（药理学专业论文）surkex诱导survivin基因沉默的分子机理研究.pdf

上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立：进行研究i ：f i 所取得的成果。除文f i 已经注明引川的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本 文的研究做m 最要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识剑术声明的法律结果山本人承担。 学位论文作者签名：孑星娅 m 期：卅口年钞一醪日 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留夕f ：向因家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授杖上海交通大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 捕等复制于段保存取l i r ：编本学位沦义。 保密口，在一年解密后适n j 本授权书。 小学位沦文属于 、 不保密毹 ( 请在队 ：力1 匡内打“”) 学位论文作者签名：至哎妞 指 日期：亿币年2 月矽厂日 日 蟹 上海交通大学博士学位论文答辩决议书 所在 姓名 马爱妞学号 0 0 5 1 7 0 9 0 0 5 药理学 学科 指导教师 周向军 答辩 2 0 1 0 0 2 2 5 答辩 上海交通大学药学院5 号楼3 1 2 室 u 期地点 论文题目 s u r k e x 诱导s u r v t v i n 基因沉默的分子机理研究 投票表决结果：f 歹，( 同意票数实到委员数虑到委员数)答辩结论：压压过口未通过 魁乏蝴冰桃侬潭铡勘多内燃， 弼究? 嘞 澹孚缈1 ，；y 栩丫轨伽蛙、耙闻? 符币用，亏。斫；蝴。勇善驯y 汤坑 黟w 组夤臼亥研磋坼研g 够们浓妻) 辩 f 3 彬小厶垸联蚜乞9 7 砝两 关钢磺斫s 洲、f 舭铂夭孕，该确懒，窆翩钞惭z知铢懈 嵌凇五题新段夕设澎m ，逻辑皑鳋，够名丐苹，谗乏f口纠新伫、安 照料燃亏跟蕊凇簪确绯撖们嬲： 蝴辫蹴中椭啪，咖题反映易芸帅乙它 幻沈跪髫彩 嗡锄格凇二弛讨 乡，仓累 ，灶；各，倒掣9弘铅酬 舡锄纨灰奸，毫故籽净? 谢 税 7 。d n a m e t h y l t i a n s t e r a s e i n h i b i t o r 5 - a z a 2 一d e o x y c y t i d i n e ( 5 - a z a c d r ) ，h i s t o n e d e a c e t y l a s ei n h i b i t o rt r i c h o s t a t i na ( t s a ) a n dh i s t o n em e t h y l t r a n s f e r a s e i n h i b i b o rb i x 一012 9 4r e s p e c t i v e l y w ed e t e r m i n e dt h ee x p l e s s i o no fs u r v i v i n m r n a b yr t - p c r ，a n a l y z e dt h es i t e s p e c i f i cc p gm e t h y l a t i o no fs u r v i v i n p r o m o t e rr e g i o nb y b i s u l f i t e s e q u e n c i n g a n dd e t e c t e dt h ec o v a l e n t m o d i f i c a t i o n so fh i s t o n et a i l sc o m b i n e dw i t hs u r v i v i np r o m o t e rb yc h r o m a t i n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( c h i p ) t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a td n am e t h y l a t i o n w a st h ec r u c i a l s t e pi ns u r v i v i ns i l e n c i n g ，b u th i s t o n ed e a c e t y l a t i o na n d s u r k e x 诱导s u r v i v i n 堆闪沉默的分了机娌研究 m e t h y l a t i o ng u i d e dd n am e t h y l a t i o n ，w h i c hc o u l dp l a yar o l et h r o u g h d n m t l f i n a l l y ，w ew o u l db ei na na t t e m p tt ov e r i f yw h e t h e ro u ri n f e l e n c ew a s c o r r e c to rn o t w ei n v e s t i g a t e dt h e e x p r e s s i o n o fd n m t1m r n ab y r t p c ri n b l o c k i n g h i s t o n ed e a c e t y l a t i o na n dm e t h y l a t i o nb yt s aa n d b i x 一012 9 4r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fd n m t i m r n aw a sd e c r e a s e d g r e a t l y a f t e rh i s t o n e d e a c e t y l a t i o n o rh i s t o n e m e t h y l a t i o nb e i n gb l o c k e d ，w h i c hr e v e a l e dt h a tb o t ho ft h e mc o ul da f f e c t d n am e t h y l a t i o nb yu p r e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no fd n m t im r n a o f c o u r s e ，t h i si so n l yap o s s i b l em e a n so f t h e i rr o l e s i ns 1 1 l y i l n a i y ，w ef i r s tc o n f i r m e dt h a ts u r k e xi san e wt y p eo f t a r g e t e d s i t e d i r e c t e dc p gd n a m e t h y l a t i o nd r u gc a n d i d a t e ，a n di tc o u l dr e s u l ti n s u r v i v i ns il e n c i n g b yi n d u c i n gs i t e s p e c i f i cc p gm e t h y l a t i o no fs u r v i v i n p r o m o t e rr e g i o n ； n e x tw el 。e v e a l e dt h a ts m k e xc o u l di n c r e a s eh i s t o n e h 3 k 9d i m e t h y l a t i o na n dh 3 一k 2 7t r i m e t h y l a t i o nl e v e l sa n dd e c l e a s eh i s t o n e h 4a n dh 4 - k16 a c e t y l a t i o nl e v e l sb e s i d e sd n am e t h y l a t i o n ；t h e nw e v e r i f i e dt h a td n a m e t h y l a t i o ni sav i t a ls t e pi ns u r v i v ns i l e n c i n g ，b u tt h e c h a n g eo fh i s t o n ec o v a l e n tm o d i f i c a t i o n s ( i n c l u d i n gh i s t o n ed e a c e t y l a t i o n a n dm e t h y l a t i o n ) i sm o r ea d v a n t a g ee v e n t ，a n di tg u i d ed n a m e t h y l a t i o n ； f i n a l l y ，w ei n i t i a l l yp r o v e dt h a th i s t o n ed e a c e t y l a t i o na n dm e t h y l a t i o ng u i d e v i i i ：海交通大学博 ：学位论文 d n a m e t h y l a t i o nb ya f f e c t i n gt h ee x p r e s s i o no fd n m t im r n a t h i sr e s e a r c h p r o v i d e s n o t o n l y n e wi d e a sf o rt h e d e s i g n o f a n t i n e o p l a s t i cd r u g sa n dan e wm e t h o df o rc a n c e rt a r g e t e dt h e r a p yf r o m c a n c e re p i g e n e t i c s ，b u ta l s ot h ee x p e r i m e n t a le v i d e n c ef o rs o l v i n gt h em a j o r t h e o r e t i c a lp r o b l e mi nt h ef i e l do f e p i g e n e t i c s k e yw o r d s ：d n am e t h y l a t i o n ，g e n es i l e n c i n g ，h i s t o n em o d i f i c a t i o n s ， c h r o m a t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o n ，e p i g e n e t i c s 缓： s u r k e x 诱导s u r v i v i n 坫浏沉默的分了机理研究 简写说明 简写英文名称汉语名称 t g s t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g p t g s p o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g d n m td n a m e t h v l t r a n s f c r a s e s a m e ( a d o m e t ) s - a d e n o s i n em e t h i o n i n e m e c p m e t h y lc p g b i n d i n gp r o t e i n m b d m e t h y lc p g b i n d i n gd o m a i n 5 - a z a c d r5 - a z a 一一2 - d e o xy c y t i d i n e r d d mr n a d i r e c t i n gd n am e t h y l a t i o n m s p m e t h y l a t i o ns p e c i f i cp c r h m t h i s t o n e m e t h y lt r a n s l k r a s e ltmtli s t o n ca c c t ) 7 l t r a n s f c r a s e i - i i ) a c 1 s t o n ed e a c e t v l a s e 转录水平基因沉默 转录后水j f 基冈沉默 d n ai 。l i ；转移酶 s 隙f l 硫氰酸 甲毖化c p g 序列结合蟹e l l l l 丛化c p g 结合纠i ：；：| 域 5 杂叙脱氧胞1 嘶l 定核f 1 ： r n a 介导的d n al i 徙化 l i 艰化特片性p c r 纰负i ，l i l l 璀化车0 移酶 终【货 ，j 乙眦化转移酶 纰货l f 上乙敞化酶 ：海交通人学博i ：学位论文 目录 第一章概论l 1 基因表达的表观遗传调控l 2 基因沉默一2 2 1 转录水平基因沉默2 2 2 转录后水平基p 寸沉默3 2 3 基因沉默的! i 物学意义4 3d n a 甲基化4 3 1d n af ；i 基化及j 建立4 3 2d n a 耳l 荩化转移酶壤5 3 3d n a 甲基化与培【大l 农达5 3 4d n aq f 肇化神l l j 南6 3 4 1h l l i l i - o l t 1 队l i 1 的d n a j 占化异常j ”r i i t i 加l l 发7 i - o 6 3 4 2d n af f f 冬化r jj l i l ， 龠的治疗一7 3 4 2 1 丛- j ：抑痛肚w n 动一j ，f x 两i f l g 化i f , y 进行的上f i l 琏比渝疗毒7 3 4 2 2 冬j ：胂慵棚天癌。l q 丘 幼f l 天低f f j 壤化嘶进 j ：的 f l 丛化治j ? 7 3 4 2 2 1r n a 介导的d n ar i 牲化8 3 4 2 2 2d n a 介导的d n al l i ，j 占化8 3 5d n a 甲基化柃测的方法9 4 组蛋白密码与基冈表达1 2 4 1 组蛋白甲基化1 3 4 1 1 组蛋白甲基化与基因表达1 3 4 1 2 组蛋白去甲基化1 4 4 1 3 组蛋白甲基化与d n a 甲基化1 4 4 1 4 组蛋白甲基化与肿瘤1 5 4 2 组蛋白乙酰化和去乙酰化与基因表达1 5 s u r k e x 诱导s u r v i v i n 摹i 丈l i ) 默的分了机理研究 4 2 1 组蛋白乙酰化去乙酰化与d n a 甲基化的关系1 5 4 2 2 组蛋白乙酰化去乙酰化与组蛋白甲基化的关系1 6 4 2 3 组蛋白乙酰化去乙酰化与肿瘤1 6 4 3 组蛋白的其他修饰方式1 7 4 4 研究组蛋白共价修饰的分析方法1 7 5 凋亡抑制因子s u r v i v i n 与肿瘤1 7 5 1s u r v i v i n 的分子结构与功能1 7 5 2s u r v i v i n 与肿瘤1 8 5 - 3 针对s u r v i v i n 的肿瘤靶向治疗1 8 6 本文的研究内容及意义1 9 6 1 前j c j 研究旌础1 9 6 1 1 核睑约物s u r k c x 的改汁1 9 6 1 2s u r k e x 的药效产实验2 l 6 1 3 对s u r k e x 诱导s u r v i v i n 沉默- f # l s j t l i ，j 纠步探限2 2 6 二本沦史、e 婴研究内容一2 2 6 3 奉沦艾的研7 己意义2 2 讹：二r “t i s u r k e x 诱导s u r v i v i n 1 ；功】t 部位t l - i 旗f 二的以。，r 2 3 l 十于料1 j 办法2 3 1 i 制科! jj i 嶝试制- 7 3 1 2 j 要仪： 2 3 1 3 细胞培养2 4 1 4 转染2 4 1 5 基因组抽提2 5 1 6 亚硫酸氢钠处理基因组d n a 2 5 1 7 纯化基因组d n a 及终止亚硫酸氢钠反应2 5 1 8p c r 扩增目的片断2 6 1 9 电泳检测2 6 j ：海交通人学博。l ：学位论义 1 1 0 回收目的条带2 6 1 1 lt a 克隆2 7 1 1 2 挑取并p c r 鉴定转化子，对讵确插入的转化子进行扩大培养2 7 1 1 3 测序2 8 2 结果2 8 3 讨论3 3 第三章s u r k e x 对与s u r v i v i n 特异结合的组蛋e m 鲁，j 芑价修饰的影u m 3 3 l 材料与方法3 3 1 1 材料与主要试剂3 3 1 2 j 奠要仪器3 4 1 3 细咆培养4 1 4 转染3 4 1 5 染色质免疫i ) c 淀分析3 4 1 5 1 超j 拧螬切璀【人l 络【d n a 一3 4 1 5 2 免疫j ! ) c 淀- 3 5 1 5 3 p c r 扩增结合花免疫沙 淀的甜【蛋【lj ：f i jd n a 6 2 结粜3 7 2 1 超卢条件的确定一3 8 2 2 免疫沉淀实验系统的州稚性验订h 3 9 2 3s u r k e x 对h 3 、h 4 特定位点乙酰化、【f l 綮化修饰的影f 忆一4 0 3 讨论4 l 第四章d n a 甲基化、组蛋白共价修饰在s u r v i v i n 沉默中的作用4 3 1 材料与方法4 4 1 1 材料与主要试剂4 4 1 2 主要仪器4 4 1 3 细胞培养4 4 1 4 转染4 4 s u r k e x 涛导s u r v i v i n 基因沉默的分了机理研究 1 5r t - p c r 4 4 1 5 1r n a 抽提4 4 1 5 2 反转录4 5 i 5 3 p c r 4 6 1 5 4 电泳4 7 1 6b i s u l f i t es e q u e n c i n g 4 7 1 7 c h i p 分析4 7 2 结粜4 7 2 1 f i6 可抑制剂对s u r k e x 抑制s u r v i v i nm r n a 表达的影响4 7 2 2 彳i f 谢q 埘；忻帜0 s t 水e x 导s u r v m n 尼；动j ， 9 5 ) 的 n c i h 4 6 0 细胞经o 2 5 胰蛋白酶消化后，用培养液收集，在2 4 孔板中以1 0 5 个孔 的浓度铺板，3 7 培养过夜。 将s u r k e x 和r a n d o m 溶于无菌p b s ( p h7 4 ) 中，并经针头式过滤器( 0 2 2l a i n ) 过滤。在e p p e n d o r f 管a 中加入室温下的o p t i m e m 培养基1 0 0 山，再加入2m l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 转染试剂，混匀后室温放置5 分钟。在e p p e n d o f f 管b 中加入室温 下的o p t i m e m 培养基1 3 5m ，加入1 5ms u r k e x 的p b s 溶液，混匀。混合a 、b 两管，反复抽吸混匀，室温放置3 0 分钟。各组转染浓度见表2 1 。 表2 1 每组的转染浓度 t a b l e2 - 1t r a n s f e c t i o nc o n c e n t r a t i o no f e a c hg r o u p 、1 1 n o g r o u p c o n e i n t u b e b c o n e f i n a l ( p m ) ( p 峋 1 l i p o f e c t a m i n e 0 2m 2r a n d o m8 3 35 0 3s u r k e x8 3 35 0 吸去2 4 孔板中的培养基，用5 0 0mr p m i1 6 4 0 洗涤细胞。每孔逐滴加入2 5 0m a 、b 管混合液，轻微摇晃混匀。3 7 c 培养1 2 小时后，吸去转染混合液，再向每孔 上海交通大学博士学位论文 加入5 0 0 山含1 0 f b s 的i 冲 1 6 4 0 培养基，3 7 ( 2 继续培养4 8 小时。 1 5 基因组抽提 移除2 4 孔板中的培养基，每孔加入l m ld n a z s 0 1 e 裂解细胞，混匀后将裂解液 转移至e p p e n d o r f 管，6 5 保温4 5 分钟( 间或混匀) 。加入5 0 0p l 氯仿异戊醇( 2 4 ： 1 ) ，室温间或振荡5 分钟，1 2 0 0 0r p m m i n 离心5 分钟。上清转移至新e p p e n d o r f 管 中，加入0 5m l 无水乙醇，混匀，室温放置5 分钟，1 2 0 0 0r p m m i n 离心1 0 分钟。 弃上清，沉淀用7 0 乙醇洗一次，1 2 0 0 0r p m m i n 离心5 分钟。吸走上清，室温干燥 1 0 分钟，加5 0 p lt e ，室温放置3 0 分钟待其完全溶解。 1 6 亚硫酸氢钠处理基因组d n a 将上述d n a 适当稀释后，用s m a 3 0 0 0 微量核酸蛋白分析仪测定d n a 浓度， 用t e 调浓度为2 0 4 0 叫m ，取5 0 “l ；加入5m 新配置的3mn a o h ( 最终浓度为 0 3m ) ，3 7 孵育2 5 分钟；加入5 1 0i x l4 0 5 的亚硫酸氢钠( s o d i u mb i s u l f i t e ) ，3 0m 1 0m m 对苯二酚( h y d r o q i _ d n o n e ) ，1 5m d d h 2 0 ，使总体积为6 1 0p l ：铝箔包好，轻 柔混匀，5 5 ，1 6 小时。 1 7 纯化基因组d n a 及终止亚硫酸氢钠反应 用w i z a r d d n ac l e a n u ps y s t e m ( p r o m e g a ，美国) 试剂盒对上述处理过的基因 组d n a 进行纯化。具体步骤按试剂盒说明书进行。首先在上述处理过的d n a 中加 入l m lr e s i n ，颠倒混匀数次，然后将d n a 收集至收集柱中，再用8 0 异丙醇2i i l l 冲洗残留在装置中的d n a ，将收集柱放置1 5 血e p 管中，1 0 0 0r p m ，2 分钟，去除 残余异丙醇。将收集柱放置到新的1 5m le p 管中，加入预热( 6 5 7 0 c ) d d h 2 05 0m ， 放置2 分钟，1 0 0 0r p m ，1 分钟洗脱d n a 。 在上步收集的d n a 溶液中，加入5 5 山3m n a o h ，于3 7 放置2 0 分钟；加入 3 5 山8m 乙酸胺，中和；加3 0 0 山预冷的无水乙醇，混匀，2 0 ( 2 冰箱过夜。 室温1 4 0 0 0r p m ，1 0 分钟，弃上清；7 0 乙醇洗沉淀，1 4 0 0 0r p m ，2 分钟，小心 s u r k e x 诱导s u r v i v i n 基因沉默的分子机理研究 吸走上清；室温干燥d n a ，加3 5p ld d h 2 0 溶解d n a ，- 2 0 c 保存。 1 8p c r 扩增目的片断 在o 2 i n l 的p c r 管中，建立1 2 “l 的反应体系，依次d i i a d n a 模板：4 山 f o r w a r dp r i m e r ( 1 0 p m ) ：0 5 山 r e v e r s ep r i m e r ( 1 0 p m ) ：0 5 山 d d h 2 0 ：1p l 2 x p c r t a qm a s t e rm i x ：6m p c r 扩增反应程序为： 9 5 3m i l l ， 9 4 1 5 s e e ，、 i 6 0 c4 0s e c ， 3 5 c y c l e s i 7 2 3 0s e c ， 7 2 1 0 r a i n 。 1 9 电泳检测 按2 的胶浓度，将琼脂糖加入到0 5 x t b e 溶液中，微波炉中高火2m i n ，使其 溶解后，待降温至6 5 ( 2 左右加入溴化乙锭( 5 01 t g 1 0 0m l 胶) ，制胶。取1 0l a lp c r 反应产物上样。d n a l a d d e r6m 上样。在0 5 x t b e 电泳缓冲液中，以恒定电压1 0 0v 电泳3 0r a i n ，用凝胶成像仪观察记录结果。 1 1 0 回收目的条带 紫外灯下切出含有目的条带的琼脂糖凝胶，按照胶回收试剂盒( 眯a r a ，日本) 说明书操作：称量胶块重量，计算体积( 1 m g = l 山) ，切碎胶块，收集至e p 管中，加 入3 个胶块体积量的d r - ib u f f e r ，于7 5 放置6 1 0 分钟加热融化胶块，间或混匀。 加入1 2d r - ib u f f e r 体积量的d r o l ib u f f e r 以及终浓度为2 0 的异丙醇，混匀； 将混合液转移至安放于收集管中的离心柱中，1 2 0 0 0r p m ，1 分钟，弃滤液；加入5 0 0 上海交通大学博士学位论文 山r i n s e a 于离心柱中，1 2 0 0 0r p m ，3 0 秒，弃滤液；加入7 0 0 山r i n s e b 于离心柱中， 1 2 0 0 0r p m ，3 0 秒，弃滤液；再用7 0 0mr i m e b 重复一次；将离心柱安置于新e p 管中，在离心柱膜中央加入2 5 山预热6 5 cd d h 2 0 ，室温放置2 分钟；1 2 0 0 0r p m ，2 分钟洗脱d n a 。 1 1 1t a 克隆 连接反应 取一干净e p 管，建立1 0 山的连接反应体系，如下： 上述胶回收的p c r p r o d i - t c t 1 5m p b s - t v e c t o r 1m 10 章t 4d n a l i g a t i o nb u f f e r 1m t 4d n a l i g a s e 1m s t e r i l ew a t e r 5 5 山 将上述连接反应液置于p c r 仪内，于1 6 过夜 转化： 取感受态细胞t o p l 01 0 0i l l 置于冰浴上融化，吸上述连接反应液5i l l 到含有 t o p l 0 的e p 管中，用枪头温柔混匀，置于冰上3 0m i l l ；4 2 9 0 秒，注意不要摇动， 立即转移至冰上；加入5 0 0i l l 的s o c 培养基，置于3 7 。c 振荡( 1 5 0r p m ) 摇床培养 1h ；取1 0 0p l 涂布于l b a g a rp l a t e s ( 含有1 0 0p g n aa m p i c i l l i n ) ，l ba g a rp l a t e s 预 先涂有3 2g li p t g ( 5 0m g m 1 ) 、4 0m x - g a m ( 2 0m g m 1 ) ；细菌培养箱3 7 。c 过夜。 1 1 2 挑取并p c r 鉴定转化子，对正确插入的转化子进行扩大培养 取出上述过夜培养的培养皿，用灭菌枪头每组挑取1 8 个白色单菌落，放入事先 加有2 0 0 山l b 的1 5n de p 管中，置于3 7 c 振荡( 1 5 0r p m ) 摇床培养l - 2h ，然后 分别吸出1 m 做菌落p c r 。电泳后，挑出与标带位置相同的菌落，再加入放有2m ll b 的1 5l n l 离心管中，1 9 0r p m 振荡摇床过夜培养。 s u r k e x 诱导s u r v i v i n 基因沉默的分子机理研究 1 1 3 测序 将上述正确插入的、扩大培养后的转化子送上海鼎安生物科技有限公司测序。 2 结果 在这部分研究中，主要用s u r k e x5 0p m 的转染浓度处理n c i h 4 6 0 细胞，并以 转染试剂l i p o f e c t a m i n e 和同浓度的r a n d o m 随机寡核苷酸序列作对照，转染6 0 小时 之后收集每组基因组d n a ，并采用b i s u l f i t es e q u e n c e i n g 方法，( 具体步骤如上 1 5 1 1 4 所述，主要是利用亚硫酸氢钠对d n a 碱基的修饰作用，它能将所有未甲基 化的胞嘧啶发生脱氨基反应转变成尿嘧啶，但5 甲基胞嘧啶不发生转变，所以经过 p c r ，克隆，到最后测序结果中只要有c 显示的地方则提示原来该位点即是甲基化 的。) 来分析目的d n a 片断的中c p g 位点的甲基化状况。 图2 1 为亚硫酸氢钠处理后的s u r v i v i n 启动子区特定序列的p c r 扩增电泳结果， p c r 扩增产物为1 4 4b p 。图2 2 为图2 1 胶回收后的电泳图。 - 2 0 0b p 卜一 1 0 0 b p 卜一 mh 2 0lrs + 一4 4b p 图2 1 亚硫酸钠处理过的s u r v i v i n 基因启动子的扩增 f i g 2 la m p l i f i e do f b i s u l f i t e m o d i f i e ds u r v i v i np r o m o t e rb yp c r 上海交通大学博士学位论文 2 0 0b p 一 1 0 0b p 一 mh 2 0lrs 图2 2p c r 目的片断回收结果 f i g 2 - 2 r e c o v e r yo fp c rp r o d g c t 一1 4 4 b p 将回收的p c r 目的片断克隆后，依据蓝白斑筛选原理，即t o p l 0 菌株含l a c z 基因，编码的p 半乳糖苷酶能分解生色底物x g a l ( 5 一溴- 4 氯3 吲哚p d 半乳糖苷) 产生蓝色，从而使菌株变蓝，当外源d n a 插入后，l a c z 基因不能表达，菌株呈白 色，以此来筛选重组细菌。我们每组挑取1 8 个白色菌落，进行菌落p c r ，根据电泳 结果选定1 0 个克隆，继续过夜悬浮培养扩增，然后将菌液直接送去测序。每组菌落 p c r 结果为图2 3 ，其中每间隔六个孔加一标带，根据与标带的电泳水平距离，确定 含插入目的片断的1 0 个克隆。如图所示我们从转染试剂l i p o f e c t a m i n e 对照组中挑取 2 ，3 ，5 ，7 ，8 ，9 ，1 2 ，1 3 ，1 6 ，1 8 等1 0 个克隆，从随随机序列r a n d o m 对照组中 挑取6 ，7 ，8 ，9 ，1 0 ，1 2 ，1 4 ，1 5 ，1 6 ，1 7 等1 0 个克隆，从s u r k e x 组中挑取5 ，6 ， 7 ，8 ，1 1 ，1 2 ，1 5 ，1 6 ，1 7 ，1 8 等1 0 个克隆。 s u r k e x 诱导s u r v i v i n 基因沉默的分子机理研究 a b 123456m7891 0 1 l 1 2m1 31 41 51 61 71 8 123456m7891 01 11 2m1 31 4 1 51 6 1 71 8 c l23456m7891 01 11 2m1 31 4 1 51 61 71 8 lm711 11 图2 3 每组1 8 个克隆的p c r 电泳结果 ( a ：转染试剂l i p o f e c t a m i n e 对照组：b ：随机序列r a n d o m 对照组；c - s u r k e x 组) f i g 2 - 3 p c r e l e c t r o p h o r e s i so f18c l o n e sf o re a c hg r o u p ( a ：l i p o f e c t a m i n eg r o u p ；b ：r a n d o mg u o u p ；c ：s u r k e xg r o u p ) 基因组d n a 先经亚硫酸氢钠处理后，再利用p c r 技术对目的片段进行扩增， 此时目的片段中不发生甲基化的“c 将全部转化成胸腺嘧啶“t ”，最后对p c r 产 物进行胶回收，再进行克隆，然后抽取进行测序。将三组的测序图谱去掉两端的p b s t 质粒后，剩余的插入序列的测序结果中只要有c 显示的，则提示该位点c 在原始序 列中是甲基化修饰的。 对每组测序的1 0 个克隆进行序列比对，比较插入的1 4 4b p 碱基序列中的1 4 个 c g 位点的甲基化情况，结果发现l i p o f e c t a m i n e 组和r a n d o m 组的l o 个克隆中，插 入序列的1 4 个c g 位点中的c 都是t 显示，而s u r k e x 组的1 0 个克隆中，有5 个克 隆插入序列的1 4 个c g 处的c 全是t 显示，而另外5 个克隆的测序图谱显示，第 1 1 个c g 位点处的c 仍是c 显示。而该位点的c 正是s u r k e x 序列的互补区域。结 果表明，s u r k e x 能引起s u r v i v i n 启动子区相应互补配对的靶序列的c 定点发生甲基 化，且甲基化效率为5 0 。l i p o f a c t a m i n e 、r a n d o m 和s u r k e x 三组的测序图谱见附1 ， 图2 4 a 表示了s u r v i v i n 启动子区的部分序列，s u r k e x 的碱基配对互补区域和以箭 头表示的正、反向引物，以及在引物之间的1 4 个c g 位点( 下划线表示，其中深黑 上海交通大学博士学位论文 色标注的“c 为发生甲基化的m c ) 。图2 - 4 b 表示了三组c f i 位点甲基化结果的统 计情况，灰色部分表示该c g 位点c 为甲基化。 e 1e 2奄3e 4 2 7 0 l 黟筠懿；滋奄翻想：6 i 茂置敞翻盘筠骰；l 篷锐冀以3 c i 鼢瓢；c 缓；c c c 嚣；c 囝落瓿 i l l - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ _ 州- _ _ _ - _ _ _ _ 峰 一一 2 7 蠡l 缀瑟芘c 蠹蕊?嚣搿溘瓢搿络钗踟x o 泓缓= 矗i 叛貌缘络伐貉。g ：铭c 叠弼零；c c c 一，坳r o = = 州妒，点 一一一。 驹燃娃韵瑰瞅畦童蝴 图2 - 4as u r v i v i n 启动子区的部分序列 f i g 2 - 4a p a r t i a ls e q u e n c eo fs u r v i v i n gp r o m o t e r 3 1 s u r k e x 诱导s u r v i v i n 基因沉默的分子机理研究 l i p o f e c t 锄i n e c g t g c c g c g g g a c c c gc g g c e s u r k e x - ta r g e te dr e g i o n s u r k e x ：t c t a a a c t t a g m c g c c c t g g g m c a r a 厦1 d o m c t c o g c g g g a c c c gc c s u r k e x - ta r g e te dr e g i o n s u r k e x ：t c t a a a c t t a g “c g c c c t g g g “c a s u r k e x _ 三 c t c c g c g g g a c c c gc c s u r k e x ta r m e te dr e 譬i o n s u r k e x ：t c t a a a c t t a g m c g c c c t g g g m c a 图2 4bs u r v i v i n 启动子区c g 位点甲基化情况 f i g 2 - 4bm e t h y l a t i o no fc g i ns u r v i v i np r o m o t e r 3 2 上海交通大学博士学位论文 3 讨论 基因组d n a 经亚硫酸氢钠处理后，单链d n a 中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基 转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，再利用p c r 技术对目的片段进行扩增， 将尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后，对p c r 产物进行克隆再测序。测序结果中只 要有c 显示的，则提示该位点c 在原始序列中是甲基化修饰的。 l i p o f e c t a m i n e 转染试剂对照组的l o 个克隆插入序列测序结果中无位点出现c ， 一方面说明n c i h 4 6 0 细胞中，位于s u r v i v i n 启动子中的该1 4 个c g 位点的c 普遍 都是无甲基化修饰的；同时也说明亚