重组表达、纯化、免疫学构象分析及其亲和短肽的筛选 和抗体制备的后续研发，或者直接应用于封闭天然趋化因子配体c c l 5 ( r a n t e s ) 以阻断乳腺癌进展。 为了获得了针对c c r 5 的拮抗短肽，本实验采用噬菌体展示技术将重组蛋白 c c r 5m n e 1 一e 2 与重组蛋白c c r 5n - l i n k e r - e 2 应用于噬菌体十二肽库的进一步筛 选，获得了九株具有高亲和力的噬菌体克隆及其编码的多肽序列，可用于后续 细胞活性分析实验。 关键词：人趋化因子受体，胞外结构域，构象分析，亲和短肽，c c r 5 拮抗剂， 噬菌体展示技术 i i 中山大学硕十学位论文吴英萍 人趋化因子受体c c r 5 胞外结构域的重组表达、纯化、免疫学构象分析及其亲和短肽的筛选 e x p r e s s i o n ，p u r i f i c a t i o n ，i m m u n o a s s a yo fr e c o m b i n a n t e x t r a c e l l u l a rd o m a i n so fh u m a nc h e m o k i n er e c e p t o r5 , a n d s c r e e n i n gf o ra f f i n i t yp e p t i d e s m a j o r ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y n a m e ：y i n g p i n gw u s u p e r v i s o r ：w e n y a nw 叱a s s o c i a t ep r o f e s s o r a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , t h er e c o m b i n a n tp r o t e i n sc o m p r i s i n gt h ee x t r a c e l l u l a rd o m a i n so f h u m a nc h e m o k i n er e c e p t o r5 ( c c r 5 ) ，w h i c hb e l o n g st ot h ef a m i l yo fg p r o t e i n - c o u p l e dw i t hs e v e nt r a n s m e m b r a n ed o m a i n sw e r ec o n s t r u c t e d a n df u r t h e ra n a l y s i s i n c l u d i n gc o n f o r m a t i o n a li m m u n o a s s a yo fr e c o m b i n a n tp r o t e i n sa b o v ew e r ea c h e i v e d i nv i t r oc o m p a r i n gw i t hn a t u r a lc o n f o r m a t i o no fc c r 5 i na d d i t i o nt oat a r g e t m o l e c u l ef o rs c r e e n i n ga n t a g o n i s t sa n dp r e p a r i n ga n t i b o d i e s ，t h e s er e c o m b i n a n t p r o t e i n sc a nb eu s e da st h ea n o l o ga n t i g e n si nt h ef o l l o w i n gr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n t ， f o re x a m p l e ，t h ec c r 5a n t a g o n i s t sc o u l db eu s e da st h ei n h i b i t sb l o c k i n gt h eh i v i n f e c t i o n , a n dt h ec c r 5a n o l o ga l s od i r e c t l ya st h eb r e a s tc a n c e ra n t a g o n i s t sb y b l o c k i n gc c l 5 ( r a n t e s ) ，t h en a t u r a ll i g a n do fc c r 5 i no r d e rt om i m i ct h ee x t r a c e l l u l a rd o m a i n so fn a t u r a lc c r 5 ，d i f f e r e n tc o n s t r u c t i o n s t r a t e g i e sw e r ea p p l i e d ，a n df o u rr e c o m b i n a n tp r o t e i n sc o m p r i s i n gt h ee x t r a c e l l u l a r d o m a i n so fc c r 5r e l a t e dw i t hh i vi n f e c t i o nw e r ec o n s t r u c t e d ，i n c l u d i n gt h en t e r m i n a le x t r a c e l l u l a rd o m a i n ，t h ef i r s to r a n ds e c o n de x t r a c e l l u l a rl o o p s t h ef o u r r e c o m b i n a n tp r o t e i n sw e r en o m i n a t e da s ：( 1 ) c c r 5m n e1 - e 2 ；( 2 ) c c r 5n - l i n k e r - e 2 ；( 3 ) l i n e a rr e c o m b i n a n tp r o t e i no fc c r 5e 2 一l i n k e - e 2a n d ( 4 ) c y c l i cr e c o m b i n a n t p r o t e i no fc c r 5c e 2 a n dt h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n a lp l a s m i d so fp t w i n i - c c r 5 m n - e 1 - e 2 ，p t w i n i - c c r 5 n - l i n k e r - e 2 ，p t w i n i c c r 5e 2 - l i n k e r - e 2a n dp t w i n i c c r 5c e 2w e r ec r e a t e d ，r e s p e c t i v e l y t h eh i g he x p r e s s i o nl e v e lw a sr e a c h e da l l ，a n d i nw h i c ht h eh i g h - p u r i t yo f9 5 a n d9 0 w e r ea l s oa c h i e v e db yo p t i m i z i n gt h e c o n d i t i o n so fe x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no fc c r 5 m n e1 一e 2a n dc c r 5n l i n k e r - e 2 ， r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a le x p r e s s i o nc o n d i t i o no fc c r 5e 2 l i n k e r - e 2w a sa l s o e s t a b l i s h e d ，w h i c hc a nb eu s e df o rs u b s e q u e n tp u r i f i c a t i o n i no r d e rt oc o n f i r mt h ee p i t o p e - c o n f o r m a t i o n a li d e n t i t yb e t w e e nt h er e c o m b i n a n t p r o t e i n sa b o v ea n dt h ee x r a c e l l u l a rd o m a i n so fn a t u r a lc c r 5 ，a na s s a ys y s t e mf o r c o n f o r m a t i o ni d e n t i f i c a t i o nw a sc a r r i e d o u t ，s u c ha s w e s t e m b l o t t i n g ， i i i 中山大学硕士学位论文吴英萍 人趋化因子受体c c r 5 胞外结构域的重组表达、纯化、免疫学构象分析及其亲和短肽的筛选 i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( i p ) ，e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) ，a n do t h e r i m m u n o l o g i c a lm e t h o d s a f f i n i t yi d e n t i f i c a t i o nt r a i l sw e r em a i n l yt a r g e t i n gt ot h e r e c o m b i n a n tp r o t e i n sb yu s i n gm o n o c l o n a la n t i b o d y2 d 7 3 a 9a g a i n s tc c r 5 ，n a t u r a l c c r 5c h e m o k i n em e t - r a n t e s ，a n dr e c o m b i n a n tp r o t e i nh i v - 1g pl2 0 t h ea n a l y s i sr e s u l t so ft w op u r i f i e dr e c o m b i n a n tp r o t e i n sa b o v es h o w e dah i g h d e g r e ei d e n t i c a lt on a t u r a lc c r 5o nt h ea n t i g e n e p i t o p ec o n f o r m a t i o n ，i n d i c a t i n gt h e p o t e n t i a lt ob eu s e dt os c r e e n i n gf o rc c r 5a n t a g o n i s t sa n da n t i b o d yp r e p a r a t i o n ，a l s o a p p l i e dd i r e c t l yt oi n h i b i tt h ep r o g r e s s i o no fb r e a s tc a n c e rb yb l o c k i n gn a t u r a l c h e m o k i n el i g a n dc c l 5 ( r a n t e s ) f o rt h ep u r p o s eo fo b t a i n i n gt h ea n t a g o n i s t i cp e p t i d e sa g a i n s tc c r 5 ，s e v e r a lh i g h a f f i n i t yp h a g ec l o n e sw e r ei d e n t i f i e df r o mt h et w e l v e - p e p t i d ep h a g el i b r a r yb yu s i n g t h ep h a g ed i s p l a yt e c h n o l o g y , a c q u i r e dp o l y p e p t i d e se n c o d i n ga m i n oa c i ds e q u e n c e s t a r g e t i n gt ot h er e c o m b i n a n tp r o t e i nc c r 5m n e 1 e 2a n dc c r 5n l i n k e r - e 2a r e v a l u a b l ef o rs u b s e q u e n ta n a l y s i se s p e c i a l l yf o rc e l l u l a ra c t i v i t ya s s a y k e yw o r d s ：h u m a nc h e m o k i n er e c e p t o r5 , e x t r a c e l l u l a rd o m a i n s ，c o n f o r m a t i o n a l i m m u n o a s s a y , a f f i n i t yp e p t i d e s ，c c r 5a n t a g o n i s t s ，p h a g ed i s p l a y t e c h n o l o g y i v 中山大学硕士学位论文吴英萍 人趋化因子受体c c r 5 胞外结构域的重组表达、纯化、免疫学构象分析及其亲和短肽的筛选 a i d s a m p a c r b i s p m e b s a b p c a c l 2 c b d c c r 5 d n a d t t d d h 2 0 d n t p e b e c l e c o l d e d l a e l i s a f a b f d a h h i v h h v 二8 i p i p t g k b 缩略语 a q u i r e di m m u n o d e f i c i e n c ys y n d r o m e 获得性免疫缺陷综合症 a m p i c i l l i n a c r y l a m i d e 氨苄青霉素 丙烯酰胺 n , n - m e t h y l e n eb i s a c r y l a m i d e nn - 亚甲双丙烯酰胺 1 3 - m e r c a p t o e t h a n o l 1 3 - 巯基乙醇 b o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白 b a s ep a i r 碱基对 c a l c i u mc h l o r i d e氯化钙 c h i t i n b i n d i n gp r o t e i n 几丁质结合蛋白 c h e m o k i n er e c e p t o r5 趋化因子受体5 d e o x y r i b o s en u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 d i t h i o t h r e i t o l二硫苏糖醇 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r 双蒸水 d e o x y r i b o n u c l e i ct r i p h o s p h a t e 脱氧核糖核苷三磷酸 e t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 e x t r a c e l l u l a rl o o p 胞外环 e s c h e r i c h i ac o l i大肠杆菌 e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t a t ea c i d 7 , - - 胺四乙酸 e n z y m eli n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附试验 f r a g m e n to fa n t i g e nb i n d i n g 抗原结合片段 f o o da n dd r u g a d m i n i s t r a t i o n美国食品与药品管理署 h o u r 小时 h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s人免疫缺陷病毒 h u m a n h e r p e s v i r u s8 入疱疹病毒8 i m m u n o p r e c i p i t a t i o n 免疫沉淀 l i s o p r o p h y lt h i o p d g a l a c t o s i d e异丙基代一p - d 半乳糖苷 k i l o b a s e千碱基对 1 4 8 中山大学硕士学位论文吴英萍 人趋化因子受体c c r 5 胞外结构域的重组表达、纯化、免疫学构象分析及其亲和短肽的筛选 k d a m a b m e s n a m l n m w n t n c o d p b s p c r p e g p f u p d t r a n t e s r p m s s d s k i l o d a l t o n m o n o c l o n a la n t i b o d y 千道尔顿 单克隆抗体 2 - m e r c a p t o e t h a n es u l f o n i ca c i d 2 一巯基乙磺酸钠 m i n u t e m o l e c u l a rw e i g h t n - t e i m i n a l n i t r o c e l l u l o s em e m b r a n e o p t i c a ld e n s i t y p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y e t h y l e n eg l y c o l p l a q u e - f o r m i n gu n i t p h a g ed i s p l a yt e c h n i q u e s r e g u l a t e do na c t i v a t i o nn o r m a l tc e l le x p r e s s e da n ds e c r e t e d r o u n d sp e rm i n u t e s e c o n d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 分钟 分子量 n 末端 硝酸纤维素膜 光密度 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 聚乙二醇 空斑形成单位 噬菌体展示技术 活化后可调节的、正常 t 细胞表达并分泌的因子 每分钟转速 秒 十二烷基磺酸钠 s d s p a g e s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 s o e t e m e d t e t s s p l i c i n gb yo v e r l a p p i n ge x t e n t i o n 重叠延伸拼接 n ，n ，n n t e t r a m e t h y l e t h t l e n e d i a m i n e n ，n ，n n 一四甲基乙二胺 t e t r a c y c l i n e 四环素 t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 三羟( 甲基) 氨基甲烷 1 4 9 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 r 7 牛爿。 学位论文作者签名：欲砗 日期：w 年多月易日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅。有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索。可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 保密论文保密期满后适用本声明。 学位论文作者签名：男滚许 导师签名：灭友么 、 日期：夕移厂p 年莎月于日 中山大学硕十学位论文吴英萍 人趋化因子受体c c r 5 胞外结构域的重组表达、纯化、免疫学构象分析及其亲和短肽的筛选 第一章前言 1 1 趋化因子受体c c r 5 与a i d s 1 1 1 趋化因子受体c c r 5 及其介导的h i v 入侵机制简介 1 9 8 1 年，人类发现第一例由人类免疫缺陷病毒( h i v ) 引起的传染性疾病一 获得性免疫缺陷综合症( 简称艾滋病) ，科学家对艾滋病的临床治疗已有了很大 进展，但是目前仍无有效治愈手段可以攻破此科学难题。研究表明，h i v 可分 为h i v - 1 和h i v - 2 两种亚型，h i v - 1 致病力强，是引起a i d s 的主要病原。随着 对病毒入侵过程的深入了解，1 9 8 4 年，研究者证实了t 淋巴细胞表面的c d 4 分 子为h i v - 1 入侵细胞时识别的主要受体；1 9 9 6 年证实，趋化因子受体c x c r 4 和 c c r 5 是h i v 一1 感染的主要辅助受体( a l k h a t i bg ，e ta l ，1 9 9 6 ：d e n gh ，e t a l ，1 9 9 6 ) ；而到2 0 0 8 年，研究者又明确了另一个h i v - 1 识别受体一整合酶 o 。b ，的作用在于介导病毒于消化道内大量复制( a r t h o sj ，e ta l ，2 0 0 8 ) 。 趋化因子受体是属于鸟嘌呤核苷酸结合蛋白( g 蛋白) 偶联的七次跨膜蛋白 受体家族，根据其配体的不同可分为c x c 和c c 受体。趋化因子受体c x c r 4 与 c c r 5 ，因其与h i v 一1 的侵染有关而备受关注。几乎所有的h i v - 1 病毒株都是利 用c c r 5 或c x c r 4 受体，或同时利用两种辅助受体侵入宿主细胞的。有研究表 明，c c r 5 和c x c r 4 的n 一末端和第二胞外区对于它们与h i v - 1g p l 2 0 的结合起着 关键的作用( p a t e r l i n im g ，2 0 0 2 ) 。c c r 5 是细胞内b 趋化因子( r a n t e s 、 m i p - 1q 和m i p - 1b ) 的受体，具有调控t 细胞和单核细胞巨嗜细胞系的迁 移、增殖与免疫的功能，主要表达于记忆性的静止期t 淋巴细胞、单核细胞、 未成熟的树突状细胞等的细胞膜上。它的分子量为4 0 6 k d ，由3 5 2 个氨基酸残 基组成，结构上可分为：胞外n 一末端，3 个胞外环( e c l l - 3 ) ，3 个胞内环 ( i c l l 3 ) ，7 个跨膜a 螺旋和胞内c 一末端。如f i g 卜l 所示( p a t e r l i n i m g 。2 0 0 2 ) 。 人趋化目于壁体c c r 5 胞；：i ：；i 篓冀：纯化、免痤学i ；i 析j # 亲祁短胜的缔造 图i - ! c c r $ 一级结构 f i gl - lp r i m a r ym n k m r eo f c c r 5 c c r 5 辅助h i v l 感染的过程是一个复杂的级联和构象变化过程，h i v1 g p l 2 0 和c c r 5 的相互识别作用可能遵循两步结合机制( 张小林等，2 0 0 9 ) ( 见 f i g 卜2 ) ：第一步，c c r 5 的n 一末端区域识别并结合h i vg p l 2 0 分子；第二步， g p l 2 0 分子与c c r 5 的构象发生变化，c c r 5 的第二胞外区与g p l 2 0 的v 3 区相互 作用，最终导致膜融合和病毒r n a 注入细胞。因此，c c r 5 作为h i v i 的重要辅 助受体参与膜融合过程。其n 末端和e c l 一2 主要与g p l 2 0 相互作用，而n 末端 对于h i v 一1 的感染来说是必需的( t h o m p s o nd a ，e ta l ，2 0 0 2 ) 。c c r 5 与趋化因 子或g p l 2 0 的结合位点是相互独立的，或者有部分重叠，产生的不同功能主要 是通过极性、疏水性氨基酸的三维构象的细微调整柬实现( 吴英萍等，2 0 0 8 ) 。 利用何种趋化因子受体侵入细胞决定了h i v1 病毒株的嗜性。h i v ig p l 2 0 与何种辅助受体结合是随着h i v l 侵入靶细胞的不同阶段而有所变化的，通常 在感染的切期是以c c r 5 为辅助受体：随着感染程度的加深h i v l 由r 5 嗜性 转化为r 5 x 4 嗜性，而双嗜性的h i v l 是蚍c x c r 4 为主要辅助受体的。 中山大学硕士学位论文 吴英萍 人趋化因子受体c c r 5 胞外结构域的重组表达、纯化、免疫学构象分析及其亲和短肽的筛选 图1 - 2h i v 入侵宿主过程 f i g ! - 2t h ep r o c e s so fh i vi n f e c t i o n 1 1 2 以c c r 5 为靶点的抗h i v 拮抗剂 目前，研究者已在此基因的编码区和启动子区域发现了多种有意义的突 变，尤其对基因编码区突变体c c r 5 a 3 2 的研究最为广泛，c c r 5 a 3 2 是指c c r 5 基因发生的3 2 个碱基缺失的突变，即在c c r 5 等位基因编码区域第1 8 5 位氨基 酸密码子以后发生了3 2 个碱基缺失，导致读码框错位，缺失了与g 蛋白信号通 路相关的胞外第三环结构，从而使c c r 5 蛋白无法正常穿膜表达于细胞膜上，进 而使h i v 一1g p l 2 0 不能与c c r 5 3 2 有效结合，使h i v 一1 病毒不能进入宿主细胞 ( r a n as ，e ta l ，1 9 9 7 ) 。人群调查和实验研究结果表明，c c r 5 a 3 2 缺失的个体 拥有正常的免疫功能和炎症反应，并且对h i v 一1 的感染表现出显著的抵御能 力，由此研究者推断，作用于c c r 5 的封闭抑制剂将有效阻断h i v l 的感染( 吴 英萍等，2 0 0 8 ) 。 目前已有3 0 多种抗h i v - 1 药物得到美国食品与药品监督管理局( f d a ) 批 准，然而，已被批准的药物中没有一种是可以完全抑制病毒感染的，而且由于 h i v - 1 突变株的产生，大部分均对不同类型的拮抗剂具有耐药性。r 5 嗜性株对 c c r 5 拮抗剂产生耐药性的主要原因是r 5 在复制过程中累积了g p l 2 0v 3 环及 v 3 环以外的氨基酸残基变异，某些r 5 在入侵过程中因此可利用己结合有 c c r 5 拮抗剂的c c r 5 ( 张小林等，2 0 0 9 ；p u g a c hp ，e ta l ，2 0 0 7 ) 。v 3 环是决定 h i v - 1 嗜性的关键部位，但r 5 嗜性株耐药性的产生大多数不伴有嗜性转变。而 且临床上有限的数据积累亦显示，已开发的c c r 5 拮抗剂在临床试验中还未发现 有加快耐药株嗜性转换的病例( 吴英萍等，2 0 0 8 ) 。因此，c c r 5 拮抗剂的应用不 会加剧病情的恶化反应。目前，c c r 5 拮抗剂主要有趋化因子衍生物、非肽类小 中山大学硕七学位论文吴英萍 人趋化因子受体c c r 5 胞外结构域的重组表达、纯化、免疫学构象分析及其亲和短肽的筛选 分子化合物、单克隆抗体、肽类化合物四种。 b 趋化因子( r a n t e s 、m i p lq 及m i p lb ) 作为c c r 5 的天然配体，是 h i v - i 受体当然的拮抗剂，在一定程度上可以保护细胞免受h i v - i 的感染，其 主要作用机制是诱导了c c r 5 的内吞作用( e n d o c y t o s i s ) 。然而，有报道显示， 高浓度的c c 一趋化因子能够减缓病情的恶化，但是m a r o z s a na j 等研究人员同 时也发现高浓度的c c 一趋化因子也可通过活化细胞而增强h i v - 1 的感染。因此 与天然的配体相比，趋化因子衍生物通过不诱导信号通路而使受体内化的方式 阻断相应的受体表位而更具优越性。目前以非肽类小分子化合物c c r 5 拮抗剂的 研究占居主导地位，这类小分子拮抗剂不具有潜在的炎症应答效应，并且具有 比生产小分子蛋白成本低，可通过静脉注射方式给药的优势，但是它也具有不 能下调受体表达的缺点。此外，研究也表明，c c r 5 的单克隆抗体与不同的受体 表位结合且能产生不同的抑制效应。而c c r 5 肽类拮抗剂与单克隆抗体一样可与 辅助受体c c r 5 的胞外环结构域识别，但又不同于小分子拮抗剂产生的毒性作 用，肽类拮抗剂能够特异性地与c c r 5 的特定胞外结构域结合而产生抑制作用， 不会产生毒性作用，安全性好，但也具有不稳定易被消化降解的缺点( 吴英萍 等，2 0 0 8 ) 。 趋化因子衍生物以r a n t e s ( 3 6 8 ) 、a o p ( 氨基氧戊烷) 一r a n t e s 、( n n y ) 一 r a n t e s 、m e t r a n t e s 、p s c r a n t e s 、v m i p i 和v m i p i i 为代表；非肽类小分子 化合物以t a k - 7 7 9 、t a k - 2 2 0 、t a k 一6 5 2 、s c h 一3 5 11 2 5 ( s c h - c ) 、s c h - 4 1 7 6 9 0 ( s c h d ) 、g w 8 7 3 1 4 0 、m a r a v i r o c ( u k 一4 2 7 8 7 5 ) 等为代表( 吴英萍等， 2 0 0 8 ) ，尤其是m a r a v i r o c ，是目前唯一被f d a 批准上市的c c r 5 拮抗剂。单克 隆抗体则以p r 0 1 4 0 、m a b 0 0 4 、2 d 7 、3 a 9 、r o a b l 2 、r o a b l 3 、r o a b l 4 、r o a b l 8 和 c c r - 0 2 等为代表；肽类化合物以s 一肽、环十二肽c d d r - m a p 为代表( 吴英萍 等，2 0 0 8 ) 。目前，进入临床试验的c c r 5 拮抗剂有( 见t a b l e1 - 1 ) ( 张小林 等，2 0 0 9 ) ： 4 中山大学硕士学位论文吴英萍 人趋化因子受体c c r 5 胞外结构域的重组表达、纯化、免疫学构象分析及其亲和短肽的筛选 表i - i 进入临床试验的c c r 5 拮抗剂概括 t a b l e1 - l s u m m a r yo fc c r 5a n t a g o n i s t si nc l i n i c a lt r i a l s 大量临床实践证明，单一抗h i v 药物治疗h i v 极易产生耐药性，故c c r 5 拮抗剂应与其他几类抗h i v 药物联合使用。s c h c 、v i c r i v i r o c 、t a k 一2 2 0 分 别与z i d o v u d i n e 、l a m i v u d i n e 、e f a v i r e n z 、i n d i n a v i r 等抗h i v 药物中的 一种或两种联合使用，对r 5 嗜性病毒株的抗病毒活性几乎都有协同作用 ( b a b am ，e ta l ， 2 0 0 5 ：t r e m b l a yc l ，e ta l ，2 0 0 2 ：t r e m b l a yc l ，e ta l ， 2 0 0 5 ) 。在临床研究中，a p l a v i r o c 、m a r a v i r o c 或v i c r i v i r o c 与其他几类抗 h i v 药物联合使用治疗h i v - 1 感染患者，效果较理想( 张小林等，2 0 0 9 ) 。如 m a r a v i r o c 与r i t o n a v i r 及一种蛋白酶抑制剂联合运用( r e v i l lp ，e t a l ，2 0 0 7 ) 。由此可见，c c r 5 拮抗剂在h i v - i 的联合治疗中前景广阔。 1 1 3 本研究利用噬菌体随机肽库体外筛选c c r 5 的短肽拮抗剂的设想 目前，噬菌体肽库的筛选技术是肽类化合物筛选的重要方法，同时这种肽 类化合物也是拮抗剂研究的一个理想方向。通过噬菌体肽库的筛选技术发现的 与蛋白靶点具有高亲和力和特异性结合的肽，具有活性较高( 1 5 - - - 6 0 倍) 、稳定 性较高、与免疫系统发生不相关相互作用的机会较少、器官和肿瘤穿透性较好 等优点，甚至可以和抗体相媲美，成为生物制药中一种可靠替代品( 吴英萍等， 2 0 0 8 ) 。王芳宇等( w a n gf y ，e ta l ，2 0 0 7 ) 采用噬菌体展示技术，从噬菌体随机 1 2 肽库筛选到与c c r 5 特异结合的亲和短肽( a f d w t f v p s l i l ) 。并初步证明该序 列与c c r 5 的第二外环( e c l 2 ) 具有特异性结合作用。同时该短肽对r a n t e s 以及 抗c c r 5 单克隆抗体同时具有竞争结合和封闭g p l 2 0 的结合作用。 5 中山大学硕士学位论文吴英萍 人趋化因子受体c c r 5 胞外结构域的重组表达、纯化、免疫学构象分析及其亲和短肽的筛选 此前的研究中，大部分的学者采用了于细胞表面直接进行噬菌体肽库的筛 选工作，然而这样会碰到一个问题是细胞表面的受体或分子种类很多，无法保 证筛选所得的亲和短肽是否以c c r 5 为唯一靶蛋白，因而也增加了噬菌体筛选过 程中的盲选几率及不确定因素。鉴于此，我们在研究的设计思路上进行了新的 挑战和改变。我们利用原核表达系统构建了多个模拟c c r 5 胞外结构域的重组蛋 白，摸索了一系列表达纯化条件，采用免疫学方法体外鉴定了重组蛋白构象的 相似性之后，利用噬菌体展示技术筛选亲和力高的短肽，最终可通过化学合成 短肽或原核表达重组短肽的方法，对这些具有潜力的亲和短肽进行细胞实验以 进一步确定其拮抗和封闭h i v 与宿主膜融合的作用。 1 2 趋化因子受体c c r 5 与乳腺癌 1 2 1 趋化因子r a n t e s ( 又名c c l 5 ) 与疾病 趋化因子是一类具有趋化活性的小分子细胞因子，其功能在于募集细胞表 面具有跨膜g 蛋白偶联受体的细胞聚集在一起，参与体内的免疫平衡作用。迄 今为止，已发现人类趋化因子家族有5 0 多个成员( 吴英萍等，2 0 0 8 ) 。r a n t e s ( 又名c c l 5 ) 是活化正常t 细胞表达和分泌的调节物，是c c r 5 的天然趋化因 子，它能增强细胞毒作用和抑制h i v 复制( 姚玲等，2 0 0 6 ) 。 r a n t e s 以两种不同的信号转导途径激活t 细胞。低浓度( n m o l l ) 时， r a n t e s 通过g 蛋白受体介导的途径，引起t 细胞瞬时钙离子内流、受体极化和 细胞迁移( 姚玲等，2 0 0 6 ) 。高浓度( m m o l l ) 时，r a n t e s 可通过p t k 介导的途 径，引起持续钙离子内流、过度磷酸化和细胞活化。r a n t e s 活化单核细胞及嗜 酸性粒细胞的确切机制尚不明了( 姚玲等，2 0 0 6 ) 。而当r a n t e s 为单体或双体 或浓度为纳摩尔级时，其受体为c c r l 、c c r 3 、c c r 4 和c c r 5 ，具有趋化活性、 可增强细胞毒作用和抑制h i v 复制。多聚体形式或微摩尔水平的r a n t e s 主要 通过与细胞表面的g a g 结合导致t 细胞、单个核细胞及巨噬细胞的活化，增强 h i v 的复制( 李臻等，2 0 0 6 ) 。多聚化的r a n t e s 不仅可以激活炎性细胞，延长 并加重炎性反应，还可调节细胞的生长和分化；r a n t e s 既可以发挥抑制病毒复 制的效应，在一定条件下也可以促进h i v 复制。 r a n t e s 通过两种机制来抑制h i v 的复制：一方面通过空间位阻效应阻断病 毒包装蛋白g p l 2 0 与c c r 5 的结合；另一方面通过下调细胞表面c c r 5 的表达， 6 中山大学硕士学位论文吴英萍 人趋化因子受体c c r 5 胞外结构域的重组表达、纯化、免疫学构象分析及其亲和短肽的筛选 即阻断c c r 5 内吞之后的再循环( 李臻等，2 0 0 6 ) 。r a n t e s 表达水平增高和很多 的炎症反应都有关，如异体移植排斥、动脉粥样硬化、关节炎、特应性皮炎、 哮喘、肾小球肾炎、子宫内膜异位症、a l z h e i m e r 病等( f e r r e i r a m a ，2 0 0 3 ) 。 m o r in 等( m o r in ，e ta l ，2 0 0 4 ) 研究发现，乳腺癌、淋巴瘤中高表达 r a n t e s 及其受体c c r 5 ，且肿瘤组织中浸润了大量的单核细胞，高表达r a n t e s 及其受体c c r 5 的肿瘤易发生转移。n o u h 等( n o u hm a ，e ta l ，2 0 0 5 ) 认为 r a n t e s 可作为乳腺癌预后的标志。前列腺癌细胞亦高表达r a n t e s ，且与其侵袭 性有关，用抗c c r 5 抗体可阻断其侵袭性( v a d a yg g ，e ta l ，2 0 0 6 ) 。 目前研究发现( 刘晶等，2 0 0 9 ) ，通过对来源于上皮组织的实体