（分析化学专业论文）色谱指纹图谱应用于烟用香精质量控制及中药研究.pdfVIP

硕士学位论文摘要 摘要 香精香料的应用被视为卷烟配方的关键技术。香精香料的化学成 分复杂，对其一种或几种化学成分进行定性定量的分析，难以对香精 香料的质量进行有效地控制，色谱指纹图谱的应用是一种有效的质量 控制方法，它能判断其质量是否稳定。建立烟用香精标准谱图数据库， 便于香精的鉴定和伪劣产品的识别，保证卷烟生产的质量。中草药化 学成份的定性定量分析是建立在中药药理理论的物质基础，联用色谱 及其相关的化学计量学方法为复杂体系的分离提供了强有力的工具。 当归是我国传统中药，挥发油为其主要活性成分。本文主要分为两个 部分：烟用香精的质量控制研究和中药当归的化学活性成分分析。 一烟用香精的质量控制( 二、三、四章) ：选取合适的香精挥 发成分提取方法，运用联用色谱及相关的化学计量学方法解析香精的 谱图，再通过n i s t l 4 7 标准质谱库的检索，获得香精中致香物质的 可能化学成分；建立香精的标准指纹图谱库，利用待测香精的谱图与 标准谱图的相似度比较来对香精香料的质量进行有效的控制。 二中药现代化在很大程度上依赖于其质量的控制水平，目前，以 指纹图谱作为中成药、草药提取物这类含有混合物质群的质量控制方 法，已经成为目前国际共识。本部分利用气相色谱质谱联用法 ( g c 。m s ) 分离和检测当归根挥发油，用子窗口因子分析法( s f a ) 和相 关化学计量学方法，对当归根的g c m s 二维数据进行分辨，从而定 硕士学位论文 摘要 性和定量分析了当归根中挥发油成分。 关键词：烟用香精香料，提取，指纹图谱，数据库，当归 h 硕士学位论文 a b s t i 认c t a bs t r a c t t h ea p p l i c a t i o no ft o b a c c of l a v o r sa n de s s e n c e si sc o n s i d e r e da st h e k e yt e c h n i q u eo f t h ec i g a r e t t ef o r m u l a t i o n a st ot h ec o m p l i c a t e dc h e m i s t r y c o m p o s i t i o no ft o b a c c of l a v o r sa n de s s e n c e s ，i ti sd i f f i c u l tt oc o n t r o lt h e s p i c ee f f e c t i v e l y ，o n l yo n eo raf e wc h e m i c a lc o m p o s i t i o n s q u a n t i t a t i o n a n dq u a l t i t a t i v ea n a l y s i s t h ea p p l i c a t i o no fc h r o m a t o g r a p hf i n g e r p r i n t d i a g r a mi sa k i n do fv a l i dc o n t r o lm e t h o d ，t h e r e f o r ei tc a nj u d g ei t sq u a l i t y s t a b i l i z ew h e t h e ro rn o t b u i l du pt h es m o k eu s e st h ef r a g r a n c ee x t r a c t s t a n d a r dt a b l ed i a g r a md a t a b a s e ，i se a s yt oi d e n t i f ya n dj u d g et h e p r o d u c t e ，e t c ，g u a r a n t e e i n gt h ec i g a r e t t ep r o d u c eo fq u a l i t y t h eq u a n t i t a t i o n a n dq u a l t i t a t i v ea n a l y s i sf o r t h ec o m p o t i s t i o no fc h i n e s em e d i c i n a lh e r bi s f o u n d e d e do nt h e p h a r m a c o l o g i c a l t h e o r i e s a s s o c i a t i o nw i t h c h r o m a t o g r a p ha n dc h e m i c a lm e t r o l o g ym e t h o dp r o v i d e dap o w e r f u lt o o l t ot h e c o m p l i c a t e ds y s t e ms e p a r a t i o n t h e c h i n e s e a n g e l i c a i st h e t r a d i t i o n a lc h i n e s eh e r b a lm e d i c i n eo fo u rc o u n t r y ，t h ev o l a t i l eo i li si t s m a i na c t i v ec o m p o s i t i o n t h i st e x ti sm a i n l yd i v i d e di n t ot w op a r t s ：t h e r e s e a r c ho ft h et o b a c c of l a v o r sa n de s s e n c e si sq u a l i t yc o n t r o la n da n a l y s i s o fc h i n e s ea n g e l i c a 、sa c t i v ec o m p o s i t i o n t t o b a c c of l a v o r sa n de s s e n c e si s q u a l i t yc o n t r o l ( c h a p t e r 2 ，3 ，4 ) c h o o s et h es u i t a b l ee s s e n c ev o l a t i l ef l u i de x t r a c t t i o nm e t h o d ，u t i l i z et h e a s s o c i a t i o nw i t hc h r o m a t o g r a p ha n di t sc h e m i c a lm e t r o l o g yt oa n a l y zt h e ! 1 1 硕士学位论文 a b s t r a c t e s s e n c ea t l a s a n dt h e n t h r o u g hn i s t l 4 7 s t a n d a r dm a s ss p e c t r u mc h a r t s r e t r i e v a l o b t a i n st h e p o s s i b l ec h e m i c a lc o m p o s i t i o n w h a tc a nb r i n ga b o u t f r a g r a n tm a t e r i a l b u i l du pe s s e n c e s 、f i n g e r p r i n tc h r o m a t o g r a p h y ，a n dm a k e u s eo ft h es i m i l a r i t yb e t w e e nt h ee n s s e c ec h a l 飞a w a t i n gs u r v e r ya n d s t a n d a r dc h r o m a t o g r a p h yt oc o n t r o lt o b a c c of l a v o r sa n de s s e n c e sq u a l i t y e f f e c t i v e l y 2 t h em o d e m i z a t i o n o fc h i n e s eh e r b a lm e d i c i n er e l y e do ni t sq u a l i t y c o n t r o ll e v e li nv a r y i n gd e g r e e s 。a tp r e s e n t ，a sw ea l lk n o w nf i n g e r p r i n t c h r o m a t o g r a p h yi st h eq u a l i t yc o n t r o lm e t h o do ft h ec h i n e s ep a t e n td r u g c o m p o u n d e di nt h ew o r l d i nt h i sc h a p t e rw em a k eu s eo ft h es e p a r a t i o no f g c m sa n dv o l a t i l eo i lt e s t i n g ，i no n t h e rw a y ，w eu s e ds f aa n ds o m e c h e m i c a lm e t r o l o g ym e t h o dr e l a t e dt od i s t i n g u i s hg c - m s t h e r e b yw e a n a l y s e dt h ec o m p o s i t i o n sa n g e l i c as i n e n s i s v o l a t i l ef l u i dq u a n t i t i v e l ya n d q u a l t i t a t i v e l y k e yw o r d s ：t o b a c c of l a v o r sa n de s s e n c e s ，e x t r a c t ， f i n g e r p r i n t c h r o m a t o g r a p h y ，d a t a b a s es y s t e m ，a n g e l i c as i n e n s i s i v 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。 作者签名： 连詹i 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：盔盔立导师趔日期：堕年如日 硕士学位论文 第一章前言 1 1 香精香料概述 第一章前言 香料是从带香物质中提取或以人工的方法得到的致香物质的总称，也称增香 剂。通常，根据香料的来源可将其分为天然香料和合成香料两大类。目前己知天 然香料有3 0 0 0 多种，合成香料则多达7 0 0 0 余种，并且新的品种还在不断涌现。 香精则是将多种香料( 有时含有一定量的溶剂和其它添加剂) 按照一定的比例 和工艺，经人工调配而得到的具有一定香型，可直接用于产品的混合物。 1 1 1 香精香料的发展简史 香料的历史可以追溯到5 0 0 0 年前。黄帝神农氏时代，早有采集树皮、草根 作为医药用品来驱疫避秽。当时人类对植物挥发出来的香气已经非常重视，又加 以自然界花卉的芳香，对它产生了美感。因此在上古时代就把这些有香物质作为 敬神拜佛，清净身心之用，同时也用于祭祀和挺葬方面。后逐渐用于饮食、装饰 和美容上。我国在夏、商、周三代前就开始了对香料的使用。印度、希腊等文明 古国也是最早使用香料的国家。 公元前1 7 2 9 年就有香料贸易，公元前3 7 0 年希腊著作中记载了至今仍在使 用的香料植物，还提出了“吸附、“浸提 等方法。至1 4 世纪，阿拉伯人经 营香料业，开始采用蒸馏法从花中提油，提取玫瑰油和玫瑰水。 1 3 7 0 年，第一只用乙醇的香水一匈牙利水( e a u d e l a r e i m e d h o n g a r i e ) 现了， 开始只是从迷迭香中蒸馏制得，其后才逐渐从薰衣草和甘牛至等植物中制得。自 1 4 2 0 年，在蒸馏中采用蛇形冷凝器后，精油发展迅速，然后在法国格拉斯( g r a s s e ) 生产花油和香水，从此成为世界著名的天然香料( 特别是香花) 的生产基地，此后 各地也逐步采用蒸馏提取精油。同时从柑桔树的花、果实及叶子中提取精油，这 样就从香料植物固体转变成液体，提取了植物中的精油，这是划时代的进展。 1 8 世纪起，由于有机化学的发展，开始对天然香料的成分分析与产品结构的 探索，逐渐用化学合成法来仿制天然香料。1 9 世纪，合成香料在单离香料之后 陆续问世，这样就在动植物香料外，增加了以煤焦油等为起始香料的合成香料品 种，进入了一个由合成香料的新时期，这大大增加了调香用香料的来源，且大大 降低了香料价格，促进了香料发展。 硕士学位论文 第一章前言 随着天然香料和合成香料品种的日趋增多及调香技艺的提高，香精工业得到 了快速发展。时至今日，人们在增香产品中使用的大多是香精，直接使用香料的 已非常少了卜姗。 1 1 2 香精香料的提取与检测方法 香精香料样品的前处理方法主要包括蒸馏法1 2 3 1 - 3 3 、萃取法 3 4 3 7 、吸附法 2 , 3 2 3 8 , 3 9 箜 寸。 蒸馏法主要包括共水蒸馏法、水蒸汽蒸馏法和分子蒸馏法。共水蒸馏法中原 料直接受热，易焦化并破坏某些香气成份，目前采用的很少。水蒸汽蒸馏法则避 免了精油长时间在高温下发生破坏性分解、水解或聚合，使精油的质量和提取效 率都得到了一定的提高。分子蒸馏法是一种在高真空度下( 绝对压力0 1 3 3 p a ) 进行分离操作的连续蒸馏过程，是目前较好的一种蒸馏方法。该方法特别适合于 分离沸点高、粘度大、热敏性天然产物。 图i k a ) 减压水蒸汽蒸馏装置图 真空系统 冷并 图1 一l ( ”刮膜式分子蒸馏器 萃取法主要包括溶剂萃取法和超临界流体萃取法( s f e ) 。溶剂萃取法的优点 是操作简单，且可通过选择不同的萃取溶剂而有选择地提取致香成分。但萃取溶 剂用量较大，且从萃取液中除去大量溶剂对致香成份的损失较大。同时蒸馏一萃 取装置( s d e 法) 使萃取溶剂的用量大幅度减少，较好地解决了在除去溶剂的 过程中损失致香成份的问题。且香气总量、数量及回收率等均优于普通溶剂萃取 法，特别是醇类和酯类香气成份尤为突出。超临界流体萃取( s f e ) 是以临界温 度和压力下的超临界流体作萃取剂进行萃取的。该方法特别适合对易氧化、热敏 性的物质萃取，可得到纯度高、安全性好、芳香成份损失少的香味物质。虽然 s f e 法具有很多其他萃取法难以比拟的优越性，但由于到目前为止，s f e 理论还 不甚完善，分离范围较窄，设备投资较大和萃取剂回收再利用等问题，限制了其 2 硕士学位论文 第一章前言 发展和推广。 水浴 图1 2 ( a ) d e a n s t a r k 萃取装置图1 2 ( b ) 同时蒸馏萃取装置示意图 4 5 图1 2 ( c ) c 0 2 超临界萃取流程示意图 1 萃取器a2 萃取器b3 分离器4 压缩机5 过滤器 吸附法是利用只吸附香气成份的吸附剂提取低沸点的香气成份。其最大特点 是能富集、提取沸点较低的香气成份且不会破坏香气的组分和性质。但对于高沸 点的组分则较差。在吸附法中，固相微萃取( s p m e ) 是上世纪9 0 年代发展起 来的一种新型样品前处理方法。它集分离、富集功能于一身，大大简化了样品的 前处理过程，而且能很方便地与气相色谱等其它分析仪器联用。国外曾利用 s p m e g c m s 联用测定了3 1 种常用烟草香味添加剂，检出限最低达到1 0 n g g 。结果表明，它对许多成份的灵敏度超过传统的方法。另外，固相微萃取装 3 硕士学位论文 第一章前言 置可以根据萃取对象选择适当的萃取头，从而消除或降低干扰，实现选择性萃取。 但与s d e 法相比，s p m e 法由于纤维萃取头使用一段时间后，由于固定液的流 失，吸附能力明显下降，不容易得到理想的重复性结果，且对于香精中的半挥发 性成份的测定灵敏度偏低。 i 一柱塞杆 5 一接头观察窗 魁 【 目 v 上o i l 图l 一3s p m e 装置示意图 2 一杆筒3 一柱杆保持螺栓4 一i 型骨槽 6 一柱杆高度调节槽7 一弹簧8 一密封隔膜 9 一隔膜穿刺针套1 0 一纤维粘接套管1 l 一熔融硅纤维及表面涂层 香精香料中的组分可以按照其沸点的高低大致分为挥发性组分( 如醇、酯、 烃、烯等) 和非挥发性组分( 如香豆素、黄酮、黄烷酮等) 两类。对于香精香料 中的挥发性组分，气相色谱( g c ) 仍然是目前最常用的分离手段。气相色谱中 最先是用填充柱来分离香气成份，但填充柱的柱效不高，难以满足分析复杂香精 样品的要求。现在柱效更高的玻璃毛细管柱及石英毛细管柱已经成为香料成份分 析的主流柱型。 在常用的毛细管气相色谱法中，经常采用内径为2 5 0i tm 或3 2 0um 的毛细 管柱作为分离柱，但分析时间较长。1 9 9 9 年d a v i d 在c h r o m a t o g r a p h y 上h 们报 道了一种新的快速高分辨毛细管气相色谱法，该方法是以内径很小的毛细管柱 ( 1 0 0l lm ) 作为分离柱，。采用6 0 0 k p a 以上的高压，在保证分离效果的前提下， 使分析时间得到大幅度的减少，有利于烟用香精的快速分析。可是该方法对仪器 的要求较高，仪器价格昂贵，在短时间内还难以得到广泛应用。 4 硕士学位论文第一章前言 我们在分析香精香料时，发现当样品组分极为复杂时，使用单独的一根色谱 柱就很难得到预期的分离效果。前人的研究发现，将两根以上极性不同的毛细管 柱连接起来，即把第一根色谱柱流出的馏分在第二根或以上的色谱柱上进行进一 步的分离，这种结构称为“极性偶合柱系统州4 。偶合柱系统的研究为复杂香精 成分的分离提供了一种新的方法。但两根色谱柱的柱连接头有无死区是影响其分 辨率的关键。 全二维气相色谱( g c g c ) 的出现则提供了一个真正的正交分离系统。它 把两根色谱柱以串联方式结合组成二维气相色谱，在这两根色谱柱之间装有一个 调制器，该调制器能定时浓缩从第一根柱流出的分析物，并转移很窄的区带到第 二根柱的柱头，起第二维进样器的作用。所以，全二维色谱具有灵敏度高( 是通 常的一维色谱的数十倍) 、分辨率高( 是两根色谱柱各自分辨率平方和的平方根) 、 峰容量大( 是两根色谱柱各自峰容量的乘积) 、分析时间短、定性可靠性增强等 特点，使得该技术在复杂体系样品的分离分析中占有越来越重要的地位m 1 。 对于香精香料中的精油等非挥发性成份，其主要分析方法是高效液相色谱 ( h p l c ) 和薄层色谱( t l c ) 。现在一般先用t l c 法预分离，然后采用h p l c 法对精油成份进行分级分离。采用h p l c 分离精油，可以避免g c 进样时可能会 出现的分子重排和热分解现象。但由于液体的粘度大，扩散系数小，因而分离速 度较慢18 1 9 3 6 例。 在香精香料的检测上，主要依靠气相色谱( g c ) 上各种不同类型的检测器， 例如催燃检测器( c c d ) 、火焰离子检测器( f i d ) 和质谱检测器( m s ) 等。然 而一般来说，由于每种检测器只对某类物质特别敏感，响应值较高，而对另一类 物质却不敏感，响应值很低，因此很难利用单一的检测器对未知物进行定性。若 将两种或两种以上检测器组合起来，则更有利于对未知组分的分类和定性。 1 9 9 8 年在c h r o m a t o g r a p h y 中的报道表明，采用催燃检测器( c c d ) 和火焰 离子检测器( f i d ) 联用可以对烟用香精进行了快速分析。此种方法操作简单， 效果较好，可作为烟用香精质量监控的有效手段。用c c d 做检测器，定量校正 相对简单，但必须配用以耐氧化性物质为固定相的色谱柱，且检测的灵敏度低于 g c f i d 。 通过g c c c d 、g c f i d 或g c c c d f i d 等对香精香料检测时，由于 香精香料本身组分较复杂，对各组分的定性等研究耗时较长。随着g c m s 联 用技术的不断发展，使香精香料成分研究的效率得到了大幅度的提高。它通过 g c 预分离，m s 检测分析，再通过谱库检索就能自动给出化合物的可能的结构 信息，一个复杂的混合物在较短时间内就可以分析完毕。所以g c m s 是目前 香精香料分析中应用最多的一种手段。 硕士学位论文第一章前言 此外，对于组成十分复杂的香精，近年来m s m s 两级质谱的出现和应用 为其定性、定量分析提供了新的途径。m s m s 可以将色谱上不能分开的物质 利用时z b - j 编程和多通道检测将其完全分开 3 8 4 9 o 对g c 、l c 或s f c 与傅立叶变换红外光谱巧们( f t i r ) 以及二维核磁共振谱 联用，也是当今香料成份分析中的常用方法，对香精等复杂混合物的分析鉴定更 有价值5 ”。 同位素质谱( i 刚s ) 近几年被初步用作在线检测器，可以对生产中使用的 香精进行连续测定，对香精的质量控制进行了有效的延伸。同时，g c - - i r m s 联用技术也开始应用，它不仅可用于分析复杂混合物中的组分，而且可以推断组 分来源。 一种以计算机技术为基础的“模式识别方法 的出现，使精油的分析效率得 到了大幅度提高。该方法的核心是使用k 氏最临近归类法比较待测与已知样品 的成分，若两者误差在规定范围内，即可判定两者成分相似或相同。它通过计算 机运算，对照g c 对不同样品的描述图谱快速识别混合物中的成分，也可将一组 组分作为一个整体识别出来。其最突出的特点是预测力强，快速准确，操作方便。 1 9 9 3 年，s t a m p a n o n i 巧2 1 发表了一篇不借助任何仪器的定量香味剖析( q f p ) 技术的论文。q f p 技术训练各人的嗅觉和味觉，使其对某种特定的香味和香气产 生深刻感受，并对此种感受量化。这种方法不仅比其他所有一切分析方法都直观， 而且能对现有仪器无法作出响应的特定气味作出反应。 1 1 3 香精香料在卷烟行业的应用及其质量控制 香精香料是卷烟生产中必不可少的物质，其配方更是卷烟行业的核心技术， 它对改善卷烟的口感，突出烟草风格具有重要的作用。目前烟用香精香料主要分 为3 个种类，来自烟草本身的香料、非烟草的天然香料和人工合成的香精。烟草 香精油可在不同的温度下用多种溶剂抽取；非烟草天然香料同是从除烟草以外的 各种植物或动物中的提取物，如从各种植物的花、果实、叶、茎、根或皮中提取 出来的精油或水、乙醇浸提物如浸膏、酊剂等；人工合成的香精则是化工产品 4 1 。 当前对烟用香精香料的质量主要通过折光指数、相对密度、酸值、挥发份总 量等一些物性指标及人工嗅香这两个环节来控制l s j 。前者只能从总体上反映香精 香料的某些特性，而后者是以鼻感作为识别工具的。由于后者受着主观意识、环 境和个体差异等因素影响，而前者也不能从化学组成的角度对嗅香的差异做出定 性、定量的解释，依靠这些指标不能有效地监控香精的质量波动情况。有些香精 厂家为了牟取暴利，添加大量溶剂将以上指标调到合格，损害了卷烟厂的利益； 6 硕士学位论文第一章前言 有些香精中含有国家已明令禁用的成份，如果使用会给消费者的健康带来极大的 损害。因此，需要对香精香料的组成进行剖析，对于微量、痕量组分进行深入剖 析并了解其中致香的关键成份，使人们对香精香料的认识从宏观、感性的层次深 入到分子水平，为客观、准确、合理地制定质量控制标准提供科学依据。 1 2 化学计量学在香精香料分析中的应用 化学计量学( c h e m o m e t r i c s ) 是2 0 世纪7 0 - 8 0 年代发展起来的一门化学与 统计学、数学、计算机科学交叉所产生的新兴的化学学科分支。它运用数学、统 计学、计算机科学以及其他相关学科的理论与方法，优化化学量测过程，并从化 学量测数据中最大限度地提取有用的化学信息。它涵盖了化学量测的全过程，包 括采样理论与方法、实验设计与化学化工过程的优化控制，化学信号处理、分析 信号的多元校正与分辨、化学模式识别、化学过程和化学量测过程的计算机模拟、 化学定量构效关系、化学数据库与化学专家系统等主要分支，是一门内涵相当丰 富的化学学科分支嘞1 。对于分析试样毫无验前信息，分析化学的任务是首先确 定其物种数，进而解析出各纯物种的谱图( 可以是光谱、波谱等) 即先将其转化 成为白色分析体系，因其象个黑匣子，故我们称之为“黑色分析体系 。分析化 学计量学家们已研究出了不少基于矩阵数据结构和张量数据结构的化学计量学 解析方法，尤其是对于色谱联用仪器，如液相色谱与二极管阵列联用仪( h p l c d a d ) 、气相色谱与质谱联用仪( g c - - m s ) 、气相色谱与红外光谱联用仪( g c - - i r ) 等所产生的矩阵数据，已发展了一系列解析新方法，如渐进因子分析法 ( e v i o l v i n gf a c t o ra n a l y s i s ) 、窗口因子分析法( w i n d o wf a c t o ra n a l y s i s ) 、直观 推导式演进特征投影法( h e u r i s t i ce v o l v i n gl a t e n tv r o j e c t i o n s ) 等，可望解决黑 色分析体系的快速定性和定量分析问题眩。 香精香料的主体香是其内含的多种化学成分的一种综合性的表现，对其一种 或几种化学成分进行定性定量的分析，难以对香精香料的质量进行有效地控制， g c m s 是目前香精香料分析中应用最多的一种手段，利用化学计量学多元校正 和多元分辨方法来解析色谱联用仪器所产生的二维数据，再通过谱库检索就能给 出化合物的可能的结构信息。 1 3 化学计量学在中药指纹图谱中的应用 中药具有疗效好、毒性低等优点，越来越受到人们的青睐。中草药化学成分 的定性定量分析是建立中药药理理论的物质基础，虽然中草药中只有有限化学成 7 硕士学位论文 第一章前言 分有药理活性，但中药中含有数十种甚至数百种化学成分，使得中药中生物活性 成分的筛选和分析与西药相比变得异常困难1 2 2 1 。联用色谱仪的出现和快速发展 的化学计量学对多维数据的分辩方法为色谱峰的解析提供了有力的工具，这使得 分离解析如中草药这样的复杂系统成为可能。目前，以指纹图谱作为中成药、草 药提取物这类含有混合物质群的质量控制方法，已经成为目前国际共识。美国 f d a 在植物药制品指导原则中( 征求意见用草案) 允许申报者提供产品的色谱 指纹图谱资料。英国草药典、印度草药典以及加拿大药用及芳香植物学会、德 国药用植物学会等也都把指纹图谱作为质控标准的内容之_ 2 3 - 3 0 。 1 4 本文各章所讨论的内容 针对前言中所提到的香精香料的质量控制及中药指纹图谱解析中药的化学 活性成分，本文的研究工作可分为两个部分，一部分是对烟用香精香料的质量控 制进行了讨论，包括香精香料的挥发性半挥发性化学成分的提取条件的选择，气 相色谱及质谱的条件，谱图的解析，香精香料指纹图谱库的建立及应用，另一部 分则是利用化学计量学的相关知识解析中药当归挥发油中的化学活性成分。详细 内容如下： 第一章前言，主要介绍了香精香料的发展历史，香精香料的前处理方法及其 组分分离和检测的方法，香精香料在烟草的应用及其质量控制，化学计量学在香 料香料的质量控制中所扮演的重要角色及其在中药化学活性成分分析中的应用。 选取合适的提取香精香料中挥发半挥发化学成分方法，可以获得更多的有用 信息；获得一香精香料样品的标准化的指纹图谱至少得有六个批次的标准样品进 行检测，把获取的原始图谱( 图像) 进行平均得出；建立香精香料指纹图谱库可以 更方便的调用所获得的香精指纹图谱来控制香精香料的质量。本文的第二章和第 三章对上述作了详细的说明。 当归( a n g e l i c as i n e n s i s ) 是名贵中草药，挥发油是当归的主要药理活性成分， 利用气相色谱质谱联用和化学计量学分辩方法来分析当归挥发油中化学成分， 可以得到其有效活性化学成分，第四章对其解析过程和结果作了详细的阐述。 8 硕士学位论文第二章指纹图谱分析法控制香精质量的研究 第二章指纹图谱分析法控制香精质量研究 2 1 引言 卷烟配方一向被视为卷烟工业企业的核心技术，而香精香料的应用更被视为 关键技术。香精香料的化学成分复杂，它的主体香是其内含的多种化学成分的一 种综合性的表现，往往很难对其都进行定性分析，对其一种或几种化学成分进行 定性定量的分析，难以对香精香料的质量进行有效地控制，色谱指纹图谱的应用 是一种有效的质量控制方法，它能判断其质量是否稳定 5 3 3 0 指纹图谱不强调个体 绝对唯一性，不要求每个组分都清楚，不要求每一组分都精确测定，而是强调群 体相似性，相似性是通过色谱指纹图谱的整体性和模糊性来体现的，这是色谱指 纹图谱分析的最基本的属性。色谱指纹图谱是近年来中药研究的热点，中药色谱 指纹图谱是采用固定实验条件和实验方法，得到不同产地或不同生长条件下中药 样品的色谱图谱，具有综合、宏观、模糊的非线性特点，该法反映的信息量大， 是控制中药材及其制剂质量的较好方法之一c 5 4 3 。本文参照中药指纹图谱的方法 对香精的质量进行控制。， 2 2 实验方法 2 2 1 实验仪器与试剂 仪器：固相微萃取器手柄和1 0 0 p r o 聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 萃取纤维头购自 s u p e l c o ( b e l l e f o n t e ，p a ，u s a ) 公司；挥发油提取器；同时蒸馏萃取装置；旋转 蒸发仪；g c 2 0 1 0 气相色谱仪和g c m s 2 0 1 0 气相色谱质谱联用仪。 样品和试剂：香精样品( a b i 、b 3 ) 由常德卷烟厂提供，二氯甲烷、三氯甲 烷、氢氧化钠、硫酸、无水硫酸钠，正己烷均为分析纯。 2 2 2 提取方法 1 溶剂萃取：分别使用二氯甲烷，三氯甲烷，正己烷作为萃取剂。移取1 0 9 样品，加饱和食盐水，用5 0 m l 萃取剂分两次萃取，合并萃取液，并用无水硫酸 9 硕士学位论文 第二章指纹图谱分析法控制香精质量的研究 钠干燥，每种萃取剂平行测三次，然后用旋转蒸发仪浓缩至l m l 。在进行色谱 测定前低温保存。 2 水蒸气蒸馏：根据药典的挥发油提取标准方法提取其挥发性成分；在 1 0 0 0 m l 的圆底烧瓶中注入3 0 0 m l 蒸馏水，称取1 0 9 样品，加入l g n a c l 来促使 可溶性的挥发性成份溶出。将正己烷提取液浓缩至l m l 。每一样品平行实验三 次。 3 同时蒸馏萃取法( s d e ) ：实验采用如图2 2 ( b ) 所示同时蒸馏萃取装 置，萃取剂使用二氯甲烷。在1 0 0 0 m l 容量瓶中加入1 0 9 样品和2 5 0 m l 蒸馏水 及l g n a c l ，用可控制电压的电热套进行加热；在另一1 0 0 m l 圆底烧瓶中加入 3 0 m l 二氯甲烷，水浴加热的温度保持在6 0 ，加热2 h 。二氯甲烷萃取物用无 水硫酸钠干燥过夜，浓缩至l m l 。在进行g c 测定前低温保存，每一样品连续做 三次平行实验来评估同时蒸馏萃取法的稳定性。 4 固相微萃取法：实验采用如图2 3 所示固相微萃取装置示意图，依据 j e f f r e y 5 5 1 等所做的工作采用如下条件处理样品：石英纤维头在使用前应在2 5 0 氦气下预热l h ，移取1 9 香精，置于5 m l 样品瓶中，加入l m l 饱和n a c l 溶液， 轻轻摇匀，盖上塞子，在7 0 水浴中平衡1 5 m i n ，然后将s p m e 注射头穿过样 品瓶的薄膜在样品溶液上方进行3 0 r a i n 的项空吸附。吸附完毕后首先将石英头 收回，然后将注射头抽出容器，然后将玻璃纤维插入色谱仪进样口，脱附1 m i n ， 不分流进样，其它色谱条件与同时蒸馏萃取的相同。每次实验平行进行三次。特 别需要注意的是使用s p m e 法时，保证石英纤维每次都位于溶液上方的同一位 置。 2 2 3g c 和g c m s 测定条件 岛津2 0 1 0 气相色谱仪，氢火焰离子化检测器，3 0m x 0 2 5 m m i d o v - 1 弹性 石英毛细管柱，载气n 2 ，进样口以及检测器温度为2 5 0 ，程序升温：起始温度 4 0 ，以1 0 m i n 升至2 3 0 ，维持1 0 m i n ；分流进样比为1 ：1 0 ，流速为 1 0 m l m i n l ，进样1ul 。将岛津2 0 1 0 型气相色谱与岛津2 0 1 0 型质谱相连接来 对香精中挥发性和半挥发性成份进行定性分析。气相色谱条件同上。质谱条件： e i 源电子轰击能量7 0 e v ；离子源温度2 3 0 ，倍增电压0 8 k v ；扫描范围 4 0 4 0 0 a i n u ；扫描速度o 2s s c a n 。利用n i s t l 4 7 谱库对质谱图进行检索。 1 0 硕士学位论文第二章指纹图谱分析法控制香精质量的研究 2 2 4 实验结果分析 选择适当的提取方法可以获得较多的有用信息；实验结果的重现性和耐用性 ( r u g g e d n e s s ) 是指纹图谱的基本要求，样品本身的一致性和提取方法的稳定则是 实验结果重现的根本保障。 1 a b l 和b 3 最优提取方法的选取 如图2 一l ( a - - 一e ) 为采用不同的提取方法所得到的a b l 样品中挥发性和半挥 发性成分的气相色谱图，其中a 、b 、c 、d 、e 分别代表同时蒸馏萃取法、水蒸汽 蒸馏、固相微萃取法、二氯甲烷溶剂萃取法和正己烷溶剂萃取法等五种不同的提 取方法。因为采用了不同的溶剂，并且溶剂一般是最终提取物中的主要部分。而 溶剂并不能代表香精的指纹图谱的特性，因此在谱图中截去了溶剂峰片段。 图2 一l ( a ) 同时蒸馏萃取法提取a b l 样品中成分的气相色谱图 硕士学位论文 第二章指纹图谱分析法控制香精质量的研究 图2 1 ( ”水蒸汽蒸馏法提取a b l 样品中成分的气相色谱图 图2 一l ( c ) 固相微萃取法提取a b i 样品中成分的气相色谱图 图2 一l ( d ) 二氟甲烷溶荆萃取法提取a b i 样品中成分的气相色谱图 。x 1 0 4 0 几i m m 丌t 1 r 丌广r t r l 丌1 _ t 一 51 01 52 02 53 03 54 0 r e t e n t j o nt j m e m i n 图2 一l ( e ) 正己烷溶剂萃取法提取a b 样品中成分的气相色谱图 1 2 4 3 2 1 0 主讲亡磐ui 硕士学位论文 第二章指纹图谱分析法控制香精质量的研究 在这五种提取方法中，都加入饱和食盐水，这样能提高待测物质在有机相中 的浓度，又可以减少乳化现象。 样品采用了几种不同的方法进行前处理，因此对于样品中的待测组份会有不 同的萃取效率。按通常的做法，提取量是评估萃取效率的主要依据。但这样既不 能表现该提取方法对于不同化合物的选择性，也不能指示所提取的化合物的数 目，我们希望所建立的指纹图谱能包含有最大的信息含量，同时为了满足色谱指 纹图谱对重现性的要求，本文中采取信息量和重现性两个指标来考察提取方法的 优劣。 信息理论是建立在概率论理论之上的。我们知道，一个色谱指纹图谱，实际 是包含有一些色谱图谱峰的样品浓度分布曲线，可以看作是由色谱谱形所决定的 一系列连续信号，用矢量x 表示，根据参考文献1 5 6 1 ，连续信号所包含的信息含 量可以由下式表达： 矽= 一i p ，l o g p ，d x ( 2 一1 ) 此处p x 是化学组份在分布函数中的存在概率或浓度。一个色谱指纹图谱须 将谱峰进行归一化处理，其信息含量可以基于e q ( 2 ) 来计算： = 一l p 。s u m ( p ，) l o g p ，s u m ( p ，) 出( 2 - 2 ) 此处p ，是色谱指纹图谱中待测化学成份的真实谱图响应值，s u m ( p 。) 是各化 学成份p ，值的总和，在上式中得到的值是某色谱指纹图谱中得到的信息含量 值。 一 表2 一l 中列出了不同提取方法计算得到的指纹图谱谱图信息含量值。从表2 2 中可以看出，固相微萃取法提取到了一个含量很大的组分，该组分通过气 质联用分析已知为l ，2 丙二醇，l ，2 一丙二醇的水溶性很强，难以通过水蒸气 和同时蒸馏萃取蒸馏出来，正己烷为非极性溶剂，难以萃取出极性较强的成分， 而在此s p m e 萃取温度( 6 0 ) 下，l ，2 _ 丙二醇有一定的挥发性，能够从香精中 挥发出来，从而使s p m e 法能够检测到香精中这种原始成分。1 ，2 丙二醇的保 留时间从6 3 分钟到1 2 5 分钟，从而掩盖了其它组分的出现。 同时蒸馏萃取提取数据中，可以看出保留时间段为5 - - 1 7 分钟所提取到的组 分较少，所以们不能提供该香精中低沸点化合物的指纹特征，水蒸汽蒸馏和二氯 甲烷提取的数据更少( 不在表中列出) ，而采用正己烷萃取，所提取到的组分最 多( 见表2 4 ) ，所以，在这里我们选用正己烷溶剂萃取法作为a b l 样品中成 分的最优提取方法。 表2 一la b i 样品的不同提取方法的信息量及稳定性( n = 3 ) 实验结果 1 3 硕士学位论文 第二章指纹图谱分析法控制香精质量的研究 耙一2s p m e 和s d e j j g j 疋a b l 香精中香气成分结果 注：一为朱检测到 实验结果的重现性和耐用性( r u g g e d n e s s ) 是指纹图谱的基本要求，样品本身 的一致性和提取方法的稳定是实验结果重现的根本保障。将所得到的色谱图进行 保留时间漂移校正后，将数据标准化，三次重复实验数据平均后得到其共有谱峰， 利用如下式( 3 3 ) 计算实验数据与共有谱峰的相似度5 7 1 ，式中s 捌为两谱图信 号之间的夹角余弦相关系数。 1 4 硕士学位论文第二章指纹图谱分析法控制香精质量的研究 = ( 一为一习“一刁2 一乃2 一l y 一1 ( 2 3 ) 如图2 2 分别为a b l 样品采用正己烷溶剂萃取方法在不同的时间由不同的 操作人员重复实验三次的气相色谱图，从图中可以很明显地看出，实验结果具有 很好的重现性。表2 3 也计算出了不同提取方法所得到谱图与其共有谱峰的相 似程度及其相对标准偏差( r s d ) 。 图2 2a b l 样品重复实验的色谱指纹图谱 表2 3a b l 和b 3 样品的不同提取方法的重现性实验结果( n = 3 ) ，- 如图2 3 ( a d ) 为b 3 样品采用不同的提取方法所得到的样品中挥发性和半 挥发性成分的气相色谱图，通过比较采用正己烷溶剂萃取法提取其中的组分。 硕士学位论文 第二章指纹图谱分析法控制香精质量的研究 图2 3 ( a ) 正己烷溶剂萃取提取b 3 样品中成分的气相色谱图 x10 一一 一 一 卜。i 叽z 疗k u h i 。b 矗山0l 乙 510 15 2 02 53 03 5 4 0 r e t e n t i o nt i m e m i n 图2 3 ( b 水蒸汽蒸馏提取b 3 样品中成分的气相色谱图 图2 3 ( c ) 同时蒸馏萃取提取b 3 样品中成分的气相色谱图 1 6 0 8 6 4 2 o 1 参i s c 粤c 一 扫丽c 兽u l 硕士学位论文第二章指纹图谱分析法控制香精质量的研究 蚤 。丽 c 粤 三 4 _ r 从 心乙u彪u 一 一 一 一 二 图2 3 ( d ) 固相微萃取提取b 3 样品中成分的气相色谱图 2 a b l 和b 3 定性定量结果 对a b l 和b 3 样品进行了g c 和g c m s 分离测定，定性分析是由g c m s 在全扫描模式下通过在l i s t1 4 7 质谱数据库进行检索而得到，如表2 4 和表2 5 分别为a b l 和b 3 样品定性分析结果。 表2 4a b i 样品定性结果( 正已烷溶剂萃取) 1 7 硕士学位论文 第二章指纹图谱分析法控制香精质量的研究 表2 4a b i 样品定性结果( 正已烷溶剂萃取) 续表1 1 8 硕士学位论文 第二章指纹图谱分析法控制香精质量的研究 表2 4a b i 样品定性结果( 正已烷溶剂萃取)续表2 峰号保留时间( 分钟)化合物名称分子式分子量 匹配度 4 61 2 8 6 4 m e t h y l t o l u e n ec 9 h 1 2 1 2 09 2 4 71 3 0 7 9 1 3 - 蒎烯c l o h l 6 1 兰鱼丝一 4 81 3