（动物学专业论文）大熊猫保护遗传学研究.pdf

垒! 型竺竺曼鲤竺= 苎壁竺鱼竺堕堡垡。墼g 墅! ! ! 堂鱼 摘要 目前，大熊猫野生种群的数量约1 0 0 0 只左右，且仅分布于我国四川、陕 西和甘肃三省之秦岭、岷山、邛崃、大相岭、小相岭和凉山等六个彼此隔离的 山系。多年来，有关大熊猫的研究，主要集中在生理学、生态学、生物化学、 病理学、古生物学、形态学和分类学等领域，而针对该物种野生种群遗传背景 方面的研究却极为鲜见。 近年来，保护遗传学基础研究与实践的结果表明，物种或亚种的起源、进 化历史、种群间的基因流和种群遗传多样性等遗传背景的有关参数，是制定物 种保护策略之最重要的科学依据之一。 小种群必然会导致近交的出现，并造成后代多态位点的丧失和种群纯合度 的上升。基于此，寻找一种能有效检测种群遗传背景相关参数的遗传标记，是 查明物种遗传背景的前提，而对种群大样本数的群体检测，则是衡量其遗传背 景相关参数可信度的基础。 文献显示，线粒体d n a 和微卫星标记，目前尚不能提供足量的遗传信息 以满足于对大熊猫遗传背景的评价。因此，d n a 指纹因可揭示物种基因组d n a 的多态性而成为迄今开展大熊猫这一特殊物种保护遗传学研究的理想遗传标 记。该标记可揭示影响物种的近期历史事件。 1 9 7 5 - 1 9 8 5 年期间，大熊猫主食竹类开花，导致几百只大熊猫的死亡。这 些死亡尸体，绝大多数通过福尔马林固定的方式予以保存。由于固定样品受交 联作用的影响，使其高分子量的d n a 难于提取和应用。 鉴于上述，作者以大熊猫保护遗传学研究为博士论文命题，开展了相 关研究，并获得了如下结果： ( 1 ) 虽然乙醇逐级脱水对于d n a 的提取是极为重要的，但是，它不能完全祛 除固定组织中的福尔马林，从而不能获得高分子量的d n a 。为此，作者： 将原方法中8 0 1 0 0 的乙醇逐级梯度脱水，改为3 0 1 0 0 的梯度脱 水，并增加了用醋酸异戊酯置换乙醇对样品进行临界点干燥，以达到完全 祛除固定组织中福尔马林的目的；经过银镜反应测试，证明了固定组织 中的福尔马林已被完全祛除；经脉冲场电泳检测表明，自经该方法处理 的固定组织中提取的d n a ，其分子量由原来的8 0 1 1 0 k b ，增加到了1 9 4 2 2 5 k b 经线粒体和核基因的p c r 扩增，以及d n a 指纹杂交验证，表 熊i 堡鲢懋曼堡! 翌鳖竺! 麴塑堡墅蜮! 巡! 盘 明该方法提取的d n a ，已完全解除了交联，可被完全酶切和进行d n a 杂 交。该绩果，不仅解决了大熊猫商质量d n a 的来源问题，也解决了生命 穗学、象狻涯学秘法纛麓学镢域中灌定缀织d n a 熬零l 矮潺蹶。 ( 2 ) 文献报道的大熊猫d n a 指纹探针f 2 z g p 9 6 0 6 0 8 0 1 ，能检测到3 6 个位点的 遗传信息，也能准确她鉴别个体，阐明种群结构与遗传结构镣问题。但是， 该探铮不戆捡蘸舅大熊獾耪群或豹秘静特短经条带，放嚣无法耋豫护遮赞 学角度，提供种群分化的直接证据。基于此，本文研制了大熊猫的第二代 寡核苷酸指纹探针g p 2 0 0 0 。g p 2 0 0 0 除了能准确地鉴别个体和阐明种群结 构与遗传结构外，其捻测豹遗传绩惑位点已由缀张豹3 6 个增嬲到了3 9 个， 荠检溅滋了大熊猫的耪种特征蒂车碡除秦岭种群戳外的其余五个由系种群鹃 特征带。这些遗传信息，为客观士搬阐明大熊猫的进化历史，以及直观地反 映“瓶颈散应”和“夔基者效应”等闷题，奠定了坚实的基础。 ( 3 ) 两个大种群曦出和邵崃种群。脊最高的遗传多样往。丽鬣小的两个种 群大相岭和小棚岭种群，显示出最低的遗传变异能力，并存在着严重 的近交。秦岭种群虽然较岷山和邓蠊种群小，且具有最少豹祭带数和最狭 窄懿漤鬻分奄薤銎，毽鼙与羝由和瑙骧耱饕处予闰逮簧多榉经承平。该 结果说明，较少的条带和较狭窄的谱带分布范嘲，不能作为评价遗传多样 性的参数指标，但显永了种群具有较慢的进化历程。 ( 毒) 遗传多榉缝靛分褥缮莱装唆，大熊猫懿耪群越大，栖惠缝冀段纯j c | 其逶传 多样性的影响就越显蒋：大熊猫的种群越小，种群数量的减少对其遗传多 样性的影响也越显著。 ( s ) d n a 豢纹鬻谱，箍承了犬熊猫六个由系其有包攒攀耪隔离、中嬲分往和近 期遗传退化等三种不同的分化模式。大约1 0 0 0 0 年前的冰川作用，导致了 秦岭种群和其他种群猩d n a 指纹圈和形态特征两方面，均出现了显著差 雾。萋予这嚣方瑟魏鼹萋差买，终甏姆秦蛉秘瑟焱楚丈熊獾瓣令蒙受耱， 郎秦岭暇种( 彳m q i n l i n g e n s i s ) ，而其余五个山系种群定为四川亚种( 指 名亚种) ( a m m e l a n o l e u c a ) 。因此，秦岭亚种成作为一个单独的保护单元 予以管璁。在四j | | 亚弹中，五个山系季孛群应划分必两个缳护单愆进行营理， 帮“曦由一筇镰”警瑗肇元和“大穗羚一小裙蛉一潦出”管理鼙元。 ( 6 ) d n a 指纹图、酶切位点的错配分布、d n a 中性检验和单倍型的麟小空间网 络结拘黟综合显示：传必一个物静，大熊猛经历了两次瓶颈；终2 4 0 0 0 堕! ! 她壁婴型璺熙塑垒堡堕塑笾坐! ! 嫩 垒 年前的冰川事件，导致了大熊猫的第一个完全性瓶颈不足l o 只的大 熊猿令髂在秦岭出系存嚣下来；约1 0 0 0 0 年蔻豹球列期，导致了丈熊猫 的局部瓶颈，即第二个魏完全能瓶颈一不足1 0 只的大熊猫个体，幸存 予夺糕岭由系，著成为四j | | 噩释静葵蘩者。鸟筵霹鼹，秦岭由系赉予受蘩 特殊地形地貌的庇护，使之有大量的熊猫幸免于第二次冰川事件而未能形 成种群瓶颈。因此，在全新世时期，这些幸免的祖先熊猫隧多蛾区起源模 式，扩数至蹩个中厘南部。 ( 7 ) 研究波明，大熊猫大种群与小种群之间的个体迁移，能在艟个种群的谱带 分布黼形上留下特征性标记。如，岷山和大相岭种群的谱带分布形状，呈 葫芦彤。圭北揭示了此二出系秘群之瓣，无个体迂移；郅蠊窥凉出秘群麴 谱带分布形状呈五边形和三角形，表明这两个山系的种群之间，存在着个 俸迁移或基黻滚。 罄于上述臻究结果，本文以霞先等级数撵裂鬏岸，撼遗了数下保妒对策： ( 1 ) 秦岭嬲小摆岭山系，痤尽快实攮圈养缳护计划； ( 2 ) 在现存圈养釉群中，应避免秦岭旺融和靼川照耪个体之阅浆杂交配耪。对 于已繁殖的杂交后代，应将其排除于翻后的繁殖计划之外； ( 3 ) 人为地将凉山种群的个体，适鬣地引入小相岭种群： ( 4 在小籀略、大相岭和凉由种群之闻，建立绿毹走廊，促遴由系之简的个体 交流，使三个隔离的静群连为一个太耪群； ( 5 ) 在岷山a 和岷山b 种群之间、岷山大种群和邛崃种群之间建立绿色走廊； 以保持大种群的进化潜力# ( 6 ) 对六大由系的久类活动加骏限籍。 关键蠲：大煞猛；福尔譬棒霾定：寡耪f 瞢酸攘锌；舔护逡俦学；释群缀褐； 遗传分纯；亚耱形残；耱群绣史；爨护策臻。 熊! 型璧黧竺婴唑麴鲤竺垡塑堡壁麴塑 鱼 a b s t r a c t 下虹g l o b a lp o p u l a t i o no fg i a n tp a n d a sw a s e s t i m a t e dt ob e - 1 0 0 0a n d c u r r e n t l y r e s t r i c t e dt ot h ei s o l a t e dq i n l i n g , m i n s h a n ，q i o n g l a i ，d a x i a n g l i n g , x i a o x i a n g l i n ga n d l i a n g s h a nm o u n t a i nr a n g e so nt h ee d g eo f t h et i b e t a np l a t e a u m u c he f f o r th a sb e e n e x p e n d e do nc o n s e r v a t i o no ft h es p e c i e s c o n s i d e r a b l ek n o w l e d g e h a sb e e ng a t h e r e d r e g a r d i n gt h ep h y s i o l o g y , e c o l o g y , b i o c h e m i s t r y , a n da n a t o m yo fg i a n tp a n d a s ，b u t l i t f l ei sk n o wa b o u tt h eg e n e t i cb a c k g r o u n do fw i l da n i m a l s ，w h i c hm a y a l l i m p o r t a n te l e m e mo f ac o n s e r v a t i o ns t r a t e g y c o n s e r v a t i o ng e n e t i c si sa b l et or e v e a l t h eo r i g i n sa n de v o l u t i o n a r yh i s t o r i e so f s p e c i e s s u b s p e c i e s ，t h er e l a t i o n s h i p sw i t h i n a n db e t w e e np o p u l a t i o n so fs p e c i e sa n dt h eg e n e t i cd i v e r s i t yo fg r o u p so fa n i m a l s ， a n dc a nt h u sd e f i n ep r i o r i t i e so f c o n s e r v a t i o nu n i t sa n de f f e c t i v ec o n s e r v a t i o n p l a n s n es m a l ls i z eo ft h ew i l dp o p u l a t i o nr e s u l t si n i n b r e e d i n g c a u s i n gl o s so f p o l y m o r p h i c l o c ia n d h i g h e rh o m o z y g o s i t y i nd e s c e n d a n t s f o rt h i s r e a s o n , a p p r o p r i a t em a r k e r sa n dl a r g es a m p l es i z e sa r ee s s e n 6 a lf o rr e l i a b l ed e t e c t i o no f g e n e t i cp a t t e r n si np a n d a s p r e v i o u ss t u d i e sr e v e a l e dt h a tm i t o c h o n d r i a ld n a a n d m i c r o s a t e l l i t e sd i dn o tp r o v i d ei n s u f f i c i e md a t af o rg e n e t i ca n a l y s e so f g i a n tp a n d a s ， 1 1 b e r e f o r e ，d n af i n g e r p r i n t i n gi sm o r es u i t a b l ef o rt h eg i a n tp a n d ab e c a u s ei ti s c a p a b l eo fr e v e a l i n gw h o l eg e n o m ep e l y m o r p h i s mp a t t e r n s f u r t h e r m o r e ，t h ep r o b e s u s e di nd n a f i n g e r p r i n t i n g , v a r i a b l en u m b e r t a n d e m r e p e a t n 琢) f a m i l i e s , c h a n g e a t8r a t eo f1 9 良l ot i m e sf a s t e rt h a nc o n v e n t i o n a la l l e l e sa n dc a nt h u sr e f l e c tm o r e r e c e n th i s t o r i ce v e n t s b a m b o od i e - o f fd u r i n g1 9 7 5 - 1 9 8 5c a u s e dt h ed e a t ho fs e v e r a l h u n d r e dg i a n tp a n d a s m o s to ft h e s ec a r c a s s e sw e r ep r e s e r v e db yf o r m a l i nf i x a t i o n , b u tt h em a t e r i a lw a sn o tu s e df o rg e n e t i c s t u d yb e c a u s ec r o s s - l i n k i n gb e t w e e np r o t e i n s a n dd n am a k e se x t r a c t i o no f h i g h - q u a l i t yn u c l e i ca c i d s q u e n c e sp r o b l e m a t i c t h i ss t u d yi sd e s i g n e dt o ( 1 ) d e v e l o pr e l i a b l em e t h o d st oe x t r a c th i g h q u a l i t y d n af r o mf o r m a l i n - f i x e dt i s s u e sa n dan e wp r o b e ，w h i c hp o s s e s s e st h e h i g h e s t p r o b a b i l i t y i nt h ep a t e r n i t yt e s t i n ga n di ss u i t a b l ef o r i d e n t i f y i n g t h e h o m o z y g o u sl o c i ； ( 2 ) 姆u s ed n a f i n g e r p r i m i n ga n dh i s t o r i c a ls a m p l e st od e t e c tp o p u l a t i o ns t r u c t u r e ， g e n e t i c d i f f e r e n t i a t i o na n d p o p u l a t i o nh i s t o r y o fg i a n t p a n d a s ；( 3 ) t oa d v i s e c o n s e r v a t i o ns t r a t e g i e su s i n gt h ea n a l y s e so fc o n s e r v a t i o ng e n e t i c sa 1 lr e s u l bc o u l d b es u m m a r i e da sf 0 1 l o w s l a l t h o u g hg r a d u a ld e h y d r a t i o ni sh e l p f u lf o r d n ae x t r a c t i o nf r o mf i x e dt i s s u e sb u t l tc a r ln o tg i v eh i g hm e l e e u l a t - w e i g h td n a d u et oi n c o m p l e t ef o r m a l i nr e m o v a l h o w e v e lc o m b i n i n gw i t hc r i t i c a l p e i md r y i n g 。t h eg r a d u a ld e h y d r a t i o nc 强r e s u l t i nt h ee x t r a c t i o no f h i 垂m o l e c u l a rw e i g h td n a , w h i c hi si d e n t i c a lt ot h es i z eo f g e n o m i cd n a f r o m & s hl i v e r , b e c a u s ec r i t i c a lt e m p e r a t u r ea n dc r i t i c a lp r e s s u r e c a nr e m o v ef o r a m l i nc o m p l e t e l y t h u s ，t h eq u a n t i t ya n dq u a l i t yo fd n af r o m f i x e dt i s s u e si sr e l i a b l ea n dc d f f lb e a p p l i e d f o rm o l e c u l a r g e n e t i cs t u d i e s ， p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i pa n a l y s i s ，f o r e n s i cd n ad e t e c t i o na n dr e t r o s p e c t i v e c l i n i c o g e n e t i ca n a l y s i s 。 蹩墅缎罂垒璧竺! 垒篓建矍! 塑茎数垒缎翟塑熊 ( 2 ) t h en e wp r o b e ，g p 2 蝴，h a dt h eh i g h e s tp a t e r n i t yp r o b a b i t 姆a n d s u c c e e d e di n i d e n t i f y i n gt h eh o m o z y g o t i cg e n e sg n dd i s c r i m i n a t i n gg i a n tp a n d a i n d i v i d u a l s i t p r o d u c e d u p t o3 9i n f o r m a t i v e l o c ii n s i n g l eg i a n tp a n d a a n d t w o s p e c i e s s u b s p e c i e s - s p e c i f i cb a n d s ，a n d t h u sr e p r e s e n t st h eb e s to p p o r t u n i t yf o rt h e d e t e c t i o no f g e n e t i cd i v e r s i t ya n dg e 掰峨ed i f f e r e n t i a t i o no f g i a n tp a n d a s 3 ) t h et w ol a r g e s tp o p u l a t i o n s ，m i n s h a na n dq i o n g l a i ，h a dt h eh i g h e s tl e v e l o f g e n e t i cd i v e r s 晦a n d t h et w os m a l l e s t p o p u l a t i o n s ，d a x i a n g l i n g a n d x i a o x i a n g l i n g , h a d t h e l o w e s tl e v e lo fh e t e r z y g o s i t y , i n d i c a t i v eo fs e r i o u s i n b r e e d i n g i nt h ed a x i a n g l i n ga n dx i a o x i a n g h n gp o p u l a t i o n s t h e q i n l i n g p o p u l a t i o np o s s e s s e d s m a l l e rs i z et h a nt h a to ft h em i n s h a na n dq i o n g l a i p o p u l a t i o n s a n d h a dt h ef e w e s tb a n d sa n dt h en a r r o w e s t r a n g e o f b a n dd i s t r i b u t i o n h o w e v e r , t h eq i n t i n gp a n d a ss h o w e ds i m i l a rg e n e t i cv a r i a b i l i t yt ot h em i n s h a n a n d q i o n g l a ip o p u l a t i o n s ，s u g g e s t i n g t h a tf e w e rb a n d sd i s t r i b u t e do v e ran a l r o w e r r a n g em a y r e f l e c tal e s se v o l u t i o n a r yp o p u l a t i o 鑫。 ( 4 ) c o m b i n i n g 撕t h t h es t a t u so fs m a l ls u b - p o p u l a t i o n sa n dh a b i t a tf r a g m e n t a t i o n , t h e g e n e t i ca n a l y s e sr e v e a l e dt h a t 麓t h el a r g e rt h ep o p u l a t i o n , t h em o r es i g n i f i c a n t t h ee f f e c to fh a b i t a tf r a g m e n t a t i o no ni t sg e n e t i cd i v e r s i t y ；c o ) t h es m a l l e rt h e p o p u l a t i o n , t h e m o f e s i g n i f i c a n t t h ee f f e c to fp o p u l a t i o nd e , l i n e so ni t s h e t e r o z y g o s i t y ( 5 ) d n af i n g e r p r i n t i n gr e v e a l e dd i f f e r e n td i f f e r e n t i a t i o np a t t e r n si ng i a n tp a n d a s , i n c l u d i n ge a r l y s t a g e ，l a t e - s t a g e , r e c e n td i v e r g e n c ea n d r e c e n tg e n e t i cd e p r e s s i o n a s e p a r a t i o na r o u n d1 0 。0 0 0y e a r sa g or e s u l t e di nv e r ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si n d n a f i n g e r p r i n t sa n dm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sb e t w e e nq i n l i n ga n ds i c h u a n p o p u l a t i o n s 。s u p p o r t e db ym o 攀h o l o g i e a ld i f f e r e n c e s 。t h eg e n e t i cd a t a 强玳u s e d t oc l a s s i f y t h eq m l i n g p o p u l a t i o na san e ws u b s p e c i e s , a i 7 1 q i n l i n g e n s i s , w h i l e t h es i c h u a np o p u l a t i o n sw e r ec l a s s i f i e di n t ot h e o r i g i n a ls u b s p a e i e s a 触 m e l a n o l e u c a t h u s ，t h eq i n l i n gp o p u l a t i o nd e s e r v e sm a n a g e m e n ta sas e p a r a t e u n i ti nt h es i e h u a np o p u l a t i o n s , t w om a n a g e m e n tu n i t sw e r ed e f t n e d , i n c l u d i n g q i o n g l a i - m i n s h a n a n d d a x i a n g l i n g - x i a o x i a n g l i n g - l i a n g s h a n ， ( 6 ) d n af i n g e r p r i n t i n g , m i s m a t c hd i s t r i b u t i o n s , n e u t r a l i t y t e s t sa n dm i n i m u m s p a n n i n gn e t w o r k sr e v e a l e dt h a ta sas p e c i e s , t h eg i a n tp a n d aa n d e r w e mt w o h i s t o r i c a l p o p u l a t i o nb o t t l e n e c k s 。a p p r o x i m a t e l y2 4 ，0 0 0y e a r sa g o , g l a c i a t i o n c a u s e d 鑫e o 撒东e r eb o t t l e n e c k , w i t hf e w e rt h a n1 0a n c e s u - a lp a n d a ss u r v i v i n gi nt h e q i n l i n gm o u n t a i n so fs o u t h e r nc h i n a a n o t h e r 翊a c i a t i o ne v e n t 舯o u n d1 0 ，0 0 0 y e a r sa g oc a u s e dap a r a a l b o t t l e n e c kd u r i n gw h i c hf e w e rt h a n1 0f o u n d e r s s u r v i v e di nt h e x i a o x i a n g t i n gm o u n t a i n s , b u t ag r e a tm a n b e ro f r m l a a sp e r s i s t e d i nt h eq i n l i n gm o u n t m m 。t h e s ep o p u l a t i o ms u b s e q u e n t l ye x p a n d e dt h r o u g h o u t s o u t h e r nc h i n a , 勤l l o w i n ga m u l t i - r e g i o n a lo r i g i nm o d e l ( 7 ) t h i ss t u d y f o u n dt h a t m i g r a t i o n o fi n d i v i d u a l sb e t w e e n l a r g e a n ds m a l l p o p u l a t i o n sl e f tc b a _ _ r a c t e r i s t i cs i g n a t u r e si nt h ed n a f i n g e r p r i n tb a n dd i s t r i b u t i o n ， 照! ! 楚壁婴婴塑迦竺塑笪! ! 蹩墅鱼鲤! 鲤 壁 s h o w i n gt h a td n af i n g e r p r i n t i n gi s e f f e c t i v ei nt r a c i n gt h ep o p u l a t i o nh i s t o r yo f g i a n tp a n d a s ，t h eb a n dd i s t r i b u t i o no fq i o n 瘿a ip o p u l a t i o ns h o w sap e n t a g o n p a r e m w h i l et h em i n s h a na n d d a x i a n g t i n gp o p u l a t i o n s h a v eac u c u r b i t d i s t r i b u t i o n r e v e a l i n gm i g r a t i o nb e i 孙撇t h em a i ns u b - p o p u l a t i o na n d 氆es r n a l i i s o l a t e ds u b - p o p u l a t i o ni nt h eq i o n g l a ip o p u l a t i o nb u tn 0g e n ef l o wb e t w e e nt w o f r a g m e n t e ds u b - p o p u l a t i o n si nt h em i n s h a n a n d d a x i a n 蠹汛gp o p u l a t i o n s 。 b a s e do nt h er e s u l t sd e s c r i b e da b o v e ，s o m ec o n s e r v a t i o n s t r a t e g i e s w e r e r e c o m m e n d e da sf o u o w s ( t ) p e r f o r m i n gc a p t i v eb r e e d i n g i nt h eq i l l i i n ga n d x i a o x i a n g l i n gp o p u l a t i o n s ； ( 2 ) a v o i d i n gp r o d u c i n gh y b r i do f f s p r i n gb e t w e e ng m i n gs u b s p e c i e sa n ds i c h u a n s u b s p e c i e sa n de x c l u d i n g c u r r e n th y b r i d sf r o mt h e b r e e d i n gp o p u l a t i o n ； ( 3 ) a r t i f i c i a l l yi n t r o d u c i n gp a n d a s f r o mt h e l i a n g s h a np o p u l a t i o n i n t ot h e x i a o x i a n g l i n gp o p u l a t i o n ； 2 0k b ) d n a f r a g m e n t s ( f i g 1 a , l a n e6 ) ，b u tp r o c e s s i n gb yg r a d u a ld e h y d r a t i o na n dc r i t i c a l p o i n td r y i n g ( f i g 1 a , l a n e7 ) r e s u l t e di nt h ee x t r a c t i o no fh i g hm o l e c u l a rw e i g h t d n a ( a p p r o x i m a t e l y2 0 k b ) ，w h i c hi si d e n t i c a lt ot h es i z eo f g e n o m i cd n a f r o mf l e s h l i v e r ( f i g 1 a , l a n e8 1 ，t h et i s s u e sb o t hf r e s ha n dp r o c e s s e db yc r i t i c a l - p o i n td r y i n g r e s u l t e di nh i g hd n ay i e l d sa n dt h eh i g h e s t0 d2 6 0 2 8 0n l nr a t i o s ( t a b l e2 、 a l t h o u g hg r a d u a ld e h y d r a t i o ni sh e i t 最df o rd n ae x t r a c t i o n i ta l o n ec a nn o tg i v e l l i g hm o l e c u l a rw e i g h td n a w h yc a l lc r i t i c a l - p o i n td r y i n gl c a dt ot h ee x t r a c t i o no fh i 吐m o l e c u l a rw e i g h t d n a ? t h er a t i o n a l eo fc r i t i c a l - p o i n td r y i n gl i e si nt h eu s eo ft e m p e r a t o r ea n d p r e s s u r e ，b o t l lo fw h i c ha r eh i 曲e rt h a nc r i t i c a lt e m p e r a t u r ea n dc r i t i c a lp r e s s u r e ， b e i n gu s e dt oe v a p o r a t ef l u i df i nt h i s c a s ef o r m a l i 酌i nt i s s u e sa n dd r yt h e m g e m p l e t e l y t h es i l v e rm i r r o rt e s ti n d i c a t e dt h a tf o i t n a l i nh a db e e nr e m o v e d c o r n p l e t e l yo n l yf r o mt h o s et i s s u e sp r o c e s s e db yg r a d u a ld e h y d r a t i o na n dc r i t i c a l p o i n td r y i n g ( f i g 2 ) s a m p l e sd e h y d r a t e di nag r a d e ds e r i e so fe t h a n o ls t i l ls h o w e d u a c e so ff o r m a l i n 1 1 1 i si n d i g a t e st l l a tc r i t i c a l p o i n td r y i n gr e s u l t e di nt 1 1 ec o m p l e t e r e m o v a lo ff o r m a l i na n df i x a t i o n i n d u c e dc r o s s - - l i n k i n g , t h u sa l l o w i n gh i g hm e l e e u l a r w e i g h td n at ob ee x t r a c t e df r o mt h ef i x e ds a m p l e s as h o r tf r a g m e n t ( a b o u t4 0 3 b p c y t bg e n e ) ，u s e dt ot e s ti f p c rr e a c t i o n sc o u l db e 垒 ! ! 坐壁竺! 竺塑型竺鱼竺鲤壁垡垒! 垡型! ! ! 塑 鱼i r e l i a b l yp e r f o r m e d w a sa m p l i f i e df r o mg r a d u a ld e h y d r a t i o n ( 7 0 - 1 0 0 ，5 0 一1 0 0 a n d 3 0 1 0 0 ) f r o mt i s s u ep r o c e s s e db yc r i t i c a l - p o i n td r y i n g ，a n df r o m 舶s hl i v e r ( f i g 1 、1 1 9 8 b pc y t bg e n ea n d1 8 4 4 b pt c e l lr e c e p t o rg e n e ，u s e dt ov e r i f yi f 】o n g e r f r a g m e n t so fd i f f e r e n ts o u r c e sc o u l db ea l s oa m p l i f i e d , w e r eo n l yi s o l a t e df r o m c o m p l e t e l yp r o c e s s e dl i v e ra n df l e s hs a m p l e s ( f i g 1 ) ，e v e nt h o u g ht h eg r a d u a l d e h y d r a t i o n ( 7 0 1 0 0 a n d5 0 1 0 0 1p r o d u c e dd n af r a g m e n t sl a r g e rt h a n2 k b s i n c eg r a d u a ld e h y d r a t i o ni su n a b l et or e p l a c ef o r m a l d e h y d ec o m p l e t e l y , r e m n a n t c r o s s 1 i n k i n gb e t w e e nh i s t o n ep r o t e i n sa n dd n am a yh a m p e rt h ep r o g r e s s i o no ft a q d n ap o l y m e r a s e ，c a u s i n gt h ea m p l i f i c a t i o nf a i l u r e so f t h el o n g e rf r a g m e n t s f i g 4 n n g e r p r i n t i n ga n a l y s i so ff i v ef o r m a l i n l u t e d h u m a ns p e c i m e n s ( 1 a n e s1 ，3 ，5 ，7 ，9 ) a n df o o rf r o z e n h u m a nm u s c l e so a n e s2 ，4 ，6 ，8 ) 1 硒血e y ( 19 5 8 ) ；3 l i v e r ( 1 9 6 6 ) ；5o v a r y ( 1 9 6 7 ) ；7l i v e r ( 1 9 8 0 ) ；9 m u s e l e f 1 9 3 9 ) t h en u m b e r smb r a c k e t sa f c e rt i s s u ei st h ey e a t t i s s u ew a sf i x e d c o m b