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d n a 纳米传感器的研究 专业：分析化学 硕士生：严洪连 指导教师：凌连生副教授 摘要 近l o 年来，纳米技术飞速发展由于金属和半导体纳米粒子具有特殊的光 学电学磁学和催化活性，并且具有巨大的比表面尺寸量子效应争化学反应 活性，因此纳米粒子在实验中体现出的灵敏度高，选择性好，应用性强等特点， 激发了人们广泛的研究兴趣，各种纳米传感器纷纷被建立起来本文主要是基于 a u 纳米在核酸分析中的基本原理，结合其特点，建立新的传感器 1 综述了纳米技术的进展，介绍了a u 纳米的合成方法及其在核酸分析中 的原理和应用，阐述了开展d n a 纳米探针研究的意义 2 本丈基于a u 纳米的光学特性，研究了小分子与d n a 作用方式通过研 究r u ( b i p y ) 2 ( d p p x ) 2 + ，r u ( p h e n h ( d p p z ) 2 + 和r u ( p h e r t b 2 + 对d n a 融链曲线的彰响， 根据试剂加入后引起的颜色体系变化，u v - v i s 光谱，t e m 等来研究它们与d n a 作用方式实验显示，r u ( b i p y ) 2 ( d p p x ) 2 + ，和r u ( p h e n ) 2 ( d p p z ) 2 + 加入后，增强了 d n a 的稳定性，修饰在金纳米粒子上互补的寡核苷酸探针的进行杂交，金纳米 粒子形成网状纳米结构，体系由红色向蓝色转变，同时波长红移，由5 2 2t i m 红 移至6 0 0n l n 。而加入r u ( p h e n b ”对体系没有影响。从而建立识别d n a 与目标 分子结合方式的新方法 3 建立了基于三螺旋d n a 比色法识别单碱基错配低聚核甘酸。通过设计 特定序列5 、s h a c a c a c a c a c a c ! i i i i ! ! i i ! 巡3 ( o l i g o 1 ) 修饰在a u 纳米上，下划线1 8 个碱基设计能够形成三螺旋，另外1 2 个碱基作为 臂。实验前，先加入5 - g t g t g tg t g t g t - 3 ( o l i g o 一2 ) 序列与臂形成双螺旋， 目的是减少a u 纳米与o l i g o 1 的物理吸附。当p h 为5 6 ，精胺 ( h 2 n ( c h 2 ) 3 n h ( c h 2 ) 4 n h ( c h 2 ) 3 n h 2 ) 为4 8 “m 时，室温( 2 2 。c ) 下加入5 - g a aa g a a a g g a a a g a a a g 一3 ( o l i g o 一3 ) ，修饰在a u 纳米上的o l i g o i 的下划线部分与 o l i g o 一3 形成三螺旋，这引起了纳米粒子间组装，体系由红色变成紫色。实验对 其机理进行了研究。如果加进的是单碱基错配或者两个碱基错配时，体系观察不 到变化。所以该法可以用来识别碱基错配，方便快捷。 关键词：双螺旋d n a ，三螺旋d n a ，a u 纳米，嵌入剂，自组装，解聚 l 【 t h e s t u d yo fd n a n a n o s e n s o r m a j o r ： a n a l y t i c a lc h e m i s t r y n a m e ：y a nh o n g l i a n s u p e r v i s o r ：a d j u n c tp r o f e s s o rl i n gl i a n - s h e n g a b s t r a c t i nt h el a s t e s td e c a d e s ，t h en a n o t e c h n o l o g yi sd e v e l o p i n gs of a s t m e t a la n d s e m i c o n d u c t o rn a n o p a r t i c l e s ，w h i c he x h i b i tu n i q u ee l e c t r o n i c ，p h o t o n i c ，a n dc a t a l y s i s p r o p e r t i e s ，h a v e a t t r a c t e dm u c ha t t e n t i o n e s p e c i a l l y , t h ec o n j u g a t i o no ft h e s e n a n o m a t e r i a l sw i t hb i o m o l e c u l e sh a sb e c o m et h ef o c u so fr e s e a r c h , t h el l a n o s e n s o r h a ss i g n i f i c a n ta d v a n t a g e so v e rc o n v e n t i o n a ld i a g n o s t i cm e t h o d sw i t hr e g a r dt o s e n s i t i v i t y , s e l e c t i v i t y , a n dp r a c t i c a l i t y h e r ew ed e v e l o pb i o s e n s o rb a s e du p o nd n a h y b r i d i z a t i o na n dt r i p l e xf o r m a t i o n 1 i nt h i sc h a p t e r , w ei n t r o d u c et h ep r e p a r a t i o no fg o l dn a n o p a r t i c l e sa n di t s a p p l i c a t i o ni nd n a l l a n o s e n s o lt h ep r o g r e s so fn a n o t e c h n o l o g yi sb i l e n yr e v i e w e d a s w e l l 2 n e wc o l o r i m e t r i cm e t h o do fd i s t i n g u i s hb i n d i n gm o d eb e t w e e nd n aa n d s m a l lm o l e c u l e sb yo l i g o n u c l e o t i d em o d i f i e dg o l dn a n o p a r t i c l e si sd e v e l o p e d t h e s o l u t i o no fo l i g o n u c l e o t i d em o d i f i e da un a n o p a r t i c l ei sr e d ，i t c h a n g e df r o mr e dt o b l u ew h e na d d i n gc e r t a i na n a o u n t o fi n t e r c a l a t i v e m o l e c u l e s ，s u c ha s r u ( b i p y ) 2 ( d p p x ) z + a n dr u ( p h e n ) 2 ( d p p z ) 2 + ，w h i l e t h ea d d i t i o no fn o n - i n t e r c a l t i v e m o l e c u l e so fr u ( p h e n ) 3 2 + h a sn oa f f e c t t h e s er e s u l t sw e r ef u r t h e rv e r i f i e db yu v - v i s s p e c t r o s c o p ya n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y t h e s er e s u l t sc a nb ee x p l a i n e d t h a ti n t e r c a l a t i v em o l e c u l ec a ni n c r e a s et h es t a b i l i t yo fd s d n 九t h u sp r o m o t et h e h y b r i d i z a t i o nb e t w e e no l i g o n u c l e o t i d em o d i f i e dg o l dn a n o p a r t i c l e s ，a n dr e s u l ti nt h e 1 i i a g g r e g a t i o no fg o l dn a n o p a r t i c l e s w h i c hn o n - i n t e r c a l a t i v em o l e c u l eo fr u ( p h e n ) 3 2 + h a sn oe f f e c to nt h es t a b i l i t yo fd s d n a ，t h e r e b yn oc o l o rc h a n g e sc a nb eo b s e r v e d t h e r e f o r e ，t h i sm e t h o dc a nb ea p p l i e dt or e c o g n i z et h eb i n d i n gm o d eb e t w e e nd n a a n dt a r g e tm o l e c u l e s 3 s e q u e n c es p e c i f i cr e c o g n i t i o no f h o m o p u r i n es t r a n db yo l i g o n u c l e o t i d e m o d i f i e da un a n o p a r t i c l e sb a s e du p o nt r i p l e xf o r m a t i o ni sd e v e l o p e d o l i g o n u c l e o t i d e w i t h t h es e q u e n c eo f 5 s h a c a c a c a c a c a c c t t t c t t t c i 至i ii i 一3 、( o l i g o 1 ) i sm o d i f i e do nt h ea un a n o p a r t i c l e s ，t h eu n d e r l i n e d 1 8 b a s e si sd e s i g n e df o rt r i p l e xf o r m a t i o n ，w h i l et h eo t h e r1 2 b a s e sa c ta ss p a c er p r i o r t oe a c he x p e r i m e n t o l i g o n u c l e o t i d ew i t ht h es e q u e n c eo f 5 - g t gt g tg t gt g t - 3 ( o l i g o 2 ) i su s e dt oh y b r i d i z ew i t ht h es p a c e rt oo v e r c o m et h ep h y s i c a la d s o r p t i o n u n d e rp h5 6a n di nt h ep r e s e n c eo f4 81 - tm s p e r m i n e ( h 2 n ( c h 2 ) 3 n h ( c h 2 ) 4 n h ( c h 2 ) 3 n h 2 ) ，t r i p l e xf o r m i n gb e t w e e n n a n o p a r t i c l e si nt h ep r e s e n c eo f o l i g o n u c l e o t i d ew i t ht h es e q u e n c eo f 5 - g a a a g a a a gg a a a g a a a g 一3 ( o l i g o 一3 ) a tr o o mt e p e r a t u r e ( 2 2 0 c ) ，w h i c hp r o m o t e st h e a s s e m b l y i n go f n a n o p a r t i c l e s r e s u l t si nt h ec o l o rc h a n g e sf r o mr e dt op u r p l e w h i l e t h i sp h e n o m e n a nc a nn o tb eo b s e r v e dn e i t h e ri nt h ep r e s e n c eo f t h es i n g l e b a s e m i s m a t c h e do l i g o n u c l e o t i d er o ti nt h ep r e s e n c eo ft h ed o u b l e b a s em i s m a t c h e d o l i g o n u c l e o t i d e k e y w o r d s ：d o u b l es t r a n dd n a ( d s d n a ) ，t r i p l es t r a n dd n a ( t s d n a ) ，i n t e r e a l a t o r , s e l f - a s s e m b l y , d i s a s s o c i a t e ，g o l dn a n o p a r t i c l e 1 1 引言 第1 章绪论 近l o 年来，纳米技术已经成为人们广泛关注的前沿领域之一。金属 和半导体纳米粒子由于具有特殊的光学、电学、磁学和催化活性，又由于 纳米粒子具有巨大的比表面、尺寸量子效应和化学反应活性，与生物体有 特殊的相互作用，因此激发了人们广泛的研究兴趣，建立了各种制备特定 形状和大小的纳米粒子的方法，并将其应用到生物分析上。纳米金在分子 生物学领域的研究和应用现己成为科学家研究的热点。基于纳米材料建立 的传感器，具有方便快捷、灵敏度高、选择性和专一性好等非常显著的优 越性。纳米技术融合渗透到分析科学中。这将极大地促进分析科学中最活 跃的领域生物分析的发展。 1 2 研究背景 脱氧核糖核酸( d n a ) 是生物体的重要组成物质，遗传信息的携带者 和基因表达的物质基础，它在生物的生长、发育和繁殖等活动中具有十分 重要的作用。 d n a 的研究，为识别和诊断许多疾病提供了靶标。研究d n a 的技术 和手段有分光光度法，电化学法、毛细管电泳法等，这些方法都存在重现 性差或者检出限不够低等不足之处，不能满足现代分析的要求。于是在这 些方法的基础之上发展了p c r 实时荧光检测，近来又新发展了基于量子 点( q u a n t u md o t s ，q d ) ，a u 纳米的纳米生物传感器。在近l o 年，纳米技 术由于其自身的优点，在核酸分析中，备受关注。 表一d n a 的新研究技术和手段 分析方法方法概述 分析方法 优点缺点 实时荧光在p c r ( 聚合酶链实时荧光 可进行核酸重现性较 定量p c r 式反应) 扩增目的p c r 仪检 实时检测：差；仪器 基因的同时，利用测 特异性强， 复杂不方 荧光信号累积实对靶序列中便携带， 时监测整个p c r单个碱基的容易对环 进程，并对靶基因错配、缺失境造成污 进行定量分析的或插入突变染，成本 方法。均能检测出大，同时 来；灵敏度检验多个 高。 靶分子难 以实现； 不能够应 用于蛋白 分析。 a u 纳米a u 纳米颗粒具有比色法 方便快捷， 生物可相 巨大的比表面、尺 1 1 ( 1 0f r o o i ) 灵敏度高、 容性、大 寸量子效应和化表面增强 选择性和专分子可接 学反应活性。a u 拉曼吸收 一性好。 近性还有 纳米颗粒间的距法嘲nf m ) 待进一步 离充分大于其直电化学 提高。 径时体系呈红色， 口1 f 5 0f m ) 荧 间距小于平均颗光标记法 粒直径时呈蓝色。 “f lt m l 2 1 3 纳米技术 1 3 1 纳米材料的特点 纳米颗粒的尺寸在1 l o o a m 之间。但并不是所有纳米材料都可用作 生物探针。作为纳米探针的纳米材料，需要具有以下特点。( 1 ) 尺寸小( 1 i o o n m ) ，比表面大。( 2 ) 界面效应和量子效应，与纳米粒子的大小，组 成，形状密切相关。( 3 ) 特殊的靶分子键合性质。( 4 ) 优良的光学和电学 性能。这些特点，使其在生物医学及生命科学中的应用成为研究的热点。 通常来说，目标物与特定大小的纳米材料的键合是基于其显著的物理 化学特性，引起信号转变。可变的物理性质是纳米材料非常重要的性质。 由于纳米材料的可修饰性和可变的物理性质使得它可以应用在生物检验 e 【6 l 。 此外，表面修饰和模拟技术的进步促进了纳米尺度的生物微分子和小 分子在其表面构筑【“”l 。随着不同大小，形状和组成的纳米粒子合成技术 的进步，不同绑定系数的许多生物分子在其表面修饰和组装也得以发展 n q 4 o 纳米粒子的这些性能，使得研究者去进行具有潜在的新的研究来提 高信号变换，这能与分子荧光法的p c r ，e l i s a ( 酶联免疫分析法) 媲美。 纳米材料种类有很多，本文主要是基于a u 纳米在核酸分析中的基本 原理和应用进行介绍，结合其特点，进行实验设计。 1 3 2a u 纳米的特点及其在核酸检验中的基本原理 a u 纳米具有巨大的比表面、尺寸量子效应和化学反应活性。当a u 纳米颗粒间的距离充分大于其平均直径时体系呈红色，间距小于平均颗粒 直径时呈蓝色。 1 9 9 6 年，m i r k i n 首次将a u 纳米应用在d n a 分析上，开拓t a u 纳米在 生物传感器的先河，也大大地促进了a u 纳米在生物分析的应用。他们利用 a u 纳米标记的寡聚核苷酸探针和靶序列杂交形成延伸的网络状a u 纳米结 构。这种杂交导致了a u 纳米粒子聚集，其表面等离子体共振吸收的红移， 从而引起y a u 纳米光学性质的变化，因此产生多核苷酸的杂交信号。 俭测过程中用巯基寡聚核苷酸修饰的a u 纳米颗粒作为报告基团，a u 纳米颗粒用末端带有巯基的寡聚核苷酸探针修饰，修饰后的a u 纳米颗粒在 室温下不相互聚集，溶液呈红色。在加入靶链d n a 时，探针通过与靶链 d n a 作用，而相互杂交，a u 纳米颗粒间通过多个短的烷巯基寡聚核苷酸 与靶链d n a 片段相互联结，形成延伸的聚合网络结构。a u 纳米粒子的特 征等离子体吸收在5 2 0 r i m 左右，聚集后的最大吸收波长依赖于a u 纳米之间 的距离和凝聚体的大小。随着a u 纳米间距逐渐缩小和聚集体的逐渐增大， a u 纳米的特征吸收峰值从5 2 2 n m 红移z 卒6 0 0 n m 伴随着溶液由红色经紫红 色向蓝色改变【1 5 7 1 。 4 1 3 3a u 纳米的合成方法 a u 纳米微粒的制备方法分为化学法和物理法。化学法通过还原反应将 a u c l 4 - 还原成a u 纳米微粒，并控制颗粒的生长在纳米尺度上，通过稳定剂 使a u 纳米稳定并均匀地分散于溶液中。物理法是利用各种技术将块状固体 金分散为a u 纳米微粒。孙双姣等 1 8 j 综述了金纳米粒子的化学和物理制备 方法。以下主要在此基础上介绍常用的化学法制备a u 纳米。用不同种类、 不同剂量的还原剂还原氯金酸( h a u c l 4 ) ，可制备粒径不同的a u 纳米。常 见的制备方法可大致分为b h 4 还原法n 9 1 、白磷还原法f 删，抗坏血酸还原 法，柠檬酸钠还原法【2 1 1 和鞣酸柠檬酸钠还原法。后两种方法制得的金颗 粒直径较为均一，因此目前常用。还原剂的选择与制备的a u 纳米的大小有 关。一般来说，1 s n m 的a u 纳米溶液用n a b h 4 还原氯金酸 1 9 1 ，制备a u 纳 米直径在5 1 2 n m 的胶体金溶液用白磷或抗坏血酸还原氯金酸，直径为 1 3 1 7 n m 的a u 纳米的胶体金则用柠檬酸三钠还原氯金酸m i 。在用同一种 还原剂时，制备的a u 纳米直径的大小还可通过还原剂的用量来控制。还原 剂用量的多少与制备的a u 纳米直径大小成反比。不同大小、形状、组成的 纳米颗粒所发射的光不一样，如 f i g - i ，1 2 t l 。 f i g - i j s i z e s 。s h a p e s 。a n dc o m p o s i t i o n so fm e t a ln a n o p a r t i c l e sc a nb es y s t e m a t i c a l l y v a r i e dt op r o d u c em a t e r i a l sw i t hd i s t i n c tl i g h t - s c a t t e r i n gp r o p e r t i e s 5 i 3 4a u 纳米在核酸分析中的应用 1 9 9 6 年，m i r k i n 首次将a u 纳米应用在d n a 分析上【l l l ，此后，许多 基于d n a 杂交的生物传感器【2 2 i 、p c r 2 3 1 ，d s d n a 与三螺旋d n a 的转录 【川，d n a 一蛋白相互作用2 5 1 、蛋白一蛋白相互作用2 6 1 ，d n a 与小分子相 互作用【2 7 l 被报道。下面主要介绍d n a a u 纳米生物传感器的应用。 1 3 4 1 单螺旋d n a 中的应用 a u 纳米修饰d n a 后抗电解质能力增强 d n a 修饰到a u 纳米上，a u 纳米溶液的特征吸收峰发生小幅度红移 5 1 9 n m 至1 5 2 4 n m t 2 7 1 。这种红移不一定是由于d n a 在a u 纳米表面修饰的作 用，可能是离心过滤影响了纳米粒子的分布，进而影响细胞质基因组的结 合位置。此外，d n a 修饰：至l j a u 纳米后，分散在电解质中，形成双电层， 也会影响细胞质基因组结合【2 3 1 ，以上因素都会引起吸收峰红移。 没有修饰的a u 纳米抗n a c i 性能非常差，c n a c l 一 5 0 m m 时，颜色就会发 生改变，由红色变成蓝色，说明a u 纳米发生聚集。而修饰后的a u 纳米， 在c n a c l = l m 的电解质溶液中可以稳定存在，这表明，d n a 的修饰作用大大 提高t a u 纳米在电解质溶液中的稳定性( 1 1 , 1 7 , 2 7 1 。 最近，有研究者利用柠檬酸盐稳定的a u 纳米和s s d n a 相互作用，应用 在p c r 放大基因组d n a 检测上【2 9 - 3 0 l 。研究发现，短链s s d n a 修饰在a l l 纳米 上后，增强了a u 纳米的稳定性，没有修饰的a u 纳米，低浓度电解质就可 以诱导其聚集( 溶液由红色变蓝色) 。日f l a u 纳米修饰d n a 后抗盐能力增强 3 0 - 3 1 1 。 a u 纳米上修饰d n a 的密度表征 测定a u 薄膜金属电极上d n a 密度的方法有电化学法，x p s ，s p r ( 表 面等离子共振吸收光谱) 法等【3 2 3 4 i 。 6 m i r k i n 课题组【3 5 1 在此基础上，发展了荧光标记法分别测定了a u 纳米 和a u 薄膜上，d n a 的密度和杂交系数( f i g - 1 2 ) 。该方法可以研究影响 固定在a u 纳米表面的s s d n a 密度和结构，如电解质的浓度对于吸附沉淀 的影响，使用d n a 为( s p a c e r ) 空间的系列和长度的影响，为预测和控制 a u 纳米和薄膜表面d n a 杂交系数提供了一种可行的方法。 i 淞一 体l 一 _ - 一 一心，赢。 已 1 “。” 、- * _ m d q - _ f f g j 2 荧光标记法测定a u 纳米上d n a 的密度 1 3 4 2 双螺旋d n a 中的应用 u v v i s 分光光度法 1 9 9 6 年，m i r k i n 第一次将纳米材料用在生物检测上，d n a 修饰的纳米 粒子和特定系列的纳米粒子通过d n a 靶标诱导的自组装，该方法通过其 光学特性和熔链特性来检验。1 3 n m 的a u 纳米粒子用在该实验中，居于 纳米粒子的聚集状态，溶液颜色发生改变，由红色变成蓝色。( f i g - i 3 ) 进一步研究表明，纳米标记的d n a 聚集的熔链曲线是非常尖锐，熔链温 度范围比没有纳米标记的荧光标记d n a 窄很多( f i g - i j ) 【3 射。 7 桨 f i g - t 3 i nt h ep r e s e n c eo f c o m p l e m e n t a r yt a r g e td n a ，o l i g o n u c l e o t i d e f u n c t i o n a l i z e d g o l dn a n o p a r t i c l e sw i l la g g r e g a t e ( a ) ，r e s u l t i n gi nac h a n g eo f s o l u t i o nc o l o rf r o m r e dt o b l u e ( b ) t h ea g g r e g a t i o np r o c e s sc a nb em o n i t o r e d u s i n gu v - v i ss p e c t r o s c o p yo rs i m p l y b ys p o r i n gt h e s o l u t i o no nas i l i c as u p p o n ( c ) 表面增强拉曼共振法( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c es p r ) 为了提高其灵敏度，利用表面增强拉曼共振法( s u r f a c ep l a s m o a r e s o n a n c es p r ) 去检验和探钡i j d n a 在a u 纳米表面杂交的真正时间，检测 限可达1 5 0 n m l 3 9 i 。当靶d n a 在表面捕获d n a 链和d n a 标记的a u 纳米间 是三明治式时，其检测限提高了1 0 0 0 音，可以检测到i o p m 靶d n a 【4 们。最 近也提出了另一种利用d n a 标记的a u 检验真正杂交时间的方法i ， d n a 荧光探针 s h u m i n gn i e 课题组【4 2 l 在2 5 r i m a u 纳米d n a 组装体中引入荧光探针， 建立纳米生物传感器，通过纳米金和荧光化合物的淬灭效应可以识别特定 8 序列d n a 和同形式的单碱基变化。比荧光分子信标更稳定，更方便。这种 新的金属纳米粒子具有独特的结构和光学特性，为新的生物传感器和分子 工程开辟了一条新道路，机理如陲4 f i g - i 4 所示。 电化学法 f i g - i 4 金纳米荧光探针检测d n a m i r k i n 等将此方法推广到微电极芯片中【4 3 】用手工点样法将探针固定 在一对微电极之间2 0um 的空隙中，杂交后纳米金聚集在空隙中，导致电 传导率的变化，用银显影液处理后信号进一步放大。 蔡宏等j 以纳米金胶为标记物，将其标记于人工合成的5 端巯基修饰 的寡聚核苷酸片段上，制成具有电化学活性的金胶标记d n a 电化学探针， 在一定条件下使其与固定在g c e 表面的靶序列进行杂交反应，利用 s s d n a 与其互补链杂交的高度序列选择性和极强的分子识别能力，以及 纳米金胶的电化学活性，实现对特定序列d n a 片段的电化学检测以及对 d n a 碱基突变的识别。 a f m 成像法 v e l l a n o w e t h 4 5 1 等研究了在金表面上形成探针靶，d n a 金纳米粒子夹 心式结构，用原子力显微镜检测核酸。该法同过金纳米粒子增强a f m 成像 并提高了核酸检测灵敏度。 9 1 3 4 3 超螺旋d n a 中的应用 ( 1 ) 三螺旋 在特定条件下，单链d n a 通过特殊的系y t h o o g s t e e n ，或者反h o o g s t e e n 氢键结合在目标双螺旋核酸的大沟内形成三螺旋d n a 【4 6 1 。 三螺旋d n a 结合试剂的筛选 比较短的序列在室温下不能形成三螺旋，需要加入分子结合试剂来增 强其稳定性，从而可以控制基因表达【”1 。m i r k i n 课题组【4 8 i 使用d n a 修饰 的a u 纳米粒子，通过比色法，筛选潜在的三螺旋特定的d n a 结合试剂， 并同时评估它们相对结合能力。这种方法显著地提高了识别d n a 结合试 剂和非结合试剂。( f i g - 1 5 ) 该方法利用a u 纳米的特殊光学性质和容易识 别的颜色变化进行检测，与m s ，u v - v i s 熔链，电泳，竞争透析法相比， 陔法具有方便、简易、廉价、快速和无设备检测的优势，能广泛应用于药 物筛选、遗传学和疾病诊断等领域。 p h 质子开关 三螺旋有平行和反平行两种结构。反平行三螺旋的形成不需要质子， 表现为无p h 依赖性，而平行三螺旋胞核嘧啶的亚氨基基团非常依赖质子 形成三螺旋d n a 。由于三螺旋d n a 的稳定性较差，韩国的k i m 课题组【4 9 j 通过改变环境温度( 混合溶液升温到6 5 c ，维持5 m i n ，缓慢冷却到3 7 c ， 然后在3 7 下保存2 4 h ，最后在4 c 下保存2 4 h ，控制三螺旋d n a 的形成， 建立可逆的p h “开关”。( 如图f g 们 1 0 f i g - i j 三螺旋d n a 绑定试剂的筛选 f i g - i 6p h 质子开关 ( 2 ) 四螺旋 当d n a 单链中的o c 含量超过6 0 时，容易形成四碱基体，并进一步 形成四链核酸，这种四链核酸的形成过程也可用于构筑p h 传感器 轫也 可直接用于研究四碱基体的形成条件。鉴于这种四链结构与核酸识体 ( a p t a m e r ) 的功能密切相关，因此，可用于建立特定分子的生物传感器。 以色列的w i l l n e r 教授在利用四链的d n a 的形成原理构筑生物传感器方面 取得了一些有意义的结果，分别建立了端粒酶活性和t h r o m b i n 的纳米生物 传感器r s t 5 2 l 。 1 3 4 4 其他 m i r k j n 课题鲥5 3 1 介绍了一种新颖的尺寸选择分离混合的a u 纳米水溶 液，基于d n a 固有的化学识别性质和d n a 修饰a u 纳米粒子的绑定特性。 h 本的m i z u om a e d a 课题组髀j 报道一种通过非交联d n a 诱导d h a 修饰的 a u 纳米聚集现象。 1 4 本课题研究的意义及研究内容 基于a u 纳米的光学特性，研究小分子与d n a 作用方式，这种方法可 通过肉眼识别，而且具有高选择性和高灵敏度，方便快捷。 基于a u 纳米的光学特性和三螺旋d n a 的性质，研究a u 纳米的自组装 过程，通过比色法识别单碱基错配。这种方法可通过肉眼识别来判断三螺 旋的形成与否和作用机理，并研究影响三螺旋稳定性因素。主要内容包括： 1 t i 开究t r u ( b i p y ) 2 ( d p p x ) “，r u ( p h e n h ( d p p z ) 2 + 和r u ( p h e n ) 3 2 + - 与d n a 作用的颜色变化，并通过t e m 进行表征a u 纳米的聚集情况，测定融链曲线 来研究其稳定性。通过a u 纳米探针法，建立了小分子与d n a 相互作用方式 识别的方法。 2 研究t a u 纳米与d n a 的作用，a u 修饰的d n a 的臂互补的存在与否， p h 值，互补链的错配对三螺旋形成的影响。通过观察体系的颜色变化，存 在臂互补与否的动力学，u v - v i s 吸收，并通过t e m 表征a u 纳米的聚集情况， 通过测定融链曲线，判别三螺旋的形成与否。通过a u 纳米探针法，建立了 识别三螺旋单碱基错配方法，并对其机理进行了探究。 【参考文献l 1 e l g h a n i a nr c in 1 s c i e n c e1 9 9 7 ，2 7 7 ：1 0 7 8 1 0 8 【2 l c a ov 砒c f i n 艮c m i r k i nc a s c i e n c e 2 0 0 2 ，2 9 7 ：1 5 3 6 【3 l p a r ks j ，t 砒o nt 丸m i r k i nc 九s c i e n c e ，2 0 0 2 2 9 5 ：1 5 0 3 f 4 z h a ox ，t a p e e d y t i o c o 艮，t a nw a mc h e ms o c 2 0 0 3 1 2 5 ：i1 4 7 4 【5 e m p e d o c l e ss b a w e n d ima c e c h e mr e s , 1 9 9 9 3 2 ：3 8 9 【6 a l i v i s a t o spn a t b i o t e c h n o l2 0 0 4 ，2 2 ：4 7 【7 g i n g e rd s ，z h a n gt - l ，m i r k i nc 九a n g e w , c h e m 血te d 2 0 0 4 ，4 3 ：3 0 ， 【8 1 w a d u m e s t h r i g ek 。x os a m r on 丸l i ugf l a n g m u & 1 9 9 9 ，1 5 ：8 5 8 0 ， 9 l l i um a l n l on 九c h o wc s ，l i u ，gyn a n ol e t t 2 0 0 2 ，2 ：8 6 3 l 1 0 k e n s e t h3 r ，h a m i s e h l 九j o n e s w p o r t e r m d l a n g m u t ，：2 0 0 1 1 ：4 1 0 5 【i l l m i r k i n c 九。l e t s i n g e r l 。m u e i e 艮c s t o r h o f f ljn a t u r e 1 9 9 6 3 8 2 ：6 0 7 - 6 0 9 【1 2 a l i v i s a t o s 丸p ，j o h n s s o nkp ，p e n gx g ，w i l s o nte 。l o w e t hc g ，b r u c h e zm ，p ，s c h u l t zpg ， v a t u r e1 9 9 6 3 8 2 ：6 0 7 - 6 0 9 1 3 c h e ni lj ，z h a n gy 。w a n gd ，d a ih ，a mc h e m s o c 2 0 0 1 1 2 3 ：3 8 3 8 1 2 【1 4 m b i n d y oj kn 。r c 螂b d 。m a r t i n b & 。k e a t i n g c ，d n a t a n m j 。m a l l o u k t e 如m a t e r 2 0 0 1 。1 3 ：2 4 9 【1 5 】l a z a t i d c s a a s c h a t z g e j p h y sc h e m 且2 0 0 0 1 0 4 ：4 6 0 - 4 6 7 1 6 s t o f h o f f j j ，l a z a t i d e s a a m u c i c r c e t a l j a m c h e m s o c 2 0 0 0 ，1 2 2 ：4 6 4 0 - 4 6 5 0 1 t t a t o nt a m u c i cr c ，m i r k i nc 丸da l j a mc h e ms o c 2 删1 2 2 ：6 3 0 5 - 6 3 0 6 【l s l 孙双姣，蒋治良p r e c i o u sm e t a l s 2 0 0 5 2 6 ：5 5 5 6 【t g d u s f i nj m a x w e l l ，l a s o n t a y t o r s h u m i n gn i e j ：a m o 切吃s o c 2 0 0 2 1 2 4 ：9 6 0 6 - 9 6 1 2 【2 0 1 ( a ) g r a b a rk c f r e e m a n 艮g ，h o m m e rm b 。n a t a nk j = a n a l c h e m 1 9 9 5 6 7 ：7 3 5 - 7 4 3 ( b ) f m n sg n a t , p h y , & i 1 9 7 3 , 2 4 1 ：2 0 - 2 2 2 1 n a t h a n i e ll r o s ia n dc h a d 丸m i r k i n c h e m 胁2 0 0 5 , 1 0 5 ：1 5 4 7 - 1 5 6 2 2 2 p o m p ih a z a r i k a b l e n tc c y h ，c h r i s t o f m n i e m e y e r a n g e w c h e m i n t e d , 2 0 0 4 , 4 3 ：6 4 6 9 6 4 7 t 2 3 h a i k u o l i ，j i e h u a n h u a n g , j u n h o n g l v , h o n g j i e a n e t a l a n g e w c h e m 加惦1 1 7 ：5 2 3 0 - 5 2 3 3 ( 2 4 1 ( a ) h u a n gc - c ，h u a n gy - e 。c a oz t a nw c h a n ght a n a l c h e m 2 0 0 5 , 7 7 ( 1 7 ) ：5 7 3 5 5 7 4 1 ( b ) l i t lj ，l u , y a n a lc h e m2 0 0 4 , 7 6 ( 6 ) ：1 6 2 7 1 6 3 2 【2 5 p o m p ih a z a r i k a , f l o r i a nk u k o l k a , c h r i s t o f m n i e m e y e r a n g e m c h e mi m 尉7 0 0 6 ，4 5 ：i 一5 f 2 6 l s u s a n n eb r a k m a n n a n g e w c h e m i n t e d 2 0 0 4 4 3 ：5 7 3 0 - 5 7 3 4 ( 2 7 1 ( a ) m i ns uh a i la b i g a i lki t l y t t o n j e a n b y u n g - k e t mo h , j u n g s c o kh e o , c h a d 丸m i r k i n a n g e w c h e mi n t e d 2 0 0 6 , 4 5 ：1 8 0 7 - 1 8 1 0 ：( b ) j u e w e nl i ua n dy il u a n g e w , c h e mi n t 臌加眶4 5 9 0 - 9 4 2 s l j a m e sj s t o r h o f f r o b e r te l g h a n i a n r o b e r tc m u c i c c h a d 九m i r k i n r o b e r tl l e t s i n g e r a m c h e # 1 s o c 1 9 9 8 1 2 0 ：1 9 5 9 - 1 9 6 4 2 9 m u l v a n e yp l a n g n m i r1 9 9 6 1 2 ：7 8 8