（生物化学与分子生物学专业论文）半乳糖激酶和半乳糖异构酶的生物化学研究.pdfVIP

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磷酸( g l u c o s e 1 p h o s p h a t e ，g i c 一1 一p ) 的大量合成及纯化2 6 2 2 7c d 分析g a l k 野生型及突变17 6 4 2 3 二级结构2 7 3 结果2 7 3 1 半乳糖激酶( g a l a c t o k i n a s e 。g a l k ) 基因的p c r 扩增一2 7 3 2 半乳糖激酶( g a l a c t o k i n a s e 。g a l k ) 基因克隆到p m c s g 载体2 8 3 3 半乳糖激酶( g a l a c t o k i n a s e ，g a l k ) 的试表达2 9 3 4 半乳糖激酶( g a l a c t o k i n a s e 。g a l k ) 的表达纯化3 0 3 5 半乳糖激酶( g a l a c t o k i n a s e 。g a l k ) 的活性检测3 1 3 6 半乳糖激酶( g a l a c t o k i n a s e 。g a l k ) 的生物化学性质分析与酶动力学分析3 3 3 7 半乳糖激酶( g a l a c t o k i n a s e g a l k ) 野生型及突变体的底物特异性研究3 5 3 7 1 半乳糖激酶( g a l a c t o k i n a s e 。g a l k ) 野生型及突变体对不同单糖的底物特异 胜3 s 3 1 7 2 半乳糖激酶( g a l a c t o k i n a s e 。g a l k ) 野生型及突变体对m 乙酰葡萄糖胺 ( n a c e t y i g l u c o s a m i n 。g i c n a c ) 的底物特异性3 7 3 7 3 半乳糖激酶( g a l a c t o k i n a s e ，g a l k ) 野生型及突变体对 - 乙酰半乳糖胺 ( n - a c e t y i g a l a c t o s a m i n ，g a l n a c ) 的底物特异性3 8 3 7 4 基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱仪( m a l d i t o f ) 检测m 乙酰半 山东大学硕士学位论文 乳糖胺- 1 - 磷酸( n - a c e t y l g a l a c t o s a m i n e - 1 - p h o s p h a t e 。g a l n a c - 1 一p ) 4 0 3 7 5 半乳糖激酶( g a l a c t o k i n a s e ，g a l k ) 野生型及突变体17 6 、17 6 4 、17 6 4 2 和 17 6 4 2 3 对l 糖的底物特异性4 2 3 7 6 半乳糖激酶( g a l a c t o k i n a s e 。g a l k ) 野生型及突变体对磷酸基供体的底物特 异性。4 3 3 7 6 1 半乳糖激酶( g a l a c t o k i n a s e ，g a l k ) 野生型对不同磷酸基供体的底物特异 性d n s 结果4 3 3 7 6 2 半乳糖激酶( g a l a c t o k i n a s e 。g a l k ) 野生型及突变体 1 7 6 ，17 6 4 ，17 6 4 2 ，17 6 4 2 3 对c t p 的底物特异性。4 4 3 8 葡萄糖1 磷酸( g l u c o s e 1 p h o s p h a t e ，g i c - 1 p ) 的纯化4 5 3 8 1 薄层层析检测纯化产物。4 5 3 8 2 电喷雾质谱( e s i - m s ) 鉴定葡萄糖- 1 - 磷酸( g l u c o s e - 1 - p h o s p h a t e 。g i c - 1 - p ) 4 1 ； 3 9c d 分析g a lk 野生型及突变17 6 4 2 3 二级结构4 6 4 讨论4 7 第三章 半乳糖异构酶( u d p - g a l a c t o s e4 - e p i m e r a s e 。g a l e ) 的生物化学分析及底物特 异性研究 5 0 1 导言：本实验的目的、意义及创新点5 0 2 材料与方法5 2 2 1 材料5 2 2 1 1 菌株和载体5 2 2 1 2 酶、试剂和耗材5 2 2 1 3 培养基与缓冲液5 2 2 1 4 引物5 2 2 1 5 主要仪器s 3 2 2 方法5 3 2 2 1 半乳糖异构酶( u d p - g a l a c t o s e 4 - e p i m e r a s e 。g a l e ) 的克隆( 同第二章2 2 - 1 ) ! ；! i 2 2 2 半乳糖异构酶( u d p - g a l a c t o s e4 - e p i m e r a s e 。g a l e ) 的表达和纯化( 同第二 j i 善2 2 2 ) 5 3 2 2 3 半乳糖异构酶( u d p - g a l a c t o s e4 - e p i m e r a s e 。g a l e ) 的酶活的毛细管电泳检 测及底物特异性分析5 3 3 结果5 4 3 1 半乳糖异构酶( u d p - g a l a c t o s e4 一e p i m e r a s e g a l e ) 基因的p c r 扩增。s 4 3 2 半乳糖异构酶( u d p - g a l a c t o s e4 - e p i m e r a s e 。g a l e ) 基因克隆到p m c s g 载体 ! ；! ； 3 3 半乳糖异构酶( u d p g a l a c t o s e4 一e p i m e r a s e ，g a l e ) 的试表达。5 6 3 4 半乳糖异构酶( u d p - g a l a c t o s e4 一e p i m e r a s e g a l e ) 的表达纯化5 7 3 5 半乳糖异构酶( u d p g a l a c t o s e4 - e p i m e r a s e g a l e ) 的活性检测。5 8 3 6 半乳糖异构酶( u d p - g a l a c t o s e4 一e p i m e r a s e g a l e ) 的生物化学与酶学性质分 析! ；8 3 6 1g a l e l 和g a l e 2 的底物特异性s 8 1 ) 底物u d p g a l 。5 8 2 ) l j 【) p g a l n a c 6 0 i v 山东大学硕士学位论文 3 ) u d p - g i c 。6 2 4 ) u d p - g i c n a c 6 4 3 6 2g a l e 2 突变的底物特异性6 6 1 ) 底物u d p - g a l 6 6 2 ) l j 【) p g a l n a c 6 8 3 ) u d p - g i c 7 0 4 ) u d p g i c n a c 7 2 3 6 3g a l e 2 最适温度7 4 4 讨论7 7 附录i 8 0 p 付录8 8 参考文献9 3 致j 射。9 7 v 山东大学硕士学位论文 摘要 荚膜是肺炎链球菌( s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e ，s p ) 的重要组成成份， g a l k 、g a l e l 和g a l e 2 蛋白是肺炎链球菌荚膜合成中的关键酶，用于合成荚膜寡 糖重复单位前体u d p g a l 。荚膜在肺炎链球菌( s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e 。s p ) 的感染过程中保护致病菌免受宿主免疫系统的识别，它是宿主产生免疫反应的结 构基础。荚膜蛋白和多糖已经开始被作为治疗药物研究，但是单纯的多糖半抗原 并不能诱导免疫记忆；将致病菌表面多糖共价连接到载体蛋白后形成的糖缀合物 疫苗是目前糖药物开发的前沿之一。 我们克隆了来自4 型肺炎链球菌的半乳糖激酶( g a l a c t o k i n a s e 。g a l k ) ，i p t g 诱导g a l k 蛋白在ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 中表达，带有n - 端h i s 6 标签的g a l k 蛋白 经过n i n t a 柱和分子筛纯化，s d s p a g e 电泳结果显示，g a l k 纯度达到9 0 以上，单体分子的表观分子量约为3 7k d a ，与理论推导值基本一致。生物化学 及酶学性质分析表明肺炎链球菌g a l k 蛋白的最适p h 为7 5 ，最适反应温度为 4 5 0 c 。4 型肺炎链球菌半乳糖激酶的动力学数据表明，g a l k 突变体1 7 6 ，17 6 4 和1 7 6 4 2 3 的定点突变增加了酶对g a l 的转化效率；g a l k 突变体1 7 6 4 ，1 7 6 4 2 和1 7 6 4 2 3 的定点突变增加了酶对g i c 的转化效率；突变体1 7 6 4 ，1 7 6 4 2 对 g i c n a c 转化效率相近。a t p 不是该酶的唯一磷酸基供体，c t p ，d a t p ，d t t p 和 d u t p 也能被g a l k 蛋白利用。g a l k 蛋白催化g a l 的转化率为1 0 0 ，使用3 ，5 二硝基水杨酸( d n s ) 分析和计算g a l k 蛋白野生型及4 个突变体仃6 ， 17 6 4 ，17 6 4 2 和17 6 4 2 3 对其余单糖的转化率和活力。4 型肺炎链球菌g a l k 的3 个突变体17 6 4 ，17 6 4 2 和17 6 4 2 3 在体外能以葡萄糖为底物，而野生型g a l k 蛋 白在体外不能以葡萄糖为底物；利用对葡萄糖转化率较好的g a l k 突变体1 7 6 4 2 3 对葡萄糖进行催化反应，使用3 ，5 二硝基水杨酸( d n s ) 显色法与薄层层析( t l c ) 检测到产物葡萄糖一1 一磷酸的生成，反应混合物经硅胶柱纯化并用e s i m s 验证。当磷酸基供体为a t p ，糖基供体由半乳糖换为m 乙酰葡萄糖胺或- 乙酰半 乳糖胺或岩藻糖或阿拉伯糖或鼠李糖，催化反应后使用3 ，5 二硝基水杨酸( d n s ) 显色法与薄层层析( t l c ) 检测产物糖一1 一磷酸的生成，并使用m a l d i t o f 或 1 h n m r 或e s i m s 分析。当磷酸基供体换为c t p 或d a t p 或d t t p 或d c t p 或d u t p ，受体为半乳糖，催化反应后使用3 ，5 二硝基水杨酸( d n s ) 显色法与 山东大学硕士学位论文 薄层层析( t l c ) 检测产物半乳糖一1 一磷酸的生成，产物经e s i m s 分析。 同时我们克隆了来自4 型肺炎链球菌的半乳糖异构酶( u d p - g a l a c t o s e 4 - e p i m e r a s e ，g a l e ) ，i p t g 诱导g a l e l 和g a l e 2 蛋白在ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 中 表达，带有n - 端h i s 6 标签的g a l e l 和g a l e 2 蛋白经过n i n t a 柱和分子筛纯化， s d s p a g e 电泳结果显示，g a l e l 和g a l e 2 蛋白纯度达到9 0 以上，单体分子 的表观分子量约为3 7k d a ，与理论推导值基本一致。生物化学分析表明4 型肺 炎链球菌g a l e l 和g a l e 2 蛋白的最适p h 为8 0 ，最适反应温度为3 7 0 c 。以 u d p - g a l ，u d p g a l n a c ，u d p g i c ，u d p g i c n a c 为底物进行g a l e l 和g a l e 2 的底物特异性分析，产物峰用毛细管电泳( c e ) 检测。u d p g a l 和u d p g i c 是 g a l e l 和g a l e 2 的天然底物，用于验证g a l e l 和g a l e 2 是否具有酶活。g a l e 2 对 u d p g a l n a c 具有催化活性，g a l e l 是否对u d p g a l n a c 具有催化活性需进一 步验证。g a l e 2 对u d p g i c n a c 具有催化活性，g a l e l 是否对u d p g i c n a c 具 有催化活性需进一步验证。g a l e 2 突变体c 3 0 0 y 和k 8 5 g 对u d p g a l n a c 和 u d p - g a l n a c 具有催化活性，g a l e 2 突变体c 3 0 0 y 对u d p g i c 具有催化活性。 关键词：半乳糖激酶；半乳糖异构酶；4 型肺炎链球菌；底物特异性 v 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t g a l k 、g a l e la n dg a l e 2a r et h ek e ye n z y m ei nt h es y n t h e s i so f s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a ec a p s u l ew h i c hi st h ei m p o r t a n tc o m p o n e n t o f s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e t h es y n t h e s i so fg a l k 、g a l e la n dg a l e 2i sc o d e d b yt i g r 4g e n o m e ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o n c _ 0 0 3 0 2 8 ) g a l k 、g a l e la n d g a l e 2a r et h ek e ye n z y m ei nt h es y n t h e s i so fs t r e p t o c o c c u sp n e u m o n a e c a p s u l e ，t h e yc a t a l y s et h es y n t h e s i so fu d p g a l c a p s u l ei st h eb a s i so fh o s t i m m u n er e s p o n s e ，i tc a np r o t e c ts t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a en o tt ob e i d e n t i f i e db yt h eh o s ti m m u n es y s t e mi np a t h o g e ni n f e c t i o np r o c e s s p r o t e i n a n dp o i y s a c c h ar i d eo fc a p s u l eh a v eb e e nr e s e a m h e di nt h e r a p y ，b u to n l y p o l y s a c c h a d d eo fc a p s u l ec a nn o ti n d u c ei m m u n o l o g i c a lm e m o r y c o v a l e n t l y l i n kt h ep o l y s a c c h a r i d et oc a r r i e rp r o t e i ni so n eo ft h ef o r e f r o n to fd r u g d e v e l o p m e n t g a l a c t o k i n a s e ( g a l k ) w a sc l o n e df 内mt h eg e n o m eo fs t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e 4a n dw a so v e r - e x p r e s s e di nec o i lb l 2 1 ( d e 3 ) t h e r e c o m b i n a n th i s - t a g g e dg a l kp r o t e i nw a sp u d f i e db yn i - - n t ac o l u m na n dg e l f i l t r a t i o nc o l u m n s d s - p a g es h o w e dt h a tt h ep u r i t yo fg a l kp r o t e i nw a sm o r e t h a n9 0 。t h ea p p a r e n tm o l e c u l a rw e i g h to ft h em o n o m e ro fg a l kp r o t e i nw a s a b o u t3 7k d a ，c o n s i s t e n tw i t ht h ec a l c u l a t e dm a s s t h eb i o c h e m i c a ls t u d y s h o w e dt h a tt h eo p t i m a lp hv a l u eo fg a l kp r o t e i nw a s7 5a n dt h eo p t i m a l t e m p e r a t u r ew a s4 5 0 c a t pi sn o t t h eo n l yp h o s p h a t e - d o n o ro fg a l kp r o t e i n t h er e a c t i o nr a t ef o r mg a it og a i 一1 一pb yg a l kp r o t e i ni s1 0 0 ，3 ，5 一 d i n i t r o - s a l i c y l i ca c i dw a su e dt oa n a l y s ea n dc a l c u l a t et h er e a c t i o nr a t eo f m o n o s a c c h ar i d ec a t a l y s e db yg a l kw i l dt y p ea n d4m u t a n ts t r a i n s17 6 ， 17 6 4 ，17 6 4 2a n d17 6 4 2 3 3m u t a n ts t r a i n s17 6 4 ，17 6 4 2a n d17 6 4 2 3c a nu s e g l u c o s ea st h es u b s t r a t e ，b u tg a l kw i d et y p ec a nn o tu s ei t r e a c t i o nw a s c a t a l y z e db yg a l km u t a n ts t r a i n s17 6 4 2 3 ，p r o d u c tg i c - 1 一pw a si d e n t i f i e db y d n sa n dt l c ，t h ep u r i f i e dg i c 一1 一pw a si d e n t i f i e db ye s i m s a t pa n d n - a c e t y l g l u c o s a m i no rn - a c e t y l g a l a c t o s a m i no rf u c o s e o ra r a b i n o s eo r r h a m n o s ew e r eu s e da ss u b s t r a t e ，p r o d u c tw a sj d e n t i f i e db yd n s ，t l ca n d m a l d i t o fo r1h n m ro re s i m s w h e np h o s p h a t ed o n o rw a sc t po r v i 山东大学硕士学位论文 d a t po rd t t po rd c t po rd u t p ，a n da c c e p t o rw a sg a l a c t o s e ，p r o d u c tg a l - 1 一p w a sa n a l y s e db yd n sa n dt l c ，i d e n t i f i e db ye s i m s u d p - g a l a c t o s e4 一e p i m e r a s e ( g a l e ) w a sc l o n e df m m t h eg e n o m eo f s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e4a n dw a so v e r - e x p r e s s e di ne c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t h er e c o m b i n a n th i s - t a g g e dg a l e la n dg a l e 2p r o t e i nw a sp u r i f i e db yn i n t a c o l u m na n dg e lf i l t r a t i o nc o l u m n s d s - p a g es h o w e dt h a tt h ep u r i t yo fg a l e l a n dg a l e 2p r o t e i nw a sm o r et h a n9 0 。t h ea p p a r e n tm o l e c u l a rw e i g h to ft h e m o n o m e ro fg a l e la n dg a l e 2p r o t e i nw a sa b o u t3 7k d a ，c o n s i s t e n tw i t ht h e c a l c u l a t e dm a s s t h eb i o c h e m i c a ls t u d ys h o w e dt h a tt h eo p t i m a lp hv a l u eo f g a l e la n dg a l e 2p r o t e i nw a s8 0a n dt h eo p t i m a it e m p e r a t u r ew a s 3 7 0 c u d p g a l ，u d p g a l n a c ，u d p g i c ，u d p g i c n a cw e r eu s e da s s u b s t r a t et oa n a l y z et h es u b s t r a t es p e c i f i c i t yo fg a l e la n dg a l e 2 。p r o d u c tw a s i d e n t i f i e db yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) k e y w o r d s ：g a l a c t o k i n a s e ；u d p - g a l a c t o s e4 - e p i m e r a s e ； s u b s t r a t es p e c i f i c i t y i x o c v v l h s m i n d a m m o i v r p m g i c m a n f u c g a i x y l a 陷 r h a m a n 山东大学硕士学位论文 缩写词表 a b b r e v i a t i o n 摄氏度 体积比 公升 小时 秒 分钟 道尔顿 米 紫外 摩尔 缬氨酸，伏特 每分钟转速 葡萄糖 甘露糖 岩藻糖 半乳糖 木糖 阿拉伯糖 鼠李糖 甘露糖 ( 1 i t e r ) ( h o u r s ) ( s e c o n d ) ( m i n u t e ) ( d a l t o n ) ( m e t e r ；m u l i ，1x10 3 ) ( u l t r a v i o l e t ) ( 6 ，0 2 3x1 0 2 3 ) ( v a l i n e ，v o l t ) ( r o t a t i o np e rm i n u t e ) ( g l u c o s e ) ( m a n n o s e ) ( f u c o s e ) ( g a l a c t o s e ) ( x y l o s e ) ( a r a b i n o s e ) ( r h a m n o s e ) ( m a n n o s e ) 4 - d e o g a l 4 一脱氧一半乳糖 ( 4 - d e o - g a l a c t o s e ) x 山东大学硕士学位论文 n e u a c a唾液酸 ( s i a l i ca c i d ) g i c n a c n - 7 _ , 酰氨基葡萄糖 ( n - a c e t y l g l u c o s a m i n ) g a l n a c n - e _ , 酰氨基半乳糖 ( n - a c e t y l g a l a c t o s a m i n ) 6 - n a c - g i c n a c 6 - 乙酰胺基一葡萄糖胺( 6 - n a c - n - a c e t y l g l u c o s a m i n ) m u r n a c乙酰胞壁酸 ( n - a c e t y l m u r a m i c ) m a n n a cn - 乙酰甘露糖 a m p k m 氨苄青霉素 卡那霉素 ( n - a c e t y ，i m a n n o s a m i n ) ( a m p i c i l l i n ) ( k a n a m y c i n ) l b 细菌全营养培养基 ( l u d a b e r t a n i m ) m d t t 弋 甲硫氨酸，摩尔 ( m e t h i o n i n e ，m o l a r ，m o l i ) 二巯苏糖醇 ( d i t h i o t h r e i t 0 1 ) 温度，苏氨酸，胸腺嘧啶( t e m p e r a t u r e ，t h r e o n i n e ，t h y m i n e ) a g e琼脂糖凝胶电泳 ( a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) e d t a c e t l c 7 _ , - - 胺四乙酸 ( e t h y l e n d i a m i n et e t r a a c e t a t e ) 毛细管电泳 ( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ) 薄层层析 ( t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ) n i n t a氮川三乙酸镍 ( n i c k e l - n i t r i l o t r i a c e t i ca c i d ) p c r 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) i p t g 异丙基硫代1 3d 半乳糖苷( i s o p r o p y l 1 3dt h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ) p a g e h p l c f p l c 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) 高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 快速蛋白液相色谱 ( f a s tp r o t e i nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 山东大学硕士学位论文 e s i - m s 电喷雾质谱( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y ) n m r p d b p b s d e a e d n s n c b i 核磁共振( n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ) 蛋白质数据库 ( p r o t e i nd a t a b a s e ) 磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ) 二乙基氨57 , 基纤维素 ( d i e t h y i a m i n o e t h y ic e l l u l o s e ) 3 , 5 二硝基水杨酸 ( 3 ，5 一d i n i t r o - s a l i c y l i ca c i d ) 美国国家生物信息中心 ( t h en a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ) s d s - p a g e十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( s o d i u md o d e c y ls u l f a t ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) b l a s t 基本的局部比对搜索工具( b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht 0 0 1 ) x 1 山东大学硕十学位论文 第一章绪论 1 肺炎链球菌( s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e ) 1 1 该疾病的感染情况 肺炎链球菌( s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e ，s p ) ，以前称肺炎双球菌，是一种 革兰氏阳性的荚膜双球菌，球菌之间的相邻面是圆形的，两端尖而呈柳叶刀状。肺 炎链球菌( s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e ，s p ) 是肺炎、中耳炎和脑膜炎的主要病原 菌，能引起心内膜炎、腹膜炎、关节炎和败血症等疾病。肺炎球菌感染是世界范 围内引起死亡的重要原因之- - 1 。 据世界卫生组织2 0 0 5 年统计，每年至少有1 6 0 万人死于肺炎链球菌感染，其 中5 岁以下儿童有8 0 0 ，0 0 0 至= j l 。0 0 0 ，0 0 0 死于肺炎和脑膜炎，且大多数感染事件发 生在发展中国家【2 】。在发达国家如美国，肺炎链球菌仍然是导致死亡的十大原 因之一，5 0 的社区获得性肺炎及1 0 的院内感染肺炎是由肺炎链球菌引起。仅 2 0 0 0 年就有1 7 ，0 0 0 例侵袭小于5 岁儿章，其中有7 0 0 例脑膜炎【3 】。英国肺 炎球菌病的年发病率从1 1 0 0 0 至u 4 7 1 0 0 0 ，病死率为11 ：在法国每年有1 2 5 万人因肺炎球菌引起肺炎，近万人死亡【4 】。 1 2 致病因子 肺炎链球菌的致病因子可分为两大类：一类是荚膜及蛋白，位于细菌表面， 主要在感染初期发挥抗吞噬作用和补体抑制作用，从而使肺炎球菌逃避宿主的免 疫应答：另一类则是细胞壁成分以及细胞内的肺炎球菌溶血素，在细胞自溶后释 放出来，导致炎症的产生，使肺炎球菌更易扩散到其它组织器官( 图1 1 ) 【5 】。 a t p b 时n 5 l p x t g r a n c h o c e d n e u r a , n n n d , u , ep r o t e 州 h 啊i _ _ - 讪口 图1 1 肺炎链球菌的致病因子 山东大学硕士学位论文 目前普遍认为荚膜是肺炎球菌最重要的致病因子。试验表明，有荚膜株与无 荚膜株的l d 5 0 有显著性差异，前者的毒性大约是后者的1 0 5 倍【6 】。现有的实验证 明，肺炎球菌的荚膜既是毒力因子又是保护因子，有试验证实在给与了致死剂量肺 炎球菌而仍然存活的小鼠体内产生了高水平的抗荚膜多糖抗体，即荚膜多糖抗体 对肺炎球菌感染具有有效的保护作用【7 】。 1 3 荚膜结构、功能、合成途径等 1 3 1 荚膜多糖结构、功能 荚膜约2 0 0 4 0 0n m 厚，是肺炎链球菌在对数生长期形成包裹在外部的薄 层结构，是由重复寡糖单位组成的高分子多聚体，每一个寡糖含2 8 个单糖。荚 膜多糖通过与磷酸脂或类脂a 分子共价连接联结于细胞表面( 图1 2 ) 【8 】。它们 高度水合化并可被乙酰基，其他酰基，磷酸基和硫酸基衍生化。荚膜多糖同样表 现出高度的结构多样性，肺炎链球菌( s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e ) ，一种引 起肺炎、脑膜炎和血流感染的革兰氏阳性菌，可以表达9 0 多种不同结构c p s 9 。 图1 2 革兰氏阳性细菌细胞表面的荚膜多糖 f i g 1 2 c p so ng r a m - p o s i t i v eb a c t e r i ac e l ls u r f a c e s c a p s u l a rp o l y s a c c h a r i d e ：荚膜多糖；p e p t i d o g l y c a n 肽聚糖 c p s 在感染型细菌疾病中表现为重要的致病因子。c p s 的这个特性被用于 开发抗感染疾病的多糖疫苗，如肺炎、脑膜炎和败血病相关疫苗【1 0 】。目前使用 的肺炎疫苗含