（微生物学专业论文）产碱性木聚糖酶菌株的筛选及产酶条件研究.pdf

山东农业大学硕士学位论文 符号说明 英文缩写英文名称 a m p a m p i c i l l i n b pb a s e p a i r d dh 2 0 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d n s m 们限 i p t g 中文名称 氨卞青霉素 碱基对 双蒸水 3 , 5 - d i n i t r os a l i e y u ea c i d3 , 5 一二硝基水杨酸 d e o x y r i b o n u e l e o s i d et r i p h o s h a t e脱氧核苷三磷酸 o p t i c a l d e n s i t y r e v o l u t i o np e rm i n u t e s o d i u m d o d e 圮y ls u l f a t e b d - 半乳糖苷 单i f _ 每毫升 吸光度 聚合酶链反应 转f 分钟 十二烷基硫酸钠 i r i sd r o x y m e t h ya m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 0 b r o 要= 4 。h 1 。r 0 - 3 - n d 0 1 y 1 。p 。d i g吲哚p - d 半乳糖苷 a l a e t o s t d e 。 m 腿 蛐 哪 耋 猁 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科 学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和 做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的 法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的 规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论 文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东 农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文 和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 日期：护7 6 一，尹 ， 山东农业大学硕士学位论文 摘要 木聚糖酶是指可以将木聚糖催化水解成低聚木糖或木糖的酶系总称， 包括多种内切酶和外切酶。内切b - l d - 木聚糖酶( e n d o - 1 3 1 , 4 - d - x y t a m s e ) 【l 三c3 2 i 8 】，简称木聚糖酶，是木聚糖降解酶系中最关键的酶，它在食品、 饲料、造纸等行业具有广阔的应用前景。近年来，随着酶法造纸技术的 发展，碱性木聚糖酶的研究与开发已引起了人们的高度关注。本文从产 碱性木聚糖酶菌株的筛选开始，对碱性木聚糖酶发酵工艺条件以及部分酶 学性质进行了系统的研究，主要研究结果如下： 1 以自制木聚糖样品为唯一碳源，采用平板透明圈法和摇瓶发酵相结 合的方法，从土壤中分离、筛选到了一株产木聚糖酶的菌株x y - 7 ，摇瓶发 酵酶活力为1 8 0i u m l 。通过1 6 8r d n a j 芋列分析，并结合菌株x y - 7 的形态 特征、培养特征和生理、生化特性，鉴定其为坎皮纳斯类芽孢杆菌 ( p a e n i b a c i l l u sc a m p i n a s e n s i s ) 。迄今为止，尚未见坎皮纳斯类芽孢杆菌产 木聚糖酶的报道。 2 通过单因素实验和正交实验对菌株x y - 7 的产酶培养基组分、发酵工 艺条件进行了研究，确定了菌株x y - 7 发酵产酶的最佳培养基( 粤q ：麸皮 5 0 ，酵母膏5 ，玉米浆7 ，硫酸镁o 2 ，氯化钠o 5 ，磷酸氢二钾o 5 ，p i - i8 o 。 最佳培养条件：2 5 0 r a l 摇瓶装液量3 0 r a l ：培养温度3 7 ；摇床转速1 8 0 r m i n ；接种种龄1 4 h ；接种量3 ；发酵周期4 8 h 。条件优化后，菌株x y - 7 摇瓶发酵产酶活力由1 8 0 y ，m i ，提高到了1 6 7 9i u m l 。 3 对菌株x y - 7 木聚糖酶的部分酶学性质进行了研究，结果显示：菌株 x y - 7 所产木聚糖酶热稳定性较好，6 0 c 保温2 h 仍能保持7 3 以上的酶活 力，酶的最适作用温度为6 0 ；该酶的适宜作用p h 范围较广，在p h6 o 9 0 范围内均能保持较高的活性，最适作用p h 值为7 0 ，在p h9 o 时相对 酶活力高达6 8 ，比对文献有关碱性木聚糖酶的研究报道，菌株x y - 7 木 聚糖酶耐碱性较强。 关键词；木聚糖碱性木聚糖酶坎皮纳斯类芽孢杆菌筛选培养基 产碱性术聚糖酶菌株的筛选及产酶条件研究 a b s t a c t x y l a n o l y t i ce n z y m g s ，as y s t e mo fh y d r o l y t i ce n z y m e s ，a c tc o o p e r a t i v e l y t oc o n v e r tx y l a ni n t oi t sc o n s t i t u e n t s u g a r s a m o n gt h e s e ，x y l a n a s e ( e n d o - 争1 ，4 - d - x y l a n a s e ) e c 3 2 1 8 】p l a y s ac r u c i a lr o l ea n dh a s g r e a t p o t e n t i a la p p l i c a t i o n si np u l pa n dp a p e ri n d u s t r y , f o o di n d u s t r ya n df e e d i n d u s t r ye t e s i n c et h ed e m o n s t r a t i o nt h a ta l k i - l t e a t e dw o o dp u l pc a l l b e b i o l o g i c a l l yb l e a c h e db yx y l a n a s ei n s t e a do fb yt h eu s u a le n v i r o n m e n t a l l y d a m a g i n gc h e m i c a lp r o c e s ss u c ha sc h l o r i n e ，t h er e s e a r c hf o rt h e r m o s t a b l e a l k a l i n ex y l a n a s eh a sb e e ne x t e n s i v es t u d i e d i nt h i sp a p e r , w ec a r r i e do u ta s e r i e so f e x p e r i m e n t s , i n c l u d i n gs c r e e n i n g ，i d e n t i f y i n g o p t i m i z i n g f e r m e n t a t i o np r o c e s s ，a n ds t u d y i n gc h a r a c t e r i s t i c so fa l k a l i n ex y l a n a s e t h e m a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 ax y l a n a s ep r o d u c i n gs t r a i nx y - 7w a so b t a i n e df r o ms o i lb ya s s a y i n g h y d r o l y z e dc i r c l e o nt h es e l e c t i v em e d i u ma n dx y l a n a s ea c t i v i t yu n d e r s h a k e - f l a s kf e r m e n t a t i o n , i nw h i c hx y l a nw e r eu s e da st h eo n l yc a r b o ns o u r c e t h ex y l a n a s ea c t i v i t yu n d e rf l a s kf e r m e n t a t i o nw 勰1 8 0i u m l b a s e d0 1 1i t s m o r p h o l o g i c a l 。p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lp r o p e r t i e sa sw e l la st h e1 6 s r d n as e q u e n c e a n a l y s i sr e s u l t , s t r a i nx y - 7w a st e n t a t i v e l yi d e n t i f i e d a s p a e n i b a c i l l u s c a m p i n a s e n s i s , w h i c h h a sn e v e rb e e n r e p o r t e da m o n g x y l a n a s c - p r o d u g t i o ns t r a i n s 2 t h r o u g has e r i e so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，e f f e c t so fc a r b o ns o u r c e , n i t r o g e ns e a r f ea n do t h e rf a c t o r so nx y l a n a s ep r o d u c t i o nf r o ms t r a i nx y - 7 w e r es t u d i e d t h er e s u l ts h o w st h a tt h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o np r o c e s sf o r e n z y m ep r o d u c t i o nw e r e ：5 w h e a tb r a n , o 7 c o r ns t e e p ，o 5 y e a s te x t r a c t , o 0 5 n a c l ，o 0 5 k 2 h p 0 4 ，o 0 2 m g s 0 4 7 h 2 0 ，p h 8 0w i t h4 8 h c u l t i v a t i o na t3 7 c u n d e rt h eo p t i m i z e df e r m e n t a t i o np r o c e s s ，t h ex y l a n a s e p r o d u c t i o nb ys u a i nx y - 7w a si n c r e a s e df r o m1 8 01 u m lt o1 6 7 9i u m l 3t h es t u d yo nc h a r a c t e r i s t i c so fx y l a n a s ef r o ms t r a i nx y - 7w a sc a r r i e d o u t t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eo p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o no fx y l a n a s ew a sp h 7 0a t6 0 c r e s p e c t i v e l y t h ee 1 1 z y m ed i s p l a y e dg o o dt h e r m a ls t a b i l i t y , w h i c h 2 山东农业大学硕士学位论文 r e m a i n e d7 3 o fi n t i a la c t i v i t ya f t e ri n c u b a t e df o r2 h 砒6 0 a tt h es a m e t i m e ，t h ex y h n a r e m a i n e dh i g h e ra c t i v i t yo v e rar a n g eo fp h6 0t o9 0 ，a n d i t sa c t i v i t yn ：i n a i n e d6 8 o fi n t i a la c t i v i t ya tp s9 0 c o m p a r e dw i t ho t h e r r e p o r t sa b o u ta l k a l i n ex y l a n a s e s ，t h ex y h n a s ep r o d u c e db ys t r a i nx y - 7h a s s o m ea d v a n t a g e so nb o t ht h e r m o s t a b i l i t ya n da l k a l i n er e s i s t a n c e a l lt h e s e p r o p e r t i e se x h i b i t e db yt h ex y l a m s ef t o ms t r a i nx y - 7i n d i c a ：t et h a tt h ea i 刁，m e i sa na l k a l i n ex y l a m s e 。 k e yw o r d s ：x y l a n a l k a l i n e x y h n a s e p a e n i b a c i l l u sc a m p i n a s e n s i s s c r e e n i n g m e d i u m 3 产碱性术聚糖酶菌株的筛选及产酶条件研究 1 引言 1 1 木聚糖及其降解酶系 1 1 1 木聚糖简介 木聚糖( x y l a n 是植物半纤维素的主要成份，是除纤维素之外自然界中 最为丰富的多糖，也是自然界中最为丰富的可再生资源之一。自然界中存 在的木聚糖形式多样，结构差异非常大，且多为异型多糖( 见图1 ) 。木聚 糖的主链由p d 木糖残基经p 1 , 4 糖苷键连接，侧链上连有多种不同类型 的取代基( d e k k e r 。1 9 9 9 ) ，比如主链木糖残基的c - 2 、c 3 位可单独或同时 发生乙酰化l 】l a l ( a m i ，1 9 9 9 ；谢晌明，2 0 0 3 ) ，还可以通过a - 1 。3 糖昔键与 a 山阿拉伯糖残基相连( p e t i t - b e n v e g n e n ，1 9 9 8 ) ，或通过小l ，2 糖苷键与4 0 甲基葡萄糖醛酸残基相连( s h a o ，1 9 9 5 ) 。有些木聚糖还可通过l 阿拉伯糖 残基的c - 5 与阿魏酸( f e r u l i ca c i d ) 或香豆酸( p - c o u m a r i ca c i d ) ( g u l a k a m ，1 9 9 9 ) 连接，或将木糖或聚合的阿拉伯糖作为其侧链( k u h k a r n i ，1 9 9 9 ) 。 图l 木聚糖的一般结构及其降解酶系的作用位点 f i g 1x y h na n dx y l a n o l y t i ce n z y m e si n v o l v e di nt h ed e g r a d a t i o no f x y l a n 1 1 2 木聚糖降解酶系 广义上讲，木聚糖酶是指可以将木聚糖催化水解成低聚木糖或木糖的 复合酶系。由于不同来源的木聚糖在主链聚合度支链残基的种类、数量、 长度及其在主链上结合位点方面的不同，要彻底降解木聚糖需要多种酶的 4 山东农业大学硕士学位论文 共同参与( w o n g ，1 9 9 8 ) 。木聚糖酶主要包括以下几种类型f p o u t a n e n ，1 9 9 1 ； 江正强，2 0 0 3 ：崔月明，2 0 0 5 ；赵玮莉，2 0 0 5 ) ： 内切p l ，4 - d - 木聚糖酶( e n d o 争l ，4 - d - x y l a n a s e ) 【e c3 2 1 8 】，简称木 聚糖酶，作用于木聚糖主链的b 1 , 4 - 糖苷键，主要生成木二糖和木三糖等 寡糖，很少生成木糖偿b 义明，1 9 9 7 ) 。 b d - 木糖苷酶( 口- d - x y l o s i d a s e s ) p c3 2 l 3 7 3 ，作用于寡聚木糖的还 原端，并逐个释放出木耱。 * l 阿拉伯糖苷酶陋l - a r a b i n o f u r a n o s i d a s e s ) ，并分为两种类型，一 种是内切1 ，5 融l 阿拉伯聚糖酶 e c3 2 。1 。9 9 ，只对线型阿拉伯聚糖侧链 有活性；另一种是外切型的旺- l 阿拉伯糖苷酶 e c3 2 1 5 5 ，它同时对分 枝阿拉伯聚糖有活性( c o u r i t i n ，2 0 0 2 ) 。 旺- d - 葡萄糖醛酸酶m - d - g l u c u r o n i d a s e s ) e c3 2 1 1 3 9 】，主要作用于 4 - o - 甲基葡萄糖醛酸与木糖之问的c t - l , 2 - 糖苷键。 乙酰木聚糖酯酶( a c e t y l x y l a ne s t c r a s c s ) e c3 1 1 6 】，作用于木糖残 基的c 2 和d 3 位上的乙酰基( k u l a k a m i ，1 9 9 9 ) 。 酚酸酯酶( p h e n o la i de s t e r a s e s ) ，主要包括阿魏酸酯酶( f u r u l i ca c i d e s t e r a s e s ) 8 c3 1 1 7 3 和香豆酸酯酶( p - c o u m a r i ca c i de s t e r a s e s ) 【e c3 2 1 】，前者主要作用于阿魏酸与阿拉伯糖残基之间的酯键，后者则主要针对 香豆酸和阿拉伯糖残基之间的酯键产生作用( p i 】l s ，1 9 9 3 ) 。 自然界中存在的木聚糖结构比较复杂，要完全降解需要如上所述多种 酶的参与，但通常文献中所说的木聚糖酶是指内切b 1 , 4 - i ) 木聚糖酶，它 主要负责木聚糖主链骨架的降解，是木聚糖降解酶系中最关键的酶，也是 当前木聚糖酶研究的重点( 江正强，2 0 0 3 ) 。 1 1 3 木聚糖酶( 内切8 - 1 , 4 d 木聚糖酶) 的结构与催化特性 1 1 3 1 木聚糖酶的分子结构 在分子水平上，木聚糖酶由功能结构域、非功能结构域和连接区组成， 功能结构域又可进一步分为催化结构域( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) 、纤维素结 合结构域( c e l l u l o s e - b i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 和木聚糖结合结构域 ( x y l a n - b i n g d i n gd o m a i n ，x b d ) 等。不同微生物产生的木聚糖酶在分子结 构上有很大的差别，有的木聚糖酶只含有单一区域，即催化结构域，有的 产碱性术聚糖酶菌株的筛选及产酶条件研究 同时具备催化结构域和多种非催化结构域( 刘瑞田，1 9 9 8 ；张红莲，2 0 0 2 ) 。 木聚糖酶的催化结构域( c d ) 承担着酶对底物的水解功能，并可作为该 酶分类的基础。木聚糖酶的氨基酸组成在数量上变化很大，但其催化区在 大小上都趋向一致，且催化区特定位置上的谷氨酸和天冬氨酸对催化特性 却至关重要。木聚糖酶一般只有一个c d ，但也有含两个c d 的，如生黄 瘤胃球菌( r u m i n o c o c c u s f l a v i f a c i e n s ) 产生的木聚糖酶a ( 张红莲，2 0 0 2 ) 。 纤维素结合结构域( c b d ) 也存在于许多木聚糖酶分子中，其功能和氨 基酸组成与纤维素酶分子中的c b d 具有一定的相似性。存在c b d 的木聚 糖酶既能水解木聚糖，也能水解纤维素，被称为双功能酶。虽然c b d 不 是酶发挥催化功能所必需的，但它能调节酶对可溶性和不溶性纤维素底物 的特殊活力，促进酶对纤维素的水解作用。例如荧光假单胞菌 ( p s e v d o m o n a s f l u o r e n s c e n s ) 中木聚糖酶d ，它的全长和缺失c b d 的形式对 水解纸浆木聚糖是等效的，但含有c b d 的酶能更有效韵降低k m 值( 李加 强，2 0 0 3 ) 。 木聚糖结合结构域( x b d ) 主要负责酶分子与木聚糖底物的结合，但并 无独立催化功能。与c b d 相比，x b d 在木聚糖酶分子中较少存在，可能 是由于木聚糖多聚物中存在的多种类型取代基使得能够结合所有木聚糖 的蛋白区域在进化上比较困难所致。由于木聚糖侧链基团带有大量的负电 荷，木聚糖酶与木聚糖的结合主要是通过离子闻的静电作用，丽非特异性 结合( 周秀梅，2 0 0 5 ) 。t c n k a n 芒n 等研究表明，木聚糖酶在p n p i 时容易 与木聚糖结合，而p h p i 时，则基本不与木聚糖结合( t e n k a n e n ，1 9 9 5 ) 。 有的微生物，如t r i c h o d e r m ar e e s e i 的木聚糖酶结构中还含有热稳定 区( t h e r m o s t a b i l i t yd o m a i nt s d ) ( t o r r o n e n ，1 9 9 4 ) 。热稳定结构域的最大 特点是脂肪族氨基酸含量丰富，它很有可能是通过增加蛋白质分子的折叠 密度来提高酶的耐热性能的。与催化结构域相比，热稳定结构域中的天门 冬氨酸和谷氨酸残基的含量很少，这可能有利于避免温度上升过程中由这 两种氨基酸导致的酶变性失活( 崔月明，2 0 0 5 ) 。 连接序列( l i n k e rs e q u e n c e ，l s ) 主要负责木聚糖酶分子中各功能区域 的相连，其长度一般为6 5 9 个氨基酸残基，且丝氨酸残基或脯氨酸残基 含量丰富。不同来源木聚糖酶的连接序列之间同源性不高，且长度变化也 山东农业大学硕士学位论文 很大( 鄢永亮，2 0 0 3 ) 。 在许多木聚糖分子中都含有重复序列( r e p e a t e ds e q u c u c c ，r s ) ，其长 度一般为2 0 1 5 0 个氨基酸残基。虽然重复序列不是木聚糖酶发挥活性的 所必需的，但可能与酶的某些特性有一定的相关性。( p a t r i d g y ，1 9 9 5 ) 除了这些区域外，在多区域木聚糖酶中还存在某些未知功能的非催化 区，它们表现出了序列的高度可变槛。这些的木聚糖酶的非催化区要比催 化区的进化自由度大得多( p 砷她盱，1 9 9 6 ) 。 1 1 3 2 木聚糖酶的催化特性 木聚糖酶的催化特性包括底物组成的特异性、键的特异性和对取代基 底物的特异性。根据木聚糖酶对底物组成的特异性不同可将其分为特异性 酶和交叉特异性酶。前者只分解木聚糖的p - l ，4 糖苷键，后者除分解木聚 糖的b - 1 , 4 糖苷键外，还分解纤维素的b 1 4 糖苷键，这种底物特异性与 木聚糖的活性位点不同有关。特异性不严格的酶可与纤维素底物相作用， 而特异性严格的酶无此能力。底物特异性反应了酶与底物结合区而不是催 化区的不同仅0 瑞田，1 9 9 8 ；陆健，2 0 0 1 ) 。 根据木聚糖酶与底物作用时是否可释放出阿拉伯糖，将其分为脱支链 酶和非脱支链酶，这取决于木聚糖酶除了裂解主链连接键外，是否可除去 阿拉伯糖侧链取代基，前者多见于一些黑曲霉和链霉菌产生的木聚糖酶 ( w o o d ，1 9 8 6 ；w o n g ，1 9 8 6 ：g t a b s k i a ，1 9 9 1 ) 。 还有一些木聚糖酶，只作用于含有某取代基邻近的主链的键，如某些 黑曲霉产生的木聚糖酶( f r e d e r i k ，1 9 8 5 ) ，它们对线型木寡糖或除去阿拉伯 糖取代基的木聚糖无作用或几乎无作用。有的木聚糖酶可切开与4 - 甲基葡 萄糖醛酸取代基邻近的主链键( n i s 陆锄，1 9 9 1 ) ，可以看出该取代基的存 在是此类木聚糖酶发挥作用所必需的。 1 2 木聚糖酶的应用 1 2 1 术聚糖酶在食品工业中的应用 1 2 1 1 小麦面粉改良 目前，木聚糖酶在小麦面粉改良方面的应用主要体现在面包生产及馒 头、面条等传统食品的制作中( m a a t ，1 9 9 2 ；a u f i o ，1 9 9 6 ；m o n i c a ，2 0 0 2 ) 。 小麦面粉中的非淀粉多糖( n o n - s t a r c hp o l y s a c c h a r i d e s ，n s p s ) 的主要 产碱性木聚糖酶菌株的筛选及产酶条件研究 成份是阿拉伯木聚糖，其中水溶性阿拉伯木聚糖约占2 0 3 0 ，水不可 溶性阿拉伯木聚糖约7 0 8 0 ，它们在面粉中的含量虽然很少( 约占面粉 于基的2 3 ) ，但对面团的流变性质和面食品质有显著影响( r q e 强， 2 0 0 5 ) 。在面粉中添加适量木聚糖酶能使不溶性阿拉伯木聚糖增溶，改进 面团的持水性和机械加工性能，增加面包的体积，改善面包心质地，起到 抗老化、延长货架寿命的作用 程显好，2 0 0 4 ：m o n i c a ，2 0 0 2 ) 。 李里特等人的研究表明，当木聚糖酶添加量为0 3m l & g ( 面粉) 时，面 团的形成时间可减少5 0 2 e 右，面粉中适当地添加木聚糖酶，可明显地增 加面包的体积和比容，改善包心的弹性、硬度及柔软性( 张勤良，2 0 0 4 ； 李里特，2 0 0 4 ) 。木聚糖酶用于馒头加工具有独特的优势，它与淀粉酶、 脂肪酶、葡糖氧化酶等复配使用可使馒头平均体积增大，使馒头口感更细 腻、轻柔，弹韧性更好，保鲜时间延长至少l 天。但木聚糖酶与其它酶制 剂或乳化剂在使用中的复配比例还需继续研究，以改善馒头增白效果( 高 艳华，2 0 0 5 ) 。 1 2 1 2 生产低聚木糖 低聚木糖具有良好的生理学功能，它在人体内难消化( 肠道内残存率 高) ，且具有极好的双歧杆菌增殖效果，成人日服用量只要达到0 7 9 ，就有 明显的双歧杆菌增殖效果，远远低于其它低聚糖的服用量。此外，低聚木 糖的甜度仅次于蔗糖，且具有良好的酸碱稳定性和热稳定性。食用后不会 引起血糖水平上升，可替代葡萄糖作为稽尿病人的疗效食品( 江正强， 2 0 0 5 ) 。目前，低聚木糖主要是以玉米芯为原料提取其木聚糖后用木聚糖 酶催化水解制得。 1 2 ，i 。3 果蔬加工 果蔬细胞壁是由果胶质、纤维素和半纤维素等组成的网状结构，可阻 止细胞内容物的渗出。要将新鲜蔬菜、水果等的嫩软组织中的营养物质加 工成果蔬汁、干燥果蔬粉或速溶食品等，就必须破除包围在这些营养物质 外的屏障。 将木聚糖酶与纤维素酶、淀粉酶、果胶酶合理复配( 也有人称其为粥 化酶，果浆酶) 就可在极温和的条件下破坏果蔬原料的细胞结构，提高有 效成分的浸出率，增加汁液中营养物质和风味物质的含量，同时又可极大 山东农业大学硕士学位论文 地降低提取液的粘度，成倍提高汁液的浓缩效率或干燥效率，使果蔬汁的 澄清度等质量指标得到明显的提高。王素雅等人经过研究表明，4 5 条件 下，用0 0 8 的果浆酶处理香蕉浆1 2 0 r a i n 后得到了高品质的香蕉汁，既 保留了香蕉原有的营养成分，又大大提高了香蕉汁的得率和澄清度( 王素 雅，2 0 0 2 ) 。榨汁过程中，添加1 5i u g 的粥化酶可使南瓜出汁率增加4 5 3 ， 添加1 2i u m l 酶可使苹果汁和芹菜汁澄清度提高1 3 0 以上( 顾宇峰， 2 0 0 5 ) 。殷露琴等将淀粉酶、木聚糖酶和纤维素酶混合用于可可饮料生产 中，发现木聚糖酶可降低可可粉的粒径，提高饮料中可溶性固形物含量及 其溶解稳定性( 殷露琴，2 0 0 6 ) 。 1 2 1 4 酒类生产 在白酒酿制过程中，木聚糖酶主要是用与破坏原料细胞的结构，促进 淀粉、蛋白质等有效成分的溶出，加速其它酶( 主要是淀粉酶) 的作用，提 高发酵效率，增加酒精的产率( o g a s a w a r a ，1 9 9 1 ) 。同样，啤酒和葡萄酒酿 造中添加外源性聚糖酶和相关的多糖酶也具有提高酒品质量和生产效率 的作用。实验证明，在麦芽汁制备过程中加入木聚糖酶后，不仅能促进细 胞内容物和淀粉酶、蛋白酶等水解酶的有效释放，缩短糖化时间，而且木 聚糖酶还能有效水解水溶性木聚糖，降低麦芽汁的粘度，提高麦汁的过滤 速度和得率。在葡萄榨汁过程中，混合添加各种浸解酶能显著提高葡萄的 可压榨能力、沉淀速度和总汁得率( 余有贵，2 0 0 5 ) 。o a l a n t e 等评价了 c y t o l a 2 1 9 ( 一种商品酶，包含果胶酶、纤维素酶和木聚糖酶) 在酿制葡萄 酒时的作用，经验证，该酶的加入使果汁提取率提高了1 0 3 5 ，压榨 时间缩短了5 0 1 2 0 m i n ，果汁粘度下降了3 0 7 0 ，果汁过滤率提高 了7 0 1 8 0 ，葡萄酒的稳定性得到了显著提高( g a l a n t e ，1 9 9 3 ) 。 1 2 2 木聚糖酶在饲料工业中的应用 小麦、黑麦、稻谷、麸皮等饲料原料中也含有较多的非淀粉多糖 ( n s p s ) ，主要包括阿拉伯木聚糖、b 葡聚糖、果胶、纤维素等( 前二者约 占3 0 ) 。n s p s 被称为抗营养因子，它能结合大量的水，导致采食动物的 消化道中食糜体积增大、粘度增加，进而阻碍营养物质尤其是脂肪和蛋白 质的消化吸收，是导致营养物质的消化率不高的主要因素。此外，食糜在 小肠中的滞留会引起微生物的异常繁殖，使动物生长受阻，生产性能大大 9 产碱性木聚糖酶菌株的筛选及产酶条件研究 降低( p r o k o p ，1 9 9 9 ：h _ r i s t o v2 0 0 0 ) 。 饲料中添加木聚糖酶，可显著降低阿拉伯木聚糖分子大小，降低消化 道中的食糜粘度，促进动物内源性消化酶的活性发挥，提高营养物质的消 化吸收率。冯定远等人报道，在生长猪的玉米一豆粕一麦麸型日粮中加入 木聚糖酶和b 葡聚糖酶后，猪的粗纤维的消化率提高了4 8 9 ，粗蛋白消 化率提高了1 6 5 冯定远，2 0 0 0 ) 。王金全等人通过研究表明，饲料中添 加木聚糖酶后，肉仔鸡( o 2 8 b 龄) 平均日增重提高了9 1 2 ，料肉比降低 了1 0 8 7 ，平均体重提高了9 。( 王金全，2 0 0 5 ) 。 此外，木聚糖的酶解产物低聚木糖还具有调节动物肠道微生态环境、 降低动物结肠炎的发生率和减少抗生素等兽药用量的功效，可使动物的生 产性能得到进一步提高( 冯定远，2 0 0 0 ：王修启，2 0 0 2 ) 。 1 2 3 木聚糖酶在造纸工业中的应用 2 0 世纪8 0 年代中期，开始出现了用木聚糖酶去除化学纸浆中半纤维 素的生物漂白法，随后，该木聚糖酶在造纸领域的应用研究越来越受到人 们的重视。 1 2 3 1 纸浆漂白 木聚糖酶在纸浆漂白过程中的作用机理有多种的解释，其中被普遍认 同的一种为：在未漂浆中，木聚糖通过化学键直接联结在纤维素和木索上， 形成木素一木聚糖复合体，使木素难以被漂白。加入木聚糖酶后，木聚糖 酶对木素和木聚糖复合体中木聚糖的降解溶出，可显著增加漂白剂与木素 的接触机会，促进细胞壁的润胀，加快漂液通过纤维细胞壁的扩散速度， 有利于木素的脱落。此外，木聚糖酶还可溶解碱法制浆中二次沉淀在纤维 表面上的木聚糖，有利于漂液与纸浆中的残余木素进一步作用，从而提高 漂白效果( 刘玉新，2 0 0 4 ) 。 1 9 8 6 年v i i l 【a r i 报道，用木聚糖酶处理硫酸盐纸浆除了能增强漂白效果 外，还可减少后续漂段的用氯量，有利于环境保护o c i i l c a r i 。1 9 8 6 ) 。随后， w j n g 等人应用商品木聚糖酶c a r t a z y m e sh s 对白杨木的硫酸盐纸浆进行了 预处理，结果使纸浆最终亮度达到了9 5 ，氯用量减少了1 8 o v o n g ， 1 9 8 8 ) 。葛培锦等人经研究发现在碱法制各麦草浆时，采用木聚糖酶预处 理原料可较好地改善麦草浆h 2 0 2 漂白的效率。利用木聚糖酶预处理h 2 0 2 山东农业大学硕士学位论文 漂白相结合的x p 5 a p 5 a 多段漂白程序，可以获得7 4 6 i s o l 刍度的麦草浆 ( 葛培锦，2 0 0 5 ) 。西班牙的m i r a n d a 造纸公司应用木聚糖酶c a r t a z y m e sh s 对一种按树的硫酸盐纸浆进行了预漂白试验，使纸浆的终亮度达到1 0 0 。 研究表明，应用木聚糖酶预漂白技术不但不会降低纸浆强度，而且可大大 降低碱用量和废液中的有机氯含量，降低造纸业对环境的污染程度，木聚 糖酶预漂白技术是未来制浆和造纸工业的一个重要发展方向。 1 2 3 2 废纸脱墨 废纸脱墨是纤维回收利用的第一步，它是依靠化学药剂，在一定的温 度及机械作用下进行的。1 9 9 1 年，韩国学者首次报道应用木聚糖酶及纤 维素酶能促进新闻废纸浆的脱油脱墨( 1 0 i r e ，1 9 9 1 ) 。此后，酶法脱墨成为 研究的热点，人们开始探索利用木聚糖酶或将其与其它酶类一同使用进行 联合废纸脱墨，以减轻或消除化学法脱墨带来的环境污染。 与化学法脱墨相比，酶法脱墨的优势明显。顾琪萍等人的研究表明， 酶法脱墨浆的白度比对照浆高出了3 2 ，残留油墨量却降低了7 3 8 ， 且与化学脱墨相比有较高的得率和较低的返黄值。两种酶联合脱墨使纸浆 纤维裂断长、耐破指数和撕裂指数分别比单独用纤维素酶脱墨时提高了 3 8 、5 9 和8 6 ，将脂肪酶和纤维素酶木聚糖酶进行了混合脱黑实验， 也取得了良好的效果( 顾琪萍，2 0 0 4 ) 。张素风等通过研究发现，在相同的 单段h 2 0 2 漂白工艺条件下，木聚糖酶、纤维素酶、化学法脱墨浆白度增 值分别为1 4 8 s b d 、1 3 1 s b d 和1 2 3 s b d ( 张素风，2 0 0 5 ) ，说明酶 法脱墨浆比化学法脱墨浆有较好的可漂性。达到同样的白度，酶法脱墨时 漂白药品用量显著较少，大大减轻造纸废水的污染负荷，有利于环境保护。 1 2 3 3 纤维改性 目前，采用酶法改善二次纤维滤水性能的研究己取得了较大的进展， 李志健等人对黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) a n 7 6 内切木聚糖酶对漂白麦草浆 的改性效果进行了研究，发现内切纤维素酶在提高麦草浆纤维的裂断长和 改善滤水性等方面效果显著。内切木聚糖酶的使用有利于降低纸浆的脆 性，它与纤维素酶混合使用时效果更佳( 李志健，2 0 0 1 ) 。用电子显微镜观 察木聚糖酶处理后的纸浆可发现，纸纤维的内、外部在发生细纤维化的同 时，纤维柔韧性也随之增加( 毛丹漪，2 0 0 2 ) 。用纤维素酶和半纤维素酶处 产碱性木聚糖酶菌株的筛选及产酶条件研究 理纸浆，还可改善纤维压缩性，降低纸页微孔直径，提高纸密度和透明度 ( 伍安国，2 0 0 5 ) 。 1 2 4 其它方面的应用 此外，在生物转化处理废弃物方面，木聚糖酶可用于将木质纤维性材 料转化为单细胞蛋白、生物燃料及其它有用物质，十分具有发展潜力。 综上所述，木聚糖酶在食品、饲料、造纸等领域都有非常广阔的应用 前景。但不同的应用领域，对木聚糖酶性能的要求也有所差别。例如，在 食品和饲料工业中应用的木聚糖酶多属于酸性或中性木聚糖酶，国内外， 尤其是一些发达国家在这方面的研究起步较早，发展也很快，目前已有商 品化的木聚糖酶出售。近年来，木聚糖酶在造纸工业中日益显示出了它的 巨大应用潜力，采用木聚糖酶进行生物漂白，不但可提高纸浆自度，改善 纸张性能，还能减少化学漂白剂用量和有毒化学物质的排放量，是一项环 境友好技术。制浆和漂白等工序一般都在高温和碱性状态下进行的，园雨 对木聚糖酶的热稳定性和耐碱性有一定要求。在这方面，碱性木聚糖酶具 有独特的优势，将该酶用于纸浆处理，无需对纸浆进行温度及p h 值的调 节，使用十分方便。因此，人们把更多的目光投向了碱性木聚糖酶，在产 碱性木聚糖酶微生物的筛选及其产酶条件的优化等方面做了大量的工作， 下面重点介绍一下碱性木聚糖酶的研究概况。 1 3 碱性木聚糖酶的国内外研究概况 1 3 1 产碱性木聚糖酶微生物的筛选 许多微生物，包括细菌( 刘巍，1 9 9 6 ：g c s s 魁s e ，1 9 9 8 ；黄运红，2 0 0 2 ) 、 放线菌饵e g ，2 0 0 0 1 朱启忠，2 0 0 4 ：张红莲，2 0 0 2 ) 、霉菌( h a l l x i c h ，1 9 9 6 ； 朱崇森，2 0 0 4 ) 以及某些酵母( m m o v a ，1 9 8 4 ：l i u 。1 9 9 9 ) 都能分泌木聚糖 酶，而且不同来源的木聚糖酶的酶学性质也有所不同。总的来说，真菌所 产的木聚糖酶活性要略高于细菌，且多为酸性木聚糖酶。热稳定性也不高， 并伴随着相当量的纤维素酶，不适合于制浆漂白工艺( 孙晓霞，2 0 0 5 ) 。相 对而言，多数细菌或放线菌能够产生中性或碱性木聚糖酶糖酶( g u p t a ， 2 0 0 0 ；b a n o s o d ，1 9 9 3 ；t a n o a ，2 0 0 2 ) ，这些酶在耐碱性和热稳定性方面 也要优于真菌木聚糖酶，是国内外碱性木聚糖酶的筛选、研究重点。 1 9 7 3 年h o r i k o s h i 首次分离到了一株能够产碱性木聚糖酶的碱性纫菌 2 山东农业大学硕士学位论文 b a c i l l u ss p c 5 9 - 2 口o r i k o s h i ，1 9 7 3 ) ，随后，h o n d a 发现碱性细菌b a c i l l u s s p c 1 2 5 能产生2 种木聚糖酶，它们的最适p h 分别在6 0 7 0 ，p h6 o n 1 0 0 ，后者甚至在p n1 2 0 时也有一定的酶活( h o n d a ，1 9 8 5 ) 。d e y 等人分 离了一株嗜碱嗜热菌b a c i l l u ss p n c i m 5 9 ，能产生最适p h1 0 0 且不含纤 维素酶的木聚糖酶( d e y ，1 9 9 2 ) 。n a k a m u r a 等人从碱性碱性土壤中分离到 了一株细菌b a c i l l u ss p 4 1 m - 1 能够产生最适p h 为9 0 的木聚糖酶 ( n a k a m u r a ，1 9 9 3 ) 。g e s s e s s e 以木聚糖为唯一碳源从埃塞俄比亚的咸水湖 中分离到了b a c i l l u ss p a r - 0 0 9 和m i c r o c o c c u ss p a r - 1 3 5 ，它们所产木聚 糖酶在p h 在7 5 9 0 左右均有最大活性，且具有良好的热稳定性 ( g e s s e s s e ，1 9 9 8 ) 。曲音波等人从碱性土样中分离到了一株芽孢杆菌( b a c i l u s s p ) ，酶学性质的研究表明，该菌所产木聚糖酶的最适作用p n 为9 0 ，最 适作用温度为5 5 ，且具有较好的p h 和温度稳定性( 曲音波，1 9 9 8 ) 。 p s e u d o m o n a ss p w l u n 0 2 4 木聚糖酶在5 5 下，p h 值为4 6 1 0 5 之间 较稳定，最适作用温度与p h 值分别为5 0 和7 6 ( 许正宏，2 0 0 0 ) 。虽然真 菌产生的木聚糖酶多为酸性木聚糖酶，但t a n e j a 筛选到了一株嗜碱真菌 a s p e r g i l l u sn i d u l a n sk k - 9 9 ，其木聚糖酶的最适作用p h 和最适作用温度分 别为8 0 和5 5 ( t a n e j a ，2 0 0 2 ) 。r o y 以木聚糖为唯一碳源的筛选平板， 从碱性土壤中分离到了4 株耐碱细菌，其所产木聚糖酶的最佳作用p h 分 别8 0 、8 5 、9 0 ，9 0 ，最佳作用温度也处于5 0 5 5 c 之间( r o y ，2 0 0 4 ) 。 包怡红采用果红法从碱性土壤中筛选到了一株产木聚糖酶菌株b a c i l u s p u m i l u ss p 5 1 ，其木聚糖酶的最适作用温度为5 5 ，最适p h6 5 ，且在 p h9 0 的条件下仍具有6 0 的酶活力( 包怡红，2 0 0 5 ) 。谢响明等人分离到 了一株能分泌木聚糖酶的绿色糖单胞菌( s a c c h a r o m o n os p o r a ) 其木聚糖酶 表现出了较强的耐碱耐热性，该酶的最适反应p h 值为7 0 ，在p s8 0 时 的反应酶活为初始酶活的7 7 3 ，并能耐6 0 c 9 0 c 的高温f 在9 0 ( 3 条件 下处理2 3 h 仍能保持