（动物学专业论文）利用鲤鱼作为指示生物评价黄河兰州段水质致遗传毒性作用.pdf

7 3 1 8 二7 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立 进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的 成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内 容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对 本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：痧穆日 期：递堕：! ：! ! 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权 归属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规 定，同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保 存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直 接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：至篁导师签名：退色翅日期：婴垡 冀州人学研究乍学侍沦史 致谢 值此论文完成之际，首先感谢我的导师张迎梅教授三年来的悉心指导和无 微不至的关怀，论文从选题、设计到撰写无不倾注着恩师的心血。导师渊博的 学识、严谨的治学态度、求实的工作作风、乐观的生活态度、对学生关心呵护 永远是我学习的榜样。在此，特向尊敬的导师致以我最衷心的感谢! 感谢刘乃发教授、王子仁教授、胡建成副教授、高岚副教授、常城副教授、 包新康和张立勋等老师，以及资料室和中心实验室的老师们，在我硕士学习期 间给予了无私帮助和关心，为我完成论文提供了很多方便。 感谢我的父母和家人，感谢他们对我默默的支持和鼓励，他们无私的爱是 我进步的最大动力。 在论文实验期间，得到了本实验室黄德军、谭玉凤、王丙莲、刘江海、宋 刚、刘阳、罗松年、朱丽娜、侯亚妮、刘涛等同学的支持与帮助，尤其是大家 一起讨论的生活激起了我更多的实验灵感和科研兴趣。在此向他们表示我诚挚 的谢意! 最后，感谢所有帮助过我，指导过我，关心过我，支持过我的人们 龙静 2 0 0 5 5 中文摘要 随着工农业生产的快速发展和人的急剧增氏环境污染问题h 益突f i ；，其中水体污 染危害最大、分布晟广已成为严峻的社会问题。所以实施水资源保护，及时掌握水环境 质量动态变化，开展水资源环境监测和评价越来越受到人们关注。 本研究选择鲤鱼作为指示生物，以刘家峡水库为对照点，主要检测了黄河兰州段水质 致遗传毒性作用并对一些相关指标如核异常、核质比、血清蛋白及乳酸脱氢酶凝胶电泳、 鱼类群落结构变化等进行了测定，取得如下结果： 与八十年代统计资料比较，黄河兰州段鱼类资源在总数量和种类上明显减少，一些常 见种、优势种变成稀有种类或濒临灭绝，水体中主要为一些耐污种鱼类，如鲤鱼、鲫鱼、 黄河麴等。对研究对象形态进行统计和分析，发现兰州段鲤鱼平均增长速度捅对缓慢，鱼 体外形不及刘家峡水库的修长。另外，兰州段鱼样的肝比重和脾比重明显增大，均为刘家 蛱的1 7 6 倍。 微核和核异常结果表明，黄河兰州段鲤鱼微拨率为0 4 6 7 ，显著高于刘家峡水库 ( f 1 1 9 = 7 3 9 7 ，p = 0 0 1 3 4 ) ，说明兰州段水体中具有较高浓度核诱变物质，具有较强的 诱变性。同时，水污染可诱导不同形式的核异常，核异常率为2 4 4 7 ，低于对照点( 刘 家蛱水库) ，但差异不显著( f 1 1 9 = 2 0 0 4 ，p = 0 1 7 3 ) ，主要表现为内凹、外 、圆锥形、 不等缢裂、核破碎、空泡化等。比较两样点红细胞大小，结果表明兰州段的红细胞小，核 质比大，主要表现为细胞短径( w b ) 明2 4 , 了= 对照组( f 1 。1 3 = 5 4 6 0 ，p = 00 3 6 ) ，细胞 短径，细胞核短径( w c w n ) 极显著小于对照组( f 1 1 3 = 1 2 5 9 2 ，p = 0 ，0 0 4 ) 。 彗星电泳试验结果表明，与刘家峡水库相比，兰州水污染导致r 更高比例和程度的 d n a 单链损伤，损伤率平均为1 0 4 ，损伤程度a u 值平均为2 2 7 ，但在两样点兀显著忭 差异( 损伤比例：f 1 ，1 5 = 0 7 9 7 ，p = 0 3 8 6 ；损伤程度：f 1 1 5 = 2 5 1 5 ，p = 0 1 3 4 ) ：水污染 对双链断裂影响不大( 损伤比例：f 1 。1 8 = 0 2 9 8 ，p = 0 5 9 2 ；损伤程度：f 1 ，1 8 = 0 1 6 8 p = 0 6 8 7 ) 。 l d h 酶活性测定表明，兰州段鲤鱼肝、肾、小肠组织中的l d h 酶活性均高】：刘家峡 水库的，在f l l ：n , q 存在姐著差异( f = 1 2 1 3 7 6 2 p = 0 0 1 3 ) 。 j i | 犬学研究i t - 学位论立 聚丙烯酰胺凝胶电泳表明，兰州段血清电泳条带数为雌性1 7 条雄性1 6 条，与刘 家峡水库( 雌雄鱼中分别为1 2 和1 1 条) 相比，相对增加率为4 5 和4 2 ，而且主要表 现为中问段的蛋白带数增加。两样点l d h 同工酶图谱显示同工酶条带数日、棚对迁移率 及色带颜色深浅在肝、肾组织中存在明显的地方差异。污染对肝脏l i ) h 同工酶影响最大， 肾脏次之，肠最小。 此外，在以上生物学检测指标中，其统计结果共同的特征表现为，兰州段个体之间存 在着高变异性。 综上所述，黄河兰州段水质污染对生物体遗传物质具有明显的损伤作用，同时，导致 鱼类物种多样性减少，抑制生长发育；另一方面，生物体对污染物具有一定的抗性作用。 表现出一些生理上的适应性变化。 关键词：兰州：黄河；刘家峡水库；水质污染；鲤鱼；遗传毒性 兰州太学研究生学忙沧文 a b s t r a c t w d ht h ef a s td e v e l o p m e n to fi n d u s t r ya n da g r i c u l t u r ea n dt h er a p i di n c r e a s eo ft h e p o p u l a t i o n 。e n v i r o n m e n tp o l l u t i o nh a sb e e n m o r ea n di t - o r es e r i o u s a n dt h ew a t e r p o h j t i e ni st h em o s th a r m f u la n dw f d e vd i s t r i b u t e d ，c a u s i n gs e r i o u ss o c i a lp r o b l e m s t h u s ，p r o t e c t i n gw a t e rr e s o 哪s ，t r a c k i n gt h ed y n a m i cc h a n g eo fw a t e rq u a l i t y 。d e t e c t i n g a n da s s e s s i n gw a t e rr e s o u r c e sa n de n v i r o n m e n ta r eg i v e nm o r ea n dm o r ec o g c e m t h ep a p e rm a i n l ye v a l u a t e st h eg e n o t o x i c i t yo fw a t e rp o l l u t i o ni nl a n z h o us e c t i o n o ft h ey e l l o wr i v e r ( l z ) u s i n gc y p n n u sc a r p i oa sab i o i n d i c a t o r t h er e s e r v o i rl i u j i a x i a ( r l ) i sd e v o i do fa n yi n d u s t r ya n dh a sb e e nr e p o r t e dt oc a r r yr e l a t i v e l yf e wt o x i c s u b s t a n c e s 。s oi tc a nb ec o n s i d e r e da sac o n t r o lb e t w e e nt w os i t e su n d e rs t u d y s o m e o t h e rr e l a t i v ep a r a m e t e r sl i k en u c l e a rs h a p ea n o m a l y n u d e o - c y t o p l a s m i cr a t i o g e l e l e c t r o p h o r e t i cp r o f i l e so fb l o o ds e f u ma n dl a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ( l d h 】i s o z y m e s 。f i s h c o m m u n i t ys t r u c t u r ea n ds o o na r ea l s 0a s s e s s e dt os t r e n g t h e nt h eb a s i sf o r a s c e r t a i n i n gg e n o t o x i cs t r e s st ow h i c ht h ef i s hm a yh ee x p o s e di nt h e i rn a t u r a lh a b i t t h er e s u n sa r ea sf 0 i l o w ： t h et o t a ln u m b e ro ff i s ha n ds p e c i e sa r el o w e ra tl zs i t et h a nt h a ti n1 9 8 0 s ，s o m e c o m m o ns p e c i e so rd o m i n a n ts p e c i e sh a sb e e nr a r e 。e v e ne x t i n c t ，p o l l u t i o n t o l e r a n t s p e c i e si nl zm a i n l yi n c l u d ec y p n n u s c a r a s s i u sa n dg o b i oh u a n g h e n s i s a n a l y s i so f c a r p s m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e d s t i c ss h o w st h a tc a r p si n 17g r o ws l o w e ra n df i s hi nr l a p p e a r , m o r es l e n d e r b o t hr e l a t i v el i v e rw e i g h t ( r l w ) a n dr e l a t i v es p l e e nw e i g h t ( r s v v ) 0 fl za r e1 7 6 - f o l dg r e a t e rt h a nc o n t r o ls i t ea n dt h e r ei sm a r k e dd i f f e r e n c eb e t w e e nt w o s i t e s m i c r o n u c e it e s ti np e n d h e r a fb l o o dc e l l ss h o w st h a tt h ef r e q u e n c yo fm i 舒o n u e l e i i nl z i s 0 ，4 6 7 ，a n d i t i s s i g n i f i c a n t l yh i g h e r ( f 1 1 9 = 7 3 9 7 ，p = 0 0 1 3 4 ) t h a n t h a t i n r l w h i c hi n d i c a t e st h a tt h e r ea r em u t a g e n se x i s t i n gi nt h ew a t e ra n dt h ew a t e rh a sh i g h m u t a g e n i c i t y w a t e rp o l l u t i o na l s oc a ni n d u c en u d e a ra n o m a l i e s t h ef r e q u e n c yo f e r y t h r o c y t e sw i t ha b n o r m a ls h a p e dn u c l e i s u c ha sn o t c h e d b l e b b e d c o n i c a l u n e q u a lc o n s t d c t e d ，f r a g m e n t e d v a c u o l a t e d ，j s2 4 4 7 i n 17 w h i c hi sl o w e rt h a n t h a ti nc o n t r o ls i t e b u tn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei s f o u n d ( f 1 ，1 9 = - 2 0 0 4 ，p = o 1 7 3 ) c o m p a r a t i v ea n a l y s i so fe r y t h r o c y t e sa n dn u c l e is i z es h o w s t h a tc e l l sa r er e l a t i v e l y 4 兰州人学研究生学位跄文 s m a l l e ra n dt h er a t i o sb e t w e e nn u c l e u sa n dc y t o p l a s ma r eb i g g i s hi nl zi tc a nb e c o n c l u d e df r o mt h er e s u l t st h a tm i n i m u mw i d t ho fc o i l s ( w i nl za r es i g n i f i c a n ts h o r t e r ( f i 1 3 - - 5 4 6 0 p = 0 0 3 6 a n dt h er a t i o sb e t w e e nm i n i m u mw i d t ho fn u c l e u sa n dt h e m i n i m u mw i d t ho fc e l l s ( w r v w c ) a l et e n d b l eb i g g e rt h a nt h a ti nc o n t r o ls i t e ( f 1 1 3 = 1 2 5 9 2 ，p = 0 。0 0 4 ) t h ep e r c e n t a g ea n dt h ee x t e n to fe 叫h 嘣。) ed n ad a m a g e s i n d u c t i n gd n a s i n g l e - s t r a n db r e a k a g ea n d e ra l k a l i - l a b i l el e s i o n s ，a r eh i g h e ri nl zb ya l k a l i n ec o m e t a s s a y , b u tn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sa r en o t e db e t w e e nt h et w os t u d ys i t e s ( d a m a g e p e r c e n t a g e ：f 1 1 5 = 0 7 9 7 ，p = 0 3 8 6 1d a m a g e d e g r e e , f 1 1 5 = 2 5 1 5 ，p = 0 1 3 4 ) ) t h e a v e r a g ef r e q u e n c ya n dd e g r e eo fd a m a g e de r y l h r o c y t e ( a u ) a r e1 0 ，4 a n d2 2 7 r e s p e c t i v e i y l i t t l ee f f e c to fw a t e rp o l l u t i o no nd o u m ed n ab r e a k a g ei sf o u n db yn e u t r a l c o m e ta s s a y ( d a m a g ep e r c e n t a g e ：f 1 ，1 8 = 0 2 9 8 ，p = 0 5 9 2 ；d a m a g ed e g r e e ： f 1 1 8 - - 0 1 6 8 ，p = 0 6 8 7 ) t h eg r e a t e rl d h a c t i v i t yi nl i v e r , i ( i d n e ya n di n t e s t i n eo fc a r p sc o l l e c t e df r o m l za r e f o u n da sc o n i p a r e dt or l a n dt h e r ei ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nl i v e rt i s s u eb e t w e e nt w o s i t e s ( f = 1 2 1 3 7 6 2 ，p = 0 0 1 3 ) g e le l e c t r o p h o r e s i ss h o wt h a tt h e r ea r e1 6b a n d si nm a l ea n d1 7i nf e m a l ec a r p s c o l l e c t e df m ml z w h i c he r e4 5 a n d4 2 g r e a t e ri nt h e i rb a n dn u m b e r sa sc o r l l i p a r e d w i t hr ls i t e ( m a l e1 1a n df e m a l e1 2 ) a n dt h ei n c r e a s e db a n d sm a i n l yl o c a t et h em i d d l e o fs e r u mp r o t e i np r o f i l e s p r o f i l e so fl i v e ra n dk i d n e yl d h i s o z y m e sr e v e a lt h a tt h e r ea r e m a r k e dd i f f e r e n c e si nt h et o t a ln u m b e ro fb a n d s ，r e l a t i v em o v i n gd i s t a n c ea n ds t a 翻i n g p r o p e r t i e sb e t w e e nt w os i t e s e f f e c t so fw a t e rp e l l u i i o no nl d hi s o z y m e sa r et h em o s t i ni i v e r , t h e nj nk i d n e y , a n dt h ei e a s ti ni n t e s t i n e f u r t h e r m o r e h i g hv a r i a n c e si na l lb i o l o g i c a lp a r a m e t e r sm e a s u r e di nt h ep r e s e n t s t u d ya r ef o u n da m o n gi n d i v i d u a l sa tl zs 舱 i nc o n d u s i o n ，w a t e rp o l l u t i o ni nl a n z h o us e c t i o no ft h ey e l l o wr i v e rc a n m a r k e d l y d a m a g et h eg e n e t i cm a t e r i a l sa n dr e s u n si nl o w e rs p e c i e sd i v e r s j t y ，r e s t r a i n st h e g r o w t ha n dd e v e l o p m e n to ff i s h i nt h eo t h e rh a n d 。a d d i t i o n a la d a p t i v ea l t e r a t i o n sh a v e o c c u r r e di nt h ec a r p sf o u n da tl zs i t et op r o t e c ta g a i n s tt h ep e u u t e de n v i r o n m e n t k e y w o r d s ：l a n z h o u ；y e l l o wr i v e r ；r e s e r v o i rl i u j a x a i ；w a t e rp o l l u t i o n ；c a r p ； g e n o t o x i c i t y 兰型查堂竺壅：! 二| 三丝堡鉴 1 前言 i 1 生物监测与水环境 随着工农业发展，环境污染已成为当今世界所面临的严峻问题之一。其中 水污染分布最广，危害最大。据统计，世界卜l 3 的水体受到不同污染源的污 染，中国七大江河( 长江、黄河、珠江、淮河、辽洞、海河和松花江) 及太湖、 巢潮和滇池受污染区域超过6 3 ，而且近海水域污染也日趋严重，范围不断扩 大( 徐希莲，2 0 0 1 ；冯玉骑，2 0 0 3 ) 。水作为一种重要的自然资源，生物生存 的首要环境要素，其污染可严重地影响到人类所赖以生存的地球，导致生态环 境退化，生物多样性锐减，并直接或间接地影响到人类的健康。 水质监测的最终目的是通过对水体的环境变化现状、成因等进行定量的调 查和测试，全面及时掌握水环境质量的动态变化特征，为水环境管理以及水污 染防治和决策提供可靠依据。所以水质监测是开展水资源环境监测、评价和水 污染预测、预报工作的基础，是实施水资源保护系列措施的重要组成部分。目 前，水质监测包括理化监测和生物监测两个方面。其中理化监测侧重于对污染 物进行定量定性分析。但在实际的水环境中，许多污染物含量很低，难以检测， 而且它无法将化学排放量的变化与生态系统乃至人类健康直接联系起来。因而 在此背景下，生物监测逐渐受到重视。 生物监测( b i o l o g i c a lm o n i t o r i n g 或b i o m o n i t o r i n g ) 的定义在不同的 文献资料中略有不同。联合国环境规划署( u n e p ) 将其定义为：测量活着的 生物体对人为压力的灵敏度；美国国家环保局( e p a ) 则定义为：使用活着的 生物体来测定环境影响。水质生物监测是反映水环境质量状况的标准和依据， 而绝刁i 仅仅是对化学监测的一种补充和验证，它矗接反映了环境质量变化对生 物的影响和危害程度尤其在目前许多污染物的环境标准尚未健全，衙新的污 染物又在不断出现的时期，环境标准的健全势在必行，而水生生物监测是制订 环境标准的基础，只有具备大量水生生物监测的基础资料，环境标准的制订j 能更其有科学性。与传统的理化监测方法相比，q ! 物监测优越性主要表现鹩j ： ( i ) 在环境中，乍物接触到的污染物不i | 一种，多种污染物共存仃可能发乍 6 兰州太学研究生学位论文 协同或拮抗作_ j ，使危害程度加剧或减轻，生物监测能较好地反映出环境污染 对生物产生的综合效应； ( 2 ) 一些低浓度甚至是痕量的污染物进入环境后， 在能直接检测或人类直接感受到以前，生物即可迅速作出反应，显示 n 可见症 状。因此，可以在早期发现污染，及时预报；( 3 ) 对于那些痕量污染物长期作 用产生的慢性毒性效应，用理化方法很难进行测定，面生物监测却可以做到： ( 4 ) 生物监测克服了理化监测的局限性和连续取样的繁琐性：( 5 ) 结果更直 观、形象地展现了生物对环境的适应性和指示特征，容易被人们理解、接受。 因而水生生物监测成为国内外水体污染监测中普遍采用的方法。 最初，生物监测主要通过涌量生物体内蓄积的污染物浓度来揭示环境污 染的程度和状况。自7 0 年代初期，生态学方法被引入到监测环境污染的领域中 ( i n v e r s o n ，1 9 7 8 ) 。从7 0 年代中期开始，美、英、日、澳等国开始进行大规 模的生物监测规划，生物监测概念的范畴已明显扩大，包括测量生物体暴露于 污染环境中的生理、生态、遗传等参数变化，以获得污染的有关信息及暴露所 造成的影响。 1 2 鱼类在水体污染指示生物的研究概况 所谓指示生物又叫做生物指示物( b i o i n d i c a t o r ) ，就是指那些在一定地 区范围内，能通过其特性、数曩、种类或群落等变化，指示环境或某一环境因 子特征的生物。许多生物对环境尤其是大气和水体环境的变化反应敏感，故可 作为环境污染的指示生物。 目前水污染指示生物主要有浮游生物、底栖动物、藻类、鱼类及鸟类等。 m a y e r ( 1 9 8 8 ) 曾报道指示生物中最灵敏的是昆虫，其次是甲壳类动物、鱼类 和两栖类。鱼类作为一种灵敏的指示生物，具有以下特点：( 1 ) 鱼类终生生活 在水体中，在水生生态系统中属于次级消费者，在食物链的营养级中居卡第二 和第三营养级，本身又是许多水鸟及其他食鱼动物的食物来源。因而在生态系 统的物质循环和能量循环中起着重要作用，它对水环境的指示作用还反映在因 食物链的富集作用表现出的毒理特性。( 2 ) 由于鱼类在水中有一定程度的分层 现象。可对不同水深的水质状况作出指示，如底栖鱼类对底质无机污染物敏感。 兰州大学研究，# 学伉论丈 ( 3 ) 由于鱼类具有很强的游动性，我t f f l 难确定鱼体中生理指标的变化或者 鱼体中污染物含量的变化缘于哪个河段或水域污染，事实上这些指标的改变是 对沿途水域污染状况“空间匀和”后的结果，因而反映了沿途平均的污染状况。 多年来，科学家利用鱼类作为指示生物从多个角度进行了大量研究，以获 得水体污染的有关信息，同时了解污染水体对生物的影响，以下分别述之。 l - 2l 利用鱼类群落分析法监测水体污染 早在上个世纪9 0 年代k a r r ( 1 9 9 1 ) 提出的用鱼类生物学完整指数( i n d e x o fb i o l o g i c a li n t e g r i t y 。i b i ) 和f o n t a i n e 等( 1 9 9 0 ) 提出了食物链动力 学模型均可用于评价不同河段水环境质量及其变化趋势。在我国，有关水体污 染对鱼类群落影响的报道主要集中在对鱼类绝对数量和种类的影响，如污染导 致了长江、黄河、松花江、洞庭湖等水域鱼类种类明显减少，一些常见种或优 势种变成稀有种类或濒临灭绝( 乐佩琦，1 9 9 5 ) 。 1 2 _ 2 利用鱼类形态指标监测水体污染 水体污染对鱼体形态结构的影响主要表现在：( 1 ) 体形变短变宽、背鳍 基部后方向上隆起，鳍条排列紧密，臀鳍基部上方的鳞片捧歹眭紧密，发生不 规则错乱，侧线中断、位移、分枝或消失等( 王焕校，2 0 0 1 ：姚闻卿，1 9 9 3 ) ： ( 2 ) 性腺发育不良甚至退化，卵巢、卵母细胞畸形，有些还表现为雌雄同 体( f o r l i n ，1 9 9 8 ：w i k l u n d ，1 9 9 4 ) ，而且发现这些变化主要由环境激素类 污染物所导致( 赵劲松，2 0 0 1 ) ；( 3 ) 组织器官受到影响，如肝、鳃、肾、 皮肤等一些组织，尤其是肝和鳃易受损害而发生病变( b e r n e t 2 0 0 4 ) ：有 些鱼类可通过增加肝比重( 肝重体重) 从而增加肝脏内与解毒相关的酶和 抗氧化防御酶的绝对数量和活性，加速其对污染物的代谢以适应污染环境 ( f a r l a n d ，1 9 9 9 ) 。 l - 2 3 利用鱼类行为指标变化监测水体污染 当鱼类接触有害污染物时，其嗅觉、味觉和视觉等感受器官受到刺激，影 响呼吸或中枢神经系统，从而影响其活动水平、摄食、繁殖或其它行为方式( 李 兰州大学研究牛学位i 仑文 江平，2 0 0 1 ) 。因而长期以来，鱼类行为指标被认为是评价特定机体状况和健 康的一种最直观、最简单的途径，而且不会对生物产生损害。 鱼类行为特征参数主要有咳嗽反应、回避反应、趋流性、泳动能力、呼吸 频率等( 王焕校，2 0 0 1 ：b r y a np a l ，1 9 9 5 ) 。其中目前广泛采用的行为标 记法是鱼类回避试验，如黄消江鱼类回避试验证明，鱼类主动回避污染地带流 向清洁区( 殷浩文，1 9 9 7 ) 。鱼类强烈回避，会改变河流原有生物群落结构， 使河流生态系统向不利于鱼类生存的方向发展( 乐佩琦，1 9 9 5 ) 。 i 2 4 利用鱼体内残毒含量分析监测水体污染 鱼类在水生生态食物链中占有一定地位是许多水鸟及其它食鱼动物的 食物来源，对水体中的重金属、农药、石油类等都有很强的富集能力，其富 集系数可高达上万倍。当被其它动物吞食后，可能引起中毒，甚至导致某一 物种的大批死亡，导致生态失衡( s c h e u h a m e r ，1 9 8 7 ) ，因此鱼体残毒分析 对于水质监测和健康风险评价等具有重要的理论和现实意义。2 0 世纪7 0 年 代，残毒分析法曾广为应用，至今仍是水环境生物监测的重要手段。如近年 来，我国学者报道了长江、黄河、松花江等几大河流部分鱼体内重金属、农 药、有机物等可蓄积性污染物都有超标现象( 于常荣，1 9 9 4 ；于沛芬，i 9 9 4 ； 张曙光，1 9 9 6 ：何力，1 9 9 8 ；吴伟，1 9 9 9 ) 。 1 2 5 利用分子和生化标志物监测水体污染 生化标志物是生物体中最早可测得的污染物诱导反应，因而可为更高生物 水平损害提供信息。生化变化常涉及蛋白水平的变化、酶活性改变或d n a 分 子的变化。表l 介绍了国内外部分已成功地应用于野外监测的生化标志物。另 一类分子生物标志物是d n a 分子的诱导变异。目前主要标志物检测有：姊妹染 色单体互换( s c e ) 。染色体异常( c a ) 及微核( 刖) 等，其中微核被认为是检 测诱变效应的最有用标志物。 但有些生化指标，如研究较多的抗氧化系统和m f o 系统酶用于野外监测并 无统一标准，在污染程度不同、鱼类种类不同的条件下变化规律还有待进一步 研究( b a r r a ，2 0 0 1 ：m c f a r l a n d ，1 9 , 9 9 ：徐立红，t 9 9 5 ) 。而且，生化指标的 兰州大学研究小学位论史 特异性要求将多种牛化指标结合起来才能客观、全面地评价水质及其污染物对 有机体的影响。 表l 鱼类生化标志物在水体污染生物监铡中的应用 t a b l e1a p p l i c a t i o no fb i o c h e m i c a li n d i c t o r si nb i o m o n i t o r i n gw a t e rp o l l u t i o n 1 3 生物监测用于黄河兰髑段水质评价的研究概况 有关黄河兰州段污染的研究比较多，主要集中于利用原生动物和藻类群落 构成特点、优势种群、污生指数和功能类群等指标评价黄河水质及污染物的致 兰抖f 夫学研究生学位论文 突变作用。 宋玉珍( 1 9 9 4 、1 9 9 5 、1 9 9 7 ) 、孙胜利等( 2 0 0 0 ) 等根据原生动物、底栖 无脊椎动物、浮游动物，阐明了黄河兰州段水质污染的状况：马正学等( 1 9 9 4 、 1 9 9 6 、1 9 9 7 ) 用藻类等对黄河水质做了评价。这些研究主要选择低等生物作为 指示生物，通过分析群落结构构成来判断水体污染程度，结果均认为黄河水质 受到了严重污染。 高玉玲等( 1 9 9 3 ) 利用t a 8 9 和t a 9 7 细胞微核及a m e s 试验对黄河干流兰 州段不同水期有机污染的时空分布、致基因突变效应、致染色体畸变效应等迸 行了研究，并针对黄河水质现状提出了监测、防治黄河三致物污染的对策和实 施性措施；邱瑞骥等( 1 9 9 4 ) 认为黄河兰州段源水经水厂加氯处理后生成新的 致突变物，致突变性增强，源水及自来水中有机物的含量和致突变性呈现明显 的季节性变化。这些研究对水质的遗传毒性进行了初步的评价。 若于兰州段黄河水质对脊椎动物的潜在影响研究较少。目前只见曹从云 等( 1 9 9 8 ) 以姐妹染色单体交换( s c e ) 率和骨髓多染红细胞核阳性率( p c e ) 为指标，用中华大蟾蜍为指示生物，检测到黄河兰州段南河滩水和中山桥下水 的强致突变作用。 t 4 遗传毒理学方法在水污染监涌中的研究现状 遗传毒理学是近2 0 年来发展起来的，是分析和鉴定污染物对生物体遗传 物质毒性效应的一门学科。分析环境污染对生物群体的遗传毒性，已成为环境 科学工作者研究的热点。目前形成了以转化试验检测基因突变、染色体畸变和 损伤为主的一系列经典研究方法，包括a m e s 试验、体细胞染色体畸变、姊妹 染色单体交换、微核试验等( k i r k l a n d ，1 9 9 4 ：d a l e ，1 9 9 6 ：l ec u r i e u x 1 9 9 6 ： 戎志毅，2 0 0 2 ) 。广泛用于遗传毒性鉴定与遗传危害度的评价，监测水体环境 中致癌、致畸、致突变的化学物质。 其中细胞微核试验是检测环境污染物对细胞遗传物质染色体损伤效 应的一种最简便快速而有效的筛选方法是在染色体分析方法的基础上于2 0 世纪7 0 年代初建立起来的细胞遗传学方法之一，现已被许多国家和国际组织 羔州大学研究生学位论史 推荐为检测致癌剂、诱变剂的遗传毒理学方法之一。 从八1 年代起，人们就试图检测鱼的外周血细胞微核发生率来评价水的遗 传毒性( h o o f t m a na n dd er a a t ，1 9 8 2 ：m a n n a 1 9 8 5 ) 。后来这种快捷的方法 作为一种筛选污染物的指示剂成为检测不同鱼类遗传毒性的有用方法( b o s e ， 1 9 8 7 ：m e t c a l f e ，1 9 8 8 ：c a r a s s c o ，1 9 9 0 ；d ef l o r r a ，1 9 9 3 ；a 1 s a b t i ，1 9 9 4 ： h l s a b t ia n dm e t e a l f e ，1 9 9 5 ；m i n i s s i ，1 9 9 6 , p o o n g o t h a i ，1 9 9 6 ) 。 而其它一些广泛用于评价遗传毒性的方法主要用于哺乳类，比如染色体畸 变、姐妹染色单体交换，它们并不适合鱼类，因为鱼类染色体小，数量多t 有 丝分裂指数低，这在盐水鱼中尤为明显( k h u d a b u k h s h c h a k r a b a r t i ，1 9 9 9 ： c h a k r a b a r t i k h u d a - b u k h s h ，2 0 0 0 ) 。 近年来，人们结合现代分子生物技术，发展了一系列检测遗传毒性的分子 标记技术： d n a 加合物标记 d n h 加合物是化学致癌物及其代谢产物与d n a 分子碱基共价结合所形成的 损伤。这种加合物一旦逃避了生物细胞的自身修复系统的修复，就可能成为致 突变、致癌的最小因子。因而d n a 加合物的形成是致突变作用的引发过程，定 量测定d n a 加合物即可初步判定样品的遗传毒性。 测定d n a 加合物的方法有3 2 p 一后标记法、特定加合物的单克隆和多克隆抗 体的免疫测定、g c m s 、h p l c 荧光分光光度法等。其中”p 一后标记法是环境监 测中分析d n a 加合物最常用的方法( h a r v e y ，1 9 9 7 ：c a n o v a r s ，1 9 9 8 ：s h u g a r t ， 2 0 0 0 ；徐立红，2 0 0 0 ) 。 目前以d n a 加合物作为遗传毒性标记物主要应用于海洋环境监测，如l y o n s ( 1 9 9 7 ) 报道了泄油导致沿海水环境污染，潮问带鱼鱼体中d n a 加合物水平明 显高于未受油污染地区的鱼；f l a r v e r y ( 1 9 9 7 ) 等发现海洋鱼类体中d n a 加合 物水平与沉积物中污染物水平相关。表明可以用来指示水生生物暴露于遗传毒 物的情况。 单细胞凝胶电泳技术 单细胞凝胶电泳( s i n g l ec e ll g e le l e c l r o p h o r e s i s ，s c g e ) ，又称彗星 兰州大学研究! l i 学位论文 实验( c o m e ta s s a y ) ，是o s t li n g 和j a n h a n s o n 于1 9 8 4 年发明的一种单细胞 d n a 电泳技术，其后由s i n g h 和o l i r e 分别加以改进，使之成为一项口臻完善 的定量检测d n a 双链或单链缺口的技术。 较之传统的d n a 链断裂检测手段，如碱性解链、碱性蔗糖沉降试验、碱洗 脱等方法，s c g e 具有廉价、操作简便、快速、灵敏、样本需要量少、无放射等 优点( 马爱国，2 0 0 1 ) ，而且它适用于所有的活细胞( 包括终止分化的细胞) ， 因而表现出重要的研究和应用前景。 至今，已有许多研究利用慧星电泳来评价某化合物诱导d n a 损伤情况， 在水环境监铡中的应用也越来越多( m i t c h e l m o r e c h i p m a n1 9 9 8 ：v e r s c h a e v e g i l l e s1 9 9 5 ) 。如p a n d r a n g i ( 1 9 9 5 ) 利用s c g e 检测了生活在不同污染程 度水体的美洲洄鱼( a m e i u r u sn e b u l o s u s ) 和鲤鱼( c y p r i n mc a r p i o ) 红细胞d n a 单链损伤程度，发现d n a 单链断裂与污染程度有很好的相关性。z h o n g ( 2 0 0 1 ) 利用s c o e 评价扬中城趣表水对人淋巴细臆的单链损伤对，认为s c g e 可作为一 种灵敏的检测手段评价水环境污染致遗传毒性作用。w i l s o n 等( 1 9 9 8 ) 对s c g e 作为一种检测海洋无脊椎动物紫贻贝细胞d n a 损伤的方法进行了详尽的评 价。他们通过分析离体鳃细胞单链断裂的本底，动物的个体大小和年龄、距采 样时间的长短、摄食节律、体内体外染毒条件和抗氧化热的作用是如何影响单 链断裂的，得出结论，该方法用于检测目标物质在海洋环境的捧放是很有潜力 的。目前，人们还成功将此方法改进用于检测d n a 一蛋白交联( d p c ) 和d n a 链间交联( i s c ) 的检测( m a r t ye ta l ，1 9 9 9 ；庄志雄等，1 9 9 7 ) 。 d n a 指纹技术 它是在p c r 基础上，检测d n a 多态性的分子标记技术，是近几年才发展 建范起来的种快速分析方法。通过随机扩增d n 多态性( r a p d ) 分析，将d n a 链的突变或核苷酸缺失或增加等损伤表现于d n a 的指纹图谱上，只要比较非 污染生物和污染生物的d n a 指纹图谱，就可以在出现突变效应之前及时检测出 d n a 的改变( s a v v a ，1 9 9 8 ) 。但是实验方法本身成本高，丽且反应容易受外界 冈素的影响，重复性不好，因此目前在环境监测中很少有报道。 兰州大学研究生学位沧文 1 5 研究内容及目的意义 黄河是中国最重要的河流之一，兰州位于黄河t 游，黄河横穿市区而过。 作为一个以冶金、石油化工为主的重工业城市，工业生产排放出的废水废渣和 城市生活污水不可避免的进入黄河水体，造成污染。这些污水直接或间接排入 黄河，使黄河水体受到严重污染，必然会影响到水生生物的种群结构、生长、 发育和繁殖情况，进而污染地下水源，也会影响到长期居住、生活在黄河沿岸 人群的身体健康，因而保护该段水资源进行合理的监测势在必行。 国内关于黄河污染的研究很多但主要是以“低等生物”和“水”作为 研究对象，本研究选择公众比较熟悉的鲤鱼作为指示生物，主要进行了以下几 个方面的研究： 水污染对鲤鱼红细胞d n a 的遗传毒性： 水污染下鲤鱼血清蛋白、组织l d h 同工酶及l d h 酶活性变化： 水污染下鱼类群落结构构成变化。 目的是为了更好的确定鲤鱼在其自然栖息环境中，困不同的污染物或有毒 物质，所面l l 每的遗传毒性压力，同时对黄河兰州段水质