（分析化学专业论文）米糠营养成分分析及其应用研究.pdf

摘要 摘要 题目：米糠营养成分分析及其应用研究 硕士研究生：曹蕊 导师：曹玉华 专业：分析化学 本课题的研究方向是米糠的营养成分分析及其应用研究。以米糠为研究对象，建立 了米糠中水溶性维生素的分析测定方法。同时从米糠中提取了具有活性功能的米糠多 糖，并建立了荧光法研究头发光损伤模型，应用该模型对米糠多糖抗紫外辐射活性进行 了研究。 课题分为以下四部分进行研究： 第一部分，高效液相色谱法同时测定米糠中四种水溶性维生素v b l ，v b 6 ，烟酸， 烟酰胺的含量。在h y p e r s i lc 1 8 ( 2 5 0 c m 4 6m mi d ，5 0p m ) 上，以体积比为8 8 ：1 2 的 o 1 磷酸水溶液一甲醇为流动相，以o 6m l m i n 流速等度洗脱，在2 6 6 姗波长下检测。 各组分在8m i n 能基线分离。四种维生素在0 6 1 0 。6 9 m l 8 5 1 0 。5 m l 范围内呈线性关 系，v b l 、v b 6 、烟酸和烟酰胺的检出下限分别为0 4 3 1 0 。6 m l 、o 3 4 1 0 。6 9 m l 、0 3 2 1 0 曲 咖l 、0 3 0 1 0 6 咖l 。经简单预处理，可以对米糠和淘米水中的这四种维生素的含量 进行测定，平均回收率在9 6 0 9 9 9 之间。该法简便、快速、准确、灵敏，对复杂体 系水溶性维生素的测定具有重要的参考价值。 第二部分，研究了微波提取法，热水蒸煮提取法，超声波提取法提取米糠多糖。同 时考察了三氯乙酸法，s e v a g e 法去除蛋白质；一步消化法，两步消化法去除淀粉。选取 了较优的微波提取法提取米糠多糖，采用改进的苯酚一硫酸法测定米糠多糖含量。实验 结果：料液比为1 ：1 0 在1 0 0 0w5 0 微波火力条件下提取3 0m i n ，提取2 次，三氯乙酸 法去蛋白质，两步消化法去淀粉，3 0 醇沉，米糠多糖得率达1 4 1 。实验所得产品r b p a 将被应用于其活性功能的研究中。 第三部分，建立了头发中色氨酸的荧光分析方法，并用该法研究了u v b 辐射下头 发中色氨酸的变化规律。头发样品以5 5m 0 1 l 氢氧化钠在1 1 0o c 下水解2 0h ，在p h l o 5 的磷酸二氢钠氢氧化钠缓冲液中，激发波长为2 8 0 衄、发射波长为3 6 0m 处测定色氨 酸的荧光强度。方法线性范围8 o 1 0 一1 7 5 1 0 - 6 9 m l ，检测限为1 6 1 0 叫g m l ，回收 率在9 6 3 1 0 0 3 。头发样品中色氨酸的量随u v b 辐射时间增加呈减少趋势，光照2 8 天后，色氨酸的损失率达到1 8 8 。该法快速，简便，灵敏度高，可推荐作为衡量头发 光损伤的定量指标。 第四部分，研究了微波提取法得到的米糠粗多糖r b p a ，r b p b 应用到头发中的抗 u v b 辐射效果。将米糠粗多糖吐温一8 0 模拟发胶喷洒到头发上，自然干燥，置于紫外灯 下照射。头发样品以5 5m o l l 氢氧化钠在1 1 0o c 下水解2 0h ，在p h l 0 5 的磷酸二氢钠 氢氧化钠缓冲液中，激发波长为2 8 0 衄、发射波长为3 6 0 衄处测定色氨酸的荧光强度 攘要 变化，加有多糖保护的头发较对照样品中色氨酸的受破坏量降低。表明米糠多糖其商一 定酶抗紫外辐射效果。 关键词：米糠高效液楣色谱头发荧光分光光度计抗紫舞辐射活性 f l a b s t r a c t a b s t r a c t t h er e s e a r c hd i r e c t i o no fm i st h e s i si sa i l a l y s i so fn u t r i e mc o m p o n e mi nr i c eb r a l la n d s t u d i e so ni t sa p p l i c a t i o n t 狄e nr i c eb r a na u st l l er e s e 甜c ho b ie c t ，h p l cm e m o dh a db e e n b u i l tu pt om e a s u r ew a t e r - s o l u b l ev i t 锄i n si nr i c eb r a n ：r i c eb r a np 0 1 y s a c c h a r i d e sh a db e e n a b s t r a c t e di nr i c eb r 舭；as t u d ym o d e lo fu l t r a v i o l e td a m n i f i c a t i o no fh a i rh a db e e nb u i l da j l d h a du s e d t l l i sm o d e ls t u d y i n gt h ea c t i v i 母r e s i s t i n gu v b u l t r a v i o l e t i nc h 印t e r l ，h i 曲p e 怕m a l l c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) h a sb e e n 印p l i e df o r t h e s i m u l t 锄e o u sd e t e m l i n a t i o no ff o u rk i n d so fw a t e r - s o l u b l ev i t 锄i n si n c l u d i n 童v i t a m i nb l ， v i t a m i nb 6 ，n i c o t i l l i ca c i d ，a n dn i c o t i n 锄i d ei nr i c eb r a i l l t h es e p a r a t i o n 、 l j sp e r f o r m e do n a h y p e r s i lc 1 8c o l u m n ( 2 5 0c m 4 6 m mi d ，5 0 m ) 谢t 1 1am o b i l ep h a l s eo fo 1 h 3 p 0 4 m e t h a n o l ( 8 8 ：1 2 ，v ) a tn o wr a t eo fo 6m l m i n ，a n dd e t e c t i o nw a v e l e n 础w 2 l s2 6 6 砌 f o u rv i t a m i n sh a dg o o dl i n e a r i t ) ri nt h er a l l g eo f6 0 1 0 - 7g m l 一8 5 1 0 。5 咖l ，w i t h d e t e c t i o nl i m i to f4 3 1 0 叫m l ，3 4 1 0 - og m l ，3 2 1 0 g m la n d3 o 1 0 。7 m g lf o r v i t 锄i nb 1 ，v i t a m i nb 6 ，n i c o t i n i ca c i da n dn i c o t i n 锄i d e ，r e s p e c t i v e l y b a s e l i n es e p a r a t i o no f f o u rv i t a m i n sc a i lb ea c h i e v e dw i t h i n8m i n u t e s w i t h o u tc o m p l i c a t e dp r e t r e a t m e n t ，f o u r a i l a l y t e si nr i c eb r a i ls a m p l e s ，a s 、v e ua se x t r a c t s 丘d mr i c ew i t hw a t e r ，w e r es u c c e s s m u y d e t e m i n e dw i t hr e c o v e r i e sb e t w e e n9 6 0 a i l d9 9 9 n l ea p p r o a c hc o u l db ea p p l i e dt o d e t e m l i n ew a t e r - s o l u b l ev i t a r i l i n si nc o m p l i c a t e ds 锄p l e so w i n gt os i m p l i c i t y ，c o n v e n i e n c e ， s e n s i t i v i t ya n da c c u l a c y i nc h a p t e r2 ，e x t r a c t i o nm e t h o d si n c l u d i n gm i c r o w a v ee x t r a c t i o n ，d e d o c t i o na 1 1 d u l t r a s o n i ce x t r l c t i o nh a db e e ns t u d i e dt oe x t r a c tp o l y s a c c h 撕d e si nr i c eb r a n t h em e t h o d sf o r r e m o v i n gp r o t e i n sb yt r i c h l o r o a c e t i ca c i da i l ds e v a g em e t h o d ， a sw e l la sf o rr e m o v i n g a m y l u mb yo n es t e pa s s i m i l a t i o n 锄dt w os t e p sw e r ea l s oi n v e s t i g a t a t e d m i c r o w a v e2 l s s i s t a n t e x t r 屺t i o nh a sb e e na p p l i e df o re x t r a c t i o np o l y s a c c h 撕d e si n r i c eb r a l l t h ec o n t e n to f p o l y s a c c h 撕d e sw e r ed e t e n n i n e db yi m p r o v e dv i t r i o l - p h e n o lm e t h o d t h eo p t i m u mt e c l l l l i c s w e r em em a t e r i a l - w a t e rr a t i oo f1 ：1o m i c r o w a v ea s s i s t a n te x t r a c t i o nf o r3 om i n sf o rt 、) 旧 t i m e su n d e r5 0 f i r e p o 、e r i tw a sp r o v e dt h a t 仅锄y l a s ec o u l dw i p eo f f 锄y l 啪e f f e c t i v e l y b yt 、v os t e p s ，a n dt r i c m o r o a c e t i ca c i dm e t h o dw a sa p p r o p r i a t et ow i p eo f fa l b u m i n o i d a n d t h ee m a n o lc o n c e n t r a t i o nw a u s3 o ，t h ee x t r a c t i o nr a t eo fm ew a t e r s o l u b l ep o l y s a c c h a r i d e so f r i c eb r a nw a s1 4 1 i nc h 印t e r3 ，an u o r e s c e n c es p e c t r o m e t 巧m e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e dt od e t e n n i n e t 巧p t o p h a ni i lh a i r ，a n d 印p l i e dt oe v a l u a t eh a i rd a m n i f i c a t i o nu n d e ru v bu l t r a v i o l e t 5 5m o l l - 1n a o hs o l u t i o nc o n t a i l l i n go 5 s o l u b l es t a r c hw a u su s e df o rh y d r o l y s i so fm eh a i rs 锄p l e s i np hl0 5b u f r e ro fn a h 2 p 0 4 - n a o h ，t h ef l u o r e s c e n ti n t e n s i t ) ，o ft 巧p t o p h a i lw a u sd e t e m i n e d a t2 8 0m n2 l se x c i t a t i o nw a v e l e n 甄ha n d36 0n ma te m i s s i o nw a v e l e n h t h el i n e a rr a n g eo f t 叫p t o p h a nw a s6 o m8 o x l 0 咖lt 0 1 7 5 1 0 _ 6 9 m l t h ed e t e c t i o nl i m i to f1 6 x 1 0 - 8 9 m l a n dt h er e c o v e r i e sr a j l g e d 行o m9 6 3 t o10 0 3 s h o w e dt h a tm em e m o dw a l ss e n s i t i v ea n d a c c u r a t e w i t ht h ei n c r e a s eo fm ei r r a d i a t i o nt i m ew i t hu v b u l t r a v i o l e t ，t 珂p t o p h a ni nh a i r d e c r e a s e da c c o r d i n g l y d 嘶n g2 8d a y si m d i a t i o n ，仃y p t o p h a ni nh a i r 、懈l o s tb y18 8 t h i s m e t h o dc o u l db er e c o m m e n d e dt om e a s u r eu l t r a v i o l e td a m n i f i c a i t i o no fh a i r a b s t 嚣e t i nc h a p t e f4 ，r i c eb r 蛆p o l y s a c c h 撕d e s 、珊r ea p p l i e df o rp r o t e c t i o nh a 董rf f o mu v 纛罄建蛾董至e a 曩。致脚爹l o p a n 迅囊蔽r 溉sd e t e 潍i 蠢e dw i 也曩愆s c e 珏c 霉印e e 囊蛩m 髓疆撒。绦o d ， t h ec o n t e n t so f 脚t o p h a nw e r ea p p l i e dt oe v a l u a t eh a i rd a n l n i ：f i c a t i o nd u et ou v b u l 氆料i o l 或鞠如rp t e c t i o 建o fr 主e eb r a np o l y s a c c h 撕d e s 。f o rs i 班u l a 鼍i n g 萎x a 钒r e ，圭l a i rw a s b e s 碰放l e dw 量t hm i x 撼r 。s o l u t i o no f 戳b 蕊釉l y s a c c h 赫d e sa 赫t w e e m 8 0 ，n 菇u r a l l y d r y e d ，m e nr a c l i a t e du n d e ru v 8u l t r a v i 0 1 e t nw a ss h o w nt h a tm o u 幽t h ec o n t e n to f 姆醛印h 雒搬h 舔r 磁魄p 鼯耗e i o no f 迅e 凝雒羚l y s 鑫c e h 撤怒& e a s o d ，建w 淞o b 弧。懒i y h i 酿e rc o m p a r o dw i mt h eh a i rb e s p r i n 褂o do n l yw i m1 w | e e n - 8 0 ，谢1 i c hp r o v er i c eb r a l l p o l v s a c c h a r i d e sm i g h th a v ee f f e c to nr e s i s t 漉gu v b - u l t r a v i o l o t k e y w o r d s ：黼c eb 雠；h i 薛& r 如蕊勰e el i q u i de 量l 嫩粕擎a p h y ；h a 蠢d 瓣n i 蠡e 妊溉； f i 瓣s c e n e es p e e 毫r o m o 留；u v b _ u l 雠v i o l e 专 i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：夔。垫 日 关于论文使用授权的说明 期：功师艿6 加 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 塑量! 导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 米糠 米糠是稻谷脱壳后依附在糙米上的表面层，由外果皮、中果皮、交朕层、种皮及糊 粉层组成，米糠中集中了6 4 的稻米营养素以及9 0 以上的人体必需元素，其化学成分 以糖类、脂肪和蛋白质为主，还含有较多的维生素、植酸盐和矿物质等营养素，并含有 生育酚、生育酚三烯、丫谷维醇、2 8 碳烷醇、a 一硫辛酸、角鲨烯、神经酰胺、d 胡萝卜 素和必需脂肪酸等近1 0 0 种具有各种功能的生物活性因子，具有预防心血管疾病、调节 血糖、减肥、预防肿瘤、抗疲劳和美容等多种功能【l 】。 目前国外己从米糠中提取出多种天然营养成分，如米糠营养素、米糠营养纤维、米 糠蛋白，可见这些以米糠为原料的保健品和护肤品势头之强劲。但在我国仅有1 0 1 5 的米糠用于制取米糠油和提取植酸钙、肌醇和谷维素等产品，这一宝贵资源尚未得到有 效利用1 2 j 。米糠在国外被誉为“天赐营养源”；联合国工业发展组织把米糠和米胚称为 一种未充分利用的资源，具有非常高的保健开发价值。若能将这些营养价值极高的米糠 变废为宝，将为大家的生活添加新鲜健康的动力。 1 1 米糠功能成分及生理活性 1 1 1 米糠中的维生素生理功能及其应用 米糠中含有丰富水溶性b 族维生素，脂溶性维生素e ，具有活性功能的维生素在化 妆品、保健品中的应用己引起人们的广泛关注。 维生素e 也称生育酚，为棕红色，性质不稳定，对热对光和紫外线较敏感，极易被 氧化，因而常被用作化妆品中的抗氧化剂。维生素e 在米糠油中的含量为4 1m 1 0 0g 一2 5 0 m l o og ，是工业用维生素e 的重要来源之一。在膏霜中的添加量为o 5 5 0 ，通过 皮肤吸收后到达真皮。其核心作用是作为体内抗氧化剂。肌肤对维生素e 的吸收可以有 两种途径，第一是皮肤表面的吸收，即从皮肤到达真皮；第二是通过毛发根部的表皮到 达真皮。维生素e 可以通过健康肌肤而被吸收，这一点对于增强组织氧的利用及良好的 毛细血管循环是十分必要的。已经有足够的证据证明，维生素e 在机体细胞、组织遭受 内部新陈代谢和外部环境刺激所产生的自由基侵害时，可以起重要的保护作用。目前， 维生素e 在膏霜中的添加已经非常普遍，主要用于改善干燥肌肤，滋润柔嫩皮肤。 由于米糠中b 族维生素的含量丰富，维生素b 6 ( 烟酰胺) 及b 3 具有抗粉刺及美白、治 疗痤疮的功效；维生素b 3 和维生素c 共同作用，能有效抑制黑色素细胞的生成；而且大 部分b 族维生素具有抗炎作用。因此，b 族维生素在化妆品中的应用广泛。 1 1 2 米糠多糖的生理活性及其应用 多糖能促进造血细胞的增殖与分化，对骨髓有核细胞与c f u s 产生一定的影响，对 g m c f c 的数量有增多作用，从而使外周血白细胞数升高。顾勇士等【3 】报道人参多糖对 受照射小鼠骨髓c f u g m 的保护作用显著，且在照后第1 4d 这种保护作用仍很明显 汪南大学硕圭学穰论文 ( p i i i i i ，可见微波火力增大会对多糖造成一 定的破坏；提取时间过长也存在同样的情况。 当微波辐射时间一定时，微波火力越高，物系吸收微波能越多，物系温度升的越快， 固液传质速度亦越快；且温度越高，对物料细胞破坏作用越大，有利于物料有效成分浸 出。但当微波火力增加到一定程度时，微波有可能促使米糠多糖分解，反而使米糠多糖 提取率下降。因此，确定1 0 0 0w 微波炉中5 0 微波火力提取3 0m i n 为米糠多糖提取条件。 3 3 6 透析袋的处理及小分子糖的去除 把透析袋剪成适当长度( 1 0 2 0c m ) 的小段；在大体积的2 碳酸氢钠和e d t a 中将 透析袋煮沸1 0m i n ；用蒸馏水彻底清洗透析袋；放在lm o l l 的e d t a 中将汁煮沸1 0m i n ； 冷却后，存放于4 环境中，必须保证透析袋浸没在溶液中，从此时起取用透析袋必须 戴手套；用前在透析袋内装满水，然后排出，使之清洗干净。 把透析袋的一头用细线绑好，把糖液倒在透析袋中，糖液体积为透析袋的2 3 ，将另 一端用细线绑好，做好编号；在3l 容器中加满蒸馏水，把装有糖液的透析袋放入其中， 使其固定好；打开磁力搅拌器，使容器中的水能够较好的循环；透析4 8h ，每4h 换一次 容器中的水；将糖液从透析袋中倒出，放入冰箱中，备用；透析袋清洗干净后，浸没在 2 0 的乙醇溶液中。 3 3 7 真空冷冻干燥 透析后的糖液，冷冻干燥得到i 氇p a 、r b p b 的固体粉末。 3 3 8 红外特征吸收光谱测定 用k b r 将多糖a ( 3 0 乙醇醇沉所得的糖) ，多糖b ( 5 0 乙醇醇沉所得的糖) 的固体 压片，在5 0 0 4 0 0 0c m 。1 的范围内进行扫描，测定r b p a 、i m p b ，见图3 4 ，3 5 。 1 9 衢 坫 j 0 乱 o 乱 0 n 一一一蜘缸耀酶霹* 江南大学硕士学能论文 c 。 艘 e c 疗 c l 卜 亡 里 c 几 塑 e 毋 c i 一 卜 谮豁e 魏疆m 魏。r 馨臻) 图3 4r b p a 的红外特征吸收光谱 f 遮3 4t h el ra b s o r p t i o ns p e c 拉u mo fr 8 f a wa v e n u m b er ( c m l ) 图3 5r b p b 的红外特征吸收光谱 f i g3 5 限el ra b s o r p 童i o 睡s p e c t f u mo fr b p b 由图3 。4 ，3 5 可以看出：3 3 6 9c m o 和3 4 2 2c m o 处有一宽峰为o h 官能团吸收峰，由 于氢键的作用使得这两个吸收峰比较宽；2 9 2 6c m 。和2 9 2 4c m 有c ， 吸收峰，很弱；1 3 8 4 c m 。1 处为c h 3 的弯曲振动所致；1 0 7 6c m j 和1 0 7 9c m _ 1 处比较大的吸收峰是由c o 伸缩振 动弓| 起的；1 6 6 2e m 。和1 6 5 4c 匿有两个比较大的羰基峰，由此可以初步推断被测样晶为 糖类结构。同时，在多糖a 的红外光谱图上可以看到在1 5 4 9c m 。1 处有一个小的吸收峰， 为酰胺中羰基的吸收蜂，可见，在多糖a 中含有微量未去除的蛋自质。多糖b 中几乎无蛋 白质存在，纯度相对较高。 第三章米糠多糖的提取研究 3 3 9 分子量的测量 ( 1 ) 测量方法：高效凝胶过滤色谱法( h p g f c ) 。 ( 2 ) 仪器：w a t e r6 0 0 高效液相色谱仪( 配2 4 1 0 示差折光监测器和m 3 2 工作站) 。 ( 3 ) 色谱条件 色谱柱：u l t r a h y d r o g e l t m “n e a r 3 0 0m m 7 8m m i d 2 流动相：0 1n 硝酸钠 流速：o 9m l m i n 柱温：4 5o c 利用高效凝胶过滤色谱法对所得多糖a 、b 进行分子量测量的结果见图3 6 、3 7 ；表 3 2 、3 3 。分子量校正曲线见图3 9 。 图3 6 多糖a 的h p g f c 色谱图 f i g3 - 6t h eh p g f c c h r o m a t o g r 锄o fr b p a 图3 7 多糖a 的h p g f c 色谱图 f i g3 7t h eh p g f c c h r o m a t o g r 锄o f r - b p b 2 l 江南大学硕士学位论文 表3 2 多糖a 的h p g f c 色谱数据 强翻e3 2 强e 粥f c c h r o m a 协g 嘲d a t ao fr b 魏 表3 3 多糖b 的h p g f c 色谱数据 t a b l e3 3t h eh p g f c c h r o m a t o g r 锄d a t ao fr b p b 1 2 1 4 _ 田1 6 1 朝d羽妇0丑2 4 匝 巍i 鳅溺砸霉 图3 8 分子量校正曲线 f i g3 8t h ec o n e c t i o nc u r v eo fl n o l e c u l a l w e l g h 重 根据图3 。7 的数据，得线性方程l o 幽撕= 1 3 6 。0 515 丁，相关系数r 2 = 0 9 9 2 6 。根据这个 线性方程计算多糖分子量，结果见表3 4 。 表3 ，4 多糖a ，b 分子量分布范围 i 铀l e3 4 d i s t r i b u t e d1 a n g eo fr b p aa n dr b p b 分子鼙范丽所占的含量 6 4 1 0 - - 2 2 1 0 1 0 7 0 多密蠹a2 2 1 0 5 1 。4 l 扩2 l 。9 6 1 4 l o 耳一1 1 1 0 2 6 7 3 4 6 8 l o7 2 。9 1 0 31 9 9 0 多糖b2 。9 1 0 5 7 1 1 0 3 3 1 7 7 7 1 l o 一1 1 1 0 。4 8 3 2 第三章米糠多糖的提取研究 3 4 本章小结 脱脂米糠与蒸馏水在料液比为1 ：1 0 时，采用三氯乙酸法去除蛋白质，两步法去除淀 粉，在5 0 微波火力条件下提取3 0m i n ( i ) 为最佳米糠多糖提取方法。米糠多糖得率 为1 4 1 ，较文献中微波提取米糠多糖得率高。3 0 醇沉米糠多糖中有3 5 分子量大于 1 0 0 0 0 ；5 0 醇沉米糠多糖中有5 0 分子量大于1 0 0 0 0 。 r b p a 为淡黄色絮状固体，i 心p b 为白色固体，均无味。苯酚一硫酸试剂反应均呈棕 红色，与碘反应不显蓝色；易溶于水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮，无挥发性。实验所得 产品r b p a 、i 也p b 将被应用于其活性功能的研究。 江南犬学硕士学使论文 第四章荧光法头发光损伤评价方法研究 4 。羔荨l言 头发受到日光中的紫外线的连续辐射，发表面角质消失，露出皮质层纤维，头发分 叉霸断裂，发结构发生鹱显退纯，因此头发的光防护不容忽视。目前头发光损伤的评价 尚无标准。n a c h 舻7 1 等认为，头发中有二硫键的断裂，就存在光损伤；胡图胜阐采用头 发张力仪测定模拟日光紫外灯照射头发的梳理功，记录梳理功曲线来评价光损伤。色氯 酸在2 9 6 。3 1 5n 辍的紫井光下不稳定，容荔产生光分解辫l ，色氨酸可以推荐 乍为头发光 损伤的灵敏标志物5 9 1 ，本实验采用荧光技术，通过监测紫外光照射后头发中色氨酸的变 化来定量评徐头发光损伤鲢程度。 氨基酸分析最常用的方法是样品水解后，进行衍生化，用高效液相色谱法测定，可 同时测定多种氨基酸。方法准确、重现性好，僵步骤繁琐，魄较耗时，此外，水鳃中和 后，不经脱盐宣接上柱，易对树脂造成污染镧。头发中的色氨酸含量为头发角蛋自的 o 。7 ，含量相对较少。荧光分析法具有灵敏度高，选择性好，操作方便等优点【6 1 1 。金静 芳等蚓采焉荧光技术测定羽毛中麴色氨酸含量。l s p 公司采餍荧光法测量了头发中的色 氨酸含量【6 3 1 。但受紫外线的辐射，头发中色氨酸含量的变化的定量测定，目前尚无报道。 本文遴过头发在联b 波段的紫雏光下照射不露时闻，采用荧光法测定头发中色氨酸含 量的变化，定量评价头发的光损伤。 4 。2 实验部分 4 2 1 仪器 岛津装墨。5 3 差分光光度役，配le 瓣的吸收洼。 u v b 紫外灯( 4 0m ，购自南京华强电子有限公司。 烘籍，淫南瑰义 4 2 2 试剂与样品 4 2 3 准备实验 辱2 3 王标准系列溶液配置 l 。色氨酸敞r ，中圜医药集豳上海化学试裁公司) ，用p l o 。5 缓冲液配成l 1 0 4 咖l 的标准储备液。承解液：含o 5 可溶性淀粉的5 5m o l 盈麴氢氧化钠溶液。p h 缓冲溶液： 第四章荧光法头发光损伤评价方法研究 o 5m o l l 磷酸二氢钠与0 5m o l l 氢氧化钠以体积比为8 5 ：1 0 混合，p h l o 5 。 分别移取o o 、o 0 8 、0 1 5 、o 4 0 、o 6 0 、0 8 0 、1 o o 、1 2 5 、1 5 0 、1 7 5m l 的 1 1 0 4g m l 色氨酸储备液于1 0 0m l 容量瓶中，用p h l o 5 的缓冲溶液定容，得到一系 列色氨酸标准溶液。 4 2 3 2 样品及样品溶液制备 取一束健康干净头发均匀铺展开，置于u v b 紫外灯下照射，照射距离2 5c m ，定 时取样。实验样品为照射5 天，1 0 天，1 5 天，1 9 天，2 8 天的头发样品，未经u v b 照 射的头发作对照样。 。 将上述头发样品剪成1c m 左右的碎发，用石油醚超声脱脂，在5 0o c 烘箱内烘 2 0m i n 。在避光处冷却至室温。 准确称取0 0 1 5 0g 的头发样品于水解管内，加入新鲜配置的内含0 5 淀粉的 5 5m o l l 的氢氧化钠溶液3m l ，将水解管抽真空2 3m i n ，封口，在烘箱中1 1 0o c 水解 2 0h ，放置暗处冷却至室温ln 1 。 将水解物转移至已加有2 6m l6m o l l 盐酸的2 5m l 容量瓶中，用蒸馏水冲洗水解 管5 6 次，直至完全转移。用o 1m o l l 盐酸调p h 到5 6 ，然后再用0 5m o l l 的氢氧 化钠调p h 到7 8 ，用蒸馏水定容，得到供试液。 4 2 3 实验方法 采用荧光分光光度计测定。选择2 8 0i u n 作为激发波长，激发光谱狭缝宽度为3n n l ， 发射光谱狭缝宽度为5m ，在2 7 0 7 0 0m n 波长范围快速扫描，得到色氨酸的荧光发射 光谱。在最大发射波长3 6 01 1 1 1 1 测定荧光强度值，对色氨酸进行定量分析。 4 3 结果与讨论 4 3 1 条件优化 4 3 1 1 水解条件优化 酸碱水解提取法是较常用的氨基酸生产方法。但是采用酸水解法，头发中的色氨酸 几乎全被破坏。因此，本实验采用碱水解。 考察氢氧化钠浓度对头发样品水解的影响，各称取0 0 1 5 0g 未光照的头发样品，分 别加入不同浓度的氢氧化钠水解液3m l 进行水解，测定色氨酸的荧光强度。图4 1 所 示5 5m o l l 氢氧化钠水解效果最好。 2 5 江毒大学硬圭学臻论文 5 ，58 浓度( m 0 1 l ) 臻毒一l 拳解液浓度对色氨酸荧光强覆翡影响 f 酶4 1e 饿c to f c o n c e n t r a t i o no f h y d r o l y s i ss o l u t i o no nf l u o r e s c e n ti n t e n s 蚵 毒。3 。薹。2 缓冲液龃的影响 色氨酸的荧光信号强弱与缓冲液p h 有很大的关系。实验考察了不同p h 缓冲液的 荧光信号强度，懿匿4 2 赝示，色氨酸在p h 9 。5 一l o ，5 缓冲液中，荧光信号较强。因此实 验选择了p h l 0 5 的缓冲液。 恿4 2 荧光强霞的影嚷 f 皓4 - 2e 毹c to f 州v a i u eo ft h eb u 懿ro nf l u o r e s c e n ti n 础l s i 锣 毒。3 。2 方法学研究 4 3 2 1 回归方程及检出限 在最佳实验条件下，对一系列蠹准溶液进行荧光溅定，工作煞线图4 3 。褥到色氨 酸的线性范围为8 0 1 0 7 5 1 0 6g m l ，回归方程y = 4 1 0 8 x + 6 4 4 0 5 ，相关系数 o 。9 9 9 2 。对未光照样瑟水解液连续取样溅试7 次，r s d = 2 2 出荧光信号强度相对标 准偏差的3 倍与工作曲线斜率之比，得色氨酸的稔出限为：1 6 l o 峭咖l 。 2 6 蕃0 5 o 5 o 5 o 5 o髂黔弘拍艇熬黯貅就毖 越骠鬟粼 第四章荧光法头发光损伤评价方法研究 o 0 e + 0 04 0 e 0 78 0 e 一0 71 2 e0 61 6 e0 62 ，o e 一0 6 浓度( g m l ) 图4 3色氨酸标准工作曲线 f i g 4 - 3 t h es t a n d a r dc u r v eo f 缸y p t o p h a n 4 3 2 2 重现性试验 对光照4 天的头发样品连续取样测定7 次，荧光强度分别为：2 1 7 4 1 9a u 、2 1 7 6 1 1 a u 、2 1 4 8 3 4a u 、2 1 3 4 9 5a u 、2 1 4 2 8 4a u 、2 1 4 2 8 5a u 、2 1 4 2 8 5 7a u ，其相对标准偏差 ( r s d ) 为：0 9 1 。表明重现性良好。 4 3 2 3 稳定性研究 为了考察供试液的稳定性，在1 5h 内每隔l o m i n 取样测定一次，荧光强度分别为： 2 1 4 0 8 5a u 、2 1 2 0 9 2a u 、2 1 3 2 0 2a u 、2 0 8 6 3 3a u 、2 1 2 1 5 3a u 、2 0 9 7 la u 、2 1 1 0 4 7a u 、 2 0 9 4 9 8a u 、2 0 8 9 2 2a u ，结果发现，9 次测定结果的相对标准偏差( r s d ) 为1 5 ，表 明供试液稳定性良好。 4 3 2 4 干扰实验 在氨基酸分析中，可以直接通过荧光技术检测的有色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。 未处理过的头发中，色氨酸的量为角蛋白的o 7 ，酪氨酸的量为角蛋白的3 1 ， 苯丙氨酸的量为角蛋白的2 7 。采用碱水解，虽然含有酚羟基的酪氨酸会部分被破坏 掉，但仍有少部分存在；色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的最大激发波长和发射波长为l t r p ： 沁x = 2 8 0i l r i l 、沁m = 3 6 0 衄； l - 即： 沁x 2 2 7 6r 吼、沁m = 3 0 5 衄；l - p h e ：地x22 1 0 i u n 、沁m = 3 0 3m 。可见在实验条件下，苯丙氨酸对该实验无影响；虽然在p h l o 5 时， 色氨酸荧光强度最大，是同等浓度下酪氨酸溶液的1 0 0 倍6 4 1 。由于色氨酸与酪氨酸的 激发波长相近，最大发射波长相差5 5 啪，因此对酪氨酸的干扰进行了考察。 考虑到头发中酪氨酸的量是色氨酸的4 4 倍，实验中先对4 1 0 一7g n 儿的色氨酸标 准样品测定了三次，平均荧光强度为1 6 2 4 7 8a u ，然后对4 1 0 - 7g m l 的色氨酸和 1 7 6 1 0 6g m l 的酪氨酸混合标准样品进行测定，平均荧光强度为1 6 4 2 8 8a u ，实验结 果发现：加酪氨酸后，色氨酸的平均荧光强度增高1 0 8 ，说明至少4 4 倍色氨酸量的 酪氨酸供试液的测定不产生影响，所以头发中的色氨酸可直接用荧光法进行测定。 4 3 3 样品测定及回收率实验 u v b 照射不同天数的头发样品及未经照射的对照样，按1 3 2 方法操作，取2m l 2 7 江南大学硕士学镳论文 供试液加入l om l 的p h l o 5 的缓冲液，混匀，进行测定。结果见表4 1 ，荧光光谱图见 图4 。4 ，发现随着紫辨光辐射时间的增长，头发样品中色氮酸的量呈下降趋势，光照2 8 天后色氨酸的量下降了1 8 8 。通过测量头发中色氨酸的含量，可以表征头发光损伤的 严重程度。 用未经照射的对照发样，进行了回收率测定。结果见表4 2 ，回收率在9 6 3 1 0 0 3 ， 表明方法准确可靠。 2 5 0 2 0 0 s 1 5 0 爿 l o o 5 0 o 3 0 0 3 5 04 0 84 5 05 0 0 五( n m ) 凿霹4l 簿6 簿头发样品水解液荧光光谱 f i g 4 - 4 t h en u o r e s c e n c es p e c t r u mo f1 撑一6 撑h a i rs a m p l e s 表4 1 头发样品中色氨酸含量测定( n - 3 ) t a b 4 1t h ec o n t e n t so f h a i rs a m p l e s ( n = 3 ) 样品含量加标量加标后测得【口i 收量回收率 ( g 髓)( g 触l )( g 矗鞋l )( f n 乙)( 譬 2 9 8 x l o 一73 3 l o 一76 2 9 l o 一72 9 9 l o 一7l 0 0 3 2 。9 8 l o 一，3 3 l o 一76 2 5 l o 一72 9 5 1 0 79 9 o 2 。9 8 l e 73 。3 x l o 一76 | 7 1 9 72 8 7 l o 一7 9 6 3 4 4 讨论 当阳光照射到头发上时，头发的主要组成部分氨基酸会吸收阳光里的紫外线。而紫 外线能产生光降解作用，令氨基酸之间的链接断裂，从而使氨基酸分解并流失，头发 的基本结构隧之被破坏，头发因此变得于桔、脆弱、暗淡。此外，紫外线还会破坏头发 第四章荧光法头发光损伤评价方法研究 中的其它化学成分，使发色变浅，越来越枯黄，并减弱头发对阳光的天然抵御作用。 阳光中的紫外线对头发的照射可产生一系列的负作用，如组织改变，明显干燥，丧 失弹性，孔隙增大，膨胀率增加，染色吸收特征改变，头发天然颜色褪色等。其主要原 因是光损伤后头发中富含的胱氨酸的二硫键被打开，例如胱氨酸变成了磺基丙氨酸。 芳香族氨基酸如色氨酸，酪氨酸可被光降解。 经过不同时间的紫外辐射后，取其中一根头发可以看出，头发组织的孔隙明显增大， 透光性增大，见图4 5 。 口 0d 驯 江南大学硕士学位论文 2 8d a 、s 图4 5 头发的显微镜照片 f i 9 4 t h e m d l o g 唧h so f h m r 4 5 本章小结 从头发的显微镜照片，发现头发的组织受损在其透光度方面有明显的表现，可咀更 加印证头发在紫外辐射下会严重受损。 本部分建立了头发中色氨酸荧光分析方法，并用该法研究了u v b 辐射下头发中色 氨酸的变化规律。头发样品在光照条件下，头发中色氨酸的量呈减少趋势，在实验条件 下光照2 8 天后，色氨酸的损失率达到1 8 8 。该法快速，简便，灵敏度高，可推荐作 为衡量头发光损伤的定量指标。 第五章米糠多糖护发应用研究 第五章米糠多糖护发应用研究 5 1 引言 米糠多糖( 融c eb r a i np o l y s a c c h 撕d e ，r b p ) 存在于稻谷的颖果皮层罩，主要是指 分子量不等的