（土壤学专业论文）药用植物内生芽孢杆菌的多样性和系统发育研究.pdf

摘要 本论文以5 0 株分离自药用植物的内生芽孢杆菌为研究对象，采用数值分类、 1 6 sr d n ap c r r f l p 、b o x - p c r 指纹图谱、1 6 sr d n a 序列分析方法对供试菌株 的生物多样性、系统发育进行了系统研究，并测定了供试菌株对几种作物真菌病 原菌的拮抗作用。获得以下主要研究结果： 供试药用植物内生芽孢杆菌具有丰富的表型及遗传多样性。与分类地位已知 的典型菌株进行比较，依据表型性状、1 6 sr d n ap c r r f l p 及b o x p c r 的聚 类分析，分别将供试菌株分为1 3 、1 6 和2 7 个表观群和遗传群。表观特征表明大 部分菌株具有较高的耐性。在所用的限制性内切酶中，m s p l 切割的带谱最丰富， 是反映内生芽孢杆菌1 6 sr d n a 序列差异性的最有效的限制性内切酶。 b o x - p c r 指纹图谱揭示的遗传多样性更丰富，能区分种内菌株间的遗传差异性。 在数值分类8 4 相似性水平上位于同一表观群的供试未知菌株大多分布于几个 综合的b o x p c r 群内。总的来说，本研究所采用的表型分群和遗传型分群的结 果在总体趋势上是一致的。 依据多样性分析结果，选择代表菌株测定保守基因1 6 sr d n a 全序列，并构 建系统发育树。结果表明：供试的代表菌株s c a u l l 与球形芽孢杆菌( b a c i l l u s s p h a e r i c u s ) 亲缘关系最近，s c a u 7 8 和s c a u 2 5 为枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 的两个亚种，代表菌株s c a u 3 9 与巨大芽孢杆菌( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) 的亲缘 关系最近。1 6 sr d n a 基因全序列分析结果揭示了供试内生芽孢杆菌的系统发育 关系。 拮抗试验表明：供试菌株中s c a u l l ，s c a u l 0 ，s c a u 4 9 ，s c a u 3 3 和s c a u 4 6 对玉米弯孢菌( c u r v u l a r i al u n a t a ) ，小麦禾谷镰刀菌( f u s a r i u mg r a m i n e a r u m ) ， 串珠镰刀菌( f u s a r i u mm o n i l i f o r m e ) ，玉米大斑病菌( s e t o s p h a e r i at u r c i c a ) 和油 菜菌核病菌( s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ) 有较强的拮抗作用。该结果为芽孢杆菌在 生物防治方面的应用奠定了基础。 关键词：药用植物；内生芽孢杆菌；遗传多样性；系统发育；拮抗 a b s t r a c t f i f t ye n d o p h y t i c b a c i l l u ss t r a i n si s o l a t e df r o mm e d i c i n a l p l a n t s w e r e c h a r a c t e r i z e db yn u m e r i c a lt a x o n o m y ，1 6 sr d n ap c r r f l p ，b o x - p c rf i n g e r p r i n t s a n d1 6 sr d n as e q u e n c et od e s c r i b et h eb i o l o g i c a ld i v e r s i t ya n dp h y l o g e n y t h e a n t a g o n i s mo ft h ei s o l a t e sa g a i n s tp a t h o g e n i cf u n g if r o mc r o p sw e r et e s t e da ts a m e t i m e t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： a l l i g hp h e n o t y p i ca n dp h y l o g e n e t i cd i v e r s i t yo fe n d o p h y t i cb a c i l l u si s o l a t e d f r o mm e d i c i n a lp l a n t s a n dc o m p a r e dw i t hs t a n d a r d e ds t r a i n s ，a c c o r d i n gt oc l u s t e r a n a l y s i so fp h e n o t y p i cc h a r a c t e r , 1 6 sr d n ap c r - r f l pa n db o x - p c r ，t h ei s o l a t e s w e r ed i v i d e di n t o1 3p h e n o n s ，1 6a n d2 7g e n t i cg r o u p sr e s p e c t i v e l y t h ep h e n o t y p i c c h a r a c t e r i z a t i o no ft h e s es t r a i n ss h o w e dt h a tm o s to ft h e s es t r a i n sh a dh i g hs t r e s s r e s i s t a n c e a m o n gt h er e s t r i c t i o ne n z y m e su s e d a t s p lw a st h em o s td i s c r i m i n a t i n g e n z y m e t h eg e n e t i cd i v e r s i t y w a s h i g h r e v e a l e d b y b o x p c r b o x p c r f i n g e r p r i n t i n gi sa p p r o p r i a t ea s am e t h o dr e v e a l i n gg e n e t y p i cd i v e r s i t yw i t h i na b a c i l l u ss p e c i e sa n ds t r a i n s s t r a i n sb e l o n g e dt oo n ep h e n oi nn u m e r i c a lt a x o n o m y a l w a y sd i s t r i b u t e di n t os e v e r a lb o x p c rg r o u p s o v e r a l l ，t h ea n a l y s i so fp h e n o t y p i c a n dg e n o t y p i cd i v e r s i t yw a sg o o da g r e e m e n tw i t he a c ho t h e r , w h i c ha p p r o v e dt h e r e s e a r c hr e s u l t sw e r cc r e d i b l ea n ds t a b l e b a s e do nt h er e s u l t ，t h e1 6 sr r n ag e n eo fr e p r e s e n t a t i v es t r a i n sw e r ec o m p i e t e l y s e q u e n c e d ，a n d t h e p h y l o g e n e t i ct r e e w a sr e c o n s t r u c t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t s c a u l lw a sh i g h l yr e l a t e dt ob 劝口e r f 伽，s c a u 7 8a n ds c a u 2 5w e r ei d e n t i f i e da s bs u b t i l i ss u b s p e c i e s ，s c a u 3 9w a sh i g h l yr e l a t e dt ob m e g a t e r i u m t h ep h y l o g e n i c r e l a t i o n s h i pc o n s t r u c t e db yt h e1 6 sr d n ag e n ef u l ls e q u e n c e t h er e s u l to fa n t a g o n i s t i ct e s t s u p p o r t e dt h a ts c a u l1 ，s c a u l 0 ，s c a u 4 9 ， s c a u 3 3a n ds c a u 4 6i nt h es t r a i n st e s t e dd i s p l a y e das t r o n g e ra n t a g o n i s t i ce f f e c t a g a i n s tp a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m ( c u r v u l a r i al u n a t a , f u s a r i u mg r a m i n e a r , f u s a r i u m m o n i l i f o r m e , s e t o s p h a e r i at u r c i c aa n ds c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ) t h a nt h eo t h e r s t h i s s t u d y l a i daf o u n d a t i o nf o ra p p l y i n go fb a c i l l u si nb i o l o g i c a lc o n t r 0 1 k e yw o r d s ：m e d i c i n a lp l a n t s ；e n d o p h y t i cb a c i l l u s ；g e n e t i cd i v e r s i t y ；p h y l o g e n y ； a n t a g o n i s m 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：暂，秀加谬年7 月日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业 大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：侧7 易 钏签夕么7| 1 月u 吾 中国是药用植物资源最丰富的国家之一，对药用植物的发现、栽培和使用， 有着悠久的历史。药用植物在医药中占有重要地位。芽孢杆菌( b a c i l l u s ) 是一类 数量众多且具有多样性，需氧或兼性厌氧、杆状、革兰氏阳性( 或可变) 、在一定 条件下能形成芽孢的细菌。由于能够产生抗逆性强的芽孢，因此可以耐受各种不 良环境，如可以在p h i 2 0 3 0 的酸性环境生存，也可以在温度高达7 5 8 0 c 的条 件下存在，即使在南极寒冷的冰雪中也能见到他们的踪迹i 。 生物进化和生命系统发育学是生命科学的重大研究课题。芽孢杆菌是一类重 要的微生物类群，由于在食品、农业、工业、医学、冶金、林业、环保乃至军事 等诸多方面均有重要的应用价值，其分类学研究具有极其重要的意义。近几年来， 一些更先进的技术被用到芽孢杆菌的分类鉴定研究中。r e v a 等从植物和土壤中分 离出1 7 株芽孢杆菌，测定了它们的1 6 sr r n a 基因、消旋酶基因( g y r a ) 和组氨酸激 酶基因( c h e a ) 的部分序列，并在此基础上分析这1 7 株菌的系统发育关系 2 1 。h a q u e 等从大米中分离出7 株芽孢杆菌，通过测定其菌落和细胞形态特征，鉴定这些菌 为蜡样芽孢杆菌。进一步对其进行生理生化特征和1 6 sr d n a 序列测定，证实了 原来的判蚓3 1 。研究芽孢杆菌的生物多样性，一方面有利于发掘新资源，另一方 面为其应用奠定基础。 1 1 芽孢杆菌的分类现状 早期芽孢杆菌分类主要以表型特征为依据，导致其分类较为混乱，现有的许 多属以种的形式位于芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 内。j o r d a n 等( 1 9 8 4 ) 在伯杰细菌鉴定 手册第八版中将芽孢杆菌属和芽孢乳杆菌属归于芽孢杆菌科。 2 0 0 1 年最新版的：b e r g e y sm a n u a lo fs y s t e m a t i cb a a e f i o l o g y 在各级分类单 位中全面应用核酸研究，在表型特征的基础上，以d n a 资料给予决定性的判断， 使人为的分类体系逐步向自然体系过渡。芽孢杆菌被重新划分，芽孢杆菌科 ( b a c i l l a c e a e ) 包含有芽孢杆菌的7 个属：芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) ，双芽孢杆菌属 ( a m p h i b a c i l l u s ) ，厌氧芽孢杆菌属( a n o x y b a c i l l u s ) ，细长芽孢杆菌属 ( g r a c i l i b a c i l l u s ) ，盐芽孢杆菌属( h a l o b a c i l l u s ) ，需盐芽孢杆菌属( s a l i b a c i l l u s ) 和 分支芽孢杆菌属( v i r g i b a c i l l u s ) 。不过，其中的需盐芽孢杆菌属( s a l i b a c i l l u s ) 在2 0 0 3 年被转入分支芽孢杆菌属( v i r g i b a c i l l u s ) 。原来的类芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属和 脂环酸芽孢杆菌属已上升到科的地位，7 个属的芽孢杆菌包括类芽孢杆菌属、硫 胺素芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、耐热芽孢杆菌属、脂环酸芽孢杆菌属和硫芽孢 杆菌属，分别位于芽孢杆菌目的3 个科中，即。芽孢乳杆菌科 s p o r o l a c t o b a c i l l a c e a e ”( s p o r o l a c t o b a c i l l u s ) ，类芽孢杆菌科 p a e n i b a c i l l a c e a e ” ( p a e n i b a c i l l u s ，a n e u r i n i b a c i l l u s ，b r e v i b a c i l l u s ，t h e r m o b a c i l l u s ) 和脂环酸芽孢杆 菌科 a l i c y c l o b a c i l l a c e a e ”( a l i c y c l o b a c i l l u s ，b i f m o b a c i l l u s ) 。近年来，芽孢杆菌 分类鉴定研究进展迅速，又有多个新属陆续被发现。 1 2 芽孢杆菌多样性研究进展 ，、生物多样性( b i o d i v e r s i t y ) 是指生物物种的多样化及其变异的深度及广度，是 物种多样性、遗传多样性和生态多样性三个层次的综合表述。当今的生物多样性 是地球4 6 亿年生物进化的结果，是人类社会赖以生存和发展的物质基础。微生物 是地球上出现最早的生物，己有4 6 亿年的生命历史【4 1 ，尽管微生物个体微小，其生 物量却达到了地球上总生物量的5 0 左右【5 】，微生物漫长的进化历史正是微生物 多样性的驱动力【6 】，因此微生物是自然界生物多样性不可缺少的组分。随着分子 生物学理论和技术的成熟和发展，细菌分类和鉴定的方法有了质的飞跃。人们不 再把目光局限在表型或个别简单遗传特征的测定上，而是将传统技术和新技术有 机结合起来，尽可能全面地表达细菌的表型和遗传特征，这一类综合技术就是所 谓的“多相分类”方法。虽然传统分类不能确切说明芽孢杆菌的遗传进化地位和关 系，但它却是人们认识芽孢杆菌实际重要性和研究生物进化的基础，尽管受到现 代系统分类学，尤其是分子分类学的冲击，但它仍然是多相分类研究的基础。早 期芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 的分类鉴定研究即采用传统分类方法。与宏观生物不同的 是，原核生物的多样性在形态和分化上表现并不突出，而主要表现在物种和基因 水平上c 7 l 。随着分子生物学的发展和各项新技术的广泛应用，促使芽孢杆菌分类 鉴定工作有了飞速的发展，已从经典的表型特征的分类鉴定深入到现代的遗传学 特性、细胞化学组分的精确分析以及利用电子计算机进行数值分类研究等新的层 次上。国际系统细菌学委员会设立了一个芽孢杆菌属的多相分类研究项目，目的 是建立种描述最小标准，对群命名进行修订，其主要细菌多相分析方法包括扩增 rd n a 限制性分析( a r d r a ) 、全细胞脂肪酸成分分析( f a m e ) 、全细胞蛋白质 s d s p a g e 分析、d n a 相关性评价、d n a 碱基组成分析、1 6 sr r n a 测序及表型 2 特征( 形态、生化生理等) 研究【8 l 。 1 2 1 表型分群的方法 一般来说，生物的表型信息来源于蛋白质及其功能、各种不同的化学标志、 以及大量的诸如形态、生理、生化、免疫等特征的表达，因此表型的测定就是对 这些特征的测定。在芽孢杆菌的分类鉴定中，常用的方法主要有数值分类法 ( n u m e r i c a lt a x o n o m y ) 、全细胞可溶蛋白电泳分析( s d s p a g eo fw a t e r - s o l u b l e c e l l u l a rp r o t e i n ) 、多位点酶电泳分析( m u l t i l o c u se n z y m ee l e 斌r o p h o r e s i s ，m l e e ) 、 全细胞脂肪酸分析( a n a l y s i so fw h o l ec e l lf a t t ya c i d s ) 、血清学反应类型测定 ( s e r o l o g yt y p e ) 、噬菌体反应类型( p h a g et y p e ) ，胞外多糖分析等等。 1 2 1 1 数值分类 数值分类的原理根据植物学家m i c h e la d a n s o n 提出的“等权”原则，逐渐完善 并应用于细菌分类。r o b e ns o k a l 和p e t e rh as n e a t h 指出数值分类是：借助数值方 法，根据其性状、状态将分类单位归类成类元【9 1 。 数值分类学最早可追溯到上个世纪生物度量学的兴起。1 9 8 4 年s n e a t h 将数 值分类列为细菌分类方法之首，概述了数值分类的程序及要领。1 9 8 8 年 d y m b o w s k if r a n k l i n 和l e p a g e 首先使用计算机进行肠道菌分类项目的概率运算， 并证明了其可靠性1 1 0 l 。在我国，徐浩发表了“微生物数值分类方法简介，1 1 1 】，并于 1 9 7 5 年首次成功的将数值分类法用于6 3 株枯草杆菌的研究【1 2 】。d y k e s 等从焙烤箱 表面、食品原料及面包中分离出1 0 2 株芽孢杆菌，通过测定其7 2 项表特征，确定 了该菌群的树状分布图【1 3 】。马俊才等从8 0 年代起，完成了中国微生物资源数据 库( m r d c ) 的构建工作，m r d c 数据库中含有数据分类软件包m i n t s l l 4 1 。现在国 际上一些流行的软件有：s a s ，s p s s ，b m d p ，s t a t 等。其中的s a s 软件提供了1 1 种 不同的样品聚类形式，即：平均法( a v e r a g e ) 、重心法( c e n t r o i d ) 、最长距离法 ( c o m p e t e ) 、非参数概率密度估计法( d e n s i t y ) 、最大似然法( e m l ) ， f l k e x i b l e 法、相似分析法( m c q u 哪、中位数法( m e d i a ) 、最短距离法 ( t a n g l e ) 、两阶段密度法( t w o s t q a g e ) ，最小方差法( w a r d ) 等【1 5 ，1 6 1 。 数值分类是向分类学家提供准确的，可重复的，大信息量的处理手段，现 已广泛应用于微生物学、动物学、植物学、古生物学等领域，尤其被微生物学研 究者普遍接受，在分类学中占有极其重蓦的地位【1 7 1 羽。其在细菌分类中运用的 3 步骤包括：收集试验( t ) 中被分类的菌株( n ) 的大量数据。试验包括生理、生化、形 态等，然后做成一个n t 的数据矩阵；使用得出的数据矩阵，根据试验菌株的相 似性或非相似性进行分类；相互关系密切的菌株再用聚类分析的方法划归类群： 检验数值上定义的群，由矩阵求出可以区别它们的任何特性，进行加权鉴定。 1 2 1 2 全细胞可溶性蛋白质电泳分析 蛋白质是基因表达的产物，是生命的最终体现形式，不同细菌其蛋白质组成 存在着差异，关系密切的细菌的蛋白质组成具有一定的相似性。采用s d s p a g e 电泳对高度标准条件下培养的细胞的可溶性蛋白质进行分析，可以得到反映生物 基因组成的蛋白质图谱信息，这是蛋白质电泳分析用于细菌表型分类及多样性研 究的理论基础。由于根瘤菌的蛋白质组成复杂，蛋白质多态性分析可以获得的信 息量很大，进行比较后即可得到菌株蛋白质图谱的多样性特征。研究发现这种分 析方法可以做细菌初步分群的一种方法，对大量菌株进行分群分析，同时也可以 区分种或者种群以下水平的菌株【1 9 创。随着细菌凝胶扫描及凝胶分析软件f 如 g e l c o m p a r 凝胶分析系统) 的普遍应用，以及培养条件和电泳条件的标准化r s d s p a g e 方法具有了快速简便、重复性好的优点，其分析结果与其它分类方法 如数值分类、d n a - d n a 杂交等的结果有较好的一致性；s d s p a g e 方法虽然简 易快速，但无法提供描述性的表型性状特征，也无法像数值分类那样有明确的相 似性百分比标准来判定新的种群，且结果有时不太稳定。因此在细菌分类中，全 细胞可溶性蛋白电泳一般用于对大量未知菌进行初步分群，并作为多相分类技术 中的一项辅助手段验证其它方法的正确性。 1 2 1 3 多位点酶电泳( m u l t i l o c u se n z y m ee l e c t r o p h o r e s i s ，m l e e ) 多位点酶又称同工酶，由细菌中不同位点的基因编码。多位点酶电泳技术 【m l e e ) 通过淀粉凝胶电泳将细胞内的同工酶分离，继而用各种酶的特异性底物 显色，最后比较其电泳迁移率，得到酶谱带型的多态性，它是一项检测等位基因 变异的技术。1 9 7 3 年，r o g e r 等首先将多位点酶电泳技术用于研究大肠杆菌自然 分离物的群体结构。随后这项技术被广泛用于许多病原菌的研究。s e l a n d e r 等【2 3 l 已利用m l e e 方法对多种微生物进行了分类学及群体遗传学研究。虽然多位点酶 电泳技术具有很多优点，但是由于遗传密码子的简并性，即使电泳后位于同一位 置的蛋白点，也并不能够表示其核酸序列就完全一致。因此，此项技术无法完全 4 真实地揭示细菌的遗传多样性。 1 2 1 4 全细胞脂肪酸分析 细胞的极性脂质成分和结构特性是其特有的种系特征。由于脂肪酸和生物系 统分类之间存在很大的相关性，因此，人们将脂肪酸组成作为生物化学分类的标 记。 目前，全细胞脂肪酸分析这技术从脂肪酸的提取、气相色谱分离以及数据 处理等过程均已达到较高程度的自动化，因此在细菌分类鉴定中也得到了广泛的 应用，并也可用于大量菌株的比较和聚群，同时也可提供菌株在脂肪酸种类上的 描述性特征信息。自1 8 7 2 年c o h n 建立芽孢杆菌属以来，由于这类细菌形态、生 理代谢及遗传的多样性，其分类状况一直较为混乱。结合化学和分子生物学分类 方法将原划归为该属的1 0 0 多个种分成十几个不同的属1 2 s 1 ，但还有相当多模式菌 株的化学数据不完整。 极性脂是细胞的重要成分已成为细菌化学分类的重要指征之一，芽孢杆菌细 胞极性脂的系统分析报道很少，尚未引起重视。利用双相薄层层析技术可以找出 不同类型芽孢杆菌，全细胞极性脂图谱可用于细菌鉴定，这种方法比传统的形态 特征与生理特征分类可靠，与分子分类相符。郭爱玲等人通过双相薄层层析对1 4 个芽孢杆菌模式菌株的细胞极性脂组分进行分析，探讨极性脂在芽孢杆菌化学分 类上的可行性，认为极性脂可作为芽孢杆菌化学分类的重要特征【硼。 1 2 2 遗传型分群的方法 ： 虽然表型特征是细菌遗传特性的表现形式，通过表型分析比较可以综合地反 映细菌的表型多样性，但终究难以全面反映细菌的全部遗传特征。以数值分类为 例，即使把数值分类测试项目增加至3 0 0 项左右，其结果仍只能反映细菌基因组 5 2 0 的遗传信息【2 刀。遗传多样性( g e n e t i c d i v e r s i t y ) 是指生物种内基因的多样性， 包括种群间和个体间的遗传变异。研究细菌的遗传多样性时，常常从细菌基因组、 一些特殊基因片段应用多种分子生物学方法进行检测。 1 2 2 1 基于基因组水平指纹图谱分析 随机扩增d n a 片断的多态性分析( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n r a p d ) 这项分析技术f 1 日w i l l i a m s 等人于1 9 9 0 年创立。它是利用随机排列碱基顺序 的寡核苷酸单链( 通常为1 0 个碱基) 为引物，对所研究的各种生物基因组d 燃 行扩增，扩增产物经电泳分离和染色后，检测d n a 片断的多态性，以揭示不同 生物基因组的特征。 由于随机引物的寡核苷酸序列在不同细菌染色体d n a 上分布的位置和数目 不同，经随机引物扩增后得到的d n a 指纹图谱也存在差异。因此，r a p d 指纹 图型能揭示基因组染色体d n a 碱基的变化【刎。但是，采用单一引物扩增，所检 测到的基因组区域非常小，多态性不明显，因而在研究工作中常应用多个随机引 物，从中选择能提供丰富的遗传信息和检测区域几乎覆盖整个基因组的引物组 合，从而反映出细菌全序列的基因变化。 r a p d 简单、快速，但是对反应条件敏感、易出现假带，常使结果的重现性 较差；而且并不是所有的随机引物都能产生足够的多态性【2 9 1 等，因此研究者通 过使用双引物、提高退火温度( 柏以上) ，设计引物时注意序列长度和g c 含量 等措施，有效地降低假带产生，提高r a p d 的重现性和多态性【刈。在此基础上， 发展成的双引物t p r a p d ( t w o - p r i m e rr a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) ，使 p c r 结果具有了种的特异性。 a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，简称a r l p ) 即扩增长度多 态性，是1 9 9 2 年由荷兰科学家z e a b e a u 和s 发展起来的一种检测d n a 多态性 的方法。其主要特点是对基因组d n a 进行双酶切，与双连接头连接后再用与之 配对的双引物进行选择性扩增，p c r 产物用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银 染或放射性自显影得到不同长度的d n a 指纹图谱，然后将图谱扫描后的信息输 入计算机，用相关软件分析即可得到聚类树状图。a f l p 结合荧光标记发展成的 f a f l p 技术【3 l l ，使a f l p 反应可以在测序仪器上完成，数据更加标准化，既便 于不同菌株间a f l p 指纹图谱的比较和建立参比菌株的a f l p 指纹图谱信息库， 也增加了a f l p 的稳定性和可靠性。a f l p 结合了r f l p 和p c r 的优点，灵敏度 高、分辨力强，指纹图谱的差异可以与菌株或相近种内基因的变化相对应，这是 其它表型分析和分子生物学方法所做不到的。因此，可以在亚属、种和亚种水平 对微生物进行分类，尤其对区别高度相关的菌株( 同一个种或同一个生物型) 具有 很大的潜力【3 2 1 。 a f l p 指纹图谱分析技术的优点有：它无需事先了解所研究的d 晰列，并且 分辨率高，重复性好和灵敏度高：另外，a f l p 指纹技术在区别高度相关的菌株( 属 6 于同一种或同一个生物型的菌株) 方面颇具潜力。h u y s 等1 3 3 l 采用a f l p 技术对 a e r o m o n a s 属的菌株进行了研究，结果表明，a f l p 技术分析结果与d n a o d n a 杂 交的结果具有较好的一致性，但是也存在一些差异。因此，他们认为从总体而言， a f l p 指纹技术以其快速，重复性好，分辨率高等特点可以替代传统的d n a - d n a 杂交的一种方法。a r a t s 等【3 4 】对6 2 个血清型的7 8 株s a m o n e t l a 菌株进行a f u 指纹分 析，发现所有的血清型都具有独特的a f l p 指纹图谱，并且a f l p 指纹技术具有较 高的分辨率，可以区分用其它方法无法区分的不同菌株，因此，他们认为a f l p 指纹技术还非常适合于细菌的诊断与鉴定工作。张小平，陈强等【3 5 l 根据四川花 生根瘤菌a f l p 指纹图谱的相似性进行聚类分析，结果表明，所有花生根瘤菌的 相似性很高，在7 0 的相似性水平上聚为四类。尽管如此a f l p 指纹图谱仍然反 映了四川花生根瘤菌菌株间存在的微小差异，因此a h ，图谱在反映d n a 同源性 高、系统发育关系密切的菌株之间的遗传多样性方面是非常有效的。 r e p p c r 指纹分析它是利用细菌基因组中广泛分布的短重复序列为引物的。 靶序列进行p c r ! 扩增，通过电泳条带比较分析，揭示基因组间存在的差异。目前 在细菌的基因中已发现存在1 0 种以上可用于基因指纹鉴定的短重复序列，如r e p ( r e p e t i t i v ee x t r a g e n i cp a l i n d r o m i c ) 基因外重复回文因子【3 6 1 ，e r i c ( e n t e r o b a c t e r i a lr e p e t i t i v ei n t e r g e n i cc c m s e n s u s ) 肠杆菌基因间重复共有序列1 3 7 1 ， b o x 【：8 ，3 9 】等短的重复序列，分散存在于细菌染色体基因组的基因间，含有多个挎 贝，长度小于2 0 0 b p 。在不同的菌株的染色体上，重复序列的位置不一定相同， 因而根据其保守序列设计引物，以总d n a 为模板进行p c r ! 扩增，通过电泳条带比 较分析，能揭示菌株间染色体基因组存在的遗传差异性。 1 2 2 2 基于特殊基因扩增片段酶切图谱和序列的多态性分析 在细菌的分类中所分析的特定基因区或序列多为r i l l 操纵元，分别是1 6 sr r n a 基因、间区( i n t e r g e n i cs p a c e r ，i c s ) , 2 3 sr r n a 基因、间区和5 sr r n a 基因。 根据二操纵元的保守区设计一系列引物，扩增出相应的基因片段，再用限制性内 切酶消化p c r 产物，然后用凝胶电泳分析酶切片段的长度多态性即可获得原核生 物的遗传多样性。 随着测序技术的发展，很多研究者倾向于直接使用1 6 sr r n a 基因序列、间 区序列进行比较分析【4 0 1 ，以揭示细菌的亲缘关系。此外，越来越多的研究者将 7 特定基因的序列分析集中到除m 操纵元以外进化上保守的功能基因上，如：g l n ， d n a k , a t p d ，r e c a 等。 a r d r a ( a m p l i f i e dr i b o s o m a ld n a r e s t r i c t i o na n a l y s i s ) 原核生物的rr n a 由 5 s ，1 6 s 和2 3 s = 个亚单位构成。5 sr r n a 很小，仅有1 2 0 b p ，所含的遗传信息量有 限，1 6 s 和2 3 sr r n a 分别为1 5 0 0 b p 和3 0 0 0 b p 。因此，1 6 s 、2 3 s r d n a 及1 6 s 2 3 sr d n a 基因间隔区序列( 1 g s ) 的多态性分析( a m p l i f i e dr i b o s o m a ld n ar e s t r i c t i o n a n a l y s i s ，合简称为a r d r a ) 具有种的特异性【4 1 1 。 由于1 6 s 2 3 sr d n ai g s 序列的变异程度比1 6 sr d n 刖芋列的变异程度大，i g s p c r r f l p 分析结果比1 6 sr d n a 的r f l p 的灵敏度高，因而可用于对细菌不同生 物型菌株、种、属的分类鉴定【4 2 1 ，甚至可用于区分关系非常近的种【4 3 , 4 4 1 。 但是1 6 sr r n a 基因也具有其局限性，如：演化速率比较慢，不能在种水平 上区分不同菌株。此外，k u n n i m a l a i y a a n ( 1 9 9 9 ) 等在踟c i l l u sm e g a t e r i u m 的质粒上 发现了包含1 6 sr 砒蛆基因在内的一个核糖体操纵元。因此，1 6 s 舭基因反映 的细菌间的进化关系不是完全真实、可靠的。 1 2 2 3 基于基因组d n a 的同源性分析 在表型和遗传分析的基础上，d n a - d n a 同源性分析及g + c m 0 1 的测定已成 为细菌分类鉴定种的基本方法，并已成为描述细菌分类单元的一个标准。国际系 统细菌学委员会规定，d n a 同源性= 7 0 、热解链温度差a t m = 5 为细菌种的界 限1 4 5 】。这个标准虽然是经验值，但并不是主观随意产生的，而是经过不同国家 的许多试验室对6 0 0 个细菌种的大量菌株( 一般每种在1 0 株以上) 进行测定比较 后，在综合统计分析试验结果的基础上得出的，并且己经在细菌的几百个属的 2 0 0 0 多个种，约1 0 0 0 0 多个菌株的研究中得到广泛应用。s t a c k e b r a n d t 等i 蛔统计了 当时u s b 已发表新种的d n a - d n a 同源性分析情况，1 9 8 7 年，6 0 的细菌新种的 描述包含了d n a 同源性分析，1 0 应用了血清学分析技术，但有3 0 的新种没有 这两方面的数据；1 9 9 3 年，7 5 的新种有d n a 同源性分析，8 应用了血清学技 术，只有3 的新种没有这两方面的数据描述，另有1 4 的新种用1 6 sr d n a 序列 分析结果确定。在根瘤菌分类中，d n a 杂交和g + ct o o l 测定亦是建立新种、属 的必要标准之一【4 7 1 。 8 1 3 芽孢杆菌在生防中的应用 1 3 1 芽孢杆菌的特点 在植物病害生防细菌中，研究较多的是芽孢杆菌。芽孢杆菌营养要求简单， 易于分离、培养和保存。田问应用己证实，其生防菌剂在稳定性、与化学农药的 相容性和在不同植物不同年份防效的一致性等方面明显优于非芽孢杆菌和真菌 生防菌剂。并且可以将芽孢杆菌做成粉剂、液剂，粉剂容易储存，便于运输，大 规模生产工艺简单，成本较低。因此，芽孢杆菌是目前一种较为理想的生防微生 物【枷，在植物病害生物防治中被广泛应用。由于上述优点，其生防作用和生防 机理一直是国内外的研究热点1 4 9 1 。 1 3 2 芽孢杆菌作为生防菌的应用 芽孢杆菌在土壤和植物表面普遍存在酬，能防治多种植物病害。稻瘟病1 5 1 】、 小麦白粉病、小麦赤霉病、苹果红癌病和西瓜枯萎病1 5 2 】等，有的己经开发成商 品1 5 3 ，5 4 1 。芽孢杆菌不仅具有防病作用，而且具有明显的促进生长的作用和增产 效果，并且具有较高的安全性。国内外使用芽孢杆菌防治植物病害非常广泛，尤 其是枯草芽孢杆菌，由于它的安全性和能产生多种抗菌物质的特性而受到生物防 治工作者的偏爱。如张中鸽1 5 5 】从宁夏春麦全蚀病田块健株根样中分离获得的b 4 8 对水稻白叶枯病菌、花生青枯病菌和马铃薯软腐病菌表现强烈抑制作用。陈志谊 1 5 6 1 用枯草芽孢杆菌b 9 1 6 菌液喷施田间接种发病的水稻，对纹枯病防治效果达到 5 0 8 o 。 1 3 3 芽孢杆菌拮抗作用 研究表明，该菌的生防机理包括竞争作用、拮抗作用、诱导植物抗性等方面， 尤以产生抗生素、抑菌蛋白和挥发性抗菌物质的拮抗作用为最主要的防病机理 【5 7 1 。许多枯草芽孢杆菌防治病害都是将大量培养的活菌接种于植株表面或植物 根际士壤中，其防治效果可能亦得益于该菌在土壤中产生的抗菌物质，而非微生 物之间对生态位的占领竞争。芽孢杆菌产生的拮抗物质细菌素具有被“公认安全 ( g a r s ) ”，对人安全无毒；抗菌的广谱性，对革兰氏阳性菌有很好的抑制活性， 对革兰氏阴性菌、真菌都能够产生一定的抑制作用。 何红等从辣椒体内分离到一株产抗菌蛋白的芽孢杆菌b s 2 ，经鉴定该菌为枯 9 草芽孢杆菌内生亚种【5 8 1 。b s 2 能在辣椒、白菜等植物体内定殖传导，并对多种 植物病原真菌具有较强的拮抗作用，对辣椒、白菜、香蕉等炭疽病和蔬菜苗期立 枯病具有良好的防治效果。芽孢杆菌能形成抗逆性强的芽孢，这有利于生防菌剂 的生产、剂型的加工及在环境中存活、定殖与繁殖，因此被看作优良的生防菌株 用于生物防治。应用芽孢杆菌防治植物病害的研究具有悠久的历史，很多优良菌 株如枯草芽孢杆菌已经应用于生产实践。国内外有许多关于枯草芽孢杆菌对植物 病原真菌的抑制作用及防治实验的报道【5 9 埘1 。马平等分离到的枯草芽孢杆菌菌 株n c d 2 ，在温室和田间防治棉花枯萎病效果显著，可有效防治棉花黄萎病的发 生和发展【6 2 6 3 1 。 1 4 本研究的目的与意义 中国是药用植物资源最丰富的国家之一，对药用植物的发现、栽培和使用， 有着悠久的历史。药用植物在医药中占有重要地位。芽孢杆菌具有巨大的应用潜 力，己成为世界上许多国家研究的重要领域。目前对芽孢杆菌的研究主要集中在 寻找特定功能的基因，并将其克隆到需要的物种中；或者是通过基因工程等手段， 对芽孢杆菌生产菌株进行改造。然而分子生物学技术在芽孢杆菌领域的应用并不 意味着可以忽视自然界天然野生菌株资源的探查工作。如果没有优良的出发菌株 和原始基因，分子生物学、细胞学等手段就成为无本之木、无源之水。分离和描 述具有不同特性的菌株，进行聚类分析和系统发育研究，发现并保藏新的菌种， 可以不断补充现有的微生物资源库。因此，芽孢杆菌资源的前期开发作为芽孢杆 菌理论和应用研究的基础，有着重要的意义。 目前，尽管芽孢杆菌菌种资源和分类鉴定研究取得了一定的进展，但仍存一 些问题。国内学者的研究主要集中在土壤中的芽孢杆菌，尤其是苏芸金芽孢杆菌 的资源调查上，国外研究者对分类研究较为深入，已有对食品、药品和极端环境 中芽孢杆菌进行了分类鉴定，但尚未有人对药用植物的内生芽孢杆菌进行分类研 究。此外，芽孢杆菌种质资源的开发利用还有待于进一步深入研究，如利用芽孢 杆菌进行植物病害的生物防治工作等。本研究采用数值分类软件对药用植物内生 芽孢杆菌进行聚类分析，分类时不仅采用芽孢杆菌现有分类系统中己有的分类特 征，还采用1 6 sr d n ap c r r f l p 分析、1 6 sr d n a 序列分析和b o x p c r 指纹图 谱分析技术对它们的多样性进行研究，为进一步发掘和利用性状优良的内生芽孢 1 0 杆菌种质资源提供依据i 在进行芽孢杆菌分类基础研究的同时，从不同侧面考察 其生物多样性，也为科研和生产提供良好的研究材料，本研究还进行了抗玉米新 月弯孢菌、小麦赤霉病菌和玉米小斑病菌等的药用植物内生芽孢杆菌的筛选，得 到的拮抗性菌株可做生防菌株的出发菌株，进一步研究并克隆其抗病基因，以获 得高抗优良植株，达到抗病效果。 2 实验材料和方法 2 1 样品采集、分离纯化及保藏 采集姜黄、射干、金银花、芍药和紫苏( 四川农业大学药用植物园) 的健康 植株，分别称取5 9 根、茎、叶，经清水冲洗后，在无菌操作台上依次进行表面 消毒9 5 酒精3 r a i n ，0 1 升汞5 r a i n ，再用无菌水漂洗4 次，将最后一次清洗液 0 5 m l 转入无菌培养皿，采用混菌法于2 8 c 培养以检测消毒是否彻底，三次