（分析化学专业论文）集成化芯片毛细管电泳柱端安培检测系统的研究.pdf

浙江太学硕士学位论文摘要 摘要 微流控芯片的快速发展，对检测系统的微型化、集成化提出了挑战。研 制高灵敏度的微型集成化检测器已成为微流控分析系统研究的热点之一。安 培检测器与芯片毛细管电泳联用，以其高效、高速、高灵敏度、易微型集成 化等诸多突出的优势很快引起了人们的兴趣。喷壁式柱端安培检测，因采用 可更新的外置式微圆盘工作电极，芯片的重复利用率大为提高，是当前芯片 毛细管电泳柱端安培检测系统所采用的主要检测模式。但是采用这种检测模 式，安培检测池处于芯片之外，须用三维平台等特殊的定位系统以实现工作 电极与分离通道出口的对准，致使整个芯片毛细管电泳一安培检测系统结构 复杂、体积增大、集成化程度降低。 针对喷壁式柱端安培检测系统的上述弊端，本文研制了一种适配于喷壁 式微型圆盘工作电极的、具有半自准安培检测池的集成化毛细管电泳安培检 测芯片。微型安培检测池设置在玻璃芯片之上，在玻璃芯片的侧边正对分离 通道末端的位置加工一微型引导孔，用以定位和固定工作电极。借助该电极 引导孔，无须外部的辅助定位装置，即可方便、快速、准确地实现工作电极 端面与毛细管出口对准，每次更换电极的对准操作只需2 3 分钟。该设计使 分离通道、安培检测池、微型工作电极全部集成于芯片上，大大提高了芯片 毛细管电泳安培检测系统的微型化、集成化程度。以葡萄糖为模型化合物考 察了该集成化微流控芯片的分析性能。实验表明，整个分析系统的重现性好， 重复安装工作电极所引起的葡萄糖响应电流问的相对标准偏差( r s d ) 仅为 4 1 ( n = 9 ) ；芯片受到一定程度的振动后，分析性能保持不变。该集成化 毛细管电泳安培检测芯片为芯片毛细管电泳安培检测系统的理论和应用研 究提供了一个可靠的技术平台。同类将可更换圆盘电极集成于芯片上的毛细 管电泳安培检测系统未见报道。 使用自行研制的集成化毛细管电泳安培检测芯片，以铜微圆盘电极为 工作电极，研究了蔗糖、葡萄糖、果糖等在芯片毛细管电泳一安培检测系统中 的分离分析方法。系统地考察了芯片上毛细管电泳的进样时间、电解质浓度、 苎警算梦、湖鏖 匆全文公布 一 浙江火学硕士学位论文摘要 分离电压等对分离检测的影响，并进行了优化。该芯片毛细管电泳安培检测 系统可在8 0s 内对3 种单糖实现基本分离，理论塔板数为1 8 7 4 块m ，线 性范围达2 3 个数量级，葡萄糖的检测限达2 4 1 0 m o l l 。 以自行研制的集成化毛细管电泳芯片一安培检测系统为平台，以碳纤维圆 盘电极为工作电极，多巴胺为模型化合物，系统地研究了工作电极与毛细管 通道出口间的距离、电泳分离电压等因素对多巴胺半波电位的影响情况。发 现随着工作电极与通道间距的减小、电泳分离电压的升高，多巴胺的半波电 位发生正向偏移，进而影响峰电流的大小。这一观察表明，在本该芯片毛细 管电泳一安培检测系统中由于未采用专用电压去耦装置，分离电压对检测系统 仍有一定的干扰。因此在改变分离电压、电极间距等实验参数后，优化工作 电极的检测电位是必须的。通过对本实验系统的优化。多巴胺的检测限为2 8 x1 0 m o l l ，线性范围达2 3 个数量级。同类芯片上分离检测系统参数对待 测物的半波电位影响的研究工作未见报道。 翌! ! ! ! ! 兰竺! ! 竺! ! ! ! ! ! ! ! ! 墨! 笪! ! ! 呈旦翌堡! ! ! ! 堡垒! ! 堡! ! ! a b s t r a c t t h ed e v e l o p m e n to fc h i p - b a s e ds e p a r a t i o nd e v i c e s ，p a r t i c u l a r l yc h i p b a s e d c a p i l l a r ye l e t r o p h o r e s i s ( c e ) s y s t e m s ，h a sw i t n e s s e da l le x p l o s i v ed e v e l o p m e n t i nr e c e n ty e a r s t h e r ea r eu r g e n tn e e d st od e v e l o pc o m p a t i b l ed e t e c t i o nm o d e s e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o no f f e r sac o n s i d e r a b l e p r o m i s e f o rd e t e c t i o ni n m i c r o m a c h i n e dc e c h i p s s u c hd e t e c t i o no f f e r sr e m a r k a b l es e n s i t i v i t y , t u n a b l e s e l e c t i v i t y a n dl o ws a m p l ev o l u m er e q u i r e m e n t s m o s ti m p o r t a n t ，i th a sa n i n h e r e n tc h a r a c t e rf o rm i n i a t u r i z a t i o na n di si d e a l l ys u i t a b l ef o rt h em i c r o c h i p f o r m a t a m p e r o m e t r i c d e t e c t i o ni so n eo fs u c he l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n t e c h n i q u e s o ft h et h r e em o d e l so f a m p e r o m e t r i c d e t e c t i o ni n c h i p b a s e d c e ， e n d c h a n n e la m p e r o m e t r i cd e t e c t i o nw i t hm i c r o ，d i s ke l e c t r o d ei sap r e f e r a b l e o n e ，b e c a u s et h ee l e c t r o d ec a nb er e p l a c e dw h e nf o u l i n go c c u r s h o w e v e r a c o m p l i c a t e do f f - c h i p m e c h a n i c a ld e v i c es u c ha st h r e e - d i m e n s i o n m i c r o - p o s i t i o n e ri sr e q u i r e dt or e a l i z et h ea l i g n i n gt h ew o r k i n ge l e c t r o d et ot h e o u t l e to fm i c r o s e p a r a t i o nc h a n n e l t h i sm a d ed e t e c t i o ns y s t e ms e p a r a t e df r o m t h em i c r o c h i pa n dm i n i a t u r i z a t i o nd e g r a d e d i nt h e p r e s e n tw o r k ，ag l a s sc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sm i c r o c h i p w i t h i n t e g r a t e da m p e r o m e t r i c d e t e c t i o nc e l l e q u i p p e db yr e p l a c e a b l e m i c r o d i s k w o r k i n ge l e c t r o d ew a sd e v e l o p e d t h ed e t e c t i o nc e l lw a s f a b r i c a t e da sab u f f e r r e s e r v o i ro nt h e m i c r o c h i p am i c r o e l e c t r o d e - g u i d i n g h o l e ，w h i c hw a s i n a l i g n m e n tw i t ht h eo u t l e to f t h es e p a r a t i o nc h a n n e l ，w a sd r i l l e di n t ot h eb o t t o m e d g eo f t h ec h i p w h e nam i c r o - d i s kw o r k i n ge l e c t r o d ew a si n s e r t e di n t ot h eh o l e ， p a s s e dt h o u g hd e t e c t i o nc e l la n df i n a l l yg o ta c c e s s t ot h eo u t l e to ft h es e p a r a t i o n c h a n n e l ，t h ee l e c t r o d ec o u l d b eq u a s i - s e l f - a l i g n e dt ot h ec h a n n e lo u t l e ta n df i x e d i n s i d et h eg u i d i n gh o l ew i t h o u tt h eh e l po fam i c r o p o s i t i o n e r t h u sa ni n t e g r a t e d e n d - c h a n n e l a m p e r o m e t r i c d e t e c t i o n s y s t e m w i t h r e p l a c e a b l e d i s k w o r k i n g t 1 1 翌! 壁! ! ! ! 墅! ! ! ! ! ! 坠! ! ! ! ! 至! 蔓! ! 竺堡! 旦堡! ：! ! 堕垒皇壁：! 壁 e l e c t r o d ew a se s t a b l i s h e do nt h em i c r o c h i p t h ee x p e r i m e n tr e s u l t si n d i c a t et h a t t h ea l i g n n a e n to ft h ee l e c t r o d et ot h ec h a n n e lo u t l e tc a nb ec a r r i e do u ta c c u r a t e l y a n dq u i c k l y g o o dr e p r o d u c i b i l i t yo ft h ee l e c t r o d ea l i g n m e n tw a sd e m o n s t r a t e d b ya4 1 r s d f o rt h ep e a kh e i g h to fs u c r o s eo b t a i n e da f t e rr e p e a t e d l y ( n 2 1 o ) p o s i t i o n o fam i c r o c o p p e rd i s ke l e c t r o d e r e p l a c i n gt h e w o r k i n ge l e c t r o d e n e e d e do n l y2 - 3m i n s w i t ha m i c r o c o p p e r d i s ke l e c t r o d e b e i n gu s e d ，t h ei n t e g r a t e d c e m i c h r o c h i pw i t he n d c h a n n e la m p e r o m e t r i cd e t e c t o rw a s u s e df o rs e p a r a t i o na n d d e t e c t i o no f o l i g o s a c c h a r i d e s 。s e p a r a t i o no fs u c r o s e ，g l u c o s ea n d f r u c t o s ec a nb e a c h i e v e dw i t h i n8 0s ，w i t hat h e o r e t i c a lp l a t en u m b e ro f18 7 4p l a t e s ma n da d e t e c t i o nl i m i t2 4 1 0 一m o l lf o rg l u c o s eb e i n go b t a i n e d b yu s i n g t h i s i n t e g r a t e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sm i c r o c h i p w i t ha m i c r o d i s kc a r b o nf i b e rw o r k i n ge l e c t r o d e ，t h ei n f l u e n c e so fs e p a r a t i o nv o l t a g e a n dc h a n n e l t o 。e l e c t r o d ed i s t a n c eo nt h eo b s e r v e dh y d r o d y n a m i cv o l t a m m e t r yo f d o p a m i n e w e r es t u d i e d i tw a sf o u n dt h a te i t h e ri n c r e a s ei nc es e p a r a t i o n v o l t a g eo rd e c r e a s ei nt h eg a pb e t w e e n t h ec h a n n e lo u t l e ta n dt h ed i s k e l e c t r o d e r e s u l t e di na p o s i t i v es h i f ti no b s e r v e dh a l f - w a v ep o t e n t i a lf o rd o p a m i n e ，a n d t h e s h i f ti nh a l g w a v ep o t e n t i a la f f e c t e di nt u r nt h ep e a kh e i g h to ft h ea n a l y t e t h i s i n d i c a t e dt h a tf o rt h ec u r r e n ti n t e g r a t e dc e e cm i c r o c h i pw i t has e p a r a t i o n c h a n n e lo f6 5 0p m 2 一s e c t i o na r e a t h e s e p a r a t i o np a r a m e t e r s h a ds i g n i f i c a n t i n f l u e n c e so nt h ep e r f o r m a n c e ，a nc o m m o n p r o b l e mf o rt h ec e - e cs y s t e mw i t h e n d - c h a n n e la m p e r o m e t f i cd e t e c t o rb u tw i t h o u ta l le l e c t r i cd e c o u p l e r t h u s ，i t s h o u l db et a k e ni nm i n dt h a th y d r o d y n a m i cv o l t a m m e t r ys h o u l db ep e r f o r m e dt o s e a r c hf o ra na p p r o p r i a t ed e t e c t i o np o t e n t i a lw h e n e v e rs e p a r a t i o np a r a m e t e r s s u c ha ss e p a r a t i o nv o l t a g ea n dc h a n n e l t o e l e c t r o d ed i s t a n c eh a v eb e e nc h a n g e d i v 浙江大学项士学位论文 第一部分睹论 第一部分绪论 第一章文献综述 当前，分析仪器的发展正在出现一个以微型化为主要特征的、带有革命 性的重要转折时期。1 ，这一变革起始于9 0 年代初由m a n z 等提出的一t a s 的 概念【2 j 。 芯片毛细管电泳是旷t a s 中的主流研究领域之一。目前，芯片毛细管电 泳多以玻璃芯片结合激光诱导荧光( l i f ) 或质谱( m s ) 检测器完成d n a 、 蛋白质等重要的复杂生化试样的高速、高效和高灵敏度的分离与分析。但是 这样的微流控分析系统尚存在着以下缺点：平方厘米大小的芯片与大型 l i f 、m s 等检测器极不相称，影响了整机的微型化；l i f 和m s 等检测器 价格昂贵，难以普及。有关检测方法和检测器的研究现已成为微流控领域的 一个重点和热点吲。 电化学检测( e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ) 是一大类常用的分析测试方法， 在常规4 州和芯片1 1 0 - 1 4 1 毛细管电泳中都有较多的应用。电化学检测法采用电极 作为传感器，许多化合物不需衍生处理就可在电极上产生信号，并且与光学 检测方法不同的是，电化学传感的灵敏度不会因为通道几何尺寸的微型化而 降低。此外，电化学检测器的信号处理系统等外围设备比较简单，易于实 现微型化。因此，作为微型全分析系统的集成化检测方式，电化学检测器具 有独特的优势。 根据电化学检测原理的不同，目前在微流控分析系统中所采用的电化学 检测器主要有安培检测器、电导检测器和电位检测器。本文以安培检测器为 重点，讨论微流控芯片上安培检测的发展现状与前景。 浙江太擎项士学位论文 第一部分培论 1 2 集成化毛细管电泳安培检测芯片 1 2 1 工作原理 毛细管电泳芯片作为微流控分析芯片的主流，其分离原理是利用毛细管 通道内离子或荷电粒子在高压电场的驱动下按淌度或n 分配系数的不同，从 而实现待测物的高效、快速分离分析。 安培检测( a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n ) 是常规毛细管电泳电化学检测 ( c e e c ) 中应用最多的一种检测方式，其检测原理是根据待测物在恒( 或 脉冲) 电位工作电极上发生电化学反应时所产生的氧化电流或还原电流从而 对待测物进行定量的检测。 1 9 8 7 年w a l l i n g f o r d 等1 5 1 首先提出了高效毛细管电泳安培型电化学检测 法，其独特性能在于检测限低、线性范围宽、选择性好；用极细分离毛细管 而不会造成灵敏度损失，从而可减小迸样量以适合单细胞分析和活体分析： 而且设备简单，价格低廉，便于推广。自此以后，安培型电化学检测越来越 多地应用于毛细管分离体系中，成为一种常用的检测方法。 1 9 9 8 年w o o l e y 等人【州报道了第一例毛细管电泳芯片上的安培检测器， 将这一检测方式应用于微流控芯片发展领域，以实现整体系统微型化、集成 化的目标。几年来，有关微流控芯片一安培检测器的报道逐渐增多，这一研究 方向引起了人们越来越多的兴趣。 在最初的j 高片毛细管电泳安培检测系统中，制作芯片的材质多采用玻 璃或石英，近年来，越来越多的材质应用于毛细管电泳一安培检测芯片中，如 树脂玻璃、低温烧结陶瓷1 1 6 1 、聚乙烯高分子材料【1 7 、聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 、聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 等。研究内容已越来越广泛，显示了这 一研究方向的重大发展潜力与广阔的前景。 一6 一 新江太学硕士学位奄文第一部分培论 1 2 2 电压隔离方法 在毛细管电泳中使用安培检测器时，消除或减小分离电压对检测系统的 干扰是一个不容忽视的问题。根据隔离分离电压的方式，安培检测器可分为 柱端式( e n d c h a n n e l ) 、在柱式( i n c h a n n e l ) 和离柱式( o f f - c h a n n e l ) 三种 ( 见图1 1 ) ，这些方式在以电渗流推动的微流控分析芯片中都有报道。 1ae n d - c h a r m e ld e t ：e e i j o n ：c h i p 协e n d - c h a n n e li ) e 佬e “o n ：o f f e l f l l ， 2 i n - c l m i m e ld e l e c t i o n w o r k l 吣胡“t 忡乳 3 0 i f - c h 8 1 1 h e ld e r e c t i o n 缰娶= ， 图1 i安培检测器的三种电压隔离方式 1 ，柱端式检测：2 ，在柱式检测：3 ，离柱式检测 在芯片毛细管电泳安培检测系统中，采用最多的是柱端( e n d - c h a n n e l ) 安培检测方式，将工作电极放置于通道出口端外几十微米处，以期检测系统 簧于分离高压电场外而减小分离高压的影响；在柱( i n c h a n n e l ) 检测法是直 1 墼 浙江太学项士学位岳文 第一却分墙论 接将工作电极放置在分离通道上，通过在检测仪器内设置电压隔离稳压器减 少毛细管分离通道上分离电压对检测系统的影响；离柱式( o f f - c h a n n e l ) 检 测法则是芯片上采用电压去耦器将分离电压在到达检测池之前接地隔离，达 到减弱其影响的目的。 1 2 2 1 柱端安培检测方式( e n d c h a n n e ld e t e c t i o n ) 柱端检测是安培检测中应用最为广泛的种检测方式。工作电极放置于 分离通道出口外几十微米处，这段距离在一定程度上隔离了分离高压对检测 池的影响【1 9 1 。但由于分离电压在检测池内接地，工作电极仍将受到分离电压 在检测池上部分电压降的影响，从而使分离电场在工作电极上对检测电位产 生微小的但至关重要的电位迁移纠，因此，对待测物而言，需要在合适的分 离条件下通过动态伏安曲线实验从而得到最佳的检测电位。此外，相对于离 柱式检测，柱端安培检测方式的背景电流较高，检测灵敏度较低：并且由于 电极端面与分离通道间距离的存在，易使样品带扩散，导致分离效率不高 【1 2 】i2 0 1 一 b a r 闩 c d 图1 2 检测池结构示意图 a ，带有安培检测池的毛细管电泳芯片( 检测池中，通道与- t 作电极可能 采用的相对位置分别表示在卜d 图中) ：b ，流经式检测池；c ，流向式检 测池；d ，流通式检测池( 端视) ( 箭头表示通道中的液流方向，阴影部 分表示工作电极) 浙江太学项士季位论文 第一部分睹论 在：枣片毛细管电泳柱端安培检测系统中，按柱后液流与工作电极相对位 置不同，可分为流经式( f l o w b y ) 、流向式( f l o w o n t o ) 、和流通式 ( f l o w t h r o u g h ) 等三种类型的检测池。如图1 2 所示。 流经式。条形薄层微电极制作在检测池的底部，方向与通道垂直或者与 通道平行，位置紧挨着通道的出口，其特点是液流方向与电极表面平行， 流体在电极表面流过。 流向式。金属丝工作电极端面或薄膜电极的表面正对通道的出口，从通 道中流出的液流垂直射向工作电极的表面，与喷壁式( j e t w a l l ) 电极相 似。 流通式。将工作电极镀在封合后毛细管通道的出口端面，形成一环状电 极，从通道中流出的液流从电极环内穿过。 ( a ) 流经式安培检测系统 流经式安培检测系统中多采用膜状电极作为工作电极，其代表是1 9 9 8 年w o o l e y 1 明报道的集成化毛细管电泳安培检测系统，其装置见图1 3 。 图1 3 采用膜状工作电极的检测池结构图 浙江太学项士学位论文第一却分墙论 此后，不同的工作组又相继报道了不同的膜状电极安培检测系统 2 0 - 2 5 j ， g a w o n 等人 2 6 】采用放置于底板凹槽内的碳纤维电极作为安培检测的工作电 极( 装置见图1 4 ) ，与此类似，h a n a j i r i 等人【2 7 1 也采用了相同的方法。这种 方式避免了制作膜状电极的繁琐操作。 s a a l p l e 填) b u f f e r 郴) s a m p l e w a s i t ( s w ) 圈1 4 毛细管通道末端处填充碳纤维工作电极的流经式安培检测装置因 ( b ) 流向式安培检测系统 s c h w a r z 等人直接将涂附有 t e f l o n 的铂丝放置在玻璃芯片毛细 管通道出口端作为工作电极，如图 1 ，5 所示，简化了安培检测系统。 w a n g 等1 2 8 】研制了可更换的工 作电极。条状碳膜工作电极筛印在图1 5 使用铂丝工作电极的流向式安培 统一尺寸的氧化铝陶瓷片上，将带 检测系统示意图 有工作电极的陶瓷片插入芯片尾端 特制的有机玻璃检测池中电极定位槽中，碳膜工作电极即可对准通道的出 浙江大学项士学隹论文 苇一部分睹硷 口。电极钝化后，更换一片新的带有筛印碳膜电极的陶瓷片即可( 图1 6 ) 。 这类检测池结构复杂、集成化程度低，适用于需经常替换工作电极的场合。 图1 6 可更换式筛印厚膜碳电极和芯片毛细管电泳的安培检测装置示意图 a ，玻璃芯片；b ，分离通道；c ，进样通道；d 、e 、f ，缓冲液、试样和闲置的储液 管：g ，有机玻璃液槽体；h 、i 、j ，缓冲液、试样和闲置的储液池；k ，检测池；l ， 筛印了工作电极的铝陶瓷条；m ，筛印碳膜工作电极：n ，筛印银导电膜；o ，筛印 绝缘膜；p ，用于控制工作电极与通道出口间隙的胶带条；o ，通道出口：r ，对电 极；s ，参比电极；t ，电泳分离电压电极；u ，塑料固定螺丝当筛印碳膜工作电 极m 沿图中的定位槽插入后，用该螺丝固定。 b a c k o f e n 等人2 9 】手艮道了种p d m s 一玻璃芯片微圆盘电极安培检测系统， 其装置见图1 7 。直接将铂圆盘电极与芯片平面呈一定角度放置于分离通道 口处，整个安培检测系统装置简单。 d o u 3 引、f a n g u y 3 3 1 等人报道的芯片毛细管电泳一安培检测系统则采用两 浙江夫章项士季位奄文 第一部夸睹论 维微调节螺丝或三维定位仪实现工作电极与毛细管出口的对准，装置如图 1 8 ( a ) ( b ) 所示。工作电极的定位精确度提高，但整个装置的结构复杂。 图1 7 采用微圆盘电极的安培检测系统装置图 1 ，p d m s 盖片；2 ，玻璃底片；3 ，分离通道；4 ，工作电极( 铂圆盘电极) ：5 ，参比 电极：6 ，对电极。 ab 图18使用外部定位仪的芯片毛细管电泳安培检测系统装置图 a ，使用两维微调节螺丝的芯片毛细管电泳安培检测系统 b ，使用三维定位仪的芯片毛细管电泳- 安培检测系统 2 浙江夫学硕士学位谁文 第一部分培岳 最近，z e n g 等 3 0 1 1 3 1 1 报道了一种可更换式圆盘工作电极电化学检测系统。 在芯片的检测池d 中，预先固定了一段细锥形的电极引导管( 见图1 9 中的 5 ) ，它的尖端( 内径4 6u m ) 在离通道出口1 0 0g i n 处严格对准分离通道的 出口。安装或更换电极时，只要将密封在外径为4 0 4 5 岬玻璃套管中的碳 纤维圆盘工作电极插入引导管，并沿引导管小心向前推进，直至穿出引导管 的尖端。由于电极玻璃套管外径只比引导管尖端内径小1 6 岬，因此电极相 对与通道出口的横向和上下两维的位置完全由引导管尖端的位置所决定，而 电极与通道出口的纵向间隙可以在显微镜下方便地调节。这种水平对准的可 更换的圆盘工作电极及其检测池的结构较上述垂直对准式的结构简单，操作 也方便。除适用于碳纤维圆盘工作电极，也可用于金属圆盘电极。 图19 水平式可更换圆盘电极的芯片毛细管电泳安培检测池装置示意图 a 带有集成化安培检测池的芯片毛细管电泳系统：1 ，分离通道： 2 ，玻璃底 板：3 ，有机玻璃周定条：4 ，环氧树脂；5 ，引导管；6 ，铀丝；7 ，a g a g c l 参 比电极；8 ，由微量移液器咀尖制作的液槽；9 ，毛细管电泳芯片；1 0 ，有机玻璃 工作台；1 1 ，电极固定夹；1 2 ，精密螺丝：1 3 ，弹簧。b 芯片通道的结构： ( a ) 缓冲液池，( b ) 试样池，( c ) 试样废液池，( d ) 检测池。 浙江太学硕士学位论文 第一部分睹论 ( c )流通式安培检测系统 w a n g 等 3 4 1 报道了在玻璃芯片毛细管出口的断面上采用溅射法制作流通 式金工作电极，用于多巴胺、异丙基肾上腺素等神经递质的分离测定。装置 结构如图1 _ 1 0 所示。 图1 1 0 流通式安培检测结构图 a 玻璃芯片；b ，毛细管通道：c ，进样通道；d ，e ，f ，储液槽；l ，金 膜状工作电极；m ，电极引导线；n ，绝缘层；o ，通道出口。 1 2 2 2 在柱式安培检测方式( i n c h a n n e ld e t e c t i o n ) m a r t i n 等人n 1 提出了在柱式安培检测方式，通过使用自制的电压隔离稳 压器，可以将工作电极直接放置在分离通道中，样品经过电极后继续向高压 负极迁移。这种检测方式相对于柱端安培检测而言可以有效地减少谱带的扩 宽，提高柱效。他们使用儿茶酚胺作为标准待测物，对在柱检测和柱端检测 两种方式进行了对照，结果见图1 1 1 。与l i f 检测方式进行对照，在柱检测 的样品峰理论塔板数与l i f 检测方式的结果相当。 浙江太学硕士学位论支 第一却分睹奄 图1 l i 两种不同的安培检测 方式下儿茶酚胺的毛细管电泳 对照图 a ，在柱检测方式 b ，柱端检测方式 1 2 2 3 离柱式安培检测方式( o f f - c h a n n e ld e t e c t i o n ) 所谓离柱式安培检测，其特征是整根毛细管被分成分离毛细管和检测毛 细管两部分，通过导电接口( 又称电压去耦器，d e c o u p l e r ) 使分离电压在分 离毛细管的末端接地，使电泳电流不通过检测毛细管，实现分离电压的实质 性隔离。在芯片毛细管电泳中采用离柱式安培检测的关键技术是如何在芯片 上制作集成化的电压去耦装置。 r o s s i e r 等人【3 5 】采用与常规毛细管电泳中导电膜接口类似的思路，在通 道的聚对苯二甲酸己二酯( p e t ) 薄膜盖板上距检测通道末端1r n l l l 处，沿 通道的轴向制作了直径为5p m 或1 0 叫1 的若干( 1 - 6 个) 小孔，分离电压通 过这些4 q l 阵列形成电泳回路，从而实现对分离电场的隔离( 图1 1 2 ) 。 l “ 一 a j k t l “ 上 一r _ 浙江夫学硕士学往论文 第一却分暗论 图i 1 2 聚对苯二甲酸已二酯( p e t ) 薄膜盖板上电压去耦器结构图 b 图1 13 p d m s 芯片与玻璃芯片上电压去耦器结构图 a ，p d m s 芯片上电压去耦器的结构示意图 1 ，样品储液池：2 ，缓冲液储液池；3 ，样品废液池；4 ，带有去耦器的储液池；5 醋酸纤维素膜：6 ，电极。 b ，玻璃芯片上电压去耦器的结构示意图 1 ，电压去耦器d q l ；2 ，检测池；3 ，碳纤维电极。 浙江上学硕士学往砼文第一部分墙砖 o s b o u r m 等人【3 6 1 与此类似，在p d m s 芯片的盖板上制作一系列2 0 、3 0 岬 的小孔，在孔内填充一层薄的醋酸纤维素膜，作为毛细管分离的电压去耦器 ( 图1 1 3a ) 。此外，他们还尝试了在玻璃盖板上通过激光烧蚀技术制作微 孔电压去耦装置，他们使用c 0 2 激光器在2 5 0 岫厚的玻璃盖片上烧蚀一系 列底部内径为3 0p , m 的小孔，填入醋酸纤维素后，完成电压去耦器的制作( 图 1 1 3b ) 。文章报道，在分离通道内的电流为6 0 儿a 的条件下，工作电极响应 的基线噪音仅为1p a ，具有良好的电压去耦效果：标准待测物多巴胺的检测 限低至2 5n m 。 c h e n 等f 3 7 】则设计制作了一种新颖的电压去耦器。在有机玻璃的通道盖 片上距十字交叉1 53 0m m 处，采用热蒸发沉积技术在与分离通道垂直的方 向上制作了一条3m m 宽的钯薄膜电极作为分离电压的去耦电极，距去耦电 l 缓冲液池 2 缓冲废液浊 3 诚样池 4 试样废液池 图1 1 4带有钯去耦电极的电压去耦装置示意图 极1m m 的通道下游处，并列制作了5 条与通道垂直的安培检测器阵列工作 电极( 图1 1 4 ) 。电泳分离电压在缓冲液池1 和去耦电极间形成回路。受分 离电压的电解作用，h + 可在去耦电极上还原生成氢，但由于氢钯电极表面的 扩散速度很快，以致于形成氢气泡以前，氢即被电渗流从电极表面带走，从 而避免了电泳通道中积聚氢气泡而引起噪音。作者观察到，在分离场强为5 7 0 v c m 的条件下，安培检测器工作电极的噪音水平小于1 5p a 。结合其它实验 浙江太学硕士季往硷文 第一却分培论 现象，作者认为这种去耦装置可以在很大程度上减小分离电压对检测器的干 扰。相比于通常采用的导电膜接口电压去耦装置，该钯电极电压去耦器的优 点是：( 1 ) 安培检测器的工作电极与通道的相对位黄可以采取在去耦电极下 游与通道垂直交叉，避免了在通道末端设置工作电极时所必须的严格对准的 条件；( 2 ) 制作相对简单。但是，这种去耦电极还不能完全隔离分离电压。 有待于进一步改进。 1 2 3 工作电极的材料及其制作技术 安培检测器的性能很大程度上取决于所选择的工作电极的材料。电极材 料的选择需同时考虑待测物的反应活性及背景电流的大小。目前在芯片毛细 管电泳安培检测器中使用较多的工作电极为碳电极、金属电极及化学修饰电 极等。 1 2 3 1 碳电极 在常规毛细管电泳安培检测器中多采用碳纤维做工作电极，其制作技术 可直接移植到芯片毛细管电泳电化学检测系统中。此外，在芯片毛细管电泳 中，安培检测器的工作电极也多采用碳素墨水、碳糊等材料通过微加工技术 制成。制作方法包括筛印和填充技术等。 z e n g 3 0 1 在其工作中描述了碳纤维微圆盘电极的制作方法。将0 9m m 内 径的玻璃毛细管拉制为末端内径为7 “m 左右、外径为2 0 2 5 岍的毛细管， 再将一根经清洗后的与铜丝焊接的碳纤维( 约7 阻外径) 插入，露出尖端， 玻璃管中填入环氧树脂，固化后，切除多余的碳纤维，使其尖端形成微盘， 使用前电极端面需经打磨处理。 w a n g 等 2 8 】描述了种批量制作厚膜( t h i c k f i l m ) 碳电极的方法。该法 采用用筛印法在1 0 0r a m 1 0 0m m x o 6 4m i d 铝陶瓷板上一次并列印制3 0 个碳膜电极( 每个电极单元占用3 33m m i o om m o 6 4m m 的铝陶瓷小 浙江太擘硕士学位谁文 摹一却分培如 条，使用时只需沿激光刻蚀过的虚线从整快铝陶瓷板上撕下含有一个电极单 元的铝陶瓷小条即可) 。具体的印制步骤为：先用碳素墨水透过镂空的电极 模板在铝陶瓷条上印上一层o 3m m x8 , 0m m 的碳膜。于1 0 0 。c 烘干后，在 碳膜的尾部用银墨水筛印一条1 5m m x 2 1 0l i l r n 的银膜( n ) ，该银膜部分 交盖在碳膜之上形成碳膜电极的导电引线。烘干后，再印上一层绝缘墨水层 ( o ) 覆盖碳膜电极和银膜引线的大部分，只在碳膜一端留下电极的工作区 域( o 3 0m m 2 5t u r n ) 和银膜一端留下与外电路的联接区域( 碳、银、绝 缘层的厚度分别为1 0 、2 8 、7 0u m ) ，最后，将印有电极的铝陶瓷在1 0 0 。c 条 件下固化1 2 0r a i n 即完成电极的制作。这种碳厚膜电极的特点在于电极可以 批量生产，降低了成本，并且在使用过程中可以方便地进行更换，作为一次 性电极使用。 m a r t i n 等则使用碳糊作工作电极。在p d m s 盖片上铸出条宽4 0p i n 、深6 0p m 的电极沟槽( 其轴向与分离通道垂直) ，向槽内填充碳糊，除 去多余的碳糊后，将条状碳糊电极中央一侧对准另一p d m s 基片上的分离通 道出口，两基片合拢后，即制成了流经式工作电极，用于由n d a ( n a p h t h a l e n e 一2 ，3 一d i c a r b o x a l d e h y d e ) 衍生的氮基酸的分离测定。由于p d m s 的封合是非永久性的，电极钝化或损坏后，可以揭开芯片重新填充碳糊。 g a w r o n 2 6 1 与h a n a j i r i 2 7 】等人的工作与此类似，他们在p d m s 垫片上制作 了微米级的电极通道，借助于光学显微镜的观察，将外径相当的碳纤维工作 电极填入电极通道，与通道出口间留有一定的间距，制成流经式安培检测模 式。 1 2 。3 2 金属电极 在芯片毛细管电泳安培检测系统中应用较多的金属电极有微圆盘电极 及膜状电极两类。 金属微圆盘电极的制作技术与碳纤维微圆盘电极一样，由于其制作方法 简单，在芯片毛细管电泳安培检测系统中使用较多m o ，一9 , 3 0 , 3 2 , 3 3 , 3 9 。但也有直 浙江太学项士擘隹论文 第一却分培如 接使用金属丝作为工作电极的报道。h e n r y 等使用2 5 啪的p t 丝在陶瓷芯 片上制作了流经式工作电极：s c h w a r z 等【1 4 】直接将涂覆有t e f l0 ：n 的铂丝放 置在玻璃芯片毛细管通道出口端，作为流向式工作电极。 对膜状金属电极来说，其制作技术主要有以下几种方式： 喷涂法 在洁净的玻璃或s i l s i 0 2 基片上，用掩膜或光胶遮盖住非电极部位，采 用热蒸发、真空溅射等技术在基片表面沉积上层金属，制成金属薄膜电极。 为增强金属电极在基片上的附着强度，可以先沉积一层铬或t i 0 2 后再喷镀金 属电极。w o o l e y 等i l o 在玻璃芯片的分离通道出口池底部靠近通道出口处， 用等离子体溅射方法制作了宽为l o “m 的条状微铂电极，用于d n a 片段和 p c r 扩增产物的分离测定。w a n g 等【3 4 】报导了在玻璃芯片毛细管出口的断面 上采用溅射法制作“流通”式金工作电极，用于神经递质的分离测定。 光刻法 该法采用热蒸发、真空溅射等技术在整个基片表面沉积一层金属膜之 后，涂上光胶，经光刻和湿法腐蚀除去非电极部分的金属层，被光胶所保护 的金属层即形成所需的金属薄膜微电极。这种方法常被用于膜状金属电极的 制作阻2 3 ，2 “。 m a r t i n 等【4 0 1 采用该法在玻璃上制作了条状流经式微金膜电极，用于邻苯 二酚等化合物的分离测定。椐报道，该电极可在8 小时内连续进行1 5 0 次以 上的电泳分离测定。在连续使用电极的情况下，电极响应会明显降低。用双 向极化方波“清洗”工作电极可在一定程度上恢复电极的响应性能，但这种 清洗电极的方法会缩短电极的使用寿命。 此外，b a l d w i n ( ：2 2 1 与l a p o s 2 0 1 等人采用一种更为简单的光刻移除技术制作 金属薄膜微电极。他们用黑色的铬板为掩膜，将电极形状转移至覆盖有铬层 和光胶的玻璃片上，电极形状处的光胶经曝光显影除去，暴露出来的铬层用 渐江太学硕士学位论文第一部分砖语 除铬液除去，则玻璃片上显示出所需的电极形状，后将此玻璃片在刻蚀液中 刻蚀6 0s ，玻璃片上形成一o 3g m 的凹槽。之后，依次在玻璃片上溅射1 0n m 厚的钛金属层与3 0 0n n 2 厚的铂金属层，最后除去玻璃片表面残余的光胶层 和铬层即可。这种电极制作方法相对于湿法刻蚀制作技术相比，不需要多次 选择性刻蚀，操作相对简便。图1 1 5 是b a l d w i n 等人制作的膜状微型金属电 极。 化学镀 图1 1 5 膜状金属电极与检测池结构图 除溅射法外，还可采用化学镀( 又称无电沉积，e l e c t r o l e s sd e p o s i t i o n ) 技术制作薄膜金属微电极。h i l m i 等f 4 ”采用化学镀技术在玻璃芯片的通道端 面沉积了一层环状金膜，形成流通式金工作电极，分离测