（植物营养学专业论文）禾本科植物根中硅结合蛋白功能的研究.pdf

摘要 本文首次报道了对高粱根硅质化内皮层中砖结合蛋白的分离、纯化、鉴定、定位及其功能的 研究；同时还研究了硅结合蛋白在早稻和玉米沙套形成中的作用。主要研究结论如r ： 1 高粱根内皮层硅结合蛋白功能的研究 通过氢氟酸处理高粱根硅质化内皮层，提取到与硅紧密结合分子量为1 0 3 k d 的蛋白质，称 之为高粱根硅结合蛋白( s i l i c a b i n d i n g p r o t e i n1 0 3 k d ，s b p l 0 3 ) 。测定了s b p l 0 3n 末端的1 0 个氨基酸序列，为：a e l p q p e p q p 。进一步查询n c b i 的表达序列标签数据库获得其相应基因的 e s t 序列片段，再以查询到的e s t 序列迸特电子克隆，得到编码s b p l 0 3 的基因序列。b l a s t 比 对发现s b p l 0 3 与水稻叶片硅结合蛋白s b p l l 7 的相似性为7 9 6 8 。s b p l 0 3 能够被s b p l l 7 抗体 特异性识别，说明二者为同源蛋白。体外实验结果表明s b p l 0 3 可阻诱导硅的沉淀，硅的沉淀量 与s b p l 0 3 的加入量和硅酸钠溶液自身的浓度都呈显著的线性正相关，且在p h 值6 , 5 附近蛋白对 溶液中硅的沉淀效率达到最大。 2 硅结合蛋白与沙套形成关系的研究 免疫印迹显示硅结合蛋白存在于早稻沙套中，并通过s b p l l 7 的荧光抗体在早稻根毛和根表 定位到了硅结合蛋自。体外实验发现，硅结合蛋白可以紧密粘结土壤颗粒，说明该蛋自能够参与 土壤团聚体的形成过程。在本实验中为了将根毛对沙套形成的作用与根冠细胞对沙套形成的作用 相区分，采用l o u m 左右孔径的尼龙膜将植株与十壤分隔开来的方法培养玉米。实验结果显示， 根毛与土壤颗粒紧密缠绕，形成新的团聚体结构，而且根毛和根毛缠绕的土壤颗粒都被硅结合蛋 白荧光抗体识别，表明大量的硅结合蛋白存在于根毛表面及根毛和土壤颗粒之间，由此推测根毛 能够通过分泌硅结合蛋白这样的有机大分子粘合剂，参与沙套形成的化学过程。 关键词：硅，硅结合蛋白，禾本科植物沙套，根毛 a b s t r a c t t h i sp a p e rw a st h ef i r s tt i m et or e p o r tt h es i l i c a b i n d i n gp r o t e i nf r o ms i l i c i f l e de n d o d e r m i so f s o r g h u mr o o t w em a i n l yi n v e s t i g a l e dt h ep r o t e i n si s o l a t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o n ，d i s t r i b u t i o n a n di t sf u n c t i o n s t h er o l eo fs i l i c a b i n d i n gp r o t e i n si nr h i z o s h e a t hf o r m a t i o no fa e r o b i cr i c ea n dm a i z e w a sa l s oi n v e s t i g a t e d t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o n so fs i l i c a b i n d i n gp r o t e i nf r o ms i l i c i f i e de n d o d e r m i so f s o r g h u mr o o t w ee x t r a c t e dp r o t e i n sw i t hh y d r o f l u o r i ca c i df r o ms i l i c i f i e de n d o d e r m i so fs o r g h u mr o o ta n dg o ta 1 0 3 k dp r o t e i nw h i c hi st i g h t l yb i n d i n gw i t hs i l i c a ，n a m e l ys b p l 0 3 ( s i l i c a - b i n d i n gp r o t e i n1 0 3k d ) t h en - t e r m i n a la m i n oa c i ds e q u e n c eo fs b p l 0 3i sa e l p q p e p q eu s i n gt h en t e r m i n a ls e q u e n c eo f s b p l 0 3 ，w es e a r c h e dt h ec o r r e s p o n d i n ge s ts e q u e n c e si nn c b ia n dg o tt h eg e n eo fs b p1 0 3b y e l e c t r o n i cc l o n i n g i tw a sf o u n dt h a tt h es i m i l a r i t yo fs b p l 0 3a n ds b p l1 7f r o mr i c el e a v e si s7 9 6 8 a n ds b p l 0 3c o u l db er e c o g n i z e db ya n t i b o d yd e r i v e df r o ms b p l l 7 ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h e s et w o p r o t e i n sa r eh o m o l o g o u s i nv i t r oe x p e r i m e n t ss h o w e dt h a ts b p l 0 3c o u l di n d u c es i l i c ap o l y m e r i z a t i o n i na q u e o u ss o l u t i o n ，a n dt h ea m o u n to fp o l y m e r i z e ds i l i c aw a sp r o p o r t i o n a lt ot h ea d d i n ga m o u n to f s b p l 0 3a n ds o d i u ms i l i c a t e t h eo p t i c a lp hf o rs i l i c ap o l y m e r i z a t i o ni n d u c e db ys b p l 0 3i s6 5 2 s i l i c a b i n d i n gp r o t e i n si n v o l v e di nr h i z o s h e a t hf o r m a t i o n s i l i c a - b i n d i n gp r o t e i nw a sf o u n di nt h er h i z o s h e a t ho fa e r o b i cr i c e ，a n dw a si m m u n o f l u o r e s c e n f l y l o c a l i z e do ni t sr o o th a i r sa n dr o o ts u r f a c e o u rs t u d i e ss h o w e dt h a ts b p l l 7c o u l db i n dt h es o i lp a r t i c l e s t i g h t l yi nv i w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h ep r o t e i nc o u l dp a r t i c i p a t ei nt h ef o r m a t i o no fs o i la g g r e g a t e s i n o r d e rt oe x c l u d et h er o l e so fb o r d e rc e l l si nr h i z o s h e a t hf o r m a t i o n ，w eu s e dn y l o nm e m b r a n ew i t ha b o u t 1 0 a mp o r e st os e p a r a t et h em a i z er o o t sf r o mt h es o i l t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt o o th a i r sw e r e t i g h t l yb o u n dw i t hs o i lp a r t i c l e s i m m u n o f l u o r e s c e n tl o c a l i z a t i o nr e v e a l e dt h a ts i l i c a - b i n d i n gp r o t e i n w a sa s s o c i a t e dw i t hb o t ht h er o o th a i r sa n dt h e i rb o u n ds o i lp a r t i c l e s i tc a nb ei n f e r r e dt h a tr o o th a i r s c o u l ds e c r e t eo r g a n i cb i n d i n gm o l e c u l es u c ha ss i l i c a - b i n d i n gp r o t e i n st op a r t i c i p a t ei nt h er h i z o s h e a t h f o r m a t i o nc h e m i c a l l y k e yw o r d s ：s i l i c a ，s i l i c a - b i n d i n gp r o t e i n s ，g r a m i n a c e o u sp l a n t s ，r h i z o s h e a t h ，r o o th a i r 独创性声明 y9 3 8 0 i2 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名时间：砂。g 年6 月f g 同 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 怫雪 微 时间： 加6 年6 月l g 日 时帆妒占年6 刖p 日 中国农业大学硕二l 学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 禾本科植物硅结合蛋白的研究 1 1 1 硅在高等植物地上部和根中的沉积机理 硅的积累是禾本科家族植物的一个重要特征( m o t o m u r a e t a l ，2 0 0 4 ) 。在禾本科喜硅植物中， 硅的含量高达其千重的4 ，2 0 ，并主要以水化无定形二氧化硅即硅胶的形态积累于特化的硅细 胞腔内，或者存在于表皮及厚壁组织的细胞壁中( e p s t e i n ，1 9 9 4 ) 。很久以来，人们一直忽略了 硅的重要作用，把它看作是随水分吸收进入植物体内的废物，认为硅在植物体内的沉积是被动的 物理过程，受蒸腾作用控制( l a w t o n ，1 9 8 0 ：h o d s o ne t a l ，1 9 8 5 ) ，其主要原因是硅大量分布在 蒸腾旺盛的部位( r a v e n ，1 9 8 3 ) 。但被动沉积理论无法说明为何植物体中具有一定形态特征、属 种高度专一的硅体存在，因为无定形硅本身没有规则的内在形态结构；也不能解释硅在植株根内 皮层及维管组织中的沉积现象，如高粱根内皮层内切向壁上均匀分布的球状硅体因为植株根系 部位无蒸腾作用。研究发现，植物体内硅体的形成不受蒸腾作用的影响( p o w e r se t 4 f ，1 9 9 7 ) ， 而受遗传控制( p i p e r n oe t a l ，2 0 0 2 ：d o r w e i l e ra n dd o e b l e y ，1 9 9 7 ) ，是主动沉积的过程。一些 学者认为，植株体内的硅体是以细胞中特殊的有机大分子作为构建过程的“摸板”，催化硅酸在 特定的细胞区域发生聚合所形成的( h a r r i s o n 。1 9 9 6 p e r r ya n dt u c k e r ，1 9 9 8 ；p e r r ya n dt u c k e r ， 2 0 0 0 ；p e r r y a n d t u c k e r ，2 0 0 3 ) 。m o t o m u r a 等( 2 0 0 4 ) 的研究结果表明，硅的主动沉积和被动沉 积二者并不矛盾，而取决于细胞的类型。他们以竹子为材料进行研究，发现在竹子所特有的叫做 纺锤维胞( e l l i s ，1 9 8 7 ：s o d e r s t r o ma n d e l l i s ，1 9 8 7 ) 的通气组织中，当叶片成熟并完全展开后， 水分通常从纺锤细胞间隙蒸发，而同时硅在纺锤细胞里逐渐沉积，并且随着细胞的成熟，纺锤细 胞内硅的沉积量增加，表明硅在该部位的沉积与细胞生理调节无关，而是伴随着水分吸收被动进 入细胞；相反对于术栓细胞、保卫细胞、长细胞、副卫细胞这四种表皮细胞尽管表面水分蒸发 量很少却存在大量硅的累积，说明硅在其中的沉积是一个受植物自身调控的主动过程( m o t o m u r a 甜口z ，2 0 0 4 ) 。 1 1 2 硅结合蛋白研究现状 在低等海洋生物硅藻和海绵中已经发现了控制硅沉积的蛋1 3 质( h i l d e b r a n d t 口，1 9 9 7 ) 。在 对高等植物的研究中，一些学者在硅体里发现了氨基酸和蛋白质碎片( h a r r i s o n ，1 9 9 6 ：p e r r ya n d t u c k e r t2 0 0 3 ) ，从而推测高等植物体中存在着和硅藻、海绵类似的控制硅沉积的蛋白质，认为这 种蛋白质与硅体紧密结合( 称2 _ y 0 “硅结合蛋1 3 ”) ，是催化硅酸聚合的主饔“模板，分子：但是 他们并未发现完接的蛋1 3 质分子。k a u s s 等人( 2 0 0 3 ) 用人工抗病诱导法从黄瓜下胚轴中分离到 一个编码富脯氨酸蛋白的基因，体外试验发现该基因编码的蛋白质具有沉淀硅的作用；但是k a u s s 等人并没有从硅体中分离得到这种蛋白质，不知该蛋白质是否与硅体结合。履近，史新慧( 2 0 0 5 ) 首次从水稻叶片的新鲜硅体中分离到一种与硅紧密结合分子量为1 1 7 k d 的蛋白质，称为硅结合 中国农业大学硕士学位论文 第一牵文献综述 i _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ l 蛋白( s i l l c a b i n d i n g p r o t e i n l l 7 ，s b p l l 7 ) 。s b p l l 7 是以p e p k 为基元组成的高度重复序列蛋白， 其氨基酸组成与硅藻中发现的硅结合蛋白相似，富含带正电荷的碱性氨基酸，但其氨基酸排列顺 序与之明显不同。体外试验证明s b p l l 7 具有与硅结台井诱导硅沉淀的能力。为了检测硅结合蛋 白在水稻和其它禾本科植物体内的分布，史新慧等( 2 0 0 5 ) 根据s b p l l 7 的氨基酸保守片段和天 然抗原表位合成两个肽段做抗原，与匙孔嘁血蓝蛋白载体偶联后免疫兔子，获得了抗s b p l l 7 的 专一性抗体。免疫印迹检测表明s b p l l 7 的抗体不仅能识别水稻叶片硅结合蛋白，而且与玉米、 高粱、小麦、大麦、竹子等累积硅的禾本科植物中提取的硅结合蛋白有交叉反应说明与s b p l l 7 同源的硅结合蛋白广泛存在于禾本科植物之中。组织印迹法定位显示，硅结合蛋白主要分布在水 稻根、茎、叶的外表皮中，在根和叶的维管组织中也有分布( 史新蓠等，2 0 0 5 ) ，这与前人报道 的硅在水稻体内的分布( y o s h i d ae ta 1 ，1 9 6 2 ) 一致，说明此蛋白参与诱导和控制硅在植物体内 的沉积。然而，对于硅结合蛋白的研究目前只局限于以水稻为代表的禾本科植物的地上部叶片 对于根中硅结合蛋白的分布及其功能等尚未有详细的报道。 1 2 硅结合蛋白与沙套形成关系的研究 1 2 1 沙套的定义及其功能 很久以来人们就发现大多数禾本科植物根表能够粘附大量的土壤颗粒，形成所谓的“沙套” ( b a i l e ya n ds e h o l e s ，1 9 9 7 ) 。人们起先在沙生植物的根系中发现这一结构，以为沙套是沙生禾本 科植物所特有的，称之为“s a n ds h e a t h ”，后来在许多中生( 指在中等湿度条件下生长的植物) 汞 本科植物中。包括所有谷类、玉米及高粱( w u l l s t e i na n dp r a t t ，1 9 8 1 ) ，一些非禾本科沙生单子叶 植物的根系( d o d de ta 1 ，1 9 8 4 ) ，及一些豆科植物的侧根和小部分双子叶农作物的根系( m e c u l l y ， 1 9 9 9 ) 中都发现了沙套。“s a n ds h e a t h ”后被改为“r h i z o s h e a t h ”，依照人们的传统习惯称之为“沙 套”，也被译作“根鞘”是指植物根表粘附了大量土壤颗粒所形成的长度1 5 c m 到3 0 c m 左右的 鞘状物( 中科院植物所编著，1 9 8 3 = m e c u l l y ，1 9 9 9 ) 。沙套主要在成熟的根毛区形成，根尖区不 能形成沙套。沙套是一个连续体，当根系运动时，沙套土会随之运动，从而与周围士体分离；其 形成受植株根系的影响( w a t te ta 1 ，1 9 9 4 ) ，是植物与土壤相互作用的典型例证。 很多研究表明，沙套具有多种生理和生态功能：1 提高根系防风固沙和耐地表高温的能力， 减少流沙对根系摩擦的损伤( 买买提，1 9 9 0 ) ；2 抗旱、保湿、贮水，提高根系水导度，即使部分 根系因受大风暴的侵袭而裸露于沙面之上，植株也不会死亡( b r i s t o w e t a l ，1 9 8 5 ：w a n g e t a l ， 1 9 9 1 ；n o r t ha n dn o b e l ，1 9 9 2 ；h u a n g e t a l ，1 9 9 3 ；y o u n g ，1 9 9 5 ；g r e t c h e na n dp a r k ，1 9 9 7 = n o r t h a n dn o b e l ，1 9 9 7 = t a l e i s n i ke ta 1 ，1 9 9 9 ) = 3 增强根系对松散沙化基质的固着，提高植物抗倒伏能 力( k i s l e v e t a l ，1 9 7 9 ；e n n o s ，1 9 9 1 ；v e l t l l ae t a l ，2 0 0 5 ) ，同时稳定土壤结构( a m a le t a l ，2 0 0 4 ； o t h m a ne t a l ，2 0 0 4 ：b h a t n a g a ra n d b h a t n a g a r ，2 0 0 5 ) ，同定沙凡和减轻水土流失；4 沙套的稳定 存在扩大了植物根系与土壤的接触面积有利于植株对水分和养分的吸收( w a t te ta 1 ，1 9 9 4 ) ， 并在根与土壤颗粒之间形成连续的水膜，促进根系在干旱环境下对z n 、f e 等营养元素的活化和 吸收( n a m b i a r ，1 9 7 6 ：c - r i t u a le t a l ，2 0 0 1 ) ；5 增加有机质含量，增加根际有益微生物( 如可分 解p 的微生物和联合固n 微生物) 的数量：6 把有害离子固着在易受损伤的根尖之外，从而减轻 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 诸如三价铝、二价镉等离子对根尖分生组织的毒害( h o r s t e t a l ，1 9 8 2 ；m o r e le t a l ，1 9 8 6 ) ，同 时可以通过固定病原真菌游离的孢子来阻挡有害微生物的侵袭( h i n e ha n dc l a r k e ，1 9 8 0 ；i r v i n ga n d g r a n t ，1 9 8 4 ：s i v a s i t h a m p a r a ma n dp a r k e r ，1 9 7 9 ) ，保护根尖免受病害的侵袭。 1 2 2 沙套形成的可能机制 植株根系分泌的粘液以及根际微生物分泌的粘液与土壤颗粒相互作用，形成沙套( p e t e r s o n a n d f a r q u h a r ，1 9 9 6 ) ，其中包含着重要的化学作用及生物的和物理的作用，既与植物自身有关， 又与其生长的微土域理化性质及气候等环境因素相关。现代细胞生物学研究证明，不论是低等的 单细胞生物还是高等植物，为了在松散的固体介质上生长和定居，细胞通常都会分泌粘液与介质 表面发生粘附作爿j 。例如，具有防风固沙作用的荒漠生物土壤结皮，就是由细菌、藻类、真菌、 地衣和苔藓等分泌的粘液与沙粒相互粘结所形成的( 胡春香等，2 0 0 3 ；徐杰等，2 0 0 3 张元明， 2 0 0 5 ) 。对于在沙套形成过程中起关键作用的粘合剂的研究很多一般认为是粘液类物质起着主 要作用。沙套中的粘液可能有多种来源：根冠细胞、土壤微生物、根表皮细胞、根毛等( w u l l s t e i n a n d p r a t t ，1 9 8 1 ) 。但是目前对于粘液的来源以及其中起粘结作用的组分尚存在争议。 1 2 2 1 根冠粘液对沙套形成的影响 植株根冠粘液由多糖分子与许多结构复杂的寡糖支链组成，末端糖基化( m i k i e t a l ，1 9 8 0 ； v e r m e e ra n dm c c u l l y ，1 9 8 2 ：w a t te ta 1 ，1 9 9 3 ) 。v e r m e e r 和m c c u l l y ( 1 9 8 2 ) 以玉米z e am a y s 为材料发现从沙套粘液的特征上看，多数沙套粘液来源于根冠。根冠粘液在土壤中起着重要的 润滑作用，而且在湿润的土壤条件下粘液的润滑效果更好( o u i n e la n dm c c u l i y 1 9 8 6 ) 。研究表 明，粘液遇水会明显膨胀 而将移出土壤的根尖置于接近土壤水分含董的湿度下观察，或者将根 尖迅速冷冻后进行观察，粘液都没有发生膨胀( m c c u l l ya n ds e a l e y ，1 9 9 6 ) 。 关于沙套形成的机理，m c c u l l y ( 1 9 9 5 ) 作出这样一种假想：由于晚间植株代谢缓慢，根系 向上运输的水分减少，土壤水分含量高，使得残留在根冠的粘液遇水发生膨胀，从而接触和粘结 一些细碎的士壤颗粒；白天植株代谢旺盛，根压作用和蒸腾拉力使得水分持续向地上部供应，土 壤水分含量下降，粘液失水收缩至根表，其黏附的土粒也同时被带到根表，从而在植株根系成熟 区形成了沙套的雏形，这样持续的干湿交替使得沙套稳固存在( w a t te t a l ，1 9 9 4 ；m c c o l i y ，1 9 9 5 ) 。 粘液粘附土壤，主要是通过中性的糖基与土壤颗粒之间氢键的结合作用( w a t t e t a l ，1 9 9 3 ) 。 1 2 2 2b o r d e rc e l l 对沙套形成的影响 m c c u l l y 研究小组在对玉米沙套的观察中发现一些“脱落的根冠细胞”，甚至存在于距离根冠 较远的土壤( v e r m e e ra n dm c c u l l y ，1 9 8 2 ) 。对于这些细胞，h a w e s 等人( 2 0 0 0 ) 称之为“b o r d e r c e l l ”，并给出这样的定义：当把植株根尖最于水中时，数秒钟内扩散到溶液中的细胞。一条玉米 根一天可以产生1 9 3 0 到3 2 2 0 个b o r d e rc e l l ( i i j i m ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。这些细胞来源于根冠分生组织 ( f e l d m e n 1 9 8 4 ) 通过多聚半乳糖醛酸酶的活动按照一定的次序分离下来( h a w e sa n dl i n ， 1 9 9 0 ) 。作为根冠细胞的一部分，以前将其称为“脱落的根冠细胞”，但是“b o r d e r c e u ”较前者更 能够强调出这个特殊的细胞群所构成的介于植物根表与土壤之间的有机界面( h a w e se ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。 一直以来人们都忽略了b o r d e rc e u 作为根系结构和功能的重要组成，一个很主要的原因是以 前的观点认为这一细胞群只是根冠新陈代谓f 的副产物，是一群濒临死亡的细胞。事实上，只有少 数家族如菊科植物的b o r d e rc e l l 在脱离根冠表面之前已经死亡，而对_ 丁i 大多数的物种而言，b o r d e r c e l l 的存活率可以达到9 0 以上( b f i g h a me t a l ，1 9 9 5 ) ，田间调查表明( v e r m e e ra n d m c c u l l y 1 9 8 2 ) ，玉米的b o r d e r c e l l 可以在土壤中存活一周甚至更久，而溶液培养的玉米和豌豆的b o r d e rc e l l 则更能存活长达三个多月之久( k n u d s o n ，1 9 1 9 ) 。根冠细胞分泌粘液，并将粘液和b o r d e r c e l l 释 放到 十体这是所有禾本科植物和许多中生植物的典型特征( m i k ie t a l ，1 9 8 0 ：h a w e s ，1 9 9 0 ) 。 b o r d e rc e h 离体后仍然具有活性，可以沿着根的边缘游动，并且可被染料着色( v e r m e e ra n d m c c u u y 1 9 8 2 ：g u i n e la n dm c c u h y ，1 9 8 7 ；m c c u u ya n dc a n n y ，1 9 8 8 ：h a w e s ，1 9 9 0 ) 。对b o r d e r c e l l 进行培养发现这一细胞群能够分裂并分化，发育成有机组织( h a w e se t a l ，2 0 0 0 ) 。大多数植 物的b o r d e r c e l l 在脱离根冠后，性质和功能上都发生了很大的变化( h a w e se t a l ，2 0 0 0 ) 新陈代 谢活力加快，基因表达则完全改变，与原根冠细胞的m r n a 、蛋白质组成发生了根本性的变化 ( b a g h a me t a l ，1 9 9 5 ) a 对于b o r d e rc e l l 的功能，一般认为保护了根尖顶端分生组织，并帮助根系下扎进入土壤( e s a u ， 1 9 7 6 ：s i e v e r sa n d b r a u n ，1 9 9 6 ；i f i i m ae t a l ，2 0 0 3 ) 。i u i m a 等人( 2 0 0 4 ) 以玉米为材料，人为移 去根系b o r d e rc e h 从而研究其功能，发现在紧实的土壤中，完整的玉米种子根在土壤生长受到 0 3 1 m p a 的压力，而去掉b o r d e rc e u 的根承受0 5 2 m p a 的压力，原因之一可能是b o r d e rc e h 可以 润滑根一土界面减少土壤对植株根系生长的阻力( i f i i m ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。研究表明，与根冠粘液 相比，b o r d e r c e l l 能为根冠表面提供更多的润滑荆降低土壤机械阻力；b o r d e r c e l l 本身及其粘液 的共同作用降低了根尖与土壤之间的摩擦阻力( b e n g o u g ha n dm c k e n z i e ，1 9 9 7 ) 在润滑根土界 面方面的贡献率高达5 8 ( j i m a e t a l ，2 0 0 4 ) 。谷类和豆科作物的b o r d e r c e l l 分泌粘液所形成的 粘液层还可以吸引病原菌侵染自身从而起到降低致病微生物侵染、损伤根尖的危害( h a w e sa n d p u e p p k e ，1 9 8 7 ；h a w e s e t a l 2 0 0 0 ) 。 1 2 2 3 微生物粘液对沙套形成的影响 据报道，在沙套表面和内部有固n 细菌等多种微生物( w u 】l s t e i ne t a l ，1 9 7 9 ：w u h s t e i n ，1 9 8 0 ： w u l l s t e i na n d p r a t t ，1 9 8 1 ；g o c h n a u e r e t a l ，1 9 8 9 ) ，这些微生物的分泌物不可避免地会对沙套粘 液有贡献( p e a r s o na n df a r q u h a r ，1 9 9 6 ) 。然而沙套微生物粘液的化学组分尚属未知，只知道其 中包含高组分的蛋白成分，并且较植物粘液的亲水性更强。w a t t 等人( 1 9 9 3 ) 认为微生物粘液粘 结土壤颗粒的机制与植物牯液粘结土壤颗粒的机制可能会有所不同。 4 1 2 2 4 根毛对沙套形成的影响 根毛由植物根系表皮细胞发育而成，具有顶端生长能力，其长度可达2 5 m m 。根毛表面积占 根系总表面积的7 7 ( p a r k e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 是根系接触土壤的主要位点。w a t t 等人( 1 9 9 4 ) 认 为根毛在沙套形成中的作用仅限于提供了可供扩展的框架；m a t s u y a m a 等人( 1 9 9 9 ) 也认为根毛 并不是造成土壤颗粒团聚的主要原因，根冠粘液、土壤颗粒、脱落的根冠细胞和一些根际微生物 控制了沙套的形成。 然而根毛也被一些学者认为是参与沙套形成并维持其稳定性的重要构成之一( s a c h s ，1 8 6 5 ： o o o d c h i l da n dm y e r s ，1 9 8 7 ；m c c u l l ya n dc a n n y , 1 9 8 8 ；h u a n ge ta 1 ，1 9 9 3 ) 。一些学者用扫描电镜 观察沙套的结构时发现，根毛遍布整个沙套，而且只有根毛区才能形成沙套，没有根毛的根尖区 不能形成沙套，沙套的厚度大致等同于根毛的长度土壤颗粒与根毛的结合位点存在着粘液物质 ( w u l l s t e i na n d p r a t t ，1 9 8 1 ：f y s o na n d o a k s ，1 9 8 7 ；f y s o ne t a l ，1 9 8 8 ；p e t e r s o na n d f a r q t t h a r ， 1 9 9 6 ；s k e n ee ta 1 ，1 9 9 6 ) 。据此认为，根毛与土壤颗粒的紧密结合可能不仅仅是出于根毛的物理 缠绕作用，也可能是因为根毛能产生某种粘合剂，粘结土壤颗粒( b a i l e ya n ds c h o l e s ，1 9 9 7 ) 。 对多种高粱属植物的观察发现，高粱根毛会产生粘稠的小液滴( w e r k e r a n dk i s l e v ，1 9 7 8 ) ， 还发现许多植物的根毛表面都有一层未知的粘液类物质( d a r t 。1 9 7 1 ；g r e a v e sa n dd a r b y s h | r e ， 1 9 7 2 s p r e n t ，1 9 7 5 ；p r i na n dr o u g i e r ，1 9 8 6 ) 。但已有的研究表明，多糖类粘液集中分布在根尖， 根毛区几乎没有( m c c u u y , 1 9 9 9 ) ，说明根毛分泌的是多糖之外的其它粘液类物质。人们对植株 根表皮细胞的分泌物所知不多，对根毛的分泌物更是知之甚少( p e t e r s o na n df a r q u h a r ，1 9 9 6 ) 。 有关根毛粘液组分的生物化学研究，几乎未见任何报道( n g u y e n ，2 0 0 3 ) 。 昂新研究报道，真菌表面固定沙粒的粘液主要为糖蛋白( d r i v e re ta 1 ，2 0 0 5 ) ) 我们用硅结 合蛋白在水稻根际定位，发现这种蛋白不仅大量存在于根毛和植株根表，而且在土壤团聚体中也 有较高的分布，于是提出猜想，认为根毛不仅通过扩展物理框架参与沙套形成的物理过程，更重 要的是通过分泌化学物质，如蛋白，粘结土壤颗粒，从而参与沙套形成的化学过程。 1 2 2 5 环境因素 粘液的真实来源及其具体组分仍存在着争议，但可以肯定的是，土壤水分含量作为影响沙套 形成的重要因素，千湿交替现象对于粘液的粘结作用有着十分重要的影响( o a d e s ，1 9 7 8 ；m o r e l 鲥a 1 ，1 9 9 1 ) 。田间观察发现，在干早条件。f 形成的沙套比在湿润条件下形成的沙套体积更大， 连贯性更好与根系的粘结也更为紧密( w a t te ta 1 ，1 9 9 4 ) 。w a t t 等人( 1 9 9 4 ) 在田间对于玉米 和其他中生植物的观察中偶然发现，对于多年生草本植物，酷夏干旱土壤中形成的沙套比早春湿 润土壤中形成的沙套半径大、韧性好，与根结台得更加紧密，不易从根表面分离。对于沙漠作物 f e r o c a c t u sa c a n t h o d e s 和仙人掌o p u n t i al i c u s i n d i c a 的研究同样表明，无论是在活体或是离体根 系，沙套与根系结合的紧密程度与所处土体的湿润程度直接相关；土壤越干旱，土壤颗粒与根表 结合越紧密；反之在湿润的土壤，沙套士很容易从根表脱落( n o r t h a n d n o b e l ，1 9 9 2 ；h u a n g e t a 1 ，1 9 9 3 ) 。w a t t 等人( 1 9 9 4 ) 以玉米z e a m a y s 为例对其进行量化分析，结果发现，对于同样直 5 中国农业大学预士学位论文 第一章文献综述 径的玉米主根，在干旱条件下( 土壤含水量9 ) 形成的沙套体积是根体积的5 倍。而湿润条件 下( 土壤含水量2 0 ) 形成的沙套体积仅是根体积的1 5 倍。所以，在干旱的土壤条件下沙套才 能发育得更加完全。 b a i l e y 和s c h o l e s ( 1 9 9 7 ) 通过对南非1 3 0 种草的调查发现，沙套的有无由遗传决定而其发 育程度受土壤质地、降水状况等环境因素的影响。高的土壤粘粒含量可以导致根系与土壤间较大 的摩擦阻力( i i i i m a e t a l ，2 0 0 4 ) ，不利于沙套的发育。土壤沙粒含量越高，土壤越干旱根毛密 度越大，形成的沙套越紧实，半径也越大：但是在特大降雨量区域，不同植物间形成的沙套厚度 近似。土壤质地不再是影响沙套发育的因素( b a i l e ya n ds c h o l e s ，1 9 9 7 ) 。 1 3 问题的提出 史新慧( 2 0 0 5 ) 从水稻叶片的新鲜硅体中分离到了硅结合蛋白，且体外实验表明该蛋白具有 沉积硅的作用，一定程度上支持了硅的主动沉积理论，即硅在水稻n | 片的沉积是一个以硅结合蛋 白为模板，受硅结合蛋白诱导的主动过程。但是，植株地上部蒸腾旺盛，叶片受蒸腾作用影响强 烈，故不可排除硅随水分运输丽被动沉积的可能。因此我们希望通过对硅质化程度很高的高粱根 系进行研究，旨在探索在无蒸腾作用的植株根系，是否存在着控制硅沉积的蛋白，即硅结合蛋白 并研究根系硅结合蛋白的功能及其分布情况。 史新鬻等人( 2 0 0 5 ) 的研究表明，以水稻为代表的禾本科植物在地上部存在着硅结合蛋白， 积累了大量的硅，但是在并不积累硅的植株根表皮细胞外侧也分布了大量的硅结合蛋白，其功能 尚属未知。观察发现，禾本科植物根表聚集大量土壤颗粒形成沙套，故我们提出猜想，认为沙套 是硅结合蛋白在植株根表实现其功能的外在表现。另外，前人的研究表明根毛在沙套中大量存在， 根毛与土壤颗粒的粘结位点有粘液类物质( w u l l s t e i na n dp r a t t ，1 9 8 1 ；f y s o na n do a k s ，1 9 8 7 ：f y s o n e t a l ，1 9 8 8 ；p e t e r s o na n df a r q u h a r ，1 9 9 6 ：s k e n ee t a l ，1 9 9 6 ) ，该粘液物质是否仅仅来源于根冠， 其中有无根毛的分泌等问题也需要进行更深入的研究。 6 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 4 技术路线 1 4 1 高梁根内皮层硅结合蛋白功能的研究 围1 1 高粱根内皮层硅结合噩白的研究路线 f i g 1 1s c h e m a t i c d i a g r a ma b o u tr e s e a r c ho f t h cs i l i c a - b i n d i n g p r o t e i n i nc n d o d c t m i so f s o r g h u mr o o t 7 中国农业大学硕士学位论文 第一帝文献综述 一i 一 8 1 4 。2 硅结合蛋白与沙套形成关系的研究路线 - 、， 圈1 - 2 硅结合蛋白与沙套形成关系的研究路线 f 旭1 - 2s c h e m a t i cd i a g r a m o f t h er e s e a r c ha b o u tr o l e so f t h es i l i c a ，b i n d i n g p r o t e i n i nr h i z o s h e a t h f o r m a t i o n 中国农业大学硕士学位论文 第二章高粱根内层硅结台蛋白功能的研究 2 1 引言 第二章高梁根内皮层硅结合蛋白功能的研究 高粱属植物是一类重要的积累硅的经济作物。物种不同，生长环境不同，硅可能被运输到的 植株组织部位也不同( l u xe ta 1 ，2 0 0 3 ) 。在高粱叶片表皮，硅高度集中沉积在各个硅质化细胞 的外壁。以高粱为代表的少数采本科植物的根系组织会发生硅质化。植株根系对硅有三种基本分 配模式( s a n g s t e ra n d p a r r y ，1 9 8 1 ) ；受凯氏带的限制；漫布根系所有的组织；在细胞间隙沉积。 商粱根中硅的分配为第一种模式以分布规则的半球形硅体的形式沉积在内皮层内切向壁上。用 x 射线微量分析及扫描电镜对高粱新鲜根内皮层的研究进一步肯定了它组织学上的硅质化特征 ( l u xe ta 1 ，2 0 0 2 ) 。剥去高粱根的外皮层组织，可见突起的硅球在细胞内皮层内切向壁上纵向 排列，形成一列连续的硅球，偶尔可见两列，密度约为2 7 0 0 r a m 2 ，与植株根系的硅含量无显著 相关性( l u xe ta 1 ，2 0 0 2 ) 。将植株从缺硅培养基转移到加硅培养基培养两个小时后，硅球开始 在内皮层的内切向壁发育( l u xe ta 1 ，2 0 0 3 ) 。s a n g s t e r 和p a r r y ( 1 9 7 6 b ；1 9 7 6 c ) 对硅球的形成 调控提出两种假说，一种假说认为硅球的形成受物化控制，另一种假说认为硅球的形成在一定程 度上受原生质控制。l u x 等( 2 0 0 2 ) 的研究结果支持了物化调控的假说。 高粱根系内皮层的高度硅质化是与其强的耐旱性相关的特征。这一现象起初发现于水稻根系 ( 1 a xe ta 1 ，1 9 9 9 ) ，但是在高粱中表现得更为明显。从解剖学角度认为这种耐旱的特性与厚壁 组织厚的细胞壁结构和次生木质部较少的导管相关( s a l i he t a l ，1 9 9 9 ) ；另一结构上的特征是其 内皮层内切向壁细胞的高度硅质化，有效阻止了由于蒸