（森林保护学专业论文）两种肿腿蜂的核型及RAPD研究.pdf

摘要 川硬皮肿腿蜂& s y c h u a n e n s f sx i a o 和管氏肿腿蜂s c l e r o d e r m ag u a n ix i a o e tw u 属膜翅目h y m e n o p t e r a 、肿腿蜂科b e t h y li d a e ，天牛肿腿蜂属s c l e r d e r m a s p ，都是外寄生蜂，是钻蛀性害虫的重要天敌。本文对这两种肿腿蜂进行了细 胞学研究，为揭示其种间关系、起源和演化提供必要的资料；并对它们及川硬皮 肿腿蜂种内四种分化类型进行r a p d 遗传多样性分析，为肿腿蜂的进一步研究如 遗传育种奠定基础，从而为研究肿腿蜂的变异时期、变异机制、变异因素及诱导 良性变异做准备。 在研究方法和制片技术探究的基础上，本研究对其进行了核型分析，结果如 下： 1 ) 最佳制片流程：肿腿蜂雌成虫卵巢在0 0 1 秋水仙素水溶液中预处理 l o m i n ，经蒸馏水低渗5 m i n ，用甲醇、冰醋酸( 3 ：1 ) 固定液固定1 5 m i n ，g i e m s i 染色液染色3 0 m i n ，冰冻揭片( 液氮) ，中性树胶封片。 2 ) 两种肿腿蜂染色体数目均为2 n ( 早) = 3 0 ，川硬皮肿腿蜂ss f c h u a n e n s f s x i a o 的核型公式为2 n ( 旱) = 4 m + 2 0 s m + 6 s t ，核型为3 b 型：管氏肿腿蜂s c l e r o d e r m a g u a n fx i a oe tw u 核型公式为2 n ( 早) = 4 m + 1 8 s m + 8 s t ，核型为2 b 型。 本试验对川硬皮肿腿蜂和管氏肿腿蜂基因组d n a 的提取方法和r a p d p c r 扩 增反应体系及程序优化方法进行了探讨，结果如下： 1 ) 基因组d n a 提取结果显示，蛋白酶k 法得到的基因组d n a 浓度合适，蛋 白质含量低，可以用于p c r 扩增。 2 ) 最佳体系为2 5 u i 中m g c l ：3 5 m i l ，t a qd n a 聚合酶1 5 u ，d n a 浓度 3 7 5 n g ，d n t p l 5 0 u m l ，d t t o 3 m m ；较优化的扩增程序为9 44 c 预变性l m i n 4 5 s e c ， 9 4 变性3 0 s e c ，3 6 。c 退火4 5 s e c ，7 2 延伸2 m i n ，4 5 个循环后7 2 c 延伸5 m i n 。 3 ) 用筛选出来的8 个引物对川硬皮肿腿蜂的四种分化类型及管氏肿腿蜂进 行扩增，共扩增出4 8 个位点( 分子量在5 0 0 0 0 之间) ，平均每个引物产生6 个，其中多态性位点3 3 个，占总位点数的6 8 9 。表明它们之间具有丰富的多 态性。 4 ) 引物d 2 0 中分子量为3 9 8 b p 的带可能是小型个体的标记带：引物b i o 中， 分子量为6 0 2 b p 的带可能是川硬皮肿腿蜂寄生率高的特异性标记带；引物b 1 6 中分子量为4 4 6 b p 的带可能是体形较大的这种外型特征的特异性标已带。 j ) 川硬皮肿腿蜂种内各群体在引物a 1 9 、b 1 0 、b 1 1 、b 1 6 、b 17 、c 9 、d 2 0 和f l 的平均s h a n n o n 信息指数为0 1 2 2 0 ，表明川硬皮肿腿蜂种内有较大的遗传 多样性，存在相当的遗传分化。而川硬皮肿腿蜂种内的四种分化类型中，i 和i i 之间的遗传相似度为0 8 3 7 1 ，i i i 和i v 之间的遗传相似度为0 8 7 1 0 ，均大于它 们分别与其它两种类型的遗传相似度；聚类分析显示i 和i i 首先聚在一起，i i i 和i v 优先聚在一起；表明i 和i i ，i i i 和i v 的基因组d n a 差异较小，而i 和 i i i 、i v ，i i 和i i i 、i v 之间在基因上的差异较大。 6 ) 川硬皮肿腿蜂和管氏肿腿蜂之间的平均遗传距离极大为0 3 0 6 9 ，川硬皮 肿腿蜂种内四种分化类型的平均遗传距离为0 2 3 9 5 ，种间群体的遗传距离大于 种内各群体的遗传距离；聚类分析显示川硬皮肿腿蜂种内各群体优先聚在一起， 然后再于管氏肿腿蜂在较小的遗传相似度聚在一起：表明川硬皮肿腿蜂与管氏肿 腿蜂在基因上的差异比川i 硬皮肿腿蜂种内的四种分化类型大，此结论印证了传统 分类的正确性。 关键词：川i 硬皮肿腿蜂管氏肿腿蜂核型r a p d a b s t r a c t s c l e r o d e r m as i c h u a n e n s i sx i a oa n ds c l e r o d e r m ag u a n ix i a oe tw ua r eb o t h e x t e mh y m e n o p t e r o u sp a r a s i t o i d s ( h y m e n o p t e r a ：b e t h y ! i d a e ) ，a n dt h e ya r et h e i m p o r t a n tn a t u r a le n e m yo ft h eb o r i n gp e s t s t h i sp a p e rs t u d i e dt h ec y t o l o g yo ft h e t w os p e c i e si no r d e rt op r o v i dn e c e s s a r yd a t af o rr e v e a l i n gt h er e l a t i o n s h i p ，o r i g i na n d e v o l v e m e n tb e t w e e nt h e m ；a n di ta l s oa n a l y s e dt h eg e n e t i cd i v e r s i t yb e t w e e nf o u r t y p e so fd i f f e r e n t i a t i o n o fs c l e r o d e r m as i c h u a n e n s i sx i a oa n ds c l e r o d e r m ag u a n i x i a oe tw ub yu s i n gr a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ( r a p d ) m a k e r sf o rt h e s a k eo fs t u d i n gt h ef o l l o w i n gs r u d i e ss u c ha sg e n e t i cb r e e d i n g ，w h i c hi n c h u d i n gt h e p e r i o d ，m a c h a n i s m ，f a c t o r so fv a r i a t i o na n di n d u c i n gg o o dv a r i a t i o n k a r y o t y p ew a sa n a l y e db a s i n go n t h er e s e a r c h i n gm e t h o d sa n dc h r o m o s o m e t e c h n i q u ei nt h et h e s i s t h er e s u l tw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 。 1 ) t h eo p t i m a lp r o d u c t i o nm e t h o d ：u s et h em a t u r ef e m a l eo v a r i e so f s c l e r o d e r m a s p pa sm a t e r i a l s t h es t e p si n c l u d i n g ：p r e t r e a t e dt h em a t e r i a l si no 0 1 c o l c h i c i n e l i q u of o r1 0m i n ，h y p o i n g i l t r a t e di nd i s t i l l e dw a t e rf o r5m i n ，u s e dg l a c i a la c e t i ca c i d ( 3 ：1 ) f i x e df o r1 5m i n ，a n dt h e nd y e dw i t hg i e m s ad y ef o r3 0r a i n ，f i n a l l y ，e x p o s e d t h ef l a k ei ni c e dc o n d i t i o na n dt h e ne v e l o pi tw i t hn e a t e rb a l a t a 2 ) t h ec h r o m o s o m en u m b e ro ft h et w os p e c i e sw a s2 n ( 早) = 3 0 ，a n dt h e i r k a r y o t y p ef o r m u l a sw e r e2 n ( 早- ) = 4 m + 2 0 s m + 6 s tf o r s c l e r o d e r m as i c h u a n e n s i s x i a o a n d2 n ( 早) = 4 m + 1 8 s m + 8 s tf o rs c l e r o d e r m ag u a n ix i a oe tw u ，r e s p e c t i v e l y t h e k a r y o t y p eo fs s i c h u a n e n s i sx i a ob e l o n g e dt o “3 b t y p e o fs t e b b i n sw h e r e a s s c l e r o d e r m ag u a n ix i a oe tw u b e l o n g e dt o “2 b ” m e t h o do fd n ae x t r a c t i o na n dr e a c t i o n s y s t e ma n do p t i m i z e dp r o c e d u r eo fp c r a m p l i f i t i o nw a sr e s e a c h e di nt h ep a p e r , a n dn t s y s 2 1s o f t w a r ew a su s e dt oa n a l y s e t h ed a t a n er e s u l tw e r es u m m a r i z e da sf o i l o w s ： 1 ) t h em e t h o do na l b u m e ne n z y m ek c o u l dg e to p t i m u md n ac o n c e n t r a t i o n ， b u tf e w e rp r o t e i n i tc o u l db eu s e dt op c ra m p l i f i c a t i o n 2 ) t h eo p t i m a lr e a c t i o no fr a p dw a ss t u d i e d ，t h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o no f f i v ei m p o r t a n tc o m p o n e n ts u c ha sm g + ，t a qd n a p o l y m e r a s e ，p r i m e r , t e m p l a t ed n a ， d n t pa n dd t ri n2 5 u lr a p dr e a c t i o ns y s t e mw e r e3 5 m m o l l1 5 u ，0 1 u m 乙 3 7 5 n g 1 5 0 u m la n d0 3 m m o i l , r e s p e c t i v e l y m o d i f i e dt h e r m a lp r o f i l ec o n s i s t e do f a ni n i t i a ld e n a t u r a t i o ns t e pa t9 4 cf o r1 m i n 4 5 s ，f o l l o w e db y4 5c y c l e so f9 4 ( 2f o r 3 0 s 。3 6 cf o r4 5 sa n d7 2 f o r2 r n i na n daf i n a le x p o s u r et o7 2 ( 3f o r5 m i n 3 ) d n aa m p l i f i e df i n g e r p r i n t so f7v a r i e t yo fs c l e r o d e r m as i c h u a n e n s i sx i a oa n d s c l e r o d e r m ag u a n i ) ( i a oe tw uh a v eb e e nt e s t e db ym e a n so fr a p dt e c h n i q u e 8 p r i m e r s h a v eb e e ns e l e c t e df r o m1 2 4 p r i m e s f o rr a p d a n a l y s i s o f7 v a r i e t y a l t o g e t h e r4 8s c o r a b l ed n af r a g m e n t sh a v eb e e nr e c o r d e d ，w i t h6r a p d f r a g m e n t sa m p l i f i e de a c hp r i m e ro nt h ea v e r a g e 3 3a r ep o l y m o r p h i c ，a c c o u n t e df o r 6 8 9 t h er e s u l ts h o w e dt h e r ea r ea b u n d a n tp o l y m o r p h i s ma m o n g7v a r i e t y 4 ) t h e3 9 8 b pf r a g m e n tc a nb em a r k e ro fs m a l li n s e c ti np r i m e rd 2 0 ，6 0 2 b p f r a g m e n tc a l lb em a r k e ro fh j g hp a r a s i t i s mf r e q u e n c yi np r i m e rb 1 0a n d4 4 6 b p f r a g m e n tc a l lb et h em a r k e ro fb i gi n s e c ti np r i m e rb 1 6 5 ) t h es h a n n o ni n d e xw a so 1 2 2 0i np r i m e r sa 1 9 ，b 1 0 ，b l l ，b 1 6 ，b 1 7 ，c 9 ，d 2 0a n d f 1 ，i ts h o w e da b u n d a n tg e n e t i cd i v e r s i t yi ns s i c h u a n e n s i sx i a o ia n di i ，h ia n di vo f s c l e r o d e r m as i c h u a n e n s i sx i a ow a sa s s e m b l e df i r s t l y ，i ts h o w e dt h a tt h er e l a t i o n s h i p w a sm o r ei n t i m a t eb e t w e e nia n di i ，b e t w e e ni i ia n di v , r e s p e c t i v e l y 6 ) t h ea v e r a g eg e n e t i cd i s t a n c ew a sg r e a t e rb e t w e e ns c l e r o d e r m as i c h u a n e n s i s x i a oa n ds c l e r o d e r m ag u a n ix i a oe tw ut h a na m o n gt h ef o u rv a r i e t ys u c ha so 3 0 6 9 a n d0 2 3 9 5 r e s p e c t i v e l y s t r a i n s g e n e t a t e db yu p g m a , t h ef i v ev a r i e t yo f s c l e r o d e r m as i c h u a n e n s i sx i a ow a sa s s e m b l e df i r s t l y , t h e ns c l e r o d e r m ag u a mx i a oe t w uw a sa s s e m b l e d ，t h er e s u l ts h o w e dt h er e l a t i o n s h i pw a sm o r ei n t i m a t eb e t w e e n5 v a r i e t yo fs s i c h u a n e n s i sx i a ot h a nb e t w e e ns c l e r o d e r m as i c h u a n e n s i sx i a oa n d s c l e r o d e r m ag u a n ix i a oe tw u k e y w o r d s ：s c l e r o d e r m as i c h u a n e n s i sx i a o ；s c l e r o d e r m ag u a n ix i a oe tw u ； k a r y o t y p e ；r a p d 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论 文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢 意。 一毖红角 “咖指 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川i 农业大学可以用不同方式在不同媒体 上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 繇拳忙角 导师签名 黛。 ，彩年 7 彩年 i 黾娲b c f 月谬 前言 肿腿蜂( s c l e r o d e r m as p p ) 是许多钻蛀性害虫幼虫和蛹的外寄生蜂。据 p e r k i n s 等研究报道，全世界肿腿蜂科共有2 0 0 0 多种。1 。在欧洲、北非、中亚、印度、 北美、日本和夏威夷群岛等地都有分布。1 。我国天牛肿腿蜂s c l e r o d e r m as p p 自1 9 7 3 年以来发现4 种，分别为1 9 7 3 年在广东发现寄生粗鞘双条杉天牛( s e m a n o t u s s n o a u s t e rg r e s s i t t ) 幼虫的管氏肿腿蜂( $ c e r o d e r m ag u a n ix i a oe tw u ) ，1 9 8 9 年在海南发现寄生家天牛 h y o t r u p e sb a j u u s ( l ) 幼虫的海南硬皮肿腿蜂 ( & h a i n a n f ax i a o ) 和1 9 9 5 年在四川发现寄生粗鞘双条杉天牛幼虫的川硬皮肿腿蜂 ( ss i c h u a n e n s i sx i a o ) “。另外，我国1 9 8 4 年在天津一居室内发现日本硬皮肿腿蜂 ( sn i p p o n c u sy u a s a ) “1 ，其寄主为蛀食房木的双角长蠹( s i n o x y l o ns p p ) 幼虫：日 本记载其寄主为大理羽脉窃蠹。肿腿蜂寄生的害虫种类很多，初步统计有鳞翅目、鞘 翅目、膜翅目3 个目2 2 科5 0 余种昆虫，其中天牛类寄主占2 0 余种。 我国从7 0 年代开始，对肿腿蜂的应用技术进行了研究，在生物学特性、人工繁 殖技术和林间放蜂防治害虫等方面均己取得显著的进展。 人工繁殖技术的发展为肿腿蜂的大量繁殖进而进行大面积的林间放蜂防治害虫 提供了一定的基础，但是如长期采用室内繁育方法，繁殖代数多了，会导致蜂种部分 退化“1 ，从而导致林间防治效果降低。有学者认为，采用群体接蜂有利于子代蜂复壮， 即一个指型管内接入多头寄主和蜂，子代蜂羽化后可互相交尾，避免近亲繁殖”1 。另 据山西试验，从不同试管内选择强壮蜂作为蜂种，增加接蜂比例，进行群体繁蜂，由 此复壮的肿腿蜂寿命长，个体大“1 。这些方法虽然有一定的效果，但并不能从根本上 解决肿腿蜂的种群退化问题。 做为细胞水平的研究重点，昆虫的染色体研究，是从群体、个体、细胞、分子水 平探讨昆虫学理论与应用的重要环节，是深入研究昆虫生命规律、改良益虫、控制害 虫的必要前提。在理论探讨方面，对昆虫染色体进行研究，可以丰富遗传学、分子遗 传学、昆虫遗传学的理论内涵与知识体系，揭示昆虫的种类演替、种间进化、种内进 化的客观规律，为昆虫分类系统建立、近缘种区分乃至种下分类提供新方法和技术： 在实际应用中，可以指导害虫的遗传防治，为探明昆虫抗药性形成的机理提供新的解 决途径，也为明确、改造与昆虫生命活动、发生、危害等密切相关的基因研究奠定基 础。根据现代遗传学的观点，物种的遗传性状是由基因决定的，物种的进化本质上是 基因组的进化，外部形态的变异及体内蛋白质分子的变化最本质的原因是由于基因中 d n a 分子碱基序列发生了改变，因而分子分类学可以在d n a 水平更精确地甚至定量地分 析物种的进化速度、遗传距离以及由此推断系统发育关系。 有关肿腿蜂的染色体和分子生物学方面的研究在国内还未见报道。 本研究的目的在于探索肿腿蜂科昆虫的染色体制片和核型分析的理想方法，通过 染色体数目、形态的差异推断其种间和种内亲缘关系。其结果可从细胞学水平上为研 究肿腿蜂的遗传变异、系统演化、起源、远缘杂交及染色体工程等奠定基础。本研究 还利用r a p d 分析技术，从分子水平探讨两种肿腿蜂的差异和种内分化的遗传进化规 律，为肿腿蜂的进一步研究如遗传育种奠定基础，从而为研究肿腿蜂的变异时期、变 异机制、变异因素及诱导良性变异做准备。 本研究的主要目的和任务包括：1 ) 对肿腿蜂染色体的制片技术进行探索并优化， 找到一种简便有效的方法，为肿腿蜂科昆虫的核型分析打下基础；2 ) 对两种肿腿蜂 进行染色体计数及核型分析；3 ) 对肿腿蜂的p a p d 分子标记技术进行探索，找到一组 合适的引物和一套优化的方法。4 ) 探索肿腿蜂物种间及川硬皮肿腿蜂的种内变异类 群的关系。 1 文献综述 1 1 肿腿蜂的研究概况 1 1 1 生物学特性 肿腿蜂一年的发生代数随其种类及所在地区的气候不同而异。管氏肿腿蜂在山东 平邑一年发生5 代，在粤北山区一年5 6 代，在广州一年可完成7 8 代。3 。川硬皮肿 腿蜂在四川年可发生3 4 代，并有滞育现象“。1 0 月中旬以后，温度提高至2 3 c 时 成虫仍静伏不动。肿腿蜂以受精雌虫在天牛虫道内群居越冬，翌年4 月出蛰活动，寻 找寄主。其钻蛀能力极强，能穿过充满虫粪的虫道寻找到寄主。雌蜂爬行迅速，一分 钟可爬行o 5 m 左右。肿腿蜂通过取食寄主体液补充营养，为产卵作准备。有些小型 昆虫，在肿腿蜂蛰刺取食过程中就己死亡：而一些体型过大的寄主，不能被其麻痹 产卵。肿腿蜂的产卵量在几粒至几十粒不等。川硬皮肿腿蜂以天牛幼虫为寄主，第一 代每雌平均产卵3 9 1 粒，最高达8 8 粒“。据报道，一头雌蜂一生能产卵2 9 2 9 0 粒，平均1 3 6 粒“。 肿腿蜂主要寄主害虫有：粗鞘双条杉天牛、双条杉天牛、松墨天牛( m o n o c h a m u s a l t e r n a t u sh o p e ) 、青杨天牛( s a p e r a d p o p u n e al i n n a e u s ) 、星天牛 ( a n o p o p h o r ac h i n e n s i sf o r s t e r ) 、光肩星天牛( 甜a b n p e n n i sm o t s c h ) 、桃红颈 天牛( a r o m i ab u n g i if a l d e r m a n n ) 、咖啡虎天牛( x y o t r e c h u s gr a y i iw h i t e ) 、中华 锯花天牛( a p a t o p h y s i ss i n i c a ) 、菊天牛( 肋t o e c i ar u f i y e n t r i sg a u t i e r ) 、玫瑰 多带天牛 p o l y z o n u sf a s c i at u s ( f a b r ) 、梨眼天牛( b a c c h i s af o r t u n e i t h o m s o n ) 、桑天牛 a p r i o n ag e r m a r i ( h o p e ) 、杉棕天牛( c a l l i d i u mv i l i o s u l u m f a i r m a i r e ) 、侧柏小蠹( p m o e o s i n u sp e r a t u sc h a p u i s ) 、梳角窃蠢( 尸f j j 力埘 f u s c u sg e o f f r o y ) 、二齿茎长蠹( $ i n o x y l o n j a p o n i c u ml e s n e ) 、杨干象 ( c r y p t o r r h y n c h u s a p a t h il i n n a e u s ) 、杨黄星象( l e p y r u sj a p o n i c u sr o e l o f s ) 、 六星吉丁虫( c h r y s o b o t h r i ss u c c e d a n e as a u n d e r s ) 、白杨透翅蛾( p a r a n t h r e n e t a b a n i f o l - m i s r o t t e m b u r g ) 、杨大透翅蛾( a e g e r i a a p if o r m i sc t e r c k ) 、梨小食心 虫( g r a p h o l i t h am o l e s t ab u s c k ) 等。 1 1 2 人工繁育和应用技术研究 程彬等进行了管氏肿腿蜂的人工繁育抽样技术的探讨，发现人工繁育管氏肿腿蜂 能否成功，除了选择好新鲜寄主、强壮蜂种外，还要控制好繁蜂室内的温湿度，保持 清洁卫生，进行精心管理，这是繁蜂成功的关键条件“。2 0 0 2 年刘锡平等也对管氏肿 腿蜂繁育场的营建和繁育技术进行了探讨。另外在1 9 9 8 年程彬等做了关于人工繁育管 氏肿腿蜂几项技术指标的试验。钱明惠选用三种不同中间寄主黄粉甲、玉米螟和红铃 虫进行繁育管氏肿腿蜂试验( 以寄主松墨天牛繁蜂为对照) ，试验结果表明，三种中间 寄主繁蜂效果不同，玉米螟在生产上更具潜力“。 曾垂惠，杨德敏等对川硬皮肿腿蜂人工繁育技术进行较系统的研究，初步解决了 肿腿蜂人工繁育技术及生产的工艺流程“”。 目前我国总共发现有四种肿腿蜂，研究报道较多的是管氏肿腿蜂，此蜂广泛分布 于我国广东、湖南、山东、江苏、陕西、山西、河南、河北等省；程惠珍等对肿腿蜂 对蛀干害虫的控制效能进行了评估研究，发现管氏肿腿蜂的雌蜂寿命长，繁殖能力强， 雌雄性比高，且成蜂钻蛀能力强，寄主范围也比较广。因此，应用肿腿蜂防治钻蛀性 害虫，是有效的生物防治手段。从试验结果看，肿腿蜂能达到稳定控制天牛为害的作 用，显示出它的持续效益3 。另夕b i l l 硬皮肿腿蜂也有一定的研究，该蜂的生物学、生 态学、繁育和应用技术等方面取得了许多重要成果，目| j 已居于肿腿蜂研究领域的前 沿。近年四川省雅安、阿坝及自贡等地，l ：展的花椒虎天牛、丰h 鞘双条杉天牛的工程防 治。其主要防治措施即是人工投放川硬皮肿腿蜂，控制天牛种群数量，减轻危害损失 n 封 口 8 0 年代初，北京西山风景区侧柏林受双条杉天牛严重危害，平均被害率2 2 9 ， 经大规模释放肿腿蜂后，平均被害率下降至2 3 2 ，肿腿蜂平均寄生率为6 5 3 7 4 6 ，防治效果8 8 6 。程惠珍等利用肿腿蜂防治金银花、菊花、玫瑰等蛀茎害虫，连 续两年放蜂结果表明，金银花上咖啡虎天牛和中华锯花天牛寄生率分别为7 1 4 、 7 0 4 ，虫口减退率分别为7 5 6 8 、7 6 6 7 “。玫瑰多带天牛在玫瑰之乡山东平阴普 遍发生，1 9 8 8 年用肿腿蜂进行防治，有虫株率从3 5 2 下降至1 7 1 ，天牛死亡率达 5 2 8 “。墨西哥咖啡上的蛀干害虫咖啡褐小蠢( h y p o t h e n em u s h a m p e i ) 用从非洲引 进的肿腿蜂等天敌进行生物防治，取得较好的防治效果“。据徐崇华等报道，波兰、 西德、美国和苏联等国家已经进行了研究，证明家天牛肿腿蜂( sd o m e s t y c ak l u g ) 和北美巨腹肿腿蜂可以抑制木材建筑物的重要害虫一一白蚁( c o p t o t e r m e s f o t m o s a n u ss h i r a k i ) 的发生0 1 。 1 1 3 其他研究 申莉莉等对j i i 硬皮肿腿蜂的胚胎发育进行了研究，根据其胚胎形态变化特征可分 4 个发育阶段：早期发育阶段，卵产后l 1 2 h ，包括卵割期、胚盘期和胚带期：胚胎伸长 及器官发育阶段，卵后1 2 5 0 h ，包括胚带分节，原头原躯分化、胚带再伸长、消化道 和口器形成：胚胎背合阶段，卵产后5 0 6 0 h 和胚胎成熟阶段，卵产后6 0 7 0h “。 申莉莉对川硬皮肿腿蜂s c e r o d e r m as y c j u a n e n s i sx i a o 进行了种蜂性状鉴定和 低温培育的初探。通过对1 3 个形态性状和5 个经济性状的测量分析，发现体长、头长、 头宽、产卵器长和前后胸颜色与出蜂数量的相关关系极显著，腹长与出蜂数量的相关 关系显著，都可作为选种的指标。根据体长的变化，将这6 个形态性状分为4 组，方差 分析表明上述6 个形态性状不同组间存在极显著差异，对应4 组的出蜂数量也存在极显 著差异，说明川硬皮肿腿蜂可能存在这4 个变异类型。根据寄生率、出蜂数量和出蜂 群中所占比例3 个方面的综合效果，确定第3 组为优良种蜂。对水分含量的测定结果表 明，经过低温驯化，其自由水含量下降，结合水含量升高，与昆虫的低温生物学特性 相符。而且低温下能寄生并产出子代的母蜂和羽化出的子蜂，个体都较大，体色为黑 色。 申莉莉对川硬皮肿腿蜂进行低温培育研究，结果表明低温培育是有效果的，但是 4 低温驯化获得的特性很难保持”3 。 l _ 2 昆虫染色体研究概述 1 2 1 研究方法和手段 在真核生物中，每一物种都有其特定的染色体数目。但是对于同一物种来说，染 色体的数目又是恒定的，而且每个个体的每个体细胞的染色体数目也是相同的，在其 世代延续中，染色体数目一般保持不变。 实验证明，在细胞周期的各个阶段中，当染色体处于收缩或卷曲时的有丝分裂中 期是最易识别和区分的时期。而其它时期，要么观察不到适宜长度，要么染色体数目 太多不易分析，加之一些染色体的多线性，由于有很多侧枝而不易识别和区分。因此， 经众多物种的研究证实，有丝分裂中期是染色体分析的最佳时期之一。 减数分裂粗线期在很多方面对染色体的形态研究还是很理想的。因为减数分裂粗 线期相对较长，从而保证有较多数目的细胞用于分析，这对于染色体较短的物种是较 理想的时期。现已经有很多研究者对各种物种进行了粗线期染色体分析，认为粗线期 有价值的形态标准是异染色质和常染色质、染色粒、着丝粒以及端粒等。 实践证明，不同物种染色体大小不同。另外，一个个体的不同组织其染色体大小 也不同。在进行染色体分析时，不同物种选用不同的组织进行分析。 昆虫染色体的研究主要是在光学显微镜下观察有丝分裂或减数分裂中期的染色 体。由于不同昆虫之间，不同组织细胞之间的差异，要根据不同的制片方法来观察分 析。我国学者采用的昆虫染色体研究方法较多，因试验所用昆虫不同，依据不同的类 群、不同的发育阶段、不同的组织采用了不同的研究方法和制片技术。 多数直翅目昆虫的处理方法为：首先给活虫注射秋水先素溶液，经过数小时的活 体培养，促使细胞分裂同步，即多数细胞处于分裂中期，然后进行活体解剖，取出生 殖细胞，经低渗，固定后，进行常规压片或涂片，冰冻揭片，直接染色后进行常规核 型分析或经分带处理后进行带型分析。 另外以昆虫的生殖细胞( 包括性腺细胞) 为试材的昆虫有蜉蝣、蜚蠊、蛾、象甲、 果蝇和养眼蜂类，其中蜚蠊类用3 4 龄若虫( 精巢或者卵巢) 、蛾类以5 龄幼虫( 睾丸或 卵巢) 、象甲类用精巢、果蝇类和赤眼蜂类先经离体培养处理后染色压片，也可采用 冰冻揭片法制片：以胚胎制片的为蚜虫类，挤出3 4 龄有翅或无翅若虫胚胎，经固定 后即行染色观察：以幼虫脑神经节为材料制片的方法已应用于蚊虫、果蝇、赤眼蜂、 蚤类等的染色体研究把蚊虫、果蝇、赤眼蜂的3 龄或4 龄幼虫在解剖液中取出脑神经 节，置于秋水仙素中离体培养，吸去培养液即可进行染色、压片：对蚤类昆虫则稍加 改进，经低渗处理、卡诺氏固定液固定、染色、压片；双翅日昆虫特别适宜以唾腺为 材料，一般将3 4 龄幼虫置于有解剖液的玻片上，取出唾腺，固定、染色、压片。“。 核型有时亦称染色体组型，指的是个体或有亲缘关系的染色体组( c h r o m o s o m e c o m p l e m e n t ) 。染色体组分析是阐明染色体组的组成，是指每种生物染色体的数目、 大小、形态等特征的总和。因为主要是用有丝分裂中期染色体进行组型分析，故也指 有丝分裂中期染色体的数目、大小、形态等特征的总和。将成对的染色体按形状、大 小依顺序排列起来，叫核型图( k a r y o g r a m ) 。通过染色体组型分析就可以鉴别染色体 组，以此作为实验分析的对照指标，再进一步研究其变化，对于研究生物的遗传变异、 生物的系统演化、物种之间的亲缘关系、某些生物的起源、远缘杂交及染色体工程等 都有重要意义。 1 2 2 寄生蜂染色体研究进展 染色体数据在一些昆虫类群分类研究中的应用已非常普遍，如直翅目昆虫，但在 寄生性膜翅日昆虫分类研究中目前还很少。 g o k h m a n & q u i c k e 嘲在总结过去2 0 年中寄生蜂核型研究情况时，列出了近1 5 0 种寄生蜂种类的染色体特征，代表了4 总科2 0 科。即使如此，仍有一半多的寄生蜂 总科没有做过染色体研究。造成这一现象的主要原因可能有二个方面：一是寄生蜂分 类学家在分类研究中仍然习惯依赖于传统的研究方法；二是从寄生蜂组织中制备染色 体样本在技术上仍有困难，从而在一定程度上阻碍了核型方法在膜翅目分类上的广泛 应用2 “2 “。 旗腹蜂总科e v a n i o i d e a 和分盾细蜂总科c e r a p h r o n o i d e a 中只有3 个有关染色体 研究的记录。短管褶翅蜂g a s t e r u p t i o nb r e c y t e r e b r a ew a r a n a b e 和投褶翅蜂 岔妇c u l a t o r ( l i n n a e u s ) 的n 值分别均为1 4 和1 6 ，而分盾细蜂总科中唯一研究过的 种类d e n d r o c e r u sc a r p e n t e r i ( c u r t i s ) ，其n 值为9 啪“1 。 在小蜂总科c h a l c i d o i d e a 中，几乎所有科的n 值均为3 7 ( 一般为5 6 ) ，这一染 色体特征支持了小蜂总科为单系类群的假设。但是，广肩小蜂科e u r y t o m i d a e 和跳小 蜂科e n c y r t i d a e 却是一个例外，它们的n 值为8 1 2 。由于这2 个科间没有显著的亲 缘关系，因此它们较高的n 值可能是小蜂总科的共同祖征，但也可能是染色体数目在 不同科中独立进化增加的结果1 3 l i 。 蚜小蜂科a p h e l i n i d a e 的成员代表了一个特殊的情况，因为这个类群的单倍染色 6 体数的范围是3 - - 1 1 ，并且在思蚜小蜂属e n c a r s i a 中n 值就有3 l o “”。然而这一属 中n 的模式值明显为5 ，因而表明低的染色体数仍是其基本特征。同时，恩蚜小蜂属 中较高数目的染色体数可能是进化中次生增加的结果，而这种增加有可能是逐步进行 的，因为在这个属中存在着介于5 1 0 之间的所有中间值。而且，在恩蚜小蜂属中第 2 个普遍的染色体数是9 ，这就几乎排除了其它解释( 如多倍体) 的可能性。 就亚科水平而言，茧蜂科和姬蜂科中各亚科间的染色体数分布是文献中论述较多 的。大部分亚科的单倍染色体数不超过1 3 ，常常是l o 。但茧蜂科中的矛茧蜂亚科 d o r y c t i n a e 、反颚茧蜂亚科a l y s i i n a e 和绳茧蜂亚科o p i i n a e 的n 值分别为1 7 、1 6 1 7 和1 4 1 。此外一种松毛虫赤眼蜂的核型也得到了观察，核型分析数目2 n = l o 。”。 另外膜翅目中研究较多的昆虫还有非寄生性的蜜蜂类和蚁类，共有1 3 种，其中 台湾9 种。汪霞等、蒙小平和刘先蜀对东方蜜蜂和i sc e r h n hf a b r i c i u s 、西方蜜蜂 a m e l l i f e r al 染色体核型分析显示其数目为2 n = 3 2 “1 。蚁类染色体除h u n g 等报 道了我国台湾9 种蚂蚁的核型( 单倍体从8 1 8 不等) 外，大陆部分则为空白。8 l 。 1 3r a p d 技术研究概况 1 3 1r a p d 技术的基本原理 r a p d 标记技术是由美国j w i l l i a m s 和j v e l s h 两个研究组于1 9 9 0 年同时提 出的一项新兴技术，是建立在d n a 聚合酶链式反应技术基础上，以一种或多种随机引 物来对模板d n a 进行随机扩增，研究模板d n a 多态性的遗传标记技术。它的理论基础 为：相同的模板d n a 用一种引物来扩增，所得到的d n a 片段应是序列一致，分子量大 小相同，即在r a p d 指纹图谱上的谱带表现为一致，其中的特异性谱带，则可作为该 模板d n a 的分子标记；对不同模板d n a 用同一引物来进行扩增，得到的r a p d 指纹图 谱上的谱带可能是相同的( 模板基因组间具有同源性) ，也可能是不同的。进一步， 如果用多种经过筛选的随机引物来对一个模板d n a 进行随机扩增，这些引物的识别位 点就可能遍布整个模板d n a ，使模板d n a 的多态性得以充分地展现。 1 3 2r a p d 技术的特点 r a p d 标记技术同现有的分子标记技术如同功酶分析技术、限制性片段长度多态 性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，r f l p ) 标记技术、d n a 测序、d n a 分子杂交等相比有如下特点。 1 ) 操作简便，自动化程度高成本低，可在短时间内完成大量模收d n a 的分子标 记，它既克服了同功酶位点偏少的缺点又避免t r f l p 操作技术复杂的弊端。 2 ) 模板d n a 用量少，灵敏度高。p c r 进行扩增时，一次仅需模板d n a 2 0 1 0 0n g ， 适合于小型昆虫的研究。在扩增时，引物的一个碱基变化就会引起扩增谱带的巨大变 化。另外对模板d n a 的纯度要求不高，模板中混有少量的蛋白质或r n a 对扩增结果几 乎没有影响，使模板d n a 制备过程中的一些纯化步骤可以省略，减少了模板d n a 的损 失量。并且保存在酒精、福尔马林浸液和f a a 保存液中的标本，所提取出的基因组d n a 都可进行r a p d 标记。这些对研究个体小的昆虫极为有利。 3 ) r a p d 技术可以在没有任何分子遗传背景的情况下对物种基因组进行d n a 多态 性分析。 4 ) r a p d 技术中可用引物种类多，可以对整个基因组进行全面的分析，基因组间微 小的