（分析化学专业论文）高效液相色谱化学发光分析研究.pdf

摘要 皇曼曼! 曼詈曼曼曼詈鲁詈曼曼曼曼鲁鲁皇曼曼, - i 一_ 曼量鼍皇量葛葛詈暑鼍曼詈鼍曼鼍曼詈曼量皇皇曼! 曼 高效液相色谱化学发光分析研究 分析化学专业博士研究生陈福南 指导教师章竹君教授 摘要 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，e l ) 是在没有光、电、磁、声、热源激发的情况下，由化 学反应或生物化学反应产生的一种光辐射。以此为基础的化学发光分析，由于可以进行发射 光子计量，又没有外来激发光源存在时散射光背景的干扰，因而具有很高的灵敏度( 检出限 可达l f f l l i o - 2 j m 0 1 ) ，很宽的线性范围( 3 - 6 个数量级) ，同时仪器设备又很简单、廉价、易微 型化，在近三十年发展非常迅速然而，化学发光分析法的一个突出的缺点是选择性比较差， 严重制约了它的应用。人们采用了多种方法来弥补化学发光分析的这个缺陷，一是与特异性 分子识别反应联用，如酶反应，包括纯酶反应、动植物组织或细胞；抗原一抗体反应或受体 配体反应：核酸、适配体、d n a 、r n a 等特异性识别及分子印迹聚合物识别等。另一种方 法是将化学发光分析同高效分离方法相结合，姐高效液相色谱，毛细管电泳和凝胶电泳等。 高效液相色谱i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 是一种具有高效、快速 及应用广泛的现代分离技术。具有分离效率高、选择性好、分析速度快、操作自动化、应用 范围广的特点，已经成为有机物质分析的支柱技术，在生物化学、临床医学、食品检验、石 油化工及环境污染监测等领域得到广泛的应用。对h p l c 的研究主要集中在三个方面：一是 研究各种类型的色谱柱：二是研究与h p l c 耦合的检测器：三是研究如何拓宽h p l c 的应用 范围。检测器作为h p l c 系统的重要组成部分，充当着“眼睛”的角色人们已经研究和开发 了多种检测器。如紫外可见光检测器( o r v l s ) 、光电二极管阵列检测器( p d a ) 、荧光检测器 ( f l d ) 、示差折光检测器( r j d ) 、电化学检测器( e c d ) 、蒸发激光散射检测器( e l s d ) ，光电导 检测- - 器( p c d ) 、磁旋光检测器( m d r ) 、放射性检测器( r d ) 、热离子化检测器( t i d ) 、化学发光 检测器( c l d ) 和质谱( m s ) 捡测器等。往众多的h p l c 检测器当中化学发光检测器结构简 西南大学博士学位论文 量! 曼暑i笪曼曼皇曼曼皇舅一蔓蔓一 _ 一| 1 1 曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼皇曹曼皇曼! 皇曼皇曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼单，背景低，灵敏度高，被越来越多地应用于各种复杂样品中p g 或龟级含量化合物的检测。 与紫外检测器、荧光检测器等常用的检测器不同，化学发光检测器不是一种通用的检测器， 某些共存物质即使不能通过色谱柱很好分离，也会因为其中一些物质不能发生化学发光，或 者产生化学发光的条件不同而被区分开来，这就可以避免了在紫外检测等方法里不可避免的 干扰。因此化学发光检测器与h p l c 联用成为当今化学发光分析分析研究及应用非常活跃的 热点之一。 h p l c c l 联用技术从理论上结合了二者的优势，可以实现高灵敏度、高选择性的快速分 离分析。实际应用中仍然存在两个主要问题：1 ) 由于化学发光检测器需要在检测池中进行化 学发光反应，反应试剂溶液的加入会出现稀释效应并导致色谱峰展宽，使h p l c 分离度降低。 2 ) 色谱分离条件与化学发光反应条件不一致，因而不是所有的化学发光体系都适合用作色谱 柱后检测器。 围绕这两个问题，本研究设计了一种新的化学发光检测池，将分离柱后的毛细导管直接 插入流动的和不断更新的化学发光试剂环形池中，由于所建立的化学发光反应是一种快速化 学发光反应。从柱后流出的各分离组分能立即在检测池中产生化学发光反应并立刻被窗口检 测到。这样设计的检测池无任何死体积和稀释效应存在，与传统的化学发光检测器比较，获 得的色谱峰比较窄，从而提高了分离度。通过在完成反应池设计、柱后接口、优化色谱分离 和化学发光检测器条件的基础上，提出了一系列灵敏度高、选择性好的h p l c c l 检测新方 法，并将这些新的高效液相色谱- 化学发光检测方法应用于生物样品如人体血液和尿液中某些 痕量药物的检测。结合微透析技术还实现了活体、在线、实时药物代谢动力学研究。 活体动态生化分析是近年来在分析化学领域迅速发展起来的新的研究领域。其中微透析 技术占重要地位。微透析技术是一种新型的生物采样技术，在药物代谢动力学领域，尤其是在 药物分布与代谢的研究方面发挥着日益重要的作用。传统的药代动力学研究都是采用脱线分 析，不能完全真实反应组分在动物体内的分布和代谢情况。而微透析取样方法对组织损伤小， 可以在基本上不破坏生物体内环境的前提下对细胞间液中小分子物质进行连续取样。当采用 在线分析时，还可以使被透析出的物质在接近体内环境的条件下得到检测。可以实时的监测 到体内多种化合物量随时间的变化。取样无需匀浆过程，可真实代表取样位点目标化合物的 浓度，同时在体内不同部位插入微透析探针可研究目标化合物的体内分布，即具有空间分辨 性这是其它化学微环境在位监测方法无法比拟的对于研究生命过程、进行疾病诊断以及 开展约物研究具有重要意义。本论文还研究了h p l c c l 分析方法与微透忻采样技术结合起 摘要 来的活体动态生化分析并应用于药物和生化物质的动力学代谢研究 现就h p l c - c l 检测技术的研究进展( 第一章) 和具体研究工作( 第二四章) 简述如下： 第一章主要就h p l c c l 检测技术的基本原理、典型化学发光反应体系( 包括鲁米诺及其 衍生物、过氧化草酸酯、- - ( 2 ，2 一联吡啶) 钉o d 、高锰酸钾化学发光体系等) 、柱后化学发光检 测器的构建及近1 0 年来在生命科学、药学、临床医学、环境及食品等领域的应用和进展情况 进行了评述。对这一检测技术在实际应用中存在的问题进行了分析，对其发展方向进行了展 望。 第二章就l u m i n o l k 3 f k c n ) 3 化学发光检测方法与高效液相色谱分离技术的结合及其在 儿茶酚胺类药物分析中应用进行了研究，主要包括： l 、微透析采样，高效液相色谱分离和鲁米诺一铁氰化钾化学发光活体在线检测血液中左旋多 巴： 基于左旋多巴可以增强鲁米诺一铁氰化钾化学发光信号的现象，结合高效液相色谱，建立 了新的h p l c c l 左旋多巴分析方法。而微透析技术是一种新的采样技术，它具有活体、原 位采样，实时、在线检测等突出特点。本研究设计了微透析探针系统，又将这个新的采样技 术与h p l c c l 联用，实现了家兔血液中的左旋多巴活体在线检测。灌流液以5 “l m i n 的速 度灌流，将血液中的分析物透析出来，经h p l c 分离后用c l 检测。该方法获得的响应信号 在l x l 0 一1 1 0 6 9 m l ( r 2 = 0 9 9 9 5 ) 浓度范围内呈良好的线性关系，检出限为3 1 0 母 g m l ( 3 0 ) 。获得的药时曲线表明左旋多巴的血药浓度在服药9 0 分钟时达到最高值，与药典 上分析结果一致。 2 、h p l c 鲁米诺铁氰化钾化学发光检测同时测定人血清中的肾上腺素、去甲肾上腺素和多 巴胺： 肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺对鲁米诺铁氰化钾化学发光体系都有增敏作用，可以 分别用本化学发光体系进行检测。但是它们三者在同一个系统中，则会产生相互干扰。本研 究设计反应池、优化色谱分离条件。建立了这三种物质同时测定的h p l c c l 新方法。以0 0 l m o i l 邻苯二甲酸氢钾溶液- 甲醇( 9 2 8 v v ) 为流动相在c l s 反相色谱柱上实现分离，柱后 用c l 进行检测。在优化好的各项条件下。肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺的线性范围分 别是i x l 0 5 1 0 6 ，5 0 x 1 0 9 - 1 0 x 1 0 缶和5 0 x 1 0 9 - 1 0 x 1 0 s g m l ，检出限分别为4 0 x 1 0 9 。 1 0 x 1 0 丹和8 0 1 0 j o g m l 。该方法已成功用于血清样品中三种物质的分析，加标回收率在 9 7 1 0 6 7 之间。 西南大学博士学位论文 第三章研究了高锰酸钾一甲醛化学发光体系在高效液相色谱柱后检测技术的应用，包括： 3 、高锰酸钾甲醛化学发光法高效液相色谱柱后检测血清中的肌苷 本文采用高效液相色谱与化学发光检测联用法，用酸性高锰酸钾和甲醛作为发光剂，流 动注射化学发光来测定肌苷，用5 5 ：4 5 的甲醇：水作为流动相，肌苷的质量浓度在0 4 - 1 2 r u tg m l 1 ，范围内与化学发光强度呈良好的线性关系。其检出限为0 1 5 1 t gm l l 。测定的相对标准 偏差为2 9 ，( c _ 1 0 x l o 6 u m l ，n - - - 9 ) 。该方法已成功地用于测定人体血清中的肌苷。 4 、高锰酸钾甲醛化学发光法高效液相色谱柱后检测血清中的维生素b 6 本文基于酸性介质中甲醛会增敏高锰酸钾化学发光体系，建立了一个新的高锰酸钾甲醛 维生素b 6 化学发光体系，并将其与高分离效率的h p l c 耦合，克服了化学发光选择性差的 缺陷，在优化好的条件下，维生素b 6 对该体系的化学发光响应线性范围为o 3 - 1 0 ) t gm l 1 ，检 出限为0 1 p g m l 1 ，测定的相对标准偏差为3 7 ，( 萨1 0 x 1 0 巧卧i l l ，n = 7 ) 。该方法已成功地 用于同时测定人血清中的维生素b 6 。 5 、高锰酸钾甲醛化学发光法高效液相色谱柱后检测尿样中的异丙嗪 高锰酸钾实际常用的化学发光试剂，经研究发现在酸性介质中可以氧化盐酸异丙嗪产生 ? 化学发光。而甲醛可以增敏高锰酸钾异丙嗪化学发光。基于这样的原理，建立了h p l c c l 检测盐酸异丙嗪的新方法。在实验优化的最佳条件下盐酸异丙嗪的质量浓度在l - 1 0 0 1 t gm l 范围内与化学发光强度呈良好的线性关系，其线性方程为厶卢1 6 9 2 3 4 + 2 6 3 6 2 0 c ( ：= 0 9 9 9 3 ) ， 对1 1 t gm l 1 的盐酸异丙嗪平行测定1 1 次，其相对标准偏差为2 7 ，根据i u p a c 建议计算得 本方法的检出限为3 x 1 0 4g m l 。 第四章研究了联吡啶钉c e ( i v ) 化学发光体系在高效液相色谱柱后检测技术，包括： 6 、联吡啶钉c e ( i v ) 化学发光体系检测血清和尿样中的呋噻米 c e 0 v ) 为氧化剂时。一方面与呋噻米发生氧化还原反应生成活性中间体，另一方面又将 r u ( b i p y ) 3 z + 氧化成r u ( b i p y ) 3 3 + 后者与呋噻米活性中间体发生反应产生激发态r u ( b i p y ) 3 2 ”。然 后释放出光能回到基态，并且产生的化学发光强度与呋噻米浓度在一定范围内呈线性关系。 本文基于这样的反应体系。建立t c e ( i v ) r u ( b r y ) 3 2 + 一呋噻米化学发光分析方法，并将这个高 灵敏的c l 分析方法与高分离效率的h p l c 耦合起来，在设计反应池的基础上，形成一个新的灵 敏、快速的呋噻米分析方法，检出限为3 o x l 0 一g m l ，线性范围在1 5 0 x 1 0 g m l 。并成功用于 血清样晶中呋噻米的测定。 7 、联毗啶钌c e ( r v ) 化学发光体系检测片剂和血清中的己烯雌酚 i v 捅要 ib| 本文研究发现酸性介质中c e 0 v ) 跏时氧化d e s 和r u ( b i p y h2 + ，两个氧化还原反应 生成的中间产物再相互作用生成激发态r u ( b i p y ) 3 2 + ，激发态r u ( b i p y ) 3 2 p 通过释放光能回到基 态，由此产生化学发光，且化学发光强度与d e s 浓度在一定范围内呈线性关系。基于此，本 文建立了新的测定d e s 的c l 方法并设计了反应池，使之与h p l c 耦合后，尽量减少柱后 峰展宽，保持化学发光方法的灵敏度，同时优化了各项分析分离条件和化学发光反应条件， 利用h p l c 的高分辨效率，成功实现了血清等复杂生物样品中d e s 的分析，在 8 x l o s - l x l 0 5 舭范围内成良好的线性关系，方法检出限为3 0 x 1 0 s g m l 。对8 x l o 矗g m l 的 己烯雌酚连续进行7 次平行测定的相对标准偏差为3 6 。 8 、联吡啶钌c e ( i v ) 化学发光体系检测血清和尿样中的甲磺酸酚妥拉明 本文研究发现，酸性介质中酚妥拉明被c e o v ) 氧化生成活性中间体。有r u ( b i p y ) 3 2 + 存 在时，r u c o i p y ) 3 2 + 同时也被c e o v ) 氧化成+ 3 价r u ( b i p y ) 3 3 + 。酚妥拉明活性中间体接着与 r u ( b i p y ) 3 3 + 产生反应生成激发态r u i p y ) 3 2 + * ，激发态r u ( b i p y h 2 + 通过释放光能回到基态，由 此产生化学发光，且化学发光强度与酚妥拉明浓度在一定范围内呈线性关系。基于此，在完 成反应泡设计基础上，首次提出用h p l c - c l 联用技术测定生物样品中的酚妥拉明，对 4 x 1 0 4 9 m l 的酚妥拉明连续进行1 1 次平行测定的相对标准偏差为3 1 ，方法检出限为 3 0 1 0 一g m l 。在l 一2 0 x 1 0 - 7 9 m l 范围内线性方程为a i = 5 5 9 5 + 4 6 4 0 c ( r 2 = 0 9 9 8 5 ) ，效果令人 满意。 关键词：高效液相色谱化学发光分析 v 西南大学博士学位论文 t h e s t u d yo fh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yb a s e do n c h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o n s p e c i a l i z a t i o n ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y r e s e a r c hd i r e c t i o n ：l u m i n e s c e n c e a n a l y s i s m e n t o r ：p r o f z h u j a nz h a n gp o s t g r a d u a t e ：f u n a nc h e n ( b 2 0 0 2 0 2 7 ) a b s t r a c t c h e m i l u m i n e s c e n c ei sal i g h te m i s s i o nf r o mc h e m i c a lr e a c t i o n s c h e m i l u m i n e s c e n c e a n a l y s i sh a ss o m ea d v a n t a g e ss u c ha sh i g hs e n s i t i v i t y , w i d el i n e a rr a n g ea n ds i m p l ei n s t r u m e n t i th a sb e c o m ea na t t r a c t i v ea n a l y t i c a lt o o li nb i o l o g i c a la n dc h e m i c a la n a l y s i s h o w e v e r ，t h ec l a n a l y s i sh a sa l s os o m ed i s a d v a n t a g e ；t h em a i nd i s a d v a n t a g ei sv e r yp o o rs e l e c t i v i t yw h i c h l i m i t e di t sa p p l i c a t i o nw i d e l y h o wt os o l u t et h i sp r o b l e m ? o n eo ft h ea p p r o a c h e si sc o m b i n i n gt h ec la n a l y s i sw i t hh i g hp e r f o r m a n c es e p a r a t i o nm e t h o d s u c ha st h eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h e r o m a t o g r a p yo rc a p i l l a r ye l e c r o p h o r e c e n c e t h ea n o t h e r a p p r o a c hi sc o m b i n i n gw i t hs p e c i f i cm o l e c u l a rr e c o g n a t i o ns u c ha se n z y m er e a c t i o ni n c l u d i n gp u r e e n z y m e ，p l a n ta n da n i m a lt i s s u eo rc e l l ，a n t i b o d y , a n t i g e no rr e c e p t o r ，n u c l e i ca c i d ，a p t a m e r , d n a o rr n aa n dm o l e c u l a ri m p r i n t i n gp o l y m e r a sap o w e r f u lm o d e ms e p a r a t i o nt e c h n i q u e ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) h a sb e e nw i d e l yu s e df o rt h ea n a l y s i so fm a n ya n a l y t e si nd i v e r s ef i e l d s d e t e c t o r sa r e o n eo ft h em o s ti m p o r t a n tc o m p o n e n t so fh p l cs y s t e ms i n c et h e y p r o d u c eaw e a l t ho f i n f o r m a t i o na b o u tt h es e p a r a t e dc o m p o n e n t sw h i c hc a nb es t o r e di nc o m p u t e r sa n dm a n i p u l a t e d a sd e s i r e dt oa s s i s ts o l u t ei d e n t i f i c a t i o n i nr e c e n ty e a r s ，c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) a sad e t e c t i o n v l a b s t r a c t t e c h n i q u eo fh p l ci sv e r ya t t r a c t i v ed u et oh i g h e rs e n s i t i v i t y ，w i d e rl i n e a rd y n a m i cr a n g e sa n d s i m p l e ri n s t r u m e n t a t i o n t h ea d v a n c eo fc ld e t e c t i o nh a sg r e a t l yc a t a l y z e dt h eg r o w t ha n d p o p u l a r i t yo fh p l c - c la p p l i c a t i o n 。a n dm a d et r a c ea n a l y s i sp o s s i b l eo w i n gt oi t sc a p a b i l i t yo f m e a s u r i n gp i c t o g r a mo rf e m t o g r a mq u a n t i t i e so fc o m p o u n d si n t h ec o l u m ne l u a t e t h e i n v e s t i g a t i o n sa n da p p l i c a t i o n so fh p l c c lt e c h n o l o g ya r ec u r r e n t l ya l s oa l li m p o r t a n ts u b j e c t , a n dah o tp o i i l ti na n a l y t i c a ls c i e n c e t h ec o m b i n a t i o no fh p l cs e p a r a t i o n ，w h i c hi sv e r s a t i l e a n dm b 鸿t , a n dc l - b a s e dr e a c t i o n s ，w h i c ha 心e x t r e m e l ys e n s i t i v e ，i sp r o m i s i n gf o rn u m e r o u s a p p l i c a t i o n si nr e c e n ty e a r s h o w e v e r , t h en u m b e ro ft h ep r a c t i c a lc lm e t h o d ss of a rr e p o r t e da r en o ts om a n yo w i n gt o s o m el i m i t a t i o na sf o l l o w s ：i nh p l c - c lm e t h o d s ，t h er 髭g e ms u c ha so x i d i z i n gr e a g e n ti s d e l i v e r e df o rt h ep o s t - c o l u m nc lr e a c t i o nu s i n ga d d i t i o n a lp u m p t h u s ，t h ed i l u t i o no ft h e a n a l y t e sb ym i x i n gw i t hr 髓g e ms o m e t i m e sr e s u l t si nt h el o w e rs e n s i t i v i t y s o f a rt h ec l r e a g e n t su s e di nh p l ca r es t i l ll i m i t e d ，t h ec o m p l i c a t e dc h e m i s t r yi n v o l v e dm a k e sa p p l i c a t i o n o ft h e s er e a g e n t si nh p l ce v e nm o r ed i f f i c u l t a l t h o u g hm a n yt y p e so fr e a c t o r s ( i n t e r f a c e s ) h a v eb e e nd e v e l o p e d ；h o w e v e r , m o s to ft h e ma r es t i l li nt h eo p t i m i z a t i o np h a s ea n dm a i n l y s u i t e dt ot h ef a s tk i n e t i cr e a c t i o n i na d d i t i o n ，a n a l y s i so fr e a ls a m p l e si nh p l c - c li s u n s a t i s f a c t o r yp m b a b l yd u et om a t r i xi n t e r f e r e n c e t os o l v et h e s ep r o b l e m s ，w ed e s i g n e das i m p l er e a c t o rs oe x t r a o r d i n a r yt h a ti tc a llo b t a i n t h em o s tl u m i n e s c e n ti n t e n s i t ya ss o o na st h ec lr e a c t i o nw a sc a r r i e do u t m o r e o v e r , t h e r e w a s h ta n yd e a dv o l u m ea n dd i l u t i o ne f f e c t t h en e wa s s e m b l et e c h n i q u eb a s e do il h p l c c o u p l e d w i t hc ld e t e c t i o nh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e di nd e t e r m i n a t i o no fs o m e m e d i c i n e m e n t so rn e u r o t r a n s m i t t e r s t h ee f f e c t so fs e v e r a lp a r a m e t e r so nt h eh p l cr e s o l u t i o n a n dc le m i s s i o nw e r es t u d i e ds y s t e m a t i c a l l y s e v e r a ln o v e lm e t h o d sb a s e do nh p l cw i t h 、，l l 西南大学博士学位论文 c h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t e t o rh a v eb e e nd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fi np h a r m a c e u t i c a l a n db i o l o g i c a ls a m p l e s c o u p l e dw i t hm i c m d i a l y s i s ，o n eo ft h eh p l c c ls y s t e m sh a sb e e n a p p l i e d t o s t u d yt h ep h a r m a c o k i n e t i e so fs o m ed r u g sf o ri n - v i v o ，o n l i n ea n dr e a lt i m e d e t e r m i n a t i o n m i c r o d i a l y s i ss a m p l i n gh a sb e c o m eap o w e r f u lt e c h n i q u ef o rs t u d y i n gb i o c h e m i c a le v e n t s i nt h ee x t r a c e l l u l a rf l u i do f a c t u a l l ya n yt i s s u e ，o r g a no rb i o l o g i c a lf l u i di nr e c e n ty e a r s i ti sa s t a n d a r dt e c h n i q u ei nt h en e u r o s c i e n c e sa n dh a sb e e ne x t e n d e dt ou s ei nm a n yo t h e rf i e l d s i n c l u d i n gp h a r m a c o k i n e t i c ，b i o p r o c e s sm o n i t o r i n ge t c m i c r o d i a l y s i si sad y n a m i cs a m p l i n g m e t h o db a s e do n a n a l y t e d i f f u s i o na c r o s sa s e m i p e r m e a b l em e m b r a n ed r i v e nb y a c o n c e n t r a t i o ng r a d i e n t t h ea d v a n t a g eo fu s i n gm i c r o d i a l y s i ss a m p l i n gi st h a tr e l a t i v e l yl o w n u m b e r so fe x p e r i m e n t a la n i m a l sc a nb eu s e da n dt h ep h y s i o l o g i c a la n da n a t o m i c a lf e a t u r e so f t h e i rt i s s u er e m a i ni n t a c t d u r i n gs a m p l i n gw i t h t h e m i c r o d i a l y s i sp r o b e i na d d i t i o n ， m i c r o d i a l y s i ss a m p l i n gc o u p l e dw i t ha p p r o p r i a t ea n a l y t i c a lc h e m i c a lt e c h n o l o g yc a nb ea p p l i e d t oc o n t i n u o u s l ym o n i t o rc h e m i c a lc h a n g e sw i t h i nt h ee c fw i t hr e s p e c tt ot i m ea to n e i m p l a n t a t i o ns i t e m i c r o d i a l y s i sh a sa l s ot h ea d v a n t a g et h a tt h et e c h n i q u ei se a s yt oa u t o m a t e a n dc a nb eo n l i n ec o u p l e dw i t hm a n ya n a l y t i c a lt e c h n i q u e s o n l i n eh p l cw i t hm i c r o d i a l y s is p e r f u s i o np r o v i d e ss i m p l i f i e ds a m p l ep r e p a r a t i o na n da u t o m a t e da n a l y s e s i nt h i sr e s e a r c hw o r k ，w eh a v ed e v e l o p e dan e wh p l c a n a l y s i s - c lm e t h o da n d s u c c e s s f u l l ya p p l i e di tt om o n i t o rl e v o d o p ai nr a b b i tb l o o di nv i v oa n do n 1 i n e t h i sd i s s e r t a t i o nc o n s i s t so ff o u rc h a p t e r s c h a p t e r sii sar e v i e wa n dc h a p t e r s2t o4a r e r e s e a r c hr e p o r t si n c l u d i n g8r e s e a r c hw o r k s i nc h a p t e rl 。t h ed e v e l o p m e n ta n dt e n d e n c yo ft h eh p l cw i t hc ld e t e c t i o na r er e v i e w e d i tc o v e r st h ep r i n c i p l e so ft h eh p l cw i t hc l d e t e c t o r , t h ed e s i g no fc ld e t e c t o r s ，c ld e t e c t i o n v l i l a b s t r a c t s y s t e m s ( i n c l u d i n gl u m i n o l ，p e r o x y o x a l a t e s ，r u ( b i p y ) 3 2 4 - ，k m n 0 4 ) ，t h ea p p l i c a t i o n so f a n a l y t i c a lm e t h o d sf o rm a n yk i n d so fi n o r g a n i c ，o r g a n i ca n db i o l o g i cs a m p l e s ，a n dt h et r e n d so f h p l c - c li ne n v i r o n m e n t a l ，l i f es c i e n c e ，p h a r m a c ya n dc l i n i c a lm e d i c a ls c i e n c e 。 t h er e s e a r c hw o r k si n c l u d e s ： ( 1 ) h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y c h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o nf o rt h ei n v i v oo n - l i n ed e t e r m i n a t i o na n ds t u d yo ft h ep h a r m a c o k i n e t i c so fl e v o d o p ai nb l o o dw i t h m i e r o d i a l y s i ss a m p l i n g as i m p l e ，r e l i a b l ea n dr e p r o d u c i b l em e t h o df o ri nv i v oo n - l i n es e p a r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o n o fl e v o d o p ab a s e do nh i 【g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yw i t hc h e m i l u m i n e s c e n c e d e t e c t i o na n dm i c r o d i a l y s i si sd e s c r i b e d t h ep e r f u s a t ei sp e r f u s e da taf l o wr a t eo f5l l l m i n t h ec o n c e n t r a t i o no fl e v o d o p ai nt h ed i a l y s a t ei sd e t e r m i n e do nl i n ew i t hac h e m i l u m i n e s c e n c e s y s t e m t h ed i a l y s a t es a m p l ev o l u m ei s a b o u t2 0 p l t h es y s t e mi s l i n e a r l yr e l a t e d t ot h e c o n c e n t r a t i o no f l e v o d o p ai nt h er a n g el x l 0 1 x 1 0 石e g m l ( r 2 = 0 9 9 9 5 ) w i t had e t e c t i o nl i m i t ( 3 0 ) o f 3 1 0 母g m la n dt h es a m p l et h r o u g h p u to f1 2 h 1 ，r s di s2 8 ( n - 1 1 ) t h em e t h o dh a sb e e n s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt os t u d yt h ep h a r m a c o k i n e t i c so fl e v o d o p ai nv i v o ，a n dt h ec m 默，a u c o - ta n d t 嘣v a l u eo ft h ep h a r m a c o k i n e t i c sp a r a m e t e r a l e1 6 6 0 n g m l ，2 0 9 2 n g m l ，9 0 m i nr e s p e c t i v e l y ( 2 ) s i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fe p i n e p h r i n e ，n o r a d r e n a l i n ea n dd o p a m i n ei nh u m a n s e r u ms a m p l e sb yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yw i t hc h e m i l u m i n e s c e n c e d e t e c t i o n as i m p l e ，r a p i da n da c c u r a t eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i c ( h p l c ) t e c h n i q u e c o u p l e d w i t hc h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) d e t e c t i o nw a sd e v e l o p e df o rt h es i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o no fe p i n e p h r i n e ( e ) ，n o r a d r e n a l i n e ( n a ) a n dd o p a m i n e ( d a ) i tw a sb a s e do nt h e a n a l y t ee n h a n c e m e n te f f e c to nt h ec l r e a c t i o nb e t w e e nl u m i n o ia n dp o t a s s i u mf e r r i c y a n i d e t h e i x 西南大学博十学位论文 e f f e c t so fv a r i o u sp a r a m e t e r s ，s u c ha sp o t a s s i u mf e r r i c y a n i d ec o n c e n t r a t i o n ，l u m i n o l c o n c e n t r a t i o n ，p hv a l u ea n dc o m p o n e n to ft h em o b i l ep h a s eo nc h r o m a t o g r a p h i cb e h a v i o r so f t h ea n a l y t e s