（水产养殖专业论文）湛江港养殖海域异养细菌、弧菌及水质因子动态变化的研究.pdf

湛江港养殖海域异养细菌、弧菌及水质因子 动态变化的研究 摘要 本论文于2 0 0 5 年4 月2 0 0 6 年3 月首次对湛江港麻斜、特呈、南三网箱养 殖海区水体中异养细菌和弧菌的数量变化进行了周年调查，并探讨了其与部分环 境因子的关系，以期为养殖海区鱼类疾病防治提供有价值的参考依据。 弧菌和异养细菌均有明显季节性变化，夏季细菌数量最多，冬季细菌数量最 少，异养细菌和弧菌的数量变化规律并不同步，异养细菌峰值要较弧菌峰值柬得 早，但南三养殖海区异养细菌除外。对于同一采样点，同期细菌数量高低为：网 箱内 网箱外 邻近非养殖海区。 网箱内异养细菌峰值期一般出现在6 月份，最高可达1 2 3 1 0 5c f u ( c o l o n y f o r m i n gu n i t s ) m l ；而最低值一般出现在2 月份左右，最低可至3 0 3 1 0 3 c f u m l 。网箱内弧菌峰值期一般出现在6 8 月份，最高值可达2 3 1 1 0 4 c f u m l ；最低值一般出现在1 2 月份，最低仅为5 o 1 0 c f u m l 。 弧菌和异养细菌的数量与水温变化存在显著相关性，而与d h 、盐度、无机 磷( p 0 4 一一p ) 、氨氮o i h 4 + - n ) 有着部分相关性，与水体中溶氧( d o ) 、碱度( a l k ) 、化 学需氧量( c o d ) 、亚硝酸盐氮( n 0 2 - n ) 不存在相关性。 利用普通生理生化方法以及p c r 方法对随机筛选的5 株弧菌进行了鉴定， z h 2 0 0 5 0 1 、z h 2 0 0 5 0 2 和z h 2 0 0 5 0 5 为哈维氏弧菌( v i b r i oh a r v e y i ) ，z h 2 0 0 5 0 3 为副溶血弧菌( v i b r i op a r a h a e m o l y t i c u s ) ，z h 2 0 0 5 0 4 为美人鱼发光杆菌 ( p h o t o b a c t e r i u m d a m s e l a e ) ，在所鉴定的弧菌中，哈维氏弧菌居多，占6 0 。 关键词：湛江港， 异养细菌，弧菌，水质因予 t h ec h a n g eo fh e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a ，v i b r i oa n dt h e w a t e r q u a l i t yf a c t o r si nt h em a r i n ea q u a c u l t u r e d i s t r i c tn e a rz h a n j i a n gh a r b o r a b s t r a c t t h ea n n u a li n v e s t i g a t i o ni nt h en u m b e ro fv i b r i oa n dh e t e r o t r o p h i cb a c t e r i a , a n d w a t e rq u a l i t yf a c t o r si n s i d ea n do u t s i d et h em a r i c u l t u r e dc a g e sn e a rz h a n j i a n gh a r b o r w e a ec a r r i e do u tf r o ma p r i l ，2 0 0 5t om a r c h ，2 0 0 6 ，a n dt h er e l a t i o n s h i pb e t 、e e nt h e n u m b e ro ft h eb a c t e r i aa n dw a t e rq u a l i t yf a c t o r sw e r ee v a l u a t e d t h e s er e s u l t sw i l l p r o v i d et h ev a l u a b l ei n f o r m a t i o nf o r t h ep r e v e n t i o no f m a r i c u l t u r e df i s hd i s e a s e s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew e r es i g n i f i c a n ts e a s o n a lc h a n g e si n t h en u m b e ro fv i b r i oa n dh e t e r o t r o p h i cb a c t e r i a , w h i c hr e a c h e dt h eh i 曲e s tl e v e li n s u n l l n e q w h i l et h el o w e s ti nw i n t e r b u tc h a n g e si nt h en u m b e ro fv i b r i oa n d h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i ad i dn o ts y n c h r o n i z e ，t h em a x i m u ml e v e lo fh e t e r o t r o p h i c b a c t e r i ao c c u r r e dm u c he a r l i e rt h a nt h a to fv i b r i o ，e x c e p ti nn a n s a nm a r i c u l t u r e d d i s t r i c t a tt h es a n l es a m p l es i t e ，t h en u m b e ro fb a c t e r i aa tt h es a n l et i m es h o w e d ： i n s i d et h ec a g e o u t s i d ec a g e n o nm a r i c u l t u r e dd i s t r i c t t h em a x i m u ml e v e lo fh e t e r o t r o p h i cb a c t e r i ai n s i d et h ec a g eo c c u r r e di nj u n e w h i c hc o u l dr e a c h1 2 3 1 0 c f u m l a n dt h em i n i m u mc o u l dr e a c h3 0 3 1 0 3 c f u m li n f e b r u a r y a n dt h eh i 曲e s tn u m b e ro fv i b r i o ，2 31 1 0 4c f u m l ， a p p e a r e db e t w e e nj u n ea n da u g u s t , t h el o w e s to f5 0 x 1 0c f u m ld i db e t w e e n j a n u a r ya n df e b r u a r y t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nb a c t e r i aa n dw a t e rq u a l i t yf a c t o r ss h o w e dt h a tt h e r e w e r eo b v i o u sc o r r e l a t i o n sb e t w e e nw a t e rt e m p e r a t u r ea n dc h a n g e si nt h en u m b e ro f h e t e r o t r o p h i cb a c t e r i aa n dv i b r i o ，t h ep a r d a lc o r r e l a t i o n sb e t w e e nt h en u m b e ro ft h e b a c t e r i aa n dp h ，s a l i n i t y , p 0 4 一- p , n h 4 + - ne x i s t e d ，b u tn oc o r r e l a t i o n sb e t w e e nt h e a m o u n to f b a c t e r i aa n dt h ed o ，a l k ，c o da n dn 0 2 一- n f i v es t r a i n so fv i b r i o s ，z h 2 0 0 5 0 1 一z h 2 0 0 5 0 5 ，w h i c hw e r er a n d o m l ys c r e e n e d f r o mv i b r i o si s o l a t e df r o mm a r i c u l t u r e dd i s t r i c tw e r ei d e n t i f i e db yc o m m o n p h y s i c a l ， b i o c h e m i c a lm e t h o da n dp c rt e c h n i q u e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t z h 2 0 0 5 0 1 ， i i z h 2 0 0 5 0 2a n dz h 2 0 0 5 0 5w e r el i b r i o h a r v e y i ，z h 2 0 0 5 0 3a n dz h 2 0 0 5 0 4w e r e t b r i op a r a h a e m o l y t i c u sa n dp h o t o b a c t e r i u md a m s e l a er e s p e c t i v e l y , t h er a t i oo f v b r oh a r v e y ia m o n gv i b r i o si d e n t i f i e dw a s h i g h e s t ，a c c o u n t i n gf o r6 0 k e yw o r d s ：z h a n j i a n gh a r b o r ，h e t e r o t r o p h i cb a c t e r i a ，v i b r i o ，w a t e rq u a l i t yf a c t o r l l i 广东海洋大学 学位论文独创性及知识产权声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得本校或其它教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 本学位论文成果归广东海洋大学所有。 研究生签名：喝恕羁 御6 年6 月修同 劳撕 缸 月 到 6 师 年 教 6 导 口 指 v 广东海洋硕士学位论文 1 1 海水养殖现状概述 第一章前言 我国是- 一个海洋资源丰富的国家。海洋覆盖着地球表面积的7 1 ，占地球总水量 的9 7 。海洋生物资源丰富、种类繁多，大约有2 0 多万种生物生活在海洋中，为人 类提供了种类繁多、分子结构新颖、化学组成复杂和生理活性特异的海洋天然产品， 它是药物、保健食品和生物材料的巨大宝库，浩瀚的海洋曾被誉为生命的摇篮“3 。近 十多年来随着国家对海洋开发的重视逐渐提高，海洋应用前景愈发广阔。海水网箱养 殖更是成为开发海洋的排头兵，在沿海省份开展得如火如荼，成为渔业经济的一支主 力军。养殖品种日渐丰富，8 0 年代只涉及石斑鱼、真鲷、黑鲷等少数几个经济鱼种， 进入9 0 年代以后，网箱养殖的品种迅增至2 0 多个，其中主要有大黄鱼、鲈鱼、真鲷、 美国红鱼、尖吻鲈、斜带髭鲷、花尾胡椒鲷，红笛鲷、高体瓣、卵形鲳黪、军曹鱼 等种。 海水养殖的开发带来了丰厚的经济效益，同时由于养殖面积过大，养殖密度过高， 养殖技术的粗放，使得海区水质污染日趋严重，继而恶化养殖环境，使得养殖动物疾 病渐增，爆发性疾病频率逐渐增高，相应又制约了养殖业的发展。 1 2 鱼类细菌性疾病 在海水养殖鱼类的病害中，细菌性疾病为常见病，且为危害性较大的疾病”3 ，其 中弧菌引起的细菌性疾病又是一种最常见的细菌性疾病，水产动物的弧菌病( v i b r i o s i s ) 是一种流行范围广，危害严重的传染性疾病。据报道，由致病性弧菌引起的疾病可危 害野生和人工养殖的鱼类、甲壳类和瓣鳃类等多种水生动物”1 ，能对水产养殖业造 成巨大的经济损失。因此，对水产动物弧菌病的研究一直受到国内、外研究者的重视， 也是海、淡水养殖动物病害的主要研究对象之一。 1 2 1 鱼类弧菌病 弧菌是海洋环境中最常见的细菌类群之一，广泛分布于近岸、河口海区的海水和 生物体中，其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素的影响较大，是一 类条件致病菌。弧菌病是最早发现的鱼类细菌性疾病之一，早在1 7 1 8 年，意大利就有 人从养殖的欧洲鳗鲡( a n g u i l l a a n g u i l l a ) 中发现了弧菌病，当时这种致病菌被命名为 湛江港养殖海域异养细菌、弧菌及水质因子动态变化的研究 鳗杆菌( b a c i l l u sa n g u i l l a ) ( c o n e s t r i n i ，1 8 9 3 ) ，1 9 0 9 年，b e r g m a n 再次从患病欧洲鳗鲡 中分离到致病性弧菌，在对其进行了比较详细理化特性签定后，将其更名为鳗弧菌 ( v i b r i oa n g u i l l a r u m ) 。从此对病原性弧菌的研究成为研究水生动物病原菌的热点。迄 今为止，作为病原菌分离报道的致病性弧菌己达数十种之多，迄今作为海水养嫡动 物弧菌病病原菌已被报道过的有2 0 多种，表1 1 列出了一些危害海水鱼类的致病性弧 菌，弧菌危害的对象包括香鱼( p l e c o g l o s s u sa l t i v e l i s ) 、隆颈愈额鲷( s p a r u sa u n a t a ) 、鳗 鲡似n g u i l l a j a p o n i c a ) 、鲨鱼( c a r c h a r h i n u s p l u m b e u s ) 、鲑鳟鱼( s a l m o n i d a e ) 、鳕鱼( c i l i a t a 踞) 、真鲷( p a g r o s o m u sm a j o r ) 、梭鱼i z ah a e m a t o c h e i l a ) 、石斑鱼( e p i n e p h e l u ss p ) 、 东方纯( f u g us p ) 、牙鲆( p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) 、鲈鱼( l a t e o l a b r a x j a p o n i c u s ) 、大黄鱼 ( p s e u d o s i c a e n ac r o c e a ) 、大菱鲆( s c o p h t h a l m u sm a x i m u s ) 、高体蛳( s e r i o l ad u m e r i l l ) 、平 鲷( r h a b d o s a r g u ss a r b a ) 、尖吻鲈( l a t e s c a l c a r i f e r ) 等鱼类，对虾、蟹、贝类也要危害”。 因此，该类疾病一直备受国内外水产工作者的关注，是海水养殖动物病害的主要研究 领域之一。 表1 1 鱼类致病弧菌及其危害对象 t a b l e l1 - 1 p a t h o g e n i cv i b r i oa n d i t sh o s tr a n g e 致病菌危害对象 致病菌危害对象 p a t h o g e n h o s tr a n g e p a t h o g e n h o s tr a n g e 鳗弧菌 鱼类、对虾、贝类 副溶血弧菌 鱼类、贝类、对虾 k a n g u i l l a r u m 。一 。 v p a r a h a e m o l y t i c u s 。 ，掣粤篓菌 鱼类、贝类、对虾 溶藻弧菌 鱼类、贝类、对虾 矿v 劬所c w 。 k a l g i n o l y t i c u s 笆篓氏弧菌 海水鱼类 产鱼竺 鱼类、贝类、对虾 矿h a r v e y i 苎4 1 罂菌 海水鱼类堂产霉菌鱼类、贝类 p m t t t t c z 盯 河流弧菌 海水鱼类、蟹类 霍乱弧菌 香鱼 e t l u v i a l i s 。一。 k c h o l e r a e 病海鱼吧挚 海水鱼类 拟态弧菌 真鲷 k o r d a 胁 。 尊誊鱼弧菌 竹荚鱼 病海鱼弧菌 海水鱼类 矿t r o c h u r i k o r d a 疗 。 ，导肠道弧菌 比目鱼 美人鱼弧菌 海水鱼类、对虾 矿i c h t h y o e n t e r i k d c o n s e l a 。 杀蛙弧菌海水鱼类堂挚弧菌 海水鱼类 k s a l m o n 衄i d n 广东海洋硕士学位论文 1 2 2 弧菌检测 1 2 2 1 传统检测方法 对于弧菌的检测，传统的方法为分离细菌后观测形态并进行选择性培养筛选，同 时进行生理生化鉴定以及病理分析。生理生化鉴定是近1 0 0 年来进行微生物分类的传 统方法，其特点是利用细胞体上随机和非系统观察的试验结果，参见伯杰氏细菌鉴 定手册检索表，查出待检菌株的学名与分类归属。 1 2 2 2 自动鉴定方法 利用生理生化方法准确鉴定必须进行多项理化指标的测定才能完成，繁琐而且受 各方面条件制约。从2 0 世纪7 0 年代起，国外开始试行成套的标准化鉴定系统和与之相 结合的计算机辅助鉴定系统，使细菌鉴定日益朝着简便化、标准化和自动化的方向发 展。目前国内外有多种不同的多项目检测系统如e n t e r 0 1 1 j b e 系统、m i n i t e k 系统、 b i o l o g 系统、m i c r o s c a n 系统、a u t o s c e p t o r 系统、e 1 5 系统以及a p i 系列产 品等。 1 2 2 3 荧光抗体技术 荧光抗体技术是根据抗原抗体反应的高特异性，以荧光素作为标记物、与已知的 抗体结合作为标准试剂，通过在荧光显微镜下观察抗原抗体复合物及其存在位置来鉴 定抗原的存在。该技术快速简便，而且测定混合感染的检出率和准确率很高，尤其对 于早期无症状的感染，检出率远远高出细菌培养法。余俊红等o ”利用间接荧光抗体技 术，不仅可以检测感染鳗弧菌的发病花鲈，还可检测带菌状态的未发病花鲈。王军等 。”建立了大黄鱼病原菌溶藻弧菌的间接荧光抗体检测方法，现场检测结果显示，该方 法对具有典型症状的发病大黄鱼的病原检出率为1 0 0 ，表观健康大黄鱼病原检出率 为3 0 ，养殖海水检测结果为阴性，表明所建立的检测方法不仅可以用于已感染的发 病大黄鱼的快速检测，而且可以用于检测已隐性感染的大黄鱼。 1 2 2 4 免疫酶技术 免疫酶技术是将抗原抗体的特异性反应与酶的高效催化反应有机地结合起来，通 过酶降解底物呈现的颜色反应来指示特异性抗体的存在，根据反应颜色的深浅指示抗 原量的多少。该方法敏感性高，特异性强，既可定位定性，又可定量，是一种非常有 效的检测方法。在多种免疫酶技术中，以间接e l i s a 、双抗体e l i s a 以及d o t e l i s a 法最为常用。国岁 应用e l i s a 法对鱼类细菌性疾病快速诊断的报道较多，如弧菌病、 疖疮病、红嘴病、细菌性肾脏病及爱德华氏菌病等1 。国内也有相应的报道，鄢庆枇 等1 进行溶藻弧菌的e l i s a 快速检测方法研究，以甲醛灭活方法获得菌苗，通过免疫 3 湛江港养殖海域异养细菌、弧菌及水质因子动态变化的研究 动物获得抗血清，该抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等1 0 株对照菌株无交叉 反应，对溶藻弧菌的最低检测极限可以达到9 7 x 1 0 4c f u m l 。余俊红等“用问接 e l i s a 技术快速检测出花鲈的病原菌，阳性检出率为7 6 1 ，若制各成快速检测试剂 盒，必将在水产养殖大量样品的检测中发挥重要作用。 1 2 2 5p c r ( 聚合酶链反应) 技术 p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 技术已应用于诊断隐性疾病，检测临床标本病原体 及法医遗传鉴定，也被用于水生动物疾病病原的诊断。从病灶组织提取病原菌的d n a 作为模板，选用针对性引物通过p c r 扩增，得到目的片段，测序后直接可以进行计算 机检索比对，得出其与己知相似菌的同源性，从而达到鉴定目的。此种方法非常灵敏， 只需l m g 病灶组织含有l o 个病原菌就可以检测出来，这种技术将在细菌性鱼病的珍断 上具有十分广阔的应用前景。 1 - 2 2 6 其它检测技术 目前还有血清学技术、单克隆抗体技术、核酸杂交等技术用于各种弧菌的检测， 为快速、准确、灵敏地检测病原菌提供了十分有效的方法，可以准确地将病原鉴定到 种、甚至亚种的水平。 1 2 3 弧菌性疾病防治 1 2 3 1 药物防治 目前，控制水产动物弧菌病的主要手段是抗菌药物治疗。通过磺胺类、呋哺类、 抗生素类以及中草药等各种抗菌药物的研究表明，在弧菌的抑制和弧菌病的治疗方面 均有一定的效果0 7 ”。但大多数报道仅局限于对病原菌的药敏试验，很少有进一步的 研究，而且，药物的作用仅仅在于控制病原体这个环节上，而对鱼体抗病力的改善及 环境调节方面的作用非常有限。 1 2 3 2 免疫防治 除了运用抗菌药物外，近年来，免疫防治方法在病害防治中的应用已只益广泛。 利用疫苗、免疫、激活剂等活化或加强动物自身的特异性免疫和非特异性免疫功能， 提高抗病能力，被公认为是目前防治病害最为有效的途径之一。通过口服、浸泡、注 射、喷雾等方式接种弧菌疫苗对鱼虾均能起到较好的保护。3 。”1 。注射过左旋咪唑 ( o n c o r h y m c h u s m y k i s s ) “”或福氏完全佐剂( f c a ) 的虹鳟“2 1 ，注射壳多糖后的虹鳟“， 注射或e l 服酵母葡聚糖后的大西洋鲑“”3 对某些弧菌的抵抗能力均得到一定增强。同 时肽葡聚糖也能增强虹鳟抗弧菌感染能力“，v c 可提高虹鳟对鳗弧菌、大西洋鲑对 杀鲑弧菌感染的抵抗力“。虹鳟注射生长激素( g h ) 或口服转铁蛋白都可大大增强对 4 广东海洋硕士学位论文 鳗弧菌的抵抗力。 1 2 3 3 生态防治 利用生态防治方法来控制水产动物弧菌病，其原理是根据同一生态系统中的不同 微生物之间的相互作用和生物间的营养竞争等方式，如一些细菌和其他微生物可在环 境中分泌抗生素，能很快杀死其他微生物；有的细菌则产生细菌素，杀死与其亲缘关 系相近的种；也有的在微生态系统中通过营养竞争来抑制致病性弧菌的大量繁殖，达 到防治弧菌病的目的。如报道有光合细菌呻1 、蛭弧菌( b d e l l o v i b r i o ) “、噬菌体5 “、 拮抗菌”1 等均在某些弧菌的抑制作用中起到一定的作用。 1 。3 细菌与环境研究 1 3 1 研究意义 鱼类疾病已经成为制约着水产养殖业进一步发展的重要障碍，海水养殖鱼病的防 治更因其水体的复杂性和多变性，使得治疗效果不甚理想，目前疾病治疗主要以预防 为主，要达到预防的目的首先就要了解疾病发生途径和流行趋势。至今已报道的的海 水鱼病研究多以病原研究和增强鱼体自身抵抗力为主，关于环境与鱼病关系的研究不 甚突出。 海水组成复杂，其中各种环境因子相互影响制约，水体中细菌波动也受到各方面 的影响，因此研究水体中细菌数量波动及其与环境因子的相关性对预防海水养殖疾病 揭示疾病流行规律都具有重大的意义。 1 3 2 研究对象 目前研究细菌动态主要以异养细菌和弧菌数量波动为主，因为部分弧菌为海水鱼 类条件致病菌，而异养细菌是异养微生物的主要组成部分，异养微生物又为微食物环 ( m i c r o b i a l f o o d l o o p ) 的主要推动者。微食物环概念由a z a m l 9 8 3 年提出，指异养微生物 吸收溶解有机质( d o m ) 转化为颗粒有机质( p o i v i ) ，即细菌自身的生物量，后者又被食 细菌的所i 胃m i e r og r a z e r ( 主要是原生动物鞭毛虫和纤毛虫) 所利用，转化为更大的颗粒 ( 几个到几十个微米) ，最后进入后生动物的食物链3 。因此异养细菌在海洋生态系的 能量转换和物质循环中占有特殊的生态位置，它能将生物排泄物、生物尸体和残饵等 有机物降解或分解成无机物，从中获取自身生长繁殖的能量，而其本身又是生态系统 的营养源。同时有些异养细菌也为条件致病菌，在养殖水域生态环境恶化时，亦可使 养殖生物致病。因此，研究对水体中的异养细菌和弧菌的数量，及其与生态系中的其 它生物、非生物环境因子的关系，对于养殖动物疾病防治和生态调控有着重要的意义。 e 湛江港养殖海域异养细菌、弧菌及水质因子动态变化的研究 1 3 3 细菌与养殖动物疾病关系 倪纯治“”( 1 9 9 5 ) 、林美兰1 ( 1 9 9 8 ) 对对虾养殖池水研究认为水体弧菌数量与 总细菌量的比值越高，病害发生的可能性越大。于占国”“( 1 9 9 5 ) 、黄美珍”“。( 1 9 9 7 ) 在对虾养殖海水研究中也认为弧菌为虾池中优势菌属，可作为有机污染指示菌，其数 量和对虾发病有一定关系。李华等。”( 2 0 0 2 ) 在河蟹育苗水体细菌研究中发现水中细 菌繁殖速度快，细菌属的组成较简单，弧茵属为优势属，其出现频次占4 5 。研究均 表明了异养细菌特别是弧菌的变化与水产动物疾病的发生存在着一定的联系。 1 3 4 细菌与水质因子关系 王国良等“4 “( 2 0 0 0 年) 对海水网箱养殖鲈鱼皮肤溃疡病进行了系统的流行病学 研究，特别是对养殖海区异养细菌和弧菌的数量动态进行了调查分析，指出异养细菌 和弧菌的数量变化呈季节波动性，同海水温度的变化密切相关。 在对对虾养殖池水的研究中，王文兴( 1 9 8 3 ) 、高尚德( 1 9 9 4 ) 、郭平( 1 9 9 4 ) 4 ”和予占国( 1 9 9 5 ) 都认为水体中细菌数量呈显著季节性变化。而林美兰等( 1 9 9 8 ) 5 “则得出结论为并不显著。得出不同结果可能与养殖情况的不同有关。 刘文华( 1 9 9 6 ) ”、a n g e l o d ( 1 9 9 0 ) ”、k a t h r e e n r o ( 1 9 9 2 ) 1 在对牡蛎养殖 区海水研究中都得出水温对于海洋环境中弧菌数量的变化是很重要的决定因素。而且 郭平等( 1 9 9 4 ) ”也认为对虾养殖池水中异养菌和弧菌的数量变化与水温的变化趋势 相同。 黄美珍( 1 9 9 7 ) ”在研究中得出对虾养殖池中异养细菌的数量与水温成正相关， 弧菌的数量与氨氮、化学耗氧量和营养状态指数成正相关，同时二者的总数与盐度呈 负相关。焦俊鹏等( 2 0 0 0 ) 在研究异养细菌与环境因子的相关分析中表明粪大肠肝 菌和异养细菌除均与水温、盐度相关较高外，前者还与无机磷呈现数量上的相关性。 钟硕良等( 1 9 9 7 ) ”3 认为虾池底质中n h 4 + - n 、s 2 - 含量和异养细菌数基本成正相关。 李华等( 2 0 0 2 ) ”3 认为异养细菌的数量与c o d 和总氨氮含量呈正相关，与p h 值呈 负相关。而倪纯治( 1 9 9 5 ) ”“、林美兰( 1 9 9 8 ) ”1 对弧菌数和环境因子进行过相关 和回归分析，认为他们不存在相关性。造成这种结果的差异也可能与养殖的具体情况 不同有关。以上的研究均表明细菌与水质因子可能存在着一定的联系。 上述文献表明，迄今为止，对对虾养殖池和贝类养殖海区的细菌生态研究较多， 尤其是对对虾养殖池的研究较多，对海水鱼类养殖海区细菌动态研究相对较少。对海 水水体，特别是养殖海区细菌的数量波动和环境影响还需做更加深入和持久的研究。 6 广东海洋硕士学位论文 1 4 本实验的研究目的和意义 近年来，湛江市大力发展海水网箱养鱼，以及沿岸池塘养虾等，使湛江港水产养 殖区海水富营养化超标，污染日趋严重，多次发生鱼、虾类暴发性疾病，给养殖业造 成巨大经济损失。而且由于疾病爆发，各种药物的过量使用，进一步恶化水体环境。 因此调查分析海区细菌和环境因子具有重要意义”。 本研究希望通过对湛江港的三个主要海水鱼类养殖海区( 麻斜养殖海区、特呈养 殖海区和南三养殖海区) 网箱内、外和邻近非养殖海区的海水进行定点、定期的分析， 同时测定各种环境因子，以期能找出细菌与鱼病，细菌同环境因子间的关系，为鱼类 疾病预防和研究提供借鉴资料。 7 湛江港养殖海域异养细菌、弧菌及水质因子动态变化的研究 第二章异养细菌和弧菌的数量检测 2 1 材料与方法 2 1 1 样品采集 本次研究选用了三个点，分别是麻斜海区渔排( m ) ，特呈海区渔排( t ) ，南山海 区渔排( n ) 。( 见图2 - 1 ) f ! ) 一，j ) 图2 一l 采样站点示意图 f i g 2 1t h es k e t c hm a po ft h es a m p l i n gs t a t i o n ( m ：麻斜养殖海区渔排；t ：特呈养殖海区渔排；n ：南三养殖海区渔排) 采样时间为2 0 0 5 年4 月至2 0 0 6 年3 月，时间跨度为1 年。采样频度为每月1 次，其中麻斜海区计划采样频度为每月2 次，但受季节、天气等一些客观因素影响， 只有8 个月达到每月2 次的频度，其中2 0 0 5 年4 、5 月和2 0 0 6 年1 、3 月均只采样一 次，因此特呈海区和南三海区采样次数为1 2 次，麻斜海区采样次数为2 0 次。 于每个站位网箱内外及邻近非养殖海区三点，分别定时定点使用有机采水容器于 水面下1 5 m 采取水样，然后将水样品冰袋保存，并于2 小时内带回实验室处理分析。 广东海洋硕士学位论文 2 1 2 培养基 异养细菌培养使用2 2 t 6 e 海水细菌培养基，成分为：蛋白胨5 9 ，酵母膏l g ，磷 酸高铁0 1 9 ，琼脂1 6 2 0 9 ，陈海水1 0 0 0 m l ；加热溶解后用氢氧化钠溶液( 1 6 0 9 l ) 调节p h 至7 6 7 8 ；然后置高压蒸气灭菌锅中在1 2 1 。c ( 约1 0 5 k p a ) 下灭菌2 0 m i n ； 最后取出倒平皿( 直径l o c m ) ，包扎备用。 弧菌培养采用t c b s 成品培养基( 北京陆桥公司) 。 2 1 3 水样处理 2 1 3 1 分散细胞 依水样量，按照t o o m l 水样加l m l 吐温溶液，充分摇匀，使样品中细菌细胞分散 成单一细胞。 2 1 3 2 稀释水样 对水样作梯度稀释，先无菌操作法吸取2 5 e l 水样注入盛有2 2 5 m l 灭菌陈海水的 容量瓶( 2 5 0 m l ) 中，充分混匀：再以相同的方法从混匀的溶液中取l i i l l 稀释液注入 盛有9 m l 灭菌陈海水的离心管( 1 5 m l ) 中，充分混匀，然后依次于离心管中以相同方 法连续稀释至所需稀释度( 倍数) 。稀释度依水样含菌量而定，以每平皿的菌落数在 3 0 3 0 0 个之间为宜。选取2 3 个稀释度，每个稀释度作3 个平行。 2 1 4 细菌培养、计数 2 1 4 1 涂平皿 取稀释好的水样0 1 l l ，滴入平板，用灭菌的玻璃涂布棒将菌液涂布均匀，水平 静置2 0 3 0 m i n ，使菌液渗入培养基。 2 1 4 2 培养 最后将涂布好的平皿转入恒温培养箱内培养，异养细菌于2 8 培养7 d ，弧菌培 养4 8 h ，然后取出计数菌落。 2 1 4 3 菌落计数，计数遵照下面规则( 海洋监测规范h y t0 0 3 9 - 9 1 ) ” 当平皿上出现较大片菌苔时，则不应计数。 选择菌落在3 0 3 0 0 个之间的平皿，以平均菌落数乘其稀释倍数，即为该水样 的细菌数。 若有两种稀释度的平均菌落数均在3 0 3 0 0 个之间，则应按两者菌落菌落数之 9 湛江港养殖海域异养细菌、弧菌及水质因子动态变化的研究 比值决定，当比值小于2 时，取两者的平均数，若大于2 时，取其较少的菌落数。 若所有稀释度中各不同稀释度的平均菌落数均大于3 0 0 ，则以稀释度最高的( 浓 度最低) 平均菌落数乘其稀释倍数。 若所有稀释度中各不同稀释度的平均菌落数均小于3 0 ，则以稀释度最低的( 浓 度最高) 平均菌落数乘其稀释倍数。 若所有稀释度都没有长出菌落，同时也没有检出抑制物，则报告小于l 乘其最 低稀释倍数。 2 3 结果 2 3 1 麻斜养殖海区异养细菌和弧菌变化 2 3 1 1 异养细菌的数量及其变化 图2 - 2 显示麻斜养殖海区网箱内外和对照海区( 即邻近非养殖海区) 的异养细菌 数量的周年变化分布。网箱内异养细菌数量从4 月份开始就逐渐上升，到6 月，达到 周年最高值，为5 6 1x 1 0 4 c f u m l ，之后数量急剧减少，但7 月出现反弹，出现一个 次高峰，为3 6 7 x 1 0 4c f u m l ，随后数量一直呈减少趋势，但1 1 月，有一个小峰值， 为2 6 3 x 1 0 4c f u m l ，之后在2 月出现周年内最低值，为3 0 3 x 1 0 3c f u m l ，比最高 值相差1 个数量级：网箱外异养细菌数量变化趋势与网箱内大致相同，最高为4 6 0 x 1 0 4 c f u m l ，最低为6 o o x l 0 2c f u m l ，相差2 个数量级；邻近非养殖海区异养细菌数 量周年变化与网箱内外也相似，但变化幅度相对缓和，范围为5 5 3 x 1 0 2c f u m l 2 5 2 x 1 0 4 c f u m l 。同期异养细菌数量高低为：网箱内 网箱外 邻近非养殖海区。 6 0 0 0 名5 0 o o 窘4 0 0 0 更3 0 0 0 删2 0 0 0 赫 捆1 0 0 0 最 o 0 0 456789 1 01 11 2123 月 图2 - 2 麻斜养殖海区异养细菌数量波动 f i g 2 2v a r i a t i o no f h e t e r o t r o p h i cb a c t e r i ao f m a r i e 广东海洋硕士学位论文 2 3 1 2 弧菌的数量及其变化 麻斜养殖海区网箱内外和对照海区的弧菌数量的周年变化分布见图2 3 ，网箱内 弧菌数量从5 月份开始增加，到8 月份达到周年最高值，为1 4 1 1 0 4c f u m l ，之后 数量急剧减少，到1 0 月份为2 8 3 x 1 0 2c f u m l ，在1 1 月份出现了一个次高峰，为 6 3 1 0 3c f u m l ，随后又急剧下降到1 月份的5 1 0 1c f u m l ，为周年的最低值，最 低值同最高值之间相差3 个数量级，变化幅度较大；网箱外弧菌数量变化趋势大致相 同，最高值在8 月，为7 5 3 x 1 0 3c f u m l ，最低值在2 月，为7 8 l o c f u m l ，最高 值和最低值之间相差2 个数量级；邻近非养殖海区弧菌数量周年变化与网箱内外相 似，范围为4 0 x 1 0 c f u m l 4 2 7 x 1 0 3c f u m l ，从1 0 月份开始，一直到3 月份的 变化均较平稳。同期弧菌数量高低为：网箱内 网箱外 邻近非养殖海区。 网箱内 网箱外 对照海区 4567891 01 11 2123 月 图2 3 麻斜养殖海区弧菌数量波动 f i g 2 - 3v a r i a t i o no f v i b r i ob a c t e r i ao f m a x i e 2 3 2 特呈养殖海区异养细菌和弧菌变化 2 3 2 1 异养细菌的数量及其变化 特里海区异养细菌数量的周年变化分布见图2 - 4 。网箱内异养细菌数量从4 月份 开始就逐渐上升，到6 月份，达到周年最高值，为1 2 3 x 1 0 5c f u m l ，之后数量逐渐 减少，从l o 月份，数量相对稳定在3 7 7 x 1 0 3 1 4 3 x 1 0 4c f u m l 之间，在2 月份出 现周年内最低值，为3 7 7 x 1 0 3c f u m l ，之后3 月份开始又呈上升趋势，最低值同最 高值之间相差2 个数量级；网箱外异养细菌数量变化趋势大致相同，最高值在6 月， 为1 0 4 x 1 0 5c f u m l ，最低值在2 月，为2 8 7 x 1 0 3c f u 珈_ l ，相差2 个数量级；邻近 非养殖海区异养细菌数量变化幅度相对缓和，周年变化趋势与网箱内外稍有不同，但 6 4 2 o 8 6 4 2 o _【ndg。o_【v蚓搽褪恳 湛江港养殖海域异养细菌、弧菌及水质因子动态变化的研究 周年细菌高峰期和菌数低值期范围基本相同，周年变化范围为6 5 0 1 0 3c f u m l 4 5 2 x 1 0 4c f u m l 。同期异养细菌数量高低为：网箱内 网箱外 邻近非养殖海区。 1 4 0 0 0 4567891 01 l1 21 23 月 图2 - 4 特呈养殖海区异养细菌数量波动 f i g 2 4v a r i a t i o no f h e t e r o t r o p h i cb a c t e r i ao f t e c h e n g 2 3 , 2 2 弧菌的数量及其变化 箱内 箱外 照海区 特呈海区中弧菌数量的周年变化分布如图2 5 所示。网箱内弧菌数量从4 月份迅 速增加，到6 月底即达到周年最高值，为2 3 l 1 0 4c f u m l ，之后数量开始减少，到 9 月份后，弧菌数量相对稳定在1 2 0 1 0 2 1 2 8 x 1 0 3c f u m l 之间，且在2 月份出现 周年最低值，为1 2 0 x l0 2c f u m l ，最低值同最高值之问相差2 个数量级；网箱外弧 菌数量变化趋势基本与网箱内变化相同，最高值为2 0 2 x 1 0 4c f u m l ，最低值为 1 0 3 x 1 0 2c f u m l ，最高值和最低值之间相差2 个数量级；邻近非养殖海区弧菌数量 在周年变化中，菌数高峰期和低值期范围基本与网箱内外相同，但数量明显低于网箱 内外，范围为1 0 7 x 1 0 2c f u m l 4 3 7 x 1 0 3c f u m l 。同期弧菌数量高低为：网箱内 网箱外 邻近非养殖海区。 加 加 0 -ndo。o_【x v 蛔籁擒恳 广东海洋硕士学位论文 = g g 2 u 皿孤： 赫 姐 最 0 o o 5 0 0 0 0 0 5 0 0 o o o 4567891 0 1 1 1 2123 月 图2 - 5 特呈养殖海区弧菌数量波动 f i g 2 - 5v a r i a t i o no f v i b r i ob a c t e r i ao f t e c h e n g 2 3 3 南三养殖海区异养细菌和弧菌变化 2 3 3 1 南三异养细菌的数量及其变化 南三海区异养细菌数量的周年变化分布见图2 - 6 。从周年变化趋势来看，变化趋 势与麻斜和特呈养殖海区显得不同，波动幅度要缓和一些，只有网箱内异养细菌在1 月份出现一个较高峰值，为1 7 2 1 0 4 c f u m l ；就周年变化范围来看，网箱内异养细 菌数量周年变化范围为2 4 3 x1 0 3c f u m l 1 7 2 1 0 4 c f u m l ，相差1 个数量级，网 箱外周年变化范围为2 4 3 1 0 3c f u m l 6 8 9 1 0 3 c f u m l ，数量级相同，邻近非养 殖海区周年变化为1 6 0 x1 0 3c f u m l 5 5 7 1 0 3c f u m l ，数量级相同。同期异养 细菌数量高低为：网箱内 网箱外 邻近非养殖海区。 0 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 2 o o 0 0 0 8 0 0 6 o o 4 0 0 2 0 0 o o o 4567891 01 11 2 12 3 月 图2 - 6 南三养殖海区异养细茜效量波动 f i g 2 6v a r i a t i o no f h e t e r o t r o p h i cb a c t e r i ao fn a n s a n _【ndgoo_u蛹纂忸最 湛江港养殖海域异养细菌、弧菌及水质因子动态变化的研究 2 3 3 2 弧菌的数量及其变化 南三海区中弧菌数量的周年变化分布见图2 7 。网箱内弧菌数量从4 月份丌始即 迅速增加，到6 月份就达到周年最高值，为3 3 3 1 0 3c f u m l ，之后在一个高峰值期 波动，1 1 月份开始迅速减少，1 月份达到最低值，为7 0 0