（海洋生物学专业论文）鱼类适应性免疫系统的早期发生以及ikaros基因的克隆和表达.pdf

中国海洋大学博士学位论文 鱼类适应性免疫系统的早期发生 以及i k a r o s 基因的克隆和表达 摘要 大多数鱼类从受精卵开始就一直生活在水中，而它们所赖以生存的水环境充 满了大量的微生物，无时无刻不对它们进行攻击，产生威胁。成年鱼类在抵御病 原物进行自身免疫保护时，先天性免疫系统首先发挥作用，然后是适应性免疫系 统发生反应。而作为鱼类的胚胎，各种免疫器官尚未发育成熟，它们是如何成功 抵御微生物的侵袭而存活下来的呢? 适应性免疫系统又是在什么时期开始具有 功能活性的? 一直以来，这方面的议题一直是发育免疫学的研究热点。我们实验 室之前已经研究了鱼类先天性免疫系统的发生。在此基础上，本文首先在斑马鱼 中鉴定了适应性免疫系统标志性基因的表达以及对脂多糖( l p s ) 的免疫应答， 并进行了分析讨论。我们还从重要的养殖鱼类半滑舌鳎中分离出一个免疫相关转 录因子i k a r o s ，并对其进行了分析和表达研究。 本论文第一部分主要研究了适应性免疫系统的早期发生和发育。我们选择的 适应性免疫系统的关键基因是r a 9 2 、a i d 、t c r a c 、i g , z , c - 1 、m l g 、s i g 和m z n f 2 9 7 ， 首先对它们在斑马鱼的不同发育时期以及成鱼中的表达模式进行了研究，然后用 l p s 对斑马鱼的胚胎幼鱼以及成鱼进行感染，进一步分析上述基因表达水平的 变化。根据实验结果，我们发现除了r a 9 2 和m z n f 2 9 7 之外，其余5 个基因在胚 胎发生早期以及幼鱼时期表达量都非常低，随着斑马鱼胚胎发育的进行，表达量 也相应提高。而对于r a 9 2 和m z n f 2 9 7 ，在胚胎发育早期即原肠期，我们检测到 了异常的高水平表达，推测可能是因为母源性的m r n a 在发育早期大量存在于 胚胎中导致。而随着幼鱼发育，二者的表达水平逐步稳定升高。当我们用l p s 对胚胎幼鱼进行感染后，发现大多数基因都做出了迅速应答，表达水平产生了 明显变化。除i g z , c - 1 和s i g 之外，其余基因在受精后8 天就发生了表达量的显 著性提高，这表明适应性免疫系统在此时期已经可以对病原感染做出应答。而 j g l c - 1 和s l g 分别是在受精后2 3 天和1 3 天对l p s 的刺激具有了较强的反应，表 达量开始显著提升。据此，我们能够初步证明，斑马鱼胚胎幼鱼的适应性免疫 系统在个体发育的早期已经逐步建立起来，并且对抗原的侵袭具有了一定的反应 中国海洋大学博士学位论文 能力，其发育成熟的时间可能会稍早于之前认为的4 - 6 周。 在本论文的第二部分，我们从重要的经济鱼类半滑舌鳎中分离出了一个关键 的血细胞分化相关因子i k a r o s 基因。i k a r o s 的e d n a 全长为1 6 8 5b p ，其开放阅 读框为1 2 9 0b p ，编码4 3 0 个氨基酸。5 非编码区为2 4b p ，3 非编码区为3 7 1b p 。 用i k a r o s 基因的氨基酸序列与其他物种的i k a r o s 以及家族其他成员包括h e l i o s 、 a i o l o s 和e o s 的氨基酸序列构建系统进化树，发现半滑舌鳎中的i k a r o s 与包括青 鲻、蛳鱼、虹鳟以及斑马鱼在内的鱼类展示了较近的亲缘关系，在进化树中聚为 一支。进一步用部分物种l k a r o s 的保守区进行同源性比对，发现同源性较高的区 域主要集中在n 、c 末端的锌指结构域。这同哺乳动物中的研究结果是一致的， 即n 末端和c 末端的锌指结构在进化过程中变化较小，保守性较强。我们又利 用d n a s t a r 中的c l u s t a lw 方法对i k a r o s 的氨基酸进行了结构上的相似度分 析，结果与聚类分析一致，与青鲻、鲫鱼、虹鳟以及斑马鱼相似度较高，分别达 8 0 o 、7 6 7 、6 6 7 以及5 7 3 。因为在其他物种早已证明i k a r o s 是调控免疫 系统发生和发育的转录因子，为了验证它是否与免疫相关，我们首先利用实时定 量r t p c r 技术检测了其在不同组织的表达情况。结果显示，i k a r o s 基因在半滑 舌鳎中的胸腺、肝脏和脾中表达量较高，在肾脏、精巢和心脏中也有一定量的表 达，而在肠、皮肤以及鳃中几乎检测不到或者表达量很低。这与美西螈、晶吻鳐 和七鳃鳗中的检测结果基本一致，这表明了半滑舌鳎中的i k a r o s 基因在主要的免 疫器官中均有表达，在表达模式上也具有一定的保守性。这暗示我们，半滑舌鳎 中的i k a r o s 可能与其他物种的i k a r o s 一样，在免疫防御上具有一定的功能。我们 从半滑舌鳎的头肾中分离出巨噬细胞，进行培养，然后用l p s 或l t a 对其刺激， 收集不同处理样品并运用实时定量技术鉴定i k a r o s 基因的表达变化。结果表明， 相比较于对照组，l p s 或l t a 处理后i k a r o s 表达量显著提高，这表明i k a r o s 基 因是一种可以在巨噬细胞中表达的受l p s 和l t a 调控的免疫防御分子。 关键词：斑马鱼；适应性免疫系统；个体发育；ik a r o s ；细胞培养； n 中国海洋大学博士学位论文 a n e a r l ym a n i f e s t a t i o no ft h ea d a p t i v ei m m u n es y s t e ma n d c l o n i n ga n de x p r e s s i o no f i k a r o sg e n ei nf i s h f i s hh a sb e e nl i v i n gi nt h ew a t e rf r o mt h es t a g eo ff e r t i l i z e de g g s ，h o w e v e r ，a t t h es a m et i m e ，a l lk i n d so fp a t h o g e n sa l s ol i v e sa r o u n dt h e ma n da t t a c kt h e ma l lt h e t i m e t h ea d u l tf i s h w i l lc a r r yo u ti n n a t ei m m u n es y s t e mf i r s t l yw h e nt h e ya r e a t t a c k e d ，a n di fp a t h o g e n sh a v ei n v a d e di n t ob o d y ，f i s hw i l lb e g i nt os t a r tt h ea d a p t i v e i m m u n es y s t e m s ) t h e nh o wd ot h ee m b r y o sr e s i s ta t t a c kf r o mp a t h o g e n s s u c c e s s f u l l ya n dp r o t e c tt h e m s e l v e s ? w h e nd ot h ea i sf u n c t i o n a l l ym a t u r ea n dw h a t i st h ep r o t e c t i o nm e c h a n i s mo fi m m u n es y s t e m ? t h ei s s u e sh a v eb e e nf o c u s e df o ra l o n gt i m e t ob ec l o s et ot h ea n s w e r s ，t h ef o l l o w i n gr e s e a r c hi sc a r r i e do u t f i r s t l y ， t h ee x p r e s s i o no fs o m em a r k e rg e n e si n v o l v e di nt h ea i sa n dr e s p o n s et ol p si n z e b r a f i s he m b r y o s l a r v a ea r ed e t e c t e d ，a n dt h e ni k a r o sg e n ew h i c hi sa t r a n s c r i p t i o n f a c t o rr e l a t e dt ob l o o dc e l ld i f f e r e n t i a t i o ni sc l o n e da n da n a l y z e da b o u ti t ss t r u c t u r e a n de x p r e s s i o np a t t e m t h ef i r s ts e c t i o no ft h i sp a p e rd e a l t 、析t 1 1t h ee a r l ym a n i f e s t a t i o no ft h ea i si n z e b r a f i s h t h eo n t o g e n e t i ca n dd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n so fs e v e nk e yg e n e s ( r a 9 2 ， a i d , t c r a c , i g l c - 1 ，m i g s l ga n dm z n j 2 9 7 ) t h a ta r et h es u i t a b l em a r k e r sf o r i n d i c a t i n gt h em a t u r a t i o no fa i sa n dt h e i rr e s p o n s e st ot h ec h a l l e n g ew i t hl p sd u r i n g d e v e l o p m e n to fd r e r i oa r ed e m o n s t r a t e d a p a r tf r o mr a 9 2a n dm z n f 2 9 z , t h e r e m a i n i n gf i v eg e n e s 堪l d t c r a c ，l g l c l ，m l ga n ds i 心d i s p l a yg e n e r a l l ys i m i l a r t r e n d so fe x p r e s s i o n 、析t l lt h ee x p r e s s i o nl e v e l sb e i n gr e l a t i v e l yl o wa te a r l ys t a g e sa n d t h e nr i s i n gs u b s e q u e n t l y r a 9 2a n dm z n f 2 9 7a r eb o t he x p r e s s e da tr e l a t i v e l yh i g h l e v e l sa tt h eg a s t r u l as t a g e ，d e c r e a s ed r a m a t i c a l l yl a t e r ，f o l l o w e db yas l i g h ts t e a d y r i s e i nc o n t r a s t , a l lt h e s eg e n e sa r ec a p a b l eo fr e s p o n d i n gt ot h ec h a l l e n g ew i t hl p s i nt h ee m b r y o s l a r v a eb yu p r e g u l a t i n gt h e i re x p r e s s i o nl e v e l sa tl e a s tf r o m2 3d p f ( d a yp o s tf e r t i l i z a t i o n ) o n w a r di naf a s h i o ns i m i l a rt ot h a to f a d u l tn r e r i o ，w h i c hh a s am a t u r ef u n c t i o ni na i s i ti st h e r e f o r es u g g e s t e dt h a tt h ea i si nd r e r i ol a r v a eh a s b e e nf o u n d e dd u r i n gt h ec o u r s eo fo n t o g e n yd e v e l o p m e n t , s l i g h t l ye a r l i e rt h a n c o n s i d e r e dp r e v i o u s l y i i i 中国海洋大学博士学位论文 t h ee d n ao fi k a r o sf r o mh a l f - s m o o t ht o n g u es o l ec l o n e di s16 8 5b pl o n g ，a n d i t sl o n g e s to p e nr e a d i n gf r a m ec o d e sf o rap r o t e i no f4 3 0a m i n oa c i d s n o n - c o d i n g r e g i o na tn - t e r m i n a li s2 4b pl o n ga n dn o n c o d i n gr e g i o na tc t e r m i n a li s3 7 1b p l o n g t oi n v e s t i g a t et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ni k & r o sf r o mh a l f - s m o o t ht o n g u es o l ea n d o t h e rs p e c i e s ，ap h y l o g e n e t i ct r e ei sc o n s t r u c t e du s i n gt h ea m i n oa c i d s e q u e n c eo f i k a r o sa n dt h a to fo t h e rr e p r e s e n t a t i v ei k a r o sf r o m1 4s p e c i e sa n do t h e r f a m i l y m e m b e r si n c l u d i n gh e l i o s ，a i o l o s ，e o s i ti s f o u n dt h a ti k a r o sf r o mh a l f s m o o t h t o n g u es o l ef o r m e dac l u s t e rt o g e t h e rw i t ht h a to fs o m ef i s hi n c l u d i n gj a p a n e s e m e d a k a , j a p a n e s ea m b e r j a c k ，t r o u ta n dz e b r a f i s h f u r t h e rc o m p a r i s o nb e t w e e ns o m e s p e c i e sa n di k a r o sr e v e a l st h a tt h er e g i o n st h a ts h o wh i g h e rh o m o l o g yf o c u sz i n c f m g e rd o m a i n sa tn a n dc - t e r m i n a l t h i si sc o n s i s t e n tw i t hp r e v i o u sr e s u l t s u s i n g t h em e t h o do fc l u s t a lwi n d n a s t a r , t h ei d e n t i t y i ns t r u c t u r eb e t w e e n h a l f - s m o o t ht o n g u es o l ea n do t h e rs p e c i e si sa n a l y z e d ，a n dt h er e s u l ti ss i m i l a rt ot h a t o fp h y l o g e n e t i ct r e e i k a r o sf r o mh a l f - s m o o t ht o n g u es o l es h o w s h i g h e ri d e n t i t yw i t h j a p a n e s em e d a k a , j a p a n e s ea m b e r j a c k ，t r o u ta n dz e b r a f i s h ，t h ep e r c e n ti d e n t i t yi s 8 0 0 ，7 6 7 6 6 7 a n d5 7 3 ，r e s p e c t i v e l y i nm a n ys p e c i e s ，i k a r o sh a sb e e n p r o v e dt ob eat r a n s c r i p t i o nf a c t o rr e l a t e dt oi m m u n es y s t e m ，a n dt ot e s tt h i s ，as e r i e s o fe x p e r i m e n t sa r ec a r r i e do u t f i r s t l y , t h ee x p r e s s i o no fi k a r o sg e n ei nd i f f e r e n t o r g a n si sd e t e c t e d a c c o r d i n gt ot h er e s u l to fq r t p c r , i k a r o sg e n es h o w sh i g h e r e x p r e s s i o nl e v e l si nt h y m u s ，l i v e ra n ds p l e e n ，a n dm o d e r a t ee x p r e s s i o nl e v e l si n k i d n e y ，t e s t i sa n dh e a r t ；h o w e v e r ，i ni n t e s t i n e ，s k i no rg i l l ，w eh a r d l yd e t e c t e d e x p r e s s i o no fl k a r o sg e n e t h i si sc o n s i s t e n t 谢t l lt h a to fs k a t e ，l a m p r e ya n da x o l o t l i k a r o sg e n es h o w sd i f f e r e n te x p r e s s i o nl e v e l si no r g a n sr e l a t e dt oi m m u n ea n d c o n s e r v a t i v ee x p r e s s i o np a r e m ，w h i c hi m p l yt h a ti k a r o sf r o mh a l f - s m o o t ht o n g u e s o l ep r o b a b l yh a st h es a m ef u n c t i o nw i t ht h a to fo t h e rs p e c i e s t h e n , m a c r o p h a g e c e l l sf r o mt h eh e a dk i d n e yo fh a l f - s m o o t ht o n g u es o l ea r ei s o l a t e da n dh a v eb e e n c u l t u r e df o r7d a y s a tt h es e v e n t hd a y ，t h ec e l l sa r ec h a l l e n g e db yl p so rl t a ，a n d t h e nd e t e c t e db yq - p c r t e c h n o l o g y c o m p a r e dt ot h ec o n t r o l ，t h ee x p r e s s i o nl e v e l so f i k a r o sg e n ea r eu p - r e g u l a t e ds i g n i f i c a n t l yi nc e l l sp o s tl p sa n dl t a c h a l l e n g e t h i s i n d i c a t e si k a r o sg e n ew h i c hh a ss h o w e de x p r e s s i o ni nm a c r o p h a g ec e l l sf r o mh e a d t v 中国海洋大学博士学位论文 k i d n e yo fh a l f - s m o o t ht o n g u es o l ei sa f a c t o rr e l a t e dt oi m m u l l e k e yw o r d s ：z e b r a f i s h ；a d a p t i v ei m m u n es y s t e m ；o n t o g e n y ；l k a r o s ；c e l lc u l t u r e v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 逵! 垫逡直墓丝盂要挂型主塑的：奎拦互窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构( 如中国科学技术信息研究所等) 送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：痞r 钩 签字日期：p 7 年6 月7 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编 鱼类适应性免疫系统的早期发生以及l k a r o s 基因的克隆和表达 第一章文献综述 免疫( i m m u n i t y ) 是指机体抵抗包括病原微生物在内的抗原感染的能力，是 生物体对一切异己分子进行识别与排除的过程。生物体内的免疫系统是机体识别 和消除“异物”的防御系统，主要指机体的免疫应答与机体器官及细胞之间的一 些协调系统的结构与成分，是生物体执行免疫功能的机构，是产生免疫应答的物 质基础，是由免疫器官、免疫细胞和体液免疫分子组成的。它的主要功能是防御、 自身稳定与免疫监督三方面( 孙德文，2 0 0 2 ) 。鱼类在进行自身免疫保护时，主 要行使先天性免疫( i n n a t ei m m u n i t y ) 或非特异性免疫( n o n s p e c i a li m m u n i t y ) 和适应性免疫( a d a p t i v ei m m u n i t y ) 或获得性免疫( a c q u i r e di m m u n i t y ) 两大免疫 防疫功能。生物体对病原防御的第一道防线是非特异性免疫。侵袭成功后，特异 性免疫即开始启动( 刘岑杰，2 0 0 8 ) 。 1 鱼类免疫系统概述 1 1 免疫器官和组织 免疫组织是免疫细胞发生、分化、成熟、定居、繁殖以及产生免疫应答的场 所。鱼类与哺乳动物在免疫器官组成上的主要区别在于前者没有骨髓和淋巴结 ( 孙德文，2 0 0 2 ) 。 鱼类的免疫器官因鱼的种类而异( 1 w a m ae ta 1 ，1 9 9 6 ) 。无颌鱼类没有真正意 义上的免疫器官。它们在某些器官内的淋巴样组织区产生免疫细胞。例如，盲鳗 的红细胞、巨噬细胞和浆细胞在前肾生成。与无颌鱼类相比，软骨鱼类具有更先 进的免疫系统。它们拥有三个独特的免疫器官：围绕性腺的性腺上器官、食道壁 内的赖迪氏器官以及小肠内的螺旋瓣。这些器官都是典型的免疫细胞包括粒细 胞、巨噬细胞和浆细胞的定居场所。同时，它们也具备了明显的胸腺和发育完全 的脾脏，二者是各种淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞发育与生存的地方。而硬骨鱼 类的免疫器官主要有肾、胸腺j 脾脏和粘膜组织内弥散的免疫区域。与哺乳动物 的免疫系统相似，硬骨鱼类脾脏内的主要细胞类型为红细胞、粒细胞和巨噬细胞， 而胸腺内的主要细胞类型为淋巴细胞( a n d e r s o ne ta 1 ，1 9 7 7 ；c h i l m o n c z y ke ta 1 ， 1 9 9 2 ；h a n s e ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。最近，在斑马鱼中报道了一个与哺乳动物相似的淋巴 系统。尽管仍需要进一步的证据支持，然而据推测该淋巴系统极有可能是祖t 鱼类适应性免疫系统的早期发生以及i k a r o s 基因的克隆和表达 细胞聚集并接受抗原感染的场所( k i i c h l e re ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 1 1 1 胸腺 鱼类的胸腺是由胚胎时期的咽囊发育而成，它是淋巴细胞增殖分化的主要场 所，并且肩负着向血液和外周淋巴器官输送淋巴细胞的任务。一般认为胸腺是鱼 类的中枢免疫器官。所有板鳃类及大多数硬骨鱼类的胸腺都分为两个区皮质区 和髓质区( z a p a t aa n dc o o p e r , 1 9 9 0 ) ，而也有一些硬骨鱼类的胸腺缺乏明显的皮、 髓质分区而分成2 到6 个区( z a p a t a e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。鱼类胸腺的形态学研究以及 免疫组化实验表明，硬骨鱼胸腺的皮质区位于胸腺外层，而髓质区位于胸腺内层 ( m a n n i n ga n dt u r n e e r , 1 9 9 4 ) 。一般来说，鱼类的胸腺位于鳃盖与咽腔交界的背 上角处，左右对称分布。但是鉴于鱼的种类繁多，每种鱼的胸腺位置就不尽相同。 不过总体上来说，硬骨鱼类的胸腺位于浅表，并且在个体发育的过程中不会从咽 腔上皮处分离出来，而软骨鱼的胸腺则有些内陷。 胸腺主要是为外周免疫器官提供成熟的t 淋巴细胞，具有中枢免疫器官的 功能。未成熟的胸腺细胞在胸腺皮质区通过与胸腺上皮的相互作用而进行阳性选 择，即胸腺中会产生a 、p 型的t 细胞受体，它们能够识别由主要组织相容性 复合物( m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ，m h c ) 呈递的外源多肽，促使t 细 胞分化( m a t s u n a g aa n dr a h m a n , 2 0 0 1 ) 。在此过程中，皮质和髓质中发育的胸腺 细胞与m h c 呈递的自身多肽也进行相互作用，并在髓质中通过与自身反应性 t 细胞的相互作用，经历阴性选择过程，也就是说在接收到抗原呈递细胞( a p c ) 的凋亡信号后，胸腺细胞被诱导从而发生凋亡( b e v a n ，1 9 9 7 ) 。通过末端标记 d n a 片段，r o m a n o 等( 1 9 9 9 ) 检测到了胸腺细胞的凋亡，并且发现从受精后4 周，凋亡细胞更多地出现在皮质区，表明胸腺细胞在皮质中是进行持续选择的。 研究还发现缺乏皮、髓分区的鱼类，其胸腺的功能并未受到任何影响( z a p a t ae t a 1 ，1 9 9 6 ) 。由此可见，胸腺皮质和髓质为胸腺细胞的发育、分化和成熟提供了微 环境。 无论是淡水鱼还是海水鱼，在其个体发育的过程中，胸腺总是最早获得成熟 淋巴细胞的免疫器官( c h i l m o n c z y k ，19 9 7 ；b o t h a ma n dm a n n i n g ，19 81 ；j 6 s e f s s o n a n dt a t n e r ，1 9 9 3 ) 。移植排斥实验的研究结果表明：在鱼类个体发育过程中，一 2 鱼类适应性免疫系统的早期发生以及i k a r o s 基因的克隆和表达 旦能通过形态学方法检测到t 细胞，则表明胸腺已达到功能成熟( m a n n i n ga n d t u m e e r , 1 9 9 4 ；t a m e r , 1 9 9 6 ；s c a p i g l i a te ta 1 ，1 9 9 9 ) 。免疫时间和免疫途径是决定免 疫效果的两个重要因素，与免疫系统功能的成熟密切相关，而胸腺t 细胞功能 的成熟是免疫系统功能成熟的基本前提。 1 1 2 肾脏 肾脏是成鱼重要的淋巴细胞组织，可分为头肾和体肾。头肾的实质分散在致 密的窦状隙中，并由肾脏基质细胞支撑，这些基质细胞统称为网状上皮基质细胞， 主要包括上皮细胞、包裹着上皮细胞外腔的外膜细胞和具有吞噬能力的网状细胞 ( m e s e g u e r e ta 1 ，1 9 9 5 ) 。成鱼的头肾己基本失去排泄的功能，仅具有造血和内 分泌的作用( f i n g e ，1 9 8 6 ) ，形态上类似于脊椎动物的骨髓( m e s e g u e re ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 同时头肾又是一个二级淋巴器官，在免疫反应中具有重要作用( k a a t t a r ia n d 1 9 8 5 ) 。鱼类的头肾一般是继胸腺之后第二个发育的免疫器官( 徐豪等，1 9 8 3 ) ， 不需要抗原感染即可以产生红细胞和b 淋巴细胞，是免疫细胞的发源地。头肾 的基质细胞是主要的造血组织，但同时也在非特异性免疫和受损细胞的清除过程 中起到一定作用。另外，头肾是硬骨鱼重要的抗体产生器官，相当于哺乳动物的 淋巴结。利用溶血空斑试验和免疫酶技术已经证实，在头肾和中肾中都存在抗体 发生细胞，且在头肾的实质中黑色素巨噬细胞的聚集可以使抗原在接种之后保留 较长时间( t s u j aa n ds e n o ，1 9 9 0 ；b r a t t g j e r da n de v e n s e n ；1 9 9 6 ) ，暗示其可能与 免疫记忆有关。在鱼类头肾中，b 淋巴细胞总是散布于造血细胞和粒细胞的生 成细胞群中，并与黑色素巨噬细胞中心和血管紧密相连，提示它们在免疫防御中 协同发挥作用( f o u r m i e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 因此可以说，硬骨鱼类的头肾具有类似哺乳动物的中枢免疫器官及外周免疫 器官的双重功能( 杨先乐，1 9 8 9 ；f o u r m i e re ta 1 ，2 0 0 0 ；l o b be ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 1 1 3 脾脏 脾脏是鱼类红细胞、白细胞和中性粒细胞发生、发育和聚集的主要场所。从 有颌鱼类开始出现了真正的脾脏。软骨鱼类的脾脏较大，内含椭圆体，主要是为 造血器官，分化为红髓和白髓。其中红髓占了脾脏的大部分( g r a c ea n dm a n n i n g ， 3 鱼类适应性免疫系统的早期发生以及i k a r o s 基因的克隆和表达 1 9 8 0 ) ，是由支撑着血窦的网状细胞组成。血窦中充满了包括巨噬细胞和淋巴细 胞在内的各类细胞。而白髓可以分成两部分：黑色素巨噬细胞聚集区和椭圆体。 此外，浆细胞也散布在整个白髓区。硬骨鱼类的脾脏无明显的红、白髓分区，但 同样具有造血和免疫的功能( f o u r m i e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。与头肾相比，脾脏在体液 免疫反应中处于相对次要的地位，而且受抗原感染后其增殖反应以弥散的方式发 生在整个器官上( 杨先乐，1 9 8 9 ；g r a c ea n dm a n n i n g ，1 9 8 0 ) 。大多数硬骨鱼类 脾内均有明显的椭圆体，具有捕集各种颗粒性和非颗粒性物质的功能( d a l m oe t a 1 ，1 9 9 7 ) 。硬骨鱼类在接受免疫接种后，其脾、肾和肝脏等器官中的黑色素巨 噬细胞增多，并与淋巴细胞和抗体发生细胞聚集在一起形成而黑色素巨噬细胞中 心，其作用主要是：( 1 ) 参与体液免疫和炎症反应；( 2 ) 对内源或外源异物进 行贮存、破坏或脱毒；( 3 ) 记忆细胞的原始生发中心；( 4 ) 保护组织免除自由 基损伤。这与高等脊椎动物脾脏中的生发中心在组织与功能上都是相似的 ( m a n n i n ga n dt u m e e r , 19 9 4 ；f o u r r n i e re ta 1 ，2 0 0 0 ；s e c o m b e sa n dm a n n i n g ，19 8 0 ； z i e n g e n f u s sa n dw o l k e ，1 9 91 ) 。 1 1 4 粘膜相关的淋巴组织 粘膜相关的淋巴组织在鱼类体液免疫和细胞免疫中也具有非常重要的作用， 鱼类的皮肤、鳃和消化道是病原菌进入其体内的最大门户。就粘膜而言，它时刻 会接触到大量的抗原，而且其中一部分是相当有害的病原体，病毒、细菌以及寄 生虫都会选择通过粘膜入侵宿主机体。粘膜组织有一套严密的防御体系即粘膜免 疫系统，当鱼体受到抗原感染时，在肠相关的淋巴组织内，巨噬细胞可以对抗原 进行处理和呈递，而抗体分泌细胞分泌特异性抗体，与粘膜中溶菌酶和补体等非 特异性保护物质共同构成机体抵抗病原菌入侵的第一道免疫屏障，从而有效地抵 御感染( m a r t i na n dp o l l e r a , 1 9 9 6 ) 。在鱼的后肠，一种上皮细胞可通过内吞和胞 饮作用，将大分子抗原从肠腔直接转运至巨噬细胞和外围组织，这个过程对于抗 感染和启动免疫应答都是非常重要的( d o r i ne ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 1 2 免疫细胞 参与免疫应答或与免疫相关的细胞均可称为免疫细胞。一般分为两大类：淋 巴细胞和吞噬细胞。淋巴细胞主要参与特异性免疫反应，在免疫应答中起着核心 4 鱼类适应性免疫系统的早期发生以及l k a r o s 基因的克隆和表达 作用；而吞噬细胞主要在非特异性的免疫反应中起作用，主要包括单核细胞、巨 噬细胞和各种粒细胞。鱼类的免疫细胞主要存在于免疫器官和组织以及血液和淋 巴液中。 1 2 1 淋巴细胞 在哺乳动物中，参与特异性免疫应答的淋巴细胞主要有两类：t 淋巴细胞和 b 淋巴细胞，分属于是两种淋巴细胞亚群。t 、b 淋巴细胞具有不同的膜表面标 志，即表面受体和表面抗原，这是鉴别两类淋巴细胞的基础。t 细胞可以直接杀 伤细胞或者通过分泌细胞因子调节免疫反应，而b 细胞在受到抗原攻击后可分 泌抗体。从上个世纪7 0 年代起，科学家们就开始了对鱼类淋巴细胞的研究，推 测在鱼类体内至少会存在功能性的t 、b 淋巴细胞，然而，直到最近几年，对 对鱼类淋巴细胞的研究才产生了较大突破。利用抗i g m 单克隆抗体已经明确地 证明硬骨鱼类具有独立的淋巴细胞群，从而证实了鱼类中同样存在类似于哺乳动 物的t 、b 淋巴细胞( g r a h a ma n ds e c o m b e s ，1 9 9 0 ) 。t 淋巴细胞主要来源于鱼 类的胸腺，而b 淋巴细胞主要来源于头肾。同样，利用单克隆抗体技术可以区 分细胞表面的抗体呈阳性或阴性，从而确定淋巴细胞的种类及其生物活性。在孵 化后几周，鲤鱼胸腺中的t 细胞已达到7 0 ，同时头肾中也有分布。但是在接 下来的发育过程中，除胸腺以外，其他免疫器官中的t 细胞会逐渐减少甚至消 失；而在孵化后第2 周，b 细胞在头肾中开始出现，随后进一步出现在脾和血 液中，不过在胸腺和肠道中却很少( m i l l e re ta 1 ，1 9 8 7 ) 。在大菱鲆( f o u m i e r - b e t z e ta 1 ，2 0 0 0 ) 和海鲈( a b e l l ie ta 1 ，1 9 9 9 ) 的肠粘膜和粘膜下层分布有较多的t 细 胞，而b 细胞主要分布在固有层，参与粘膜免疫应答。 1 2 2 吞噬细胞 鱼类体内的吞噬细胞不仅可以作为辅佐细胞具有特异性的免疫功能，而且还 是组成非特异性防御系统的关键成分，可以杀伤细菌和寄生虫，在抵御微生物感 染的过程中具有重要作用。当病原菌侵入鱼体后，能够诱导鱼体产生趋化因子， 而吞噬细胞能够在趋化因子及其他成分的共同协助下接近抗原物质，通过吞噬或 吞饮的方式将病原菌吞入。可以说，粘膜吞噬细胞构成了抗感染的第一道屏障。 5 鱼类适应性免疫系统的早期发生以及l k a r o s 基因的克隆和表达 而单核细胞和粒细胞等则构成了第二道屏障，它们可以破坏随时出现在循环系统 中的病原微生物，最后再由器官和组织中具有吞噬活性的细胞去摄取和降解微生 物及其相关产物( z e l i k o f f , 1 9 9 8 ) 。一般来说，鱼类的吞噬细胞主要包括巨噬细 胞、粒细胞和单核细胞。 鱼类的巨噬细胞是其体内广泛存在的具有强大吞噬功能的细胞。位于疏松结 缔组织内的巨噬细胞又称为组织细胞，常沿纤维广泛分布，在炎症和异物等感染 下会活化成游走的巨噬细胞。巨噬细胞有重要的防御功能，它具有趋化性定向运 动、吞噬异物及衰老伤亡的细胞、分泌多种生物活性物质以及调节免疫应答等多 种功能。在免疫应答过程中，当病原微生物表面覆盖有免疫球蛋白和补体成分时， 巨噬细胞可以通过这些因子的特异性受体识别并杀伤微生物。巨噬细胞能捕捉、 加工处理和呈递抗原。被巨噬细胞捕捉的抗原经加工处理后，与主要组织相容性 复合体( m h c ) 的i i 类基因产物结合，形成抗原一m h ci i 类分子复合物，并贮 存在巨噬细胞表面，然后呈递给淋巴细胞，启动免疫应答。其次，巨噬细胞本身 也是免疫效应细胞，活化的巨噬细胞能杀伤病原体和肿瘤细胞。此外，巨噬细胞 分泌的某些生物活性物质如白细胞介素i 、干扰素等也参与调节免疫应答。 鱼类的粒细胞，根据其来源、形态及功能，可分为嗜碱性、嗜酸性和中性粒 细胞。不过，并不是所有的鱼类都同时具有这三种粒细胞，如鲑、鳟鱼类中只有 中性粒细胞。另外，对于鱼类是否可以同时具有嗜酸性和嗜碱性粒细胞，争议较 大。目前发现，大多数鱼类仅具前者，只有极少数才有嗜碱性粒细胞。嗜中性粒 细胞具有活跃的吞噬和杀伤功能，但其吞噬能力一般比单核细胞要弱些( 徐豪等， 1 9 8 3 ) 。 单核细胞生于骨髓，属于无粒白细胞的一种，存在于所有硬骨鱼的血液中， 其体积较大，经常在血液与组织间来回游走，并能渗出血管。它在造血组织中产 生并最终进入血液，成为分化不完全的终末细胞。它还可以随血流进入各组织并 在适宜的条件下发育成不同的组织巨噬细胞( m e s e g u e re ta 1 ，1 9 9 4 ) 。与哺乳动 物相似，鱼类的单核细胞也具有较多胞质突起，内含液泡和吞噬物，可进行活跃 的变形运动，具有较强的粘附和吞噬能力，能够在血液中对异物和衰老的细胞进 行吞噬消化。 6 鱼类适应性免疫系统的早期发生以及i k a r o s 基因的克隆和表达 1 2 3 自然杀伤细胞 7 0 年代初，研究人员在研究t 细胞对靶细胞的特异性杀伤时，发现正常小 鼠的脾细胞可以象免疫小鼠的脾细胞一样能够杀伤某些肿瘤细胞，继而又发现正 常人外周血淋巴细胞也可以杀伤某些癌细胞。这些细胞的杀伤功能不需要预先免 疫或致敏，故将其取名为自然杀伤细胞( n kc e l l ) 。n k 细胞对癌细胞、病毒、 胞内寄生菌和变异细胞都具有极强的清除能力。自8 0 年代中后期，n k 细胞的 研究开始蓬勃发展。目前认为，n k 细胞是机体先天性免疫的主要承担者，同时 也是适应性免疫的核心调节者。另外，有学者认为n k 细胞也是造血的主要调 控成分，不过，目前这一说法仍存争议。 目前发现，虹鳟和鲑鱼的头、肾、脾以及末梢血管中的n k 细胞可直接杀 伤各种靶细胞，甚至对已感染传染性胰坏死病毒的细胞，也显示了杀伤的活性。 肾中2 5 - - - 2 9 、脾中4 2 - - - 4 5 、末梢血管中2 5 的细胞都有此特性。此类细 胞在鱼类中亦被称为非特异性的毒性细胞，它与靶细胞接触后，可通过自身产生 的淋巴毒素来杀伤、破坏靶细胞。另外，与哺乳动物相比，鱼类中的n k 细胞 小而无颗粒，其靶细胞主要包括肿瘤细胞、病毒感染细胞等( 张艳秋等，2 0 0 5 ) 。 1 3 体液免疫因子 1 3 1 免疫球蛋白 免疫球蛋白在脊椎动物的体液免疫中起着十分重要的作用。现已证明，鱼类 能够进行体液和细胞免疫应答，其中i g 是鱼类特异性免疫应答中最主要的介 质。就目前的研究结果而言，真骨鱼类只含有1 种免疫球蛋白，类似于哺乳动 物的i g m ，但是以四聚体的形式存在于血清中，每个单体也是由两条重链和两 条轻链组成。鱼类的免疫球蛋白i g 在血液、皮肤粘液、肠粘液、胆汁以及卵中 广泛分布。不同组织中i