（作物遗传育种专业论文）小麦DERB及EREBP类转录因子的特性分析.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其他教育机 构的学位证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：饰移l 西1 签字日期。聊年f 月7 7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即 吉林农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权吉林农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：多矽办l 哥1导师签名： 马曩象 签字日期：力矿哆年占月厂j 日签字日期：t ，吁年( 月，f 日 学位论文作者撼、柙缈叶荨降浓博 工作单位：呻f 幻寝珏浒善p 影电话：一一一幻7 9 矿p 通讯地址：扯烹年惦谨瓦、f 苌玎南 邮编：柙。彦 彻，够 吉林农业大学硕士学位论文小麦d r e 8 及e r e b 类转录因子的特性分斩 a b s t r a c t p l a n t sa r ee x p o s e dt oa b i o t i ce n v i r o n m e n t a ls t r e s ss u c ha s d r o u g h t ，h i g hs a l t a n dl o w t e m p e r a t u r e ，w h i c hc a u s ea d v e r s ee f f e c to nt h eg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to ft h ep l a n t p l a n t s r e s p o n s et ot h es t r e s sb yi n i t i a t i n gt h es i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a ya n di n d u c i n gt h et r a n s c r i p t i o n a n de x p r e s s i o no ft h eg e n e t h et r a n s c r i p t i o nf a c t o rp l a y sa ni m p o r t a n tr o l eo nt r a n s c r i p t i o n a l c o n t r 0 1 af u s i o ne x p r e s s i o n c d n a l i b r a r yw e r ec o n s t r u c t e da n ds e v e r a lg e n es u c ha sw 2 3w 1 8w 1 7 w e r ec l o n e d b i o i n f o r m a f i o n a la n a l y s i ss h o wt h a ta l lt h e s eg e n e si n c l u d e saa p 2 e r e b pd n a b i n d i n gd o m a i nw h i c hb e l o n g st ot h ea p 2t r a n s c r i p t i o n a lf a c t o rf a m i l y w 2 3a n dw i8b e l o n gt o t h ed r e bf a m i l y ；w 1 7b e l o n g st ot h ee r e bf a m i l y b a s e do nt h ew o r kd o n e ，t h ee m s aa n dt h e t r a n s a c t i v a t i o ne x p e r i m e n t sh a v eb e e nd o n et os t u d yt h ec h a r a c t e r i s t i co ft h et r a n s c r i p t i o nf a c t o r w h i c ht h e ye n c o d e ，f u r t h e rf o rt r a n s g e n i ca n a l y s i sa n ds t u d yo fc o n t r o lm e c h a n i s mi ns i g n a l t r a n s d u c t i o np a t h w a y t h ee m s ai n d i c a t e dt h a tw 2 3a n dw 1 8c a l lb i n dt ot h ed r e p r o b e ；w 1 7c a nb i n dt ot h eg c c p r o b e b i n d i n gt ot h em u t a n tp r o b el e a dt ot h eb a n dg e t t i n gw e a ko rd i s a p p e a r e d t h i si n d i c a t e d t h a tt h e yb i n dt ot h ec s e l e m e n ts p e c i f i c a l l ya n db e l o n gt ot h ed r e ba n de r e bf a m i l y r e s p e c t i v e l y f u r t h e r m o r ew eg e tt h ei n f o r m a t i o na b o u tt h ei m p o r t a n tb a s ei nt h ec i s - e l e m e n t f o rp r o v i n gt h ec h a r a c t e r i s t i co ft h et m n s a c t i v a t i o no ft h e t r a n s c r i i p t i o n a lf a c t o r ，w e t r a n s f o r m e dt h ec o n s t r u c t e de x p r e s s i o nv e c t o ri n t ot h ey e a s tr e p o r t e rw h i c hh a st h ed r ea n d g c cc i s e l e m e n t t h er e s u l tr e v e a l e dt h a tt h e s et r a n s c r i p t i o nf a c t o rn o to n l yh a v et h ed n a b i n d i n gd o m a i nb u ta l s oh a v et h et r a n s a c t i v a t i o n a la b i l i t y t h e i rt r a n s a c t i v a t i o n a la b i l i t yi s d i f f e r e n t t h et r a n s c r i p t i o nf a c t o rh a st h ec o n s e r v e dd n ab i n d i n gd o m a i nb u tt h ed i f f e r e n t t r a n s a c t i a t i o nd o m a i n t h ed r e b sb i n dt ot h ed r ec i s - e l e m e n tw h o s ec o r es e q u e n c ei sc c g a c ：t h ee r e b p sb i n d t ot h ee r ec i s e l e m e n tw h o s ec o r es e q u e n c ei sg c c g c c t 1 l et w os e q h e n c ei sv e r ys i m i l a ri n c o m m o ni nc c g n c b u tt h e ya r ec o n t r o l e di nd i f f e r e n tp a t h w a y w h i c hd o w n s t r e a mg e n e st h e y c o n t r o la n db yw h i c hu p s t r e a mg e n et h e yi n d u c e d ，a l lt h eq u e s t i o nn e e dt ob ef u r t h e rs o l v e d 3 吉林农业大学硕士学位论文小麦9 r e b 及e r e b 类转录因子的特性分析 k e yw o r d s ：t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ；c s - e l e m e n t ；d r e ；e r e ；d n a - b i n d i n g ；t r a n s a c t i v a t i o n 4 吉林农业大学硕士学位论文 小麦d r e b 及e r e b 类转录因子的特性分析 摘要 植物在生长过程中，会遇到诸如干旱、低温和高盐的非生物逆境胁迫影响。逆境条件 下植物对环境刺激作出反应，通过一系列信号传递过程最终激发转录因子，肩动基因的转 录和表达来抵御外界得胁迫伤害。转录因子对基因的转录调控起至关重要的作用。 本实验室构建了干早诱导的小白麦e d n a 文库，并且从中克隆了w 2 3 ，w i g ，w 1 7 等基 因。通过生物信息学的方法进行比对发现这些基因都含有6 0 个左右氨基酸的a p 2 e r e b p 保守域，都属于a p 2 e r e b p 基因家族。w 2 3 ，w i g ，属于d r e b 家族，w 1 7 属于e r e b 家族。 本论文是在此基础上，通过体外结合实验和体内转录激活实验来进一步证明它们表达产物 的功能特性，为转基因分析和研究转录因子在信号转导中的调控机理做理论基础研究。 凝胶阻滞实验表明w 2 3 和w 1 8 能和d r e 探针特异结合，推测其能够调控含有d r e 顺式元件的下游基因的转录表达；w 1 7 能和e r e 探针特异结合，推测其能够调控含有e r e 顺式元件的下游基因的转录表达。这些基因编码的产物是特异结合顺式元件的，这符合转 录因子的结合特性。同时基因产物与突变探针的结合实验也得到了顺式元件中重要碱基的 信息。 为了进一步证明这些转录因子的激活特性，本实验将构建好的表达载体转化到带有 d r e 和e r e 顺式元件的酵母报道子中。转录激活实验表明这些转录因子不但具有结合区， 能特异结合到顺式元件上，并且有转录激活的功能。而且它们的转录激活特性是不一样的。 这符合关于同一类的转录因子的d n a 结合区比较保守，但它们的激活区是不同的研究报 告。 d r e b 类转录因子的结合d r e 顺式元件，核心序列为c c g a c ，而e r e b 类转录因子 结合e r e 顺式元件，核心序列为g c c g c c 。两者的序列很相似，共同的序列为c c g n c 。 但两者的调控途径却不相同。这些基因能够调控哪些下游基因，又受哪些上游信号刺激， 还有待于对这些基因的功能作进一步的分析。 关键词；转录因子；顺式元件；d r e ；e r e ；d n a 结合性；转录激活。 童茎窒些查兰堡主兰些堡塞 ! ：壅竺望墨! ! 望耋堑重里兰塑竺丝坌堑 缩写词表 a b a ：a b s e i s i ca c i d a b f ：a b r eb i n d i n gf a c t o r a b r e ：a b a r e s p o n s i v ee l e m e n t a d ：d n a a c t i v ed o m a i n b d ：d n a - b i a d i n gd o m a i n b z i p ：b a s i cr e g i o n - l e u c i n ez i p p e r c b f ：c - r e p e a t d r eb i n d i n gf a c t o r c d p k ：c a l c i u m - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e d r e j c r t ：d e h y d r a t i o n - r e s p o n s i v ee l e m e n v c - r e p e a t d r e ：d e h y d r a t i o n - r e s p o n s i v ee l e m e n t d r e 8 1 a ：d r eb i n d i n gf a c t o r d r e b 2 a ：d r eb i n d i n gf a c t o r e m s a ：e l e c t m p h o r e s i sm o b i l i t ys h i f ta s s a y e r d s ：e a r l yr e s p o n s i v et od e h y d r a t i o n e r e b p a p 2 ：e t h y l e n e - r e s p o n s i v ed e m e n t e r e b p ：e t h y l e n e - r e s p o n s i v ed e m e n tb i n d i n gp r o t e i n g b d ：g c c - b o xb i n d i n gd o m a i n g s t ：g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e 谷胱甘肽s 型转移酶 l e a ：l e ae m b r y o g e n e s i s - a b u n d a n t m a pk i n a s e ：促分裂原活化蛋白激酶 m y b ：带有色氨酸串基元的转录因子家族 m y c ：带宵基本螺旋串的螺旋转录因子家族 r d 2 2 ：n a m eo f g e n ew h i c h r e s p o n s i v et od e h y d r a t i o n r d 2 2 b p ：r d 2 2b i n d i n gp r o t e i n r d 2 0 a ：g e n ew h i c hr e s p o n s i v et od e h y d r a t i o n r p k ：r e c e p t o rp r o t e i nk i n a s e s o d ：s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 6 吉林农业大学硕士学位论文 小麦d r e b 及e r b b 类转录因子的特性分析 第一章文献综述 干早、盐渍和低温是诸多非生物逆境中对作物危害最为严重的自然灾害，它严重影响 作物的产量和种植面积，据不完全统计，全世界的干旱地区占陆地总面积的三分之一，且 有逐年增加的趋势。干旱导致的农作物减产造成的经济损失每年达数百亿美元，其危害相 当于其它自然灾害的总和。我国是一个农业大国，干旱、半干旱地区占国土面积的二分之 一。干旱，土壤沙化以及近年来频繁发生的沙尘天气，严重破坏了人类赖以生存的生态环 境。近年来人们从各个角度对植物与抗非生物逆境之间的关系进行了研究，从最初的生理 现象的研究到生态、遗传的研究，再到生理生化、代谢的研究，已积累了大量的资料，但 由于非生物逆境的复杂性，使人们对植物与非生物逆境之间的关系的理解仍比较有限，人 们在改良作物抗非生物逆境方面的结果并不理想。随着分子生物学与现代生物技术的发展， 使人们从分子水平上深入认识植物与非生物逆境之间的关系成为现实，并且为改良作物的 抗非生物逆境性能开拓了新的途径目前，植物与非生物逆境之间的关系在分子细胞水平上 已有较深入的研究( x i o n gl 2 0 0 2 ) 。理解非生物逆境信号在植物体内的传导途径和克隆抗 逆相关基因对植物抗逆性能的提高具有重要的指导意义。 植物在遭受干早、盐渍和低温等非生物逆境胁迫时，不仅在生理生化水平，而且在细 胞分子水平都做出积极的响应和适应。这时在植物体内发生了很多的变化：包括新蛋白质的 合成，代谢的转变，抗逆境物质的积累，气孔的关闭，光合作用降低等等。如图l 所示，植 物在逆境胁迫下会产生各种反应抵抗外界环境对植物的伤害。在逆境条件下，通过一系列 的信号传导，植物细胞开始合成一些新的抗逆相关转录因子，同时增强已有的逆境相关转 录因子的表达，通过控制转录因子的表达调控其它的功能基因的表达，由这些功能基因再 去执行各种各样生理功能，如转变细胞代谢，合成脯氨酸、多胺等抗渗透物质，调节离子 平衡，调节基因表达等( b o h n e r th j ，1 9 9 5 ) 。 在诸多生理生化反应中，蛋白质的代谢变化，包括蛋白功能的激活、抑制，蛋白的合 成等最引人注目。研究表明，逆境会诱导植物大量的特异蛋白表达，不同的逆境诱导表达 的蛋白不完全相同，既有交叉又有差别，而同一种逆境在同一种植物的不同部位其所诱导 表达的蛋白也不完全相同。在不同的品种中这种差别就更大( b o h n e r t i - i j 1 9 9 5 ) 。因此有很 多的蛋白参与了植物对非生物逆境的反应，它们协同作用调整植物生理生化以及代谢的变 化，以适应外部逆境，提高植物对非生物逆境的抗性，可见植物对非生物逆境的抵抗并不 吉林农业大学硕士学位论文小麦d r e b 及e r e b 类转录因子的特性分析 图1 1 ：植物对渗透胁迫的响应( b o h n e r th j 。1 0 9 5 ) f i 9 1 1 ：r g a n i s m a lr e s p o n s e st ow a t e rd e f i c i t ( b o h n e r th 1 ，1 9 9 5 ) 是依靠某一个两个功能基因就能完成的。 在非生物逆境条件下，许多基因的表达受上述干早、高盐及低温等胁迫的诱导。其中 的一些基因已被克隆。根据基因产物的作用，可将这些胁迫诱导的基因分为两大类。第一 类基因的编码产物包括，直接保护细胞免受水分胁迫伤害的功能蛋白，如l e a 蛋白( 胚胎 发生后期丰富蛋白) 、渗透蛋白、抗冻蛋白、水通道蛋白、离子通道蛋白、伴侣蛋白和m r n a 结合蛋白等；渗透调节因子，如脯氨酸、甜菜碱、一些糖类等的合成酶；以及毒性降解酶， 如谷胱甘肽s 转移酶、可溶性环氧化物水解酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过 氧化物酶等，使细胞各种生理生化代谢活动能维持正常进行。这一类基因产物的具体功能 受到广泛重视，研究的比较透彻。利用l e a 蛋白基因( x u de t a l ，1 9 9 6 ；o h n o r e ta 1 ，2 0 0 3 ) 、 脯氨酸合成酶基因以及甜菜碱合成酶基因( s a k a m o t o ae t a i ，1 9 9 8 ) 等进行转化，获得了一 吉林农业大学硕士学位论文小麦d r e b 及e r b b 类转录因子的特性分析 些耐旱耐盐性状得到改善的转基因植物。第二类基因编码的产物包括，参与传递信号的调 控因子和调控基因表达的转录因子，o n b z i p 类转录因子( 带有亮氨酸拉链的转录因子家族) 、 m y c 类转录因子( 带有基本螺旋串的螺旋转录因子家族) 、m y b 类转录因子( 带有色氨酸 串基元的转录因子家族) 及a p 2 e r e b p 类转录因子等；感应和转导胁迫信号的蛋白激酶， 如m a p 激酶( 活化分裂素的蛋白激酶) 、c d p 激酶( 依赖钙的蛋白激酶) 、受体蛋白激酶、 核糖体蛋白激酶和转录调控蛋白激酶等；以及在信号转导中起重要作用的蛋白酶，如磷酸 酯酶、磷酸酶c 等。最近在拟南芥中和烟草中也发现双组分系统t w o c o m p o n e n t s y s t e m ) 基因的存在，其基因产物为“感受器”( s e n s o r ) 和“反应调节器”( r e s p o n s er e g u l a t o r ) 合二为一的激酶蛋白( u r a oe ta 1 ，1 9 9 8 ) 。拟南芥的双组分系基因a t r r l 和a t r r 2 受干旱、 高盐及低温的诱导，烟草双组分系统基因n t h k l 也受高盐胁迫处理的诱导。 由于第二类基因在传递胁迫信号以及调控下游功能基因表达中发挥着重要的作用，同 时对植物细胞如何感应干旱，高盐及低温引起的胁迫反应，转录因子如何将这些胁迫信号 传递到细胞核，以及如何调控下游的各种功能基因的表达等一系列的分子机理知之甚少， 因此对第二类基因的的研究，已经成为近年来植物分子生物学领域的一个前沿内容。 1 植物感受非生物逆境的信号转导途径 植物信号传导的第一步首先是细胞质膜上的受体对信号的感受，然后再产生第二信使 ( 如磷脂酞肌醇和活性氧( r o s ) 等) ，将膜外信号转变成膜内信号，同时引起胞内钙离子浓 度升高，启动蛋白磷酸化通路，产生级联放大效应，最后，产生的靶蛋白直接参于细胞保 护或通过转录因子调控一系列特异的逆境相关基因的表达，保护细胞，提高植物对逆境的 抗性。这些被转录因子调控的基因有些又参与了a b a 、乙烯、荣莉酸的调控，激素又会反馈 调控上述的信号路径和更多的逆境相关信号分子( l i m i n gx i o n g ，2 0 0 2 ) 信号传导是在一定的空间、时间以及众多的信号分子参与下协同完成的。参与信号传 导的因子可分为两大类：一类是直接参与到信号传导途径中的因予，另一类是信号传导途径 中的辅助因子，它们参与信号组分的修饰、输送及装配，如蛋白的磷脂化、甲基化、糖基 化、泛素化等( x i o n ga n dz h u ，2 0 0 1 ) 根据目前的研究进展，植物在干早、高盐和低温逆境条件下的主要的信号传导路径可 分为三个：( i ) m a p k k k m a p k k m a p k 路径，渗透胁迫氧化逆境信号可通过该路径进行信号 的传导，最终会产生许多渗透调节因子和抗氧化因子，同时与逆境条件下的细胞周期调控 吉林农业大学硕士学位论文 小麦d r e b 及e r e b 类转录因子的特性分析 也有关系( 图2 ) ( i i ) 依赖于c a 2 + 的c d p k 信号路径， 顺式元件的基因( i i i ) 依赖于c a ”的s o s 信号路径 子平衡。 最终作用于l e a l i k e 基因，如含d r e c r t 该路径相对地比较特异，主要是调控离 图1 ，2 ：主要植物逆境信号传导通路( x i o n gl ，2 0 0 2 ) f i 9 1 2 ：m a j o rt y p e so fs i g n a l i n gf o rp l a n t sd u r i n gc o l d ，d r o u g h t ，a n ds a l ts t r e s s 1 1 a s a 的代谢调控 a b a 是植物生长过程中非常重要的植物激素，参与植物许多生理生化过程的调控。在 植物种子发育或水分亏缺等逆境过程中，细胞迅速积累a b a ，积累的a b a 再诱导不同基因 的表达，提高植物对逆境环境的抗性，使植物产生了不同的生理反应。例如，诱导气i l 关 闭：光台效率下降；抑制由赤霉素诱导的a 一淀粉酶的合成，诱导某些特异蛋白质的合成 等，a b a 在植物的整个生长发育周期中都起着重要作用。 吉林农业大学硕士学位论文 小麦d r e b 及e r e b 类转录因子的特性分析 干旱、高盐和低温逆境条件下a b a 含量的升高主要是由于诱导了编码a b a 生物合成途 径中的酶的表达增加，高等植物中a b a 的生物合成途径已经得到了非常深入的研究 ( m i l b o r r o w ，2 0 0 1 ) 。研究表明a b a 合成酶基因的诱导很可能是由依赖于e a ”的蛋白磷酸化 通道，而且a b a 也会反馈刺激上述的通道。 通过对逆境胁迫下及非胁迫下不同植物的对比研究，以及对同一植物水分胁迫前后进 行差异筛选，已经鉴定出了许多已知功能的基因，其中部分基因已经得到了分析、克隆。 根据与a b a 的关系可将逆境信号转导途径分为3 种类型：a b a 依赖型途径、a b a 非依赖 型途径和不能被a b a 诱导的途径。逆境胁迫信号的感受和基因表达的调控如图3 所示 ( y a m a g u c h i s h i n o z a k ik 2 0 0 5 ) 。 图1 3 ：渗透压及低温胁迫应答转录因子与顺式元件的调控网络 f i 9 1 3 ：r e g u l a t o r y n e t w o r k s o f c i s a c t i n ge l e m e n t sa n d t r a n s c r i p t i 0 1 1 f a c t o r s i n v o l v e d i no s m o t i c a n dc o l d - s t r e s s r e s p o n s i v eg e n ee x p r e s s i o n 1 2 队依赖型途径 a b a 依赖型基因的表达依赖于内源a b a 的积累或外源a b a 的处理，随着内源a b a 的增加丽加强，随着内源a b a 的减弱而减弱。外源a b a 的处理也可促进其表达。在离体 吉林农业大学硕士学位论文小麦d r e b 及e r e b 类转录因子的特性分析 的条件下，则完全随外源a b a 的量的变化而变化( 向旭等，1 9 9 8 ) 。 a b a 依赖型基因的表达主要有需要蛋白质生物合成的a b a 依赖型基因表达和不需要 蛋白质生物合成的a b a 依赖型基因表达途径两种。 依赖于a b a 且需要蛋白质生物合成的基因表达途径是指在水分胁迫条件下，一些基因 对a b a 的响应需要有蛋白质的生物合成。如拟南芥的干旱诱导基因r d 2 2 ( s h i n o z a k ike t a 1 ，1 9 9 6 ) ，r d 2 2 启动子的一个6 7 b p 的片段对于a b a 的响应是必需的，这个片段包含了几 个保守d n a 结合蛋白的结合位点，如m y c 和m y b ，但这个区域之中没有a b r e s ( 1 w a s a k i tc ta 1 ，1 9 9 5 ) 。其中的第一个m y c 和m y b 位点是r d 2 2 脱水渗透表达的顺式表达元件。 r d 2 2 b p ，是一个m y c 同源物转录因子的c d n a ，是通过以6 7 b p 的片段作探针用d n a 配 位结合法克隆的。r d 2 2 b p 编码的蛋白质与其它的m y c 一样，有一个典型的d n a 识别结 构域，且r d 2 2 b p 蛋白能与6 7 b p 片段的第一个m y c 识别位点发生特异性结合。经r n a 凝 胶印记分析显示，r d 2 2 b p l 基因能在脱水胁迫中先于r d 2 2 基因被诱导。这表明m y c 及其 同源物可能在r d 2 2 基因的脱水诱导表达中起转录因子的作用。同时，研究发现了a t m y b 2 基因，它能被干旱、盐渍及外源a b a 诱导，它是一个编码m y b 同源物的基因，重组的 a t m y b 2 蛋白能与r d 2 2 基因启动子中6 7 b p 片段中的m y b 识别位点结合。因此可推测m y b 和m y c 蛋白在r d 2 2 基因地干旱诱导表达中协同作用，共同激活r d 2 2 基因的转录( s h i n o z a k i ke ta t ，1 9 9 7 ) 。 a b a 依赖型基因的第二条表达途径是依赖于a b a 但不需要蛋白质生物合成的表达。 这类基因的启动子区域包含有一个保守的序列( p y a c g t g g c ) ，这个序列被称为a b a 应 答元件( a b r e ) ，对些受a b a 诱导的逆境基因地表达起顺式调控作用。a b r e s 首先是 在小麦的e m 基因和水稻的r a b 基因中被鉴定出来的。此外，水稻的w s i l 8 、拟南芥的t a b l 8 、 r d 2 2 、r d 2 9 都属于这类基因。a b r e - d n a 结合蛋白e m b p - 1 编码了一个b z i p 蛋白的g - b o x ， 它与a b r e 元件类似。a b r e 和g b o x 结合蛋白的e d n a 已被分离，它们都具有个亮 氨酸拉链( b z i p ) 结构域。a b r e 的核心序列a c g t 周围的核苷酸已被证明与决定b z i p 蛋白的特定结合有关。a b r e 是通过先形成a b r e 响应复合体而起调控作用的。至于a b a 如何活化b z i p 蛋白并使其与a b r e 结合从而调控基因表达的机制现在还不是很清楚。对于 需要a b r e 作为顺式作用元件的a b a 响应基因地分子机制还需要进一步研究。 1 3 a b a 非依赖型途径 在a b a 非依赖型途径中，基因的表达除受a b a 影响外还受其它因子如干旱、低温等 吉林农业丈学硕士学位论文 小麦d r e b 及e r e b 类转录因子的特性分析 影响，在没有a b a 存在时对其它因子照常反应，即a b a 的存在对其表达不是必需的。d r e b 的表达受a b a 非依赖型途径的调控。 这类基因的表达主要是通过对外源a b a 处理发生响应的a b a 非依赖型基因表达途 径。在a b a 不敏感型和a b a 缺乏型的拟南芥突变体中，一些基因可以由干旱、盐渍、冷 害等诱导，如r d 2 9 a 、k i n l 、c o t 6 6 、c o r 4 7 等( y a m a g u e h i s h i n o z a k ik 。，1 9 9 4 ) ，它们的表达 是不需要a b a 的，可是如采用外源a b a 处理时，也会有这些基因表达。在这些基因中发 现有被称为脱水应答元件( d e h y d r a t i o n r e s p o n s i v ee l e m e n t ，d r e ) d r e 的保守序列，经过仔 细分析后推测至少有两个独立的调控系统在这类基因的表达中起作用：一个是与a b a 相关 的对脱水的慢反应，另一个是在与a b a 不相关的快速诱导中起作用。 这类基因有酵母的1 e 2 5 ，番茄中的i “、l e 6 、1 e 2 5 ，大麦中的h v l 、h v 2 ，油菜中的p v l e a 7 b ， 水稻中的r a b l 7 、r a h 2 8 ，拟南芥中的l e r 4 7 、1 i 3 0 、l t i 4 5 、r d 2 、r d l 7 、r d 2 0 、r d 3 6 等。 1 4 不能被a 队诱导的途径 不能被a b a 诱导的基因是指由逆境胁迫诱导的，对a b a 没有应答的基因。它们的表 达与外源a b a 的使用与否或内源a b a 的合成受抑无关。如拟南芥中的r d l 9 基因，它可以 先于a b a 水平的升高而表达，对外源a b a 的施用不响应。它们之中含有一个d r e 顺式 作用元件( d e h y d r a t i o n r e s p o n s i v e e l e m e n t ) ，这个元件只与干旱、脱水、低温等诱导有关，与 a b a 响应元件无关( s h i n o z a k ike ta 1 ，1 9 9 7 ) 。这类基因还有拟南芥中的r d 2 1 、r d 2 8 、 d r e b i a 、d r e b 2 a 及e r d s ( e a r l yr e s p o n s i v et od e h y d r a t i o n ) 系列基因，它们都是在胁迫发 生的早期对脱水发生响应，不受a b a 诱导和调控。 从转录因子层面来说，同一种胁迫可能会同时激活多条信号途径( 多个转录园子) ： 而同一转录因子也可能会由多种胁追激活。从功能基因层面来说，同一转录因子可能会同 时激活多种功能基因；而同一功能基因也可能由多个转录因子激活，因为它的启动子区域 可能存在不止一种顺式元件，例如抗逆功能基因r d 2 9 a 同时具有d r e 元件和a b r e 元件 ( o m h et a k a g ime ta 1 ，1 9 9 5 ) 。干旱、低温和高盐对植物有相似的伤害过程，抗逆信号转 导途径的交叉性可能是植物对此相似的生理生化变化的一种适应。 吉林农业大学硕士学位论文小麦d r e b 及e r e b 粪转录因子的特性分析 2 。抗逆相关转录因子的研究现状 植物在生长发育过程中，需要对各种逆境和发育信号作出反应，这就要求对各种功能 基因的表达进行精确调控。植物通过一系列信号传递激发相应的转录因子，从而肩动相应 功能基因的转录表达，最后通过基因产物对外界信号在生理生化等方面作出台适的响应。 植物体内存在大量的转录因子，对拟南芥第4 号染色体的基因组序列进行分析，发现 1 5 的基因编码或可能编码转录因子。近年来，相继分离出大量的不同类型的转录因子， 仅拟南芥中就有3 0 多个b z i p 类转录因子和1 4 5 个a p 2 e r e b p 类转录因子( s a k u m ay e ta 1 2 0 0 2 ) 。有的转录因子可以调控多个基因的表达，从而调节不同的生理生化过程。 2 1 转录因子功能结构域 转录因子也称为反式作用因子，是能够与基因启动子区域内顺式作用元件发生特异性 作用的d n a 结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转 录。转录因子的d n a 结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定了 它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影 响。 在生长发育过程中，植物体除对组织和发育信号作出反应外，还要对各种环境因素做 出各种反应，通过一系列信号传递过程最终激发转录因子，转录因子与顺式作用元件结合 后，激活r n a 聚合酶i i 转录复合物，从而启动基因的转录表达，最后通过基因产物的作用 对外界信号在生理生化等方面做出适合的调节反应。k a s u g a 等人将从拟南芥中分离得到调 节r d 2 9 a 基因表达的转录因子d r e b l ，在r d 2 9 a 基因的启动子控制下转入拟南芥，这个转 录因了在干旱胁迫下得到增量表达，大大增强了转基因拟南芥的抗干旱胁迫能力( k a s u g am e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。由此可见，转录因子在基因的表达调控中起关键作用。 近年来，基因分子生物学研究领域的重点已逐渐从功能基因转到启动子顺式作用元件 和转录因子及其调控机理上。对转录因子的结构与功能的分析鉴定，是阐明在各种条件下 基因表达调控机理的重要内容之一，揭示转录因子间以及它们与d n a 之间相互作用的具体 机制，对于阐明细胞内信号传递网络及有效地控制特定基因的表达具有重要意义。 吉林农业大学硕士学位论文小麦d r e b 及e r e b 类转录因子的特性分析 2 11 d n a 结合域 d n a 结合域( d n ab i n d i n gd o m a i n ) 是指转录因子识别顺式作用元件并与之结合的一_ 段氨基酸序列，相同类型转录因子d n a 结合域的氨基酸序列较为保守，转录因子d n a 结合 区的特定氨基酸序列决定他们与顺势元件识别及结合的特异性。另外，d n a 结合域的二级 结构也可能影响转录因子的结合的特异性在这过程中一些中性氨基酸残基例如脯氨酸 和甘氨酸更为重要。典型的高等植物转录因子d n a 结合域有b z l p 结构域，a p 2 e r e b p 结构 域，锌指结构域，m a d s 框，州c 结构域，m y b 结构域等。 2 1 2 转录调控域 转录调控域( t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o nd o m a i n ) 转录调控域包括转录激活域和转录 抑制域两类，它们决定了转录因子功能的差异。转录因子的激活或抑制作用依赖于它对靶 基因的转录起激活还是抑制作用。典型的植物转录激活区一般具有这些特征，如富含酸性 氨基酸，脯氨酸或谷氨酰氨等。转录因子对靶基因的抑制作用可能是通过与其他转录因子 竞争同一顺式调控元件而发挥作用的。除此之外，还可能存在诸如通过使转录因子二聚化 而导致调控域被掩盖，转录抑制域与转录因子相互作用等机制。 2 2 3 核定位信号区 核定位信号区( n u c l e a rl o c a t i o ns i g n a l ，n l s ) 是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸 残基的核定位区域，转录因子进人细胞核的过程受该区段控制。h i r o m i 等在研究5 一l o ( 5 - l i p o x y g e n a s e ) 在细胞中定位的分子机制时发现，核定位信号对5 一l o 的细胞分布有决 定作用。目前，已经在水稻的g t 一2 ，玉米的b z i p 型转录因子o p a q u e2 等多种转录因子 中发现了核定位信号。不同植物转录因子核定位信号的序列、组织器官的分布和数量存在 着差异。另外，不同转录因子的核定位信号的数目也不相同。有的转录因子只有一个核定 位信号区，该类核定位信号区的碱性氨基酸或者聚集在一起或者形成两个被非保守氨基酸 隔开的功能群。而有的转录因子具有多拷贝的核定位信号区，这些多拷贝的核定位信号区 或者在功能上相互独立，或者成簇存在 吉林农业大学硕士学位论文 小麦d r e b 及e r e b 类转录因子的特性分析 2 1 3 寡聚化位点 寡聚化位点( o l i g o m e r i z a t i o ns i t e ) 是不同转录因子借以发生相互作用的功能域。它们的氨 基酸序列很保守，大多与d n a 结合域相连并形成一定的空间构象，如b z i p 类转录因子的 寡聚化位点包括1 个拉链结构，而b h i h 型转录因子含有螺旋一环螺旋结构，m a d s 转 录因子的寡聚化域则形成丽个a 一螺旋和两个b 一折叠。这些寡聚化位点空间构象的变化 产生了转录机制的多样性，从而使转录因子具有调控高等植物基因表达的能力。许多高等 植物的转录因子形成异聚或同聚物，以影响d n a 结合的特异性、转录因予对启动子元件 的亲和和核的定位。 2 2 a p 2 e r e b p 类转录因子 最近对拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 的a p 2 e r e b p 转录因子的功能研究得比较深入。 这些转录因子主要参与植物的细胞周期、生长发育以及生物和非生物胁迫相关的基因的表 达调控，它们都含有非常保守的d n a 结合区，即a p 2 e r e b p 结构域，有5 8 个左右的氨 基酸残基组成的；它们的n 末端都有碱性氨基酸序列，起核定位信号的作用。r i e c h m a n n 等 人分析了拟南芥基因组全序列，发现有1 4 4 个a p 2 e r e b p 类转录因子，并根据含d n a 结 合区的数目分为三个亚族；a p 2 ( a p e t a l a 2 ) 亚族，有2 个a p 2 e r e b p 结构域，共有1 4 个成员，主要参与调节细胞的生长发育；r a v 亚族，有2 个不同的d n a 结合结构域， a p 2 e r e b p 结构域和b 3 结构域，共有6 个成员：以及e r e b p 亚族，仅含1 个a p 2 e r e b p 结构域，共有1 2 4 个成员，主要参与调控植物对激素( 乙烯) 、病原、干旱、高盐和低温等 胁迫应答反应( r i e c h m a n nj l e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。s a k u m a 等人分析拟南芥基因组全序列，发现 有1 4 5 个a p 2 e r e b p 型转录因子，并进一步将其分为5 个亚族：a p 2 亚族，r a v 亚族， d r e b 亚族，e r f 亚族和a l 0 7 9 3 4 9 ( s a k u m ay e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。如图所示。 2 2 1 d r e b 和e r f 转录因子结构与功能 y a m a g u c h i s h i n o z a k i 等人从拟南芥中克隆了一批受干早诱导的基因，定名为r d 2 9 基 因。其中r d 2 9 a 基因的表达，不仅受到干旱，商盐的诱导，也受低温的诱导。由于r d 2 9 a 基因的表达比较特殊，对其启动子进行分析，揭示出一个与干旱，高盐及低温应答有关的 d r e 顺式作用元件( 序列为t a c c g a c a t ) 。r d 2 9 a 基因的表达也受外源a b a 的诱导，但 吉林农业大学硕士学位论文 小麦d r e b 及e r e b 类转录因子的特性分析 图1 4 ：e r f a p 2 相关蛋白家族的进化树 f i g1 4 ：p h y l o g e n i et r e eo f e r f a p 2 r e l a t e dp r o t e i n 是删去该启动子区域的a b a 应答元件a b r e ，保留d r