（微生物与生化药学专业论文）镇江恒顺香醋风味物质及川芎嗪的分析研究.pdf

摘要 摘要 镇江恒顺香醋是我国传统四大名醋之一，具有醇香浓厚，回味悠长的特点。酿醋业 属于传统工艺行业，由于历史原因，缺乏规范的生产工艺标准，再加上现行醋的质量标 准比较简单，较难据此判断醋的品质好坏。恒顺香醋道地性数据库能为产品质量的保证 和不同产品的鉴定提供标准，能有力打击市场上以次充好的不良竞争。本文采用多种检 测方法，分析恒顺香醋中表征性物质，包括香气成分、游离氨基酸和川芎嗪，为建立道 地性标准奠定基础。 利用h s s p m e g c m s 方法，对优质恒顺香醋香气成分进行分析，选取1 8 种共有指纹 峰物质，初步建立优质恒顺香醋香气成分的指纹图谱，用于区别和鉴定恒顺香醋。 分析不同陈化阶段中的香气成分，结果表明，随着陈化的时间增加，杂环类物质逐 渐增加，尤以川芎嗪含量变化最大，八年时高达1 6 1 4 。酸类、醇类、醛酮类物质在醋 中的相对含量逐渐减少，但趋势较缓；酯类物质的相对含量呈现先增加后减少的趋势。 利用氨基酸自动分析仪对恒顺香醋7 个品牌中的1 7 种游离氨基酸进行分析，发现醋 中氨基酸含量丰富。丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸、精氨酸、缬氨酸含量较高，且相对较稳 定。 醋酸发酵过程中游离氨基酸总量减少了3 6 左右，特别是谷氨酸、天冬氨酸、脯氨 酸和亮氨酸。陈化过程中含量最多的5 种氨基酸变化率相对来说较小。 实验发现川芎嗪虽早出现在醋酸发酵过程中，但产生量很少，密封陈放过程能显著 增加川芎嗪含量。随着陈放时间的延长，川芎嗉持续增加。因此它具有成为产品质量指 标的可能。 通过对多个样品的川芎嗪、还原糖和游离氨基酸变化的分析，证明了恒顺香醋中川 芎嗪成分主要来自于美拉德反应，由于加热煎煮对川芎嗪含量影响不明显，川芎嗪可能 不是由美拉德反应直接得到，而可能是由美拉德反应生成一毗嗪类物质中间体，通过陈 放转化成川芎嗪。 关键词恒顺香醋香气成分顶空固相微萃取游离氨基酸川芎嗪 a b s t r a c t a b s t r a c t z h e n j i a n gh e n g s h u nv i n e g a rw a so n eo ft h ec h i n af a m o u sv i n e g a r s v i n e g a ri n d u s t r y w a st r a d i t i o n a lt e c h n i c s i tw a sh a r dt oe s t i m a t et h eq u a l i t yo fv i n e g a r , b e c a u s et h e r ew a sn o n o r m a t i v ep r o d u c et e c h n i c sa n dt h eq u a l i t ys t a n d a r dw a ss i m p l e t h eg e n u i n e n e s sd a t a b a n ko f h e n g s h u nv i n e g a rw o u l dp r o v i d et h es t a n d a r do fp r o d u c t i o nq u a l i t ya n di d e n t i f i c a t i o no f d i f f e r e n tv i n e g a r a l s oi tc o u l da v o i dt h eb a dc o m p e t i t i o no fm a r k e t i nt h i ss t u d y , t h e c h a r a c t e r i s t i c c o m p o n e n t s s u c ha sv o l a t i l e c o m p o n e n t s ，d i s s o c i a t i v e a m i n oa c i d sa n d l i g u s t r a z i n ei nt h eh e n g s h u nv i n e g a r , w e r ea n a l y z e dw i t hd i f f e r e n tm e t h o d s h i g h - q u a l i t yh e n g s h u nv i n e g a r s w e r e a n a l y z e db y l l e a d s p a c e - s o l i dp h a s e m i c r o e x t r a c t i o n - g a sc h r o m a t o g r a g h - m a s ss p e c t m m ( h s s p m e - g c - m s ) t h ec h a r a c t e r i s t i c f i n g e r p r i n ts p e c t r u m so ft h ev i n e g a r sw e r ee s t a b l i s h e db yt h es e l e c t i o no fe i 【g h t e e nt o t a li o n c u r r e n tp e a k so ft h ec o m p o n e n t s t h eg e n u i n ea n dc o u n t e r f e i to ro t h e rb r a n dv i n e g a r sw e r e i d e n t i f i e db yc o m p a r i s o no f t h e i rf i n g e r p r i n ts p e c t r u m s v o l a t i l ef l a v o rc o m p o u n d so fd i f f e r e n ta g i n gt i m ew e r ea n a l y z e d r e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h ec o n t e n to fh e t e r o g e n e o u sr i n gc o m p o u n d sw a sg r a d u a l l yi n c r e s i n g t h er e l a t i v ec o n t e n to f l i g u s t r a z i n ew a s1 6 1 4 a f t e re i g h t - y e a rs t o r a g e w h i c h ，a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a no t h e r s t h er e l a t i v ec o n t e n t so fa c i d s ，a l c o h o l sa n da i d e h y d ek e t o n e sw e r ed e c r e a s i n g ，b u tt h e t e n d e n c yw a sg e n t l y e s t e r sw e r ei n c r e a s i n gf i r s t l y , t h e nd e c r e s i n g s e v e n t e e nk i n d so fd i s s o c i a t i v ea m i n oa c i d si ns e v e nb r a n dv i n e g a r sw e r ed e t e r m i n e d u s i n ga m i n oa c i da n a y l y z e r t h er e s u l ts h o w e dt h a td i s s o c i a t i v ea m i n oa c i d sw e r ea b u n d a n t t h ec o n t e n t so fa l i a n i n e ( a l a ) ，l e u c i n e ( l e u ) ，g l u t a m a t e ( g l u ) ，a r g i n i n e ( a r g ) a n dv a l i n e ( v a l ) w e r er e l a t i v e l yh i g ha n ds t a b l e t h et o t a la m o u n to fd i s s o c i a t i v ea m i n oa c i dr e d u c e d3 6 d u r i n ga c e t i cf e r m e n t a t i o n ，e s p e c i a l l yg l u ，a s p a r t a t e ( a s p ) ，p r o l i n e ( p r o ) a n dl e u t h e v a r i a t i o nr a t i oo f t h ef i v em a j o ra m i n oa c i d sw a ss m a l l al i t t l eo fl i g u s t r a z i n ea p p e a r e da tt h ee a r l ys t a g eo fa c e t i cf e r m e n t a t i o n t h eq u a n t i t yo f l i g u s t r a z i n ei n c r e a s e dg r e a t l ya f t e rh e r m e t i c a l l ys t o r i n g s ol i g u s t r a z i n ec o u l db eu s e da s q u a l i t yc r i t e r i o no fh e n g s h u nv i n e g a r t h eq u a n t i t a t i v ec h a n g e so fl i g u s t r a z i n e ，s u g a ra n dd i s s o c i a t i v ea m i n oa c i dw e r e a n a l y z e di ns o m ev i n e g a rs a m p l e s i tw a sp r o v e dt h a tl i g u s t r a z i n ew a sc o m ef r o mm a i l l a d r e a c t i o n ，b u tn o td i r e c t l y , b e c a u s eh e a t i n gd i dn o tm a k eo b v i o u se f f e c to nl i g u s t r a z i n e a n i n t e r m e d i a t eo fp y r a z i n e s ，p r e c u r s o rf o rl i g u s t r a z i n e ，m i g h tb em a d eb ym a i l l a dr e a c t i o n k e y w o r d s ：h e n g s h u nv i n e g a r ；v o l a t i l e m i c r o e x t r a c t i o n ；d i s s o c i a t i v ea m i n oa c i d ； f l a v o r c o m p o u n d ；h e a d s p a c e s o l i d p h a s e l i g u s t r a z i n e i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名；盔垫盎日期：工。年6 月即日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：鲣导师签名：丛耋：刍 j 日期：。厶以年6 月却日 第一章绪论 第一章绪论 i 醋的食用在我国有悠久的历史，人们常说的“生活开门7 件事，柴米油盐酱醋茶” 中就有醋，说明醋在我国人民生活中的重要性。 1 1 食醋的诞生与古代酿醋业的发展 食醋的诞生还得从酿酒开始，早在奴隶社会，奴隶主经常用上好的谷物酿酒供他们 宴饮作乐和祭祀神灵。酒中的主要成分乙醇受微生物“醋母”的作用，被空气中的氧气 氧化而变成醋酸，出现了当时人们认为的“坏酒”现象，人们称这种酿坏的酒为“苦酒”， 显然“苦酒”就是原始食醋的概念。在古时，醋还有酰、酢等异称。公元前6 世纪，醋 就已成为常用的调味品，如论语中就有“或乞酰焉”之语，在公元前4 世纪就有了 专门管理酿醋的官员，如周礼天官中的酰人。公元6 世纪中叶，酿醋已有了较为 科学的方法，如当时的农学家贾思勰着书齐民要术，书中谈到了有关酿造方面的知 识，其中包括酿醋。这是我国现存史料中，对粮食酿造醋的最早记载。同时，这一记载 也表明中国是世界上谷物酿醋最早的国家到了明代，酿醋常识已普及百姓之家，如涂 光启所著农政全书卷四十二中就载有“作酢法”、“秫米神酢法”等百姓酿醋的详细 方法。至此，我国古代发酵制醋的工艺基本形成。 1 2 食醋的功能性 1 2 1 古代人们对于食醋功能性的认识 三千多年来，醋不但是调味不可缺少的佳品，还是一种医疗良药。1 9 7 3 年长沙汉墓 出土的医学帛书五十二病书是迄今已发现的最古医方，大概抄成于公元前3 世纪秦汉 之际，其中用醋组方治灼伤，疝、疽、癣、疯狗咬伤等1 1 种病毒有1 7 则处方。三国时。 名医华陀曾用蒜泥加醋治愈一例严重的蛔虫感染患者，开创食疗治急症的先例。继而在历 代重要医学著作中，都有不少食醋参与的组方。在国外，据历史考证，日本自古以来就 有重醋轻盐风，并把食醋列在“长寿十训”之二的位置上。公元1 8 一1 9 世纪时，欧洲 人外出旅游时，随身携带果醋，饮水前必先在水中滴几滴醋，杀毒，消菌预防传染病。 西方医学的奠基人、西腊的希波可拉底医师( 公元前4 6 0 _ - 3 7 7 年) 赞赏食醋的医疗价 江南大学硕士论文 值，并对呼吸器官的疾病、疹癣、狂犬咬伤等疾病使用食醋治疗。在罗马的民间医学中 广泛应用醋来治疗创伤。圣经中还有醋能减轻疾病的记载“。 1 2 2 现代关于食醋功能性的研究成果 随着消费观点的更新和对医疗科技认识的深化，食醋已不再是传统意义上的单纯酸 性调味了。在医学上具有：杀菌灭毒、预防感冒；溶解钙质、软化骨头；除血散肿、敛 血止血；驱蛔蛲虫、杀灭滴虫；降压止痢、治疗胃病；疗疸退黄、治疗肝炎；治皮肤病、 外治烫伤；防治癌症、功效卓著的医疗功能“。本实验室在研究中发现镇江恒顺香醋含 有川芎嗪这一有效成分，这也是首次被发现醋中含有此物质“1 。文献报道川芎嗪具有降 压活血化淤、改善冠心病，溶栓抑栓、清除自由基的保健作用，且相对安全性较高“1 ， 但对食醋中川芎嗪产生的机理还有待迸一步的研究。日本金泽医科大学和京都大学联合 研究小组通过老鼠实验证实，以糙米为原料的黑醋具有防癌效果。研究人员在实验中先 给小鼠注入诱发直肠癌的物质，然后把小鼠分为两组，让一组小鼠饮用平常的自来水， 另一组小鼠的饮水中放入黑醋。3 5 周后，检查小鼠的直肠，结果发现，饮用自来水的一 组2 7 只小鼠，其中有1 6 只患了直肠癌，而另一组饮用掺有0 1 黑醋的水的2 7 只小鼠，只 有7 只患有直肠癌。1 9 9 8 年，l i l j e b e r g 等人对身体的研究表明给与淀粉卷饮食时给与 醋酸( 食醋) 能明显降低餐后葡萄糖和胰岛素响应，其机理为延缓了胃排空率。因此饮食 时供应有机酸有助于降低血糖和所需的胰岛素量。1 9 9 9 年，m i k i y ak i s h i 做了食醋对人 体钙吸收影响的实验。以切除卵巢的大鼠为对象，喂给食醋并测定尿液中的钙离子，喂 养3 0 天后与空白组产生明显差别。研究人员认为产生这一结果的原因是由于乙酸有利于 增加钙离子的溶解性，加速钙离子的代谢过程，增加了肠道中钙质的吸收。上述实验结 果恰恰佐证了食醋确有其医疗保健之功效。 1 3 食醋的生产概况 世界上食醋的生产和消费主要集中在两个大区：以意大利、法国为主的欧洲传统葡 萄酒生产区和东亚的中韩日三国。 欧洲食醋绝大部分是果醋。据1 9 9 7 年的资料，当年欧洲年产食醋四亿五千万升。 其中第一大生产国是意大利，年产五千四百万升，其次西班牙和法国的产量也很大。欧 洲食醋中以意大利摩德纳地区的芳香醋( b a l s a m i c o ) 最著名。芳香醋发酵后还要贮藏三 年才为成品，该醋不仅风味突出而且被认为具有很高的保健功能，因此价格昂贵。 东亚的食醋生产原料以谷物为主。日本食醋多为米醋，其中福山地区生产的黑米醋 最为著名，此外，在日本还有不少醋饮料、醋食品等食醋衍生产品。 2 第一章绪论 我国食醋产地分布极广，许多省份都有自己的原产醋。我国著名的食醋品种有山西 陈醋、镇江香醋、四川麸醋、江浙玫瑰醋及福建红曲醋等。其中产量最大，生产工艺最 规范成熟，国际影响最大的名醋是镇江恒顺集团生产的镇江香醋。 1 4 建立镇江恒顺香醋道地性标准和指纹图谱分析方法的可行性 1 4 1 镇江恒顺香醋简介 ， 本文以镇江恒顺香醋为研究对象。镇江恒顺香醋是我国传统四大名醋之一，具有醇 香浓厚，回味悠长的特点。对恒顺香醋还有“香醋摆不坏，愈陈愈香”的古语。镇江香 醋用糯米为原料，是一种典型的米醋。粱代陶弘景神农本草经注中就有关于米醋用 法的记载。据此，恒顺香醋已有1 4 0 0 多年的历史。1 8 4 0 年，江苏丹徒的朱兆怀始创“朱 恒顺糟坊”，1 8 5 0 年易牌号为“朱恒顺糟淋坊”，以酒糟加入谷壳发酵，酿制香醋，这是 镇江第一家醋厂( 今恒顺酱醋厂) ，也是今天镇江香醋的真正发源地。1 9 0 9 年，恒顺以 醋参加南洋劝业会评赛，荣获了第一枚金牌奖。民国年间，又多次在江苏物产展览会、 京沪铁道沿线评赛会、西湖博览会上获多种奖牌，镇江香醋名声日盛。中国医药大典 记载，“醋产浙江杭绍二县为最佳，实则以江苏镇江为最”。 恒顺香醋采用固态分层发酵工艺酿制，富含营养物质，风味独特。时至今日，镇江 恒顺集团年产食醋十万吨以上。无论产量知名度，镇江恒顺香醋都居全国之首。 1 4 2 引入道地性标准的可行性 镇江恒顺香醋由于其独特优良的品质在长期的应用和流通中得到公认，信誉卓著， 有口皆碑，并且其品牌已是当地经济生活中独秀的一枝。激烈的市场竞争中，品牌已成 为竞争的主流，正因为品牌的巨大价值和无穷魅力，许多企业针对不同的消费者提供了 不同的品牌，形成以主力品牌为主，辅助品牌、细分市场品牌为成员的品牌体系。就消 费者而言，品牌可以作为一种鉴别特定质量水平的方法，使消费者简化选择。品牌可以 建立消费者对产品的忠诚度，在一段时间内为企业提供利润保护，发展多种品牌组合， 可以使企业面向不同的消费群体，增加市场份额，也是企业最重要的无形资产。 酿醋业属于传统工艺行业，由于历史原因，酿醋业没有适合大多数企业的标准化和 规范化的生产工艺，工艺流程缺乏严格的规范监督机制，产品质量的稳定性较差，对其 风味未有准确的理化指标的数据化支持，再加上现行醋的质量标准比较简单，较难据此 判断醋的品质好坏，科技水平应用不够。其次品牌与品牌之间的竞争与区别也仅限于口 感差异，地域不同，营销手段，产品多样化和一些传统检测鉴别方法等方面，对造成其 江南大学硕士论文 产品所特有风味的物质研究较少，不能从具体的数据化标准来区别品牌之间的差异，这 就给不法分子提供了机会。一些企业为了获得利润，忽视了以“质量为本”的原则，导 致大量低劣食醋投放市场。2 0 0 4 年2 月8 日中央电视台每周质量报告播出山西三 家醋厂以醋酸、色素和香料熬制老陈醋以后，在社会上引起了轩然大波。有关报道称该 行为“激怒了山西百姓，惹恼了山西食醋生产企业”，山西省政府高度重视，一系列规范 食醋行业、加大市场管理力度的措施正在酝酿出台。 至此，本课题首次在食醋业引入道地性概念，所谓道地，具有原产的，真实的，纯 粹的，无暇的，高质量的，够标准的含义。此词原用于中药材领域，在中医药长期医疗 实践中，道地药材一直是评价药材品质的独特的综合性标准。道地药材这个概念不仅是药 材生产的地理概念，更重要的是一个质量概念，经济概念和文化概念。在古时候，认定 和鉴定药材一靠权威认可，二靠道地药材。不识货，货比货，把道地药材作为标准品， 对照真伪优劣，甚至比权威和书本更有说服力肼。道地性标准恰恰正是恒顺香醋品质的 体现，为提高镇江恒顺香醋的生产、检测水平，开发出高品质的恒顺香醋，能在国际食 醋行业中更具有竞争力。我们更应该尽快建立镇江香醋道地性数据库，并以其数据库为 依据，可以在生产中对产品质量进行快速检测，从而更好地规范工艺流程。这样，既可 以保证产品质量，又可以作为不同产品的鉴定标准，有力打击市场上以次充好的不良竞 争。 由于建立镇江恒顺香醋道地性数据库，任重而道远，本课题仅对恒顺香醋中表征性 物质进行初步研究，为今后的工作打好基础。 1 4 3 镇江恒顺香醋指纹图谱分析方法的可行性研究 i a 3 1 中药指纹图谱的研究进展 指纹图谱等质量控制技术现已广泛的应用在中药生产上的各个领域，中药指纹图谱 有两个特点：一是通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪或产地；二是通过指 纹图谱主要特征峰的面积或比例的制定，能有效控制产品的质量，确保产品质量的相对一 致。常用的研究方法有：色谱法：包括传统的薄层色谱法，液相色谱法、气相色谱法、 高效毛细管电泳法等；光谱法：包括紫外光谱法、红外光谱法、近红外光谱法；其 它方法：如x 射线衍射法、核磁共振法等等。中药指纹图谱研究方法虽然较多，但色谱 学方法应是主流方法，尤其是t l c 、h p l c 和g c 色谱技术，已经成为大家所公认的三种 常规的分析手段，是且前我们研究中药指纹图谱应优先考虑的方法“。 由于中药注射剂的特殊性，我国决定先采用中药指纹图谱控制中药注射剂的质量。 国家药品监督管理局要求“中药注射剂应固定药材产地，建立药材和制剂的指纹图谱标 准”，并颁发了中药注射剂指纹图谱研究的技术要求( 暂行) 等相应的指导原则。目 4 第一章绪论 前，许多常用中药材如川芎、苦参等都有了较为系统的指纹图谱研究“小”1 t t l j 预计近两、 三年内，常用见的中药材都将有相应的指纹图谱。香港中文大学医学院李松林应用 h p l c - d a d m s 联用技术测定四川g a p 示范基地3 个公司的9 个川芎样品，鉴定共有蜂和 特征峰，指定参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积。9 4 样品的色谱指纹 图谱有2 1 个共有峰，这2 1 个共有峰的相对保留时间稳定，同一公司同一年采收的样品1 3 个主要共有峰的相对峰面积稳定，而不同公司同一年采收的样品1 3 个主要共有峰的相对 峰面积差异非常显著。说明3 家公司产品不但所含主要成分的相互比例差异大，而且绝 对含量也有明显的差异，也说明所建立的液相色谱指纹谱特征性和专属性强，可作为川 芎药材内在质量控制的有效方法“”。 国际上采用指纹图谱对植物药进行质量控制，效果显著，如韩国、日本、德国等。 他们比较重视对植物药的开发和利用，德国用指纹图谱技术控制质量的银杏制剂，在国 际上具有很强的竞争力1 1 5 1 0 美国食品药品管理局( f d a ) 已开始接受指纹图谱，在递交 新药成分控制资料时，植物物质和植物药产品的质量控制允许采用指纹图谱。英国、印 度以及世界卫生组织等药品管理机构，也都采用指纹图谱技术对植物药、草药质量进行 评价。国外大批植物药研究机构正在加紧绘制中药和中成药的指纹图谱，有的甚至专挑 中国著名的中药保护品种“”。目前，国外开展的植物制剂指纹图谱研究，主要还是针对 单味药材提取物而言，在植物制剂的整体性作用和药效相关性方面研究很少。 1 4 3 2 建立镇江恒顺香醋指纹图谱分析方法的思路 从古到今，无数的著作与事例证实了食醋不仅仅作为单纯的酸性调味品，更具有相 当高的医疗保健功效，通过现代的科学技术研究发现，食醋中含有中药的有效成分物质， 更加佐证了醋的医药价值。作为我国四大名醋之一镇江恒顺香醋食醋，风味独特，营养 成分丰富，保健作用明显，经实验证实含有川芎的有效成分川芎嗪柚。因此可以借鉴中 药指纹图谱的研究方法建立镇江恒顺香醋的指纹图谱研究方法，近期有文献报道了采用 高效液相色谱建立了保健酒的石油醚乙醚提取物的指纹图谱。通过分析比较色谱指纹 图谱中的相对保留值d 和相对面积s r ，对不同批次的保健酒进行对比研究，结果表明， 该法简便可靠，对保健酒的质量控制效果明显“。因此，以恒顺香醋中风味物质和功能 因子为对象，建立其指纹图谱将能很好的反映恒顺香醋的品质内涵，对今后的生产，品 牌的维护和发扬光大具有重要意义，相关研究在我国酿醋业中还未见报道。 1 5 食醋风味物质研究进展 自从高效液相色谱和毛细管气相色谱获得广泛应用以来，食醋的成分分析工作取得 了很大进展。据不完全统计，目前在食醋中发现的各类成分有1 2 0 余种。醋酸是酿造醋 江南大学硕士论文 中的主要成分，糖、氨基酸、酯、醛、醇、酚、酮类等为微量化学成分，形成香醋特有 的色、香、味。而醋中各种物质含量的高低及相互之间的比例关系会直接影响到食醋的 质量与风味“”。 食醋的成分分析工作较少涉及难挥发的水溶性物质。这主要因为液相色谱质谱 ( h p l c - m s ) 联用技术发展远不如气相色谱质谱( g c m s ) 联用技术迅速：其次是由 于食醋中尤其是谷物醋中蛋白质、多糖类等大分子物质含量大结构复杂，不易检测；最 后食醋中醋酸含量超过5 ，过高的含量干扰了水溶性酸组分的分析，加热挥发醋酸则 导致热敏感物质的破坏。 1 5 1 国外研究情况 早在上世纪6 0 年代末，国外学者就做过很多食醋挥发性组分的分析工作； s u o m a l a i n c n 和k a n g g a s p e r k o 在1 9 6 3 年、k a i m 在1 9 6 6 年“】、a u r a n d 在1 9 6 6 年、 j o n e s 和g r e e n s h i e l d s 在1 9 6 9 年和1 9 7 0 年都发表过这类文章叫“1 。以a u r a n d 的工作为 例，他以三种果醋( 苹果醋、葡萄醋和龙嵩醋) 为对象，采用气相色谱分析了7 0 水浴 蒸馏组分，比保留值定性共获得了包括醛、酮、酯和醇在内的2 5 种成分，其中有1 1 种 成分为三种醋所共有m ，。 7 0 年代以后，食醋分析方法不断获得改进。首先是对提取方法的改进。由最早的直 接蒸馏开始，h a r d y ( 1 9 6 9 ) “，r a p p ( 1 9 7 6 ) ，b r a n d e r ( 1 9 8 0 ) ，f a g a n ( 1 9 8 2 ) 采用液液萃取， 所用有机溶剂一般为二氯或三氯甲烷；其后k a h n ( 1 9 7 2 ) ，g e r b i ( 1 9 9 2 ) 使用混合有 机溶剂( 二乙酯戊烷( 2 ：1 ) ，戊烷二氯甲烷( 7 ：3 ) ) 提取，从食醋中获得了更多物质的 信息。 9 0 年代后应用顶空捕集法幢。1 和同步蒸馏萃取法( s i m u l t a n e o u sd i s t i l l a t i o n e x t r a c t i o n ，s d e ) 从食醋中富集微量或痕量组分进行分析。此外，利用树脂的特异吸 附性进行预分离也是近来常见的方法。1 9 9 2 年，b l a n c h 对六种果醋进行成分分析，s d e 萃取后g c m s 检测。为了保证分析的准确性，他使用了两种g c m s 装置分别检测，共 检测到6 0 种挥发性物质”1 。1 9 9 8 年t e r b e 和h b r o c k n e r 用手性气质联用色谱法对2 5 种醋检测其所含的手性游离氨基酸对映体，这些醋包括葡萄合成醋，雪利酒醋，苹果醋， 米醋，b a l s a m i 醋，s p i r i t 醋。结果表明所有的酿造醋都含有d 丙氨酸，d 天冬氨酸和 d 谷氨酸，手性氨基酸的分析可以用来区别是酿造醋还是合成醋，也能鉴别醋产品使用 的是什么原料。从研究中发现由d 脯氨酸的含量可以判断b a l s a m i c 醋陈酿的时间w 。 2 l 世纪是信息技术与分析方法技术迅猛发展的时期，随着国际间科学技术相互交流 的日益增多，各国间对食醋芳香物质的分析研究得到很快的发展，尤以欧盟国家的研究 最为多样化和新颖。2 0 0 0 年m a r i e l l ec h a r l e s 对两种红葡萄酒醋芳香物质的分析工作应 6 第一章绪论 用了溶剂冰萃取，s d e 和树脂分离等多种提取方法进行比较，结果发现能检出的物质类 别有差异，且各种物质相对含量有不同“”。欧洲研究人员还将成分分析工作与风味评定 相联系，试图以科学数据来反映醋的风味品质。其中m a r i n ac o c c h i 以羧酸为指标1 ， s i g n o r ed e l 以醇为指标采用不同数据分析方法“，各自单独完成了b a l s a m i c o 醋的指纹 图谱。 目前在样品预处理方法技术方面，固相微萃取( s p m e ) 是一种新的采样技术1 ，集 萃取、浓缩和进样于一体，一问世即引起关注，1 9 9 2 年实现了商品化、并获得了1 9 9 4 年匹兹堡分析大会发明奖，该技术已应用于水、食品、土壤中的挥发、半挥发物质和化 学有害物质的测定”“”。它通过吸附脱附技术，富集样品中的挥发和半挥发性成分， 克服了以前一些传统样品处理技术的几乎所有缺点，无需有机溶剂、成本消耗低、所需 样品量少，灵敏度高( 达p p b 级) 、重现性及线性好、操作简单方便快速并能较真实的 反映样品特别是活体样品的风味组成。使用方法有两种：一种为直接固相微萃取法 ( d i r e c t - s p m e ) ，是将纤维直接输入样品溶液中进行萃取，达到分配平衡后即可取出进行 色谱分析；另一种为顶空固相微萃取( h s s p m e ) ，此方法不是直接将纤维输入溶液中而 是在液上进行项空萃取，可避免基体干扰和提高分析速度。2 0 0 2 年r a m o nn a t c r am a n n ， r e m e d i o sc a s 订om e j t a s 和f e m a n d og a r c l ar o w e 采用h s s p m e - g c - m s 的色谱方法分析 雪利酒醋中挥发性物质，所用纤维涂层是羧酸聚二甲基硅氧烷纤维，结果显示了检测和 量化的界限和线性范围足够分析这类化合物。其回收率接近1 0 0 ，重现性小于2 0 ， 尽管如此，使用不同的纤维检测结果有很大差异，这种技术已经应用在各个品种的雪利 酒醋中。 2 0 0 5 年9 月在f o o dc h e m i s t r y 杂志上报道了利用近红外光谱法对雪利酒醋的1 4 种 质量参数进行测量，以达到生产监控，质量控制和预报生产能力目的的可行性研究，这 些参数包括总酸，不挥发性和挥发酸，有机酸，l 脯氨酸，灰分，氯化物等，对这些参 数用不同的数据预处理方法，比如直角信号修正，乘法分散修正，圆柱中心修正的方法， 最终用多变量统计方法进行分析和比较。结果表明校准模型是有效的，预报生产能力的 研究是为了检查在酒醋工业生产中这些方法的实际适用能力”1 。2 0 0 6 年e n d q t md u r d n g u e r r e r o 搅拌棒吸附萃取法( s b s e ) 分析醋中的挥发性物质，结果表明此方法简便，快 速，灵敏度高，缺点是对极性化合物的浓缩能力是有限的1 。 1 5 2 国内研究情况 我国食醋绝大多数是谷物醋，因此在成分上与欧洲果醋有较大差异。一般来说，谷 物醋酯类物质种类较少，但氨基酸和挥发性有机酸含量要大得多。过去国内在食醋分析 方面更多是利用特殊分析手段快速准确对已定性成分进行定量。 7 江南大学硕士论文 1 9 9 1 年程传格等用二氯甲烷提取，g c m s 分析了济宁香醋的香味成分“。2 0 0 2 年 陈斌，吴珏等探讨了利用近红外光谱法快速分析了食醋中的总酸，挥发酸和还原糖含量 的可行性“”2 0 0 2 年屈元雨利用卡尔曼滤波紫外光谱法测定食醋中的防腐剂。随着高 效液相色谱和毛细管气相色谱等色谱手段的广泛应用，2 0 0 4 年山西大学化学生物学与分 子工程教育部重点实验室应用气相色谱方法对山西老陈醋和其他种类醋的9 种香气成 分( 乙醛、乙酸乙酯、乙醇、乙酸丙酯、3 羟基2 丁酮、乙酸、糖醛、丙酸、2 ，3 丁二醇) 进行了定性、定量测定，并用聚类分析、模糊综合评判、方差分析、回归分析的方法对 实验结果进行了数理分析。尝试建立了山西老陈醋香气成分测定与质量评价的方法，分 析结果表明，划分为不同等级醋样的香气成分有显著的差别“”。2 0 0 5 年4 月江南大学分 析测试中心工程师刘杨岷采用顶空固相微萃取气质联用( h s s p m e c , - c m s ) 对市售四 个不同品种食醋的挥发性成分进行了比较研究，鉴定了其中的1 0 5 种成分，其中有4 8 种共有成分，主要为醇、酯、酸、呋喃类，毗嗪类等化合物，不同醋样所含的芳香性成 分的种类及其含量均存在着较大的差异性，可据此区分评价不同醋样1 。 在氨基酸分析方面，一般采用氨基酸自动分析仪，它较于液相色谱仪的柱前衍生法 测定，优点在于氨基酸不用衍生，可直接对其分离，从而避免了由于衍生所造成的测定 误差。2 0 0 4 年三峡大学化学与生命科学学院高级工程师邵伟等人以大米为原料。通过红 曲发酵、酒精发酵和醋酸发酵等步骤，对降脂醋发酵工艺条件进行了初步探索，并对所 制出的降脂醋中的氨基酸与降脂活性成分进行了测定，实验说明红曲降脂醋富含多种氨 基酸与降脂活性物质，有一定的保健功能”1 。鉴于氨基酸对食醋风味的重要影响，本文 将对恒顺香醋中的游离氨基酸进行分析研究。 1 6 本课题要达到的目的与要求 1 采用顶空固相微萃取气质联用( h s s p m e g c m s ) 分析方法，对恒顺香醋的香 气物质进行指纹图谱分析研究，为建立道地性数据库提供依据。 2 对恒顺香醋中重要的口味物质氨基酸进行分析，研究恒顺香醋生产工序各产品中 的游离氨基酸变化规律，以探究恒顺醋中游离氨基酸含量组成与变化情况。 3 对恒顺香醋中一种重要的功能性物质川芎嗪进行研究，进一步探索其生成机 理。 第三章恒顺香醋中游离氨基酸的分析 第二章恒顺香醋香气成分的气相色谱质谱指纹图谱 2 1 前言 镇江恒顺香醋是我国四大名醋之一，有着1 4 0 0 多年的历史。由于恒顺香醋独特的酿 造工艺，使之形成了特有的色、香、昧、体风格这些风格中，香是恒顺香醋优良品质 的灵魂，是最具吸引力的表征成分，因此应该作为评价恒顺香醋质量的重要指标之一。 恒顺香醋的香气成分历来受人们的重视，然而长期以来，对于香气成分的评判仅靠 人的感官对其做出整体评价。这种评价方式，尽管比较直观且容易得到消费者的认可， 但受人为因素影响很大，常因品评者不同得出不同的结果。此外，这种方式根本无法指 出香气成分的种类、含量与比例，缺乏科学依据并且难以制定统一标准，随着色谱技术 的发展和广泛应用，尤其以气相色谱质谱( c , - c m s ) 联用技术，已经具备了准确测定香 气成分的先进仪器和数量分析方法，能够对香醋这样复杂的香气成分体系进行定性、定 量及其组成结构的分析，使得建立醋香气成分的科学分析方法成为可能。 本章将采用顶空固相微萃取气质联用( h s s p m e g c m s ) 色谱技术对恒顺香醋香 气成分进行定性、定量的测定，并对实验数据进行数理分析，研究恒顺香醋的指纹图谱， 为恒顺香醋道地性标准的建立提供可靠的依据。 2 2 实验材料与方法 2 2 1 仪器与试剂： t r a c em s 气相色谱质谱仪 回流浓缩柱 电热恒温水浴锅 手动s p m e 进样器 7 51 1mc a r b o x e n p d m s 萃取头 1 5 m l 带硅橡胶垫的样品瓶 8 2 1 型磁力恒温搅拌器 美国f i n n i g a n m a t 公司 江南大学分析测试中心气相色谱实验室 美国s u p e l e o 公司 美国s u p e l c o 公司 美国s u p e l c o 公司 上海曹行无线电元件厂 二氯甲烷、无水硫酸钠、氢氧化钠等试剂均为分析纯 9 江南大学硕论文 2 2 2 实验样品 各品牌镇江香醋；醋样均由镇江恒顺集团提供 2 2 3 实验方法 2 2 3 1 样品处理 先将萃取头在气相色谱的进样口于3 0 0 老化至无杂峰，将1 0i i l l 醋样( 加入5 0 肛l l m 咖1 月桂酸甲酯内标的甲醇溶液) 放入1 5 m l 固相微萃取样品瓶中，加入2 5g 固体氯 化钠，盖上盖子。放入4 0 恒温水浴中，将s p m e 萃取头通过瓶盖插入到样品中的顶 空部分，推出纤维头，顶空吸附4 0m i n ，随后抽回纤维头，从样品瓶中拔出萃取头，再 将萃取头插入c - c - m s 仪的气相色谱进样口，推出纤维头，于2 5 0 解吸3m i l l ，抽回 纤维头后拔出萃取头，同时启动仪器采集数据。 2 2 3 2 仪器条件 色谱条件：o v - 1 7 0 1 毛细管色谱柱，柱长3 0m ，内径o 2 5t o n i ，液膜厚度o 2 5i i m ，载气h e ，流量0 8m l m i n ，不分流，进样口温度2 5 0 1 2 ，柱温：起始温度3 2 ， 以5 m i n 升温至1 8 0 ，再以1 2 1 2 m i n 升温至2 4 0 ，保持5 m i n 。 质谱条件：接口温度2 5 0 ，离子源温度2 0 0 ，电离方式e l + ，电子能量7 0e v ， 扫描质量范围3 3 4 5 0a i n u 。 2 2 3 3 数据检索 检索谱库为w i l l e y 谱库和n i s t 谱库，检测出的挥发性成分匹配度大于8 0 0 的化 合物，其最高匹配度为1 0 0 0 。 2 3 实验结果与讨论 2 3 1h s - s p m e g c - m s 方法的评价 2 3 1 1 顶空固相微萃取法与二氯甲烷冰浴萃取法的比较 醋的香气成分非常复杂，在g c m s 分析前，通常要采取一定的预处理。常规的方 法是利用相似相溶原理，采用有机溶剂把物质中的香气成分萃取出来，然后再进行分析。 对于醋中香气成分的分析，本实验室就曾采用二氯甲烷冰浴萃取法来进行预处理，基本 流程如下： 1 0 第三章恒顺香醋中游离氨基酸的分析 醋样1 0 0 m l ，n a 0 h 调p h5 1 - 抽滤- - - - - - i p 加二氯甲 烷3 0 m 】冰浴萃取1h 分液收集有机相回流 浓缩至1 5 m 1 啼加入无水硫酸钠，待测 此过程所需时间大约要2h 左右，要有一定的样品量，且操作比较繁琐。故考虑采 用新型的顶空固相微萃取法来对样品预处理。 固相微萃取( s p m e ) 采用涂附不同化合物的微型熔融石英萃取纤维吸附水溶液中或 者气体中的微量有机化合物，再结合色谱技术将被吸附物质脱附进行鉴定。s p m e 法不 是将待测物全部分离出来，而是通过样品与固相涂层之间的平衡来达到分离目的。此方 法不仅节约时间，对样品量要求不高( 如醋样1 0m l 左右) ，而且操作简便。 从萃取效果来比较两种方法，图2 1 是用两种不同的萃取方法对同一醋样品进行预 处理后的总离子流图。 一 n 正一。 i)(” 图2 1 不同萃取方法的总离子流图 f i g 2 1t h et o t a li o nc b r o m a t o g r s m sc r l c ) w i t hd i f f e r e n te x t r a c t i o nm e t h o d s ( a ) d i c h l o r o m e t h a n ee x t r a c t i o n ；c o ) s m f e 表2 1 不同萃取方法的g c - m s 检测结果 t i b 2 1t h er e s u l t so f g c - m sd e t e c t i o nw i t hd i f f e r e n te x t r t a c t i o nm e t h o d s 根据总离子流图，g c m s 检测结果如上表2 1 ： 从上表可以明显的看出s p m e 法比二氯甲烷冰浴萃取法的效果要好。前者检测到的 总组分比后者高出4 0 ，特别是酸类物质，能多出近3 倍的组分。可见s p m e 法在全 面分析物质中的香气成分上有绝对的优势。 无论从操作还是最终的结果，都显示引用s p m e 法到醋的香气成分的分析上来是一 种非常有效的尝试。但同时必须考虑到萃取头的使用寿命短( 一般约为4 0 1 0 0 次) ，价 格比较昂贵。 江南大学硕士论文 2 3 1 2h s - s