（有机化学专业论文）高纯黄芩素的制备及化学修饰.pdf

摘要 高纯黄芩素的制备及化学修饰 摘要 随着中药现代化的进行，中药有效成份的提取分离、改性的研究已成 为不可缺少的部分。以天然有机化合物为先导，利用半合成法对其进行结 构修饰和改性是发现新疗效成分和新药开发的一个重要途径。黄芩素是中 药黄芩的重要活性成份，具有抗菌、抗病毒、抗癌等多种药理作用。本课 题对高纯黄芩素的制备和黄芩素的化学修饰进行了研究，首次合成了三种 黄芩素金属配合物和一种强水溶性的黄芩素磺化物，对黄芩素的进一步研 究和新药开发有着重要的实际价值。 本课题主要包括三个方面：( 1 ) 由黄芩制备高纯度黄芩素。在制备中， 先利用酸沉碱溶的方法从黄芩中提取黄芩苷，然后通过水解黄芩苷和柱层 析提纯得到高纯度的黄芩素，其纯度达9 9 3 5 ；( 2 ) 首次合成了黄芩素 一f e ( i i ) 、c o ( i i ) 、n i ( i i ) 配合物。采用正交试验法优化合成条件，通过 元素分析和原子吸收光谱确定其组成为m ( c 1 5 h 9 0 5 ) 2 i 蝎o ，并利用红外 吸收光谱、紫外吸收光谱、t g d t a 等对配合物进行了表征；( 3 ) 首次合 成了强水溶性的黄芩素一3 ，7 一二磺酸钠，并对磺化物、黄芩素及黄芩苷 清除羟基自由基的效果进行了评价，结果比较满意。 关键词：高纯度，黄芩素，制备，化学修饰，黄芩素一f e ( i i ) 、c o ( i i ) 、 n i ( i i ) 配合物，磺化 北京化工大学硕士论文 p r e p a i i o no fh i g h p u l u t yb a i c a l e i na n d c h e m i c a lm o d i f i c a t i o n a b s t r a c t w i t ht h ep r o g r e s so fm o d e m i z a t i o no fc h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n e ，t h e d i s t i l l a t i o n ，s t m c t u r e m o d i f i e do ft h ea v t i v ec o m p o n e n t so fc h i n e s et r a d i t i o n a l m e d i c i n ei sb e c o m i n ga ni n d i s p e n s a b l ep a r t i ti sa ni m p o r t 咖w a yt of i n dm e m c m el sb e c o m m ga nm d i s p e n s a b l ed a r t i ti sa ni m d o r t a n tw a vt 06 n d n e wm e d i c a lc o m p o n e n t sa n dt o d e v e l 叩n e wd r u g sb ym o d i 匆i n gt h e s t m c t u r eo fn a t u r a lp r o d u c t b a i c a l e i ni so n eo ft h ee 虢c t i v ei n 铲e d i e n t so f c h i n e s eh e r b ss c u t e l l a r i a b a i c a l e n s i s g e o 唱i ，i t c a na n t i b i o s i s ，a n t i v i r a l ， a n t i c a n c e ra n do t h e rp h a n n a c 0 1 0 9 i c a la c t i o n s t h er e s e a r c ho fm y d i s q u i s i t i o n i sr e l a t e dt op r 印a r a t i o no fh i 曲一p u r i t ) ，b a i c a l e i na n dc h e m i c a lm o d i f i c a t i o no f b a i c a l e m t h r e em e t a lc o 1 p l e x e sa n das t r o n gw a t e r - s o l u b i l i t ys u l f o n a t ew e r e s y n t h e s i z e d i th a sa na c t u a lm e a n i n gt ot h ep r o g r e s sr e s e a r c hf o rb a i c a l e i n a n dm ed e v e l o p m e n to fn e wm e d i c i n e h i 曲- p u r i t yb a i c a l e i nw a sp r e p a r e d 仔o ms c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i sg e o 玛i i n t h ep r o c e s so fp r e p a r a t i o n ，b a i c a l i nw a sg o t t e n 丘o ms c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i s g e o 玛ib ya l k a l i - s o l u t i o na n da c i d i s o l a t i o n ，a n dt h e nh i g h p u r i t yb a i c a l e i n w a so b t a i n e d b yh y d r o l y s i s o fb a i c a l i na n dc o l u n m c h r o m a ，t o g r a p h y p u r i f i c a t i o n ，m ep u r i t yo ft h eb a i c a l e i nw a s9 9 35 a b s t r a c t t h es y n t h e s i sa n dc h a r a c t e r i z a t i o no fb a i c a l e i nw i t hf e ( i i ) ，c o ( i i ) a n dn i ( i i ) a r er 印o r t e di nt h i sp a p e r a no r t h o g o n a lt e s tw a su s e dt oo p t i m i z et h e c o n d i t i o n so ft h es y n t h e s i so fb a i c a l e i na n df e ( i i ) ，c o ( i i ) a n dn i ( i i ) t h e c o m p o s i t i o na n ds t m c t u r eo fb a i c a l e i nm e t a lc o m p l e x e sw e r ec h a r a c t e r i z e d b ye l e m e n t a 拶a n a l y s i s 、t g d t a 、i r 、u v 二v i sa n da a ss p e c t r o s c o p i e s b a i c a l e i n 3 ， 7 s u l f o n a t es o d i u m ， t h e w a t e r s o l u b i l i t y d e r i v a t i v e so f b a i c a l e i nw e i es y n t h e s i z e d t h es c a v e n g i n ge f ! e e c t so fb a i c a l e i ns u l f o n a t e ， b a i c a l e i na n db a i c a l i no nh y d r o x y lr a d i c a lw e r ee v a l u a t e d a ut h er e s u l t s o b t a i n e dw e r es a t i s f a c t o k e yw o r d s ：h i g h - p u t y ，b a i c a l e i n ，p r e p a r a t i o n ，c h e m i c a lm o d i f i c a t i o n ， c o m p l e x a t i o nw i t hf e ( i i ) ，c o ( i i ) a n dn i ( i i ) ，s u l f o n a t i o n i i i 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：三嚣址 日期： 一土d l 上扯 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授 权书。 作者签名： 导师签名： 董邀巷 日期： 日期： 第一章文献综述 1 1引言 第一章文献综述 黄芩( s c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i sg e o 鲥) 是我国著名的传统中药，属唇形科植物，性 寒、味苦，具有清热泻火、解毒、止血、安胎等功效，在临床上常用于治疗上呼吸道 感染、泌尿系统感染、菌痢、肝炎、高血压等疾病【l 】。黄芩的有效成份是黄酮类化合 物，主要有黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷等【2 】。近年来对黄芩各有效成份的药理活性进 行了深入的研究，发现活性成份之一的黄芩素不仅具有比其他活性成份更高的活 性【3 4 1 ，同时也发现了黄芩素一些特有的药效【5 1 。图卜1 为黄芩素的化学结构图。 h o h o o h o 4 图1 1黄芩素的化学结构图 f i g u r e1 1 c h e m i c a ls t r u c t u r e so fb a i c a l e i n 1 2 黄芩素的药理活性 黄芩素( b a i c a l e i n ，b a i ) 是黄芩主要有效成份之一，化学结构属黄酮类，具有多 种药理活性，现对黄芩素的药理活性研究进展作一概述。 1 2 1 清除氧自由基及抗氧化作用 自由基的强氧化性能使不饱和脂肪酸发生过氧化，生成氧化脂质，伤害生物膜， 促使衰老，诱发多种疾病，尤其在促发糖尿病微血管病变起重要作用【6 】。目前研究表 明，黄酮类物质大多具有清除自由基活性，而且自由基清除活性与其所含有的酚羟基 数量和结构密切相关【7 】。黄芩素的酚羟基数量较黄芩中其他有效成份的数量多，且a 环中含有邻二酚结构，因而具有较强的自由基清除活性【8 】，是一类较好的抗氧化 剂【9 ，i 们。黄芩素可抑制由铁诱导的鼠肝线粒体脂质过氧化，清除由二苯基苦味肼 ( d p p h ) 诱导的自由基【l 。体外实验表明，黄芩素能淬灭超氧阴离子和羟自由基， 其作用呈剂量效应关系；在f e c l 3 诱导的癫痫模型中，黄芩素能够抑制f e c l 3 注射区 北京化工大学硕士论文 硫代巴比妥酸反应物( 1 1 3 a r s ) 水平的升高；黄芩素还能抑制因缺血再灌导致的沙土 鼠海马神经元的死亡【l2 1 。在鼠肝微粒体脂质过氧化实验中，黄芩素减少了抗坏血酸与 f e c l 3 体系中硫化巴比妥酸活性物质( t b a r s ) 的产生【1 3 】。 1 2 2 抑制炎症反应 ( 1 ) 抗花生四烯酸代谢黄芩素可通过抑制有丝分裂原激活的蛋白激酶一细胞溶 质磷脂酶a 2 通道( m a p k - c p l a 2 ) 来减少花生四烯酸的释放。黄芩素对大鼠血小板 花生四烯酸代谢中环氧酶与脂氧酶均有抑制作用，对脂氧酶更具有选择性，还对大鼠 白细胞花生四烯酸代谢中脂氧酶代谢产物5 一羟基二十四烯酸( 5 髓t e ) 及环氧酶代 谢产物1 2 一羟基十七碳三烯酸( h h t ) 的生成有抑制作用。黄芩素在慢性炎症模型 ( 大鼠佐剂性关节炎，e d 5 0 = 1 2 0 6m g l ( g ) 中的抗炎活性大于在爱兰苔胶诱导的大鼠 足趾水肿模型中的抗炎活性，其抗炎机制可能是抑制花生四烯酸代谢中的5 一脂氧合 酶途径1 1 4 j 。 ( 2 ) 抗过敏通过黄芩素对抗原攻击后的致敏豚鼠肺内s r s a 和l t 释放及气管 平滑肌紧张度影响的研究，发现黄芩素可抑制s r s a 和l t 释放，同时降低l t c 4 和 d 4 的释放，并使豚鼠呈收缩状态的支气管平滑肌松弛【1 5 】。对豚鼠的过敏性气喘有缓 解作用，能缓解整体动物的哮喘，而且与麻黄素有协同作用，拮抗过敏性浮肿及炎症。 此外，对动物的被动全身变态反应及皮肤变态反应，亦有一定抑制作用。 1 2 3 抗病毒 黄酮类物质的抗人类免疫缺陷病毒( h i v ) 是近来研究的热门，研究显示，黄芩 素具有抗艾滋病病毒的作用【1 6 17 1 ，能诱导感染h i v 的细胞发生凋亡。此外，赵引3 ，1 8 】 研究了黄芩苷和黄芩素对人免疫缺陷病毒逆转录酶活性的抑制作用，测定了浓度分别 为0 1 4 7 岬l o l 和0 0 3 8 “m o l m l 的黄芩苷和黄芩素的i c 5 0 分别为6 5 8 8 和1 0 2 6 ，表 明黄芩素抑制h 二i 玎活性较黄芩苷强。同时研究发现，如果黄芩素的6 一羟基被遮 蔽，则丧失抑制h 二1l 玎的活性，说明6 一羟基为抑制h i v 1r t 活性所必需。 1 2 4 抗肿瘤作用 黄酮类化合物具有广泛的抗肿瘤活性，可通过多种途径抑制多种肿瘤细胞的生 长，是一类颇具前景的抗肿瘤药物【1 9 ，2 0 1 。黄芩素的抗肿瘤作用与其抑制肿瘤血管生成 有关，黄芩素可明显降低c a m 中基本成纤维生长因子诱导的血管生长应答，降低 h u v e c s 基质金属蛋白酶一2 的活性【2 ，而且显示量效地抑制黄曲霉毒素b 1 和亚硝 胍对沙门菌的致突作用。此外，黄芩素对白细胞介素2 和肿瘤坏死因子的作用均有增 强【2 2 1 ，对人肝癌细胞株的凋亡有诱导作用2 3 1 。研究还发现，黄芩素也许能成为一个治 疗膀胱癌具有吸引力和前景的药物【2 4 1 第一章文献综述 1 2 5 保肝利胆 肝炎是一种常见的严重危害人们健康的疾病，其发病率高，发展成慢性后治疗困 难。目前世界上用于治疗肝炎的药物很多，但迄今尚无一种能根治的药物，世界各地 的许多药学工作者，一直致力于防治肝病药物的研究与开发，希望发明一种针对肝病 疗效较好的药物。近年来，我国也对中草药防治肝病进行了大量的筛选和实验研究工 作。研究结果表明，中草药黄芩具有明显的护肝作用。近几年来，人们在黄芩素及黄 芩苷护肝作用机理方面做了大量的研究工作。药理实验表明，黄芩素对c c l 4 或半乳 糖胺所致原代培养大鼠肝细胞和整体动物肝损伤模型有显著保护作用【2 5 】；在肝炎患者 血浆中，黄嘌呤氧化酶水平明显高于正常值，而黄芩素对黄嘌呤氧化酶具有明显抑制 作用【2 6 1 。黄芩素对培养的大鼠肝星状细胞显示强的抗增殖作用，有可能成为一种抗肝 纤维化形成的药物【2 7 】。黄芩素具有利胆作用，可使实验动物的胆汁分泌量增加。此外， 它还具有利尿作用，对麻醉犬静脉注射10m 眺g 或2 0m g l 【g 的黄芩素后有明显利尿 作用。 1 2 6 其他作用 ( 1 ) 抗凝血和抗血栓形成以标准抗血栓药阿司匹林和肝素作对照，黄芩素可抑 制胶原诱导的大鼠血小板聚集作用，抑制凝血酶诱导的纤维蛋白原转化为纤维蛋白， 对花生四烯酸诱导的血小板聚集也有抑制作用，并防止由内毒素诱导的d i c 及大鼠血 小板和纤维素蛋白原的减少。黄芩素能抑制凝血酶及凝血酶受体紧张肽诱导的血纤维 蛋白溶酶原激动剂抑制因子一1 ( p a i 1 ) 的生成，其机制也许是降低了c a 2 + 的升高， 提示黄芩素可能成为一个治疗动脉硬化和抗血栓形成的药物【2 引。 ( 2 ) 降血压作用黄芩素不能影响血压正常大鼠的血压，但可降低高血压大鼠的 血压【2 9 1 。 此外，黄芩素还具有抑制胰酶活性、抑制粘附分子表达等活性。随着对黄芩素药 理作用的深入研究，黄芩素良好的临床应用前景也将逐渐显露。目前，有关黄芩素的 一些制剂已在临床应用于上呼吸道感染、急性扁桃体炎、咽炎、慢性阻塞性肺病、传 染性肝炎、急慢性胃肠炎及细菌性痢疾、肾盂肾炎等，并显示出了较好的疗效。 1 3 黄芩素的制备 黄芩素研究所用的原料很少由化学合成得到，一般是从黄芩中提取得到。黄芩中 黄芩素的含量很低，只有0 0 4 0 2 8 【3 0 1 ，直接从黄芩中提取制各黄芩素难度较大。 研究发现黄芩中的主要有效成分之一的黄芩苷具有与黄芩素类似的结构，其在一定条 件下水解可得到黄芩素。目前已有相关报道，其方法一般为：先从黄芩中提取黄芩苷， 黄芩苷经酶【3 1 ，3 2 1 或酸【3 3 1 水解得到黄芩素。 北京化工大学硕士论文 1 3 1 酶解法 刘云华【3 i 】和武雪彬等【3 2 】分别报道了利用酶解法与结晶法从黄芩苷制备黄芩素。 酶具有专一和高效性，利用酶的特性将黄芩苷转化为黄芩素。具体方法为：将经酶处 理后的黄芩苷粗品，置于3 0 水浴中逐渐加入乙醚溶剂，不断摇动，待刚好完全溶解 后，制成饱和溶液，趁热过滤除去杂质。薄层色谱法( t l c ) 检测，至滤渣中已基本 不含有酶解产物黄芩素。减压浓缩，再加入乙醇一水共溶，低温放置一段时间，析出 晶体，抽滤后得到的晶体即黄芩素，得率为理论得率的8 8 6 ，纯度约为9 3 。整个 实验结果比较理想，但是在结晶过程中采用大量的乙醚溶解黄芩素，具有一定的危险 性，有待进一步研究选择合适的溶剂。 1 3 2 酸水解法 赵春颖【3 3 】报道了用酸水解黄芩苷制备黄芩素。制备方法为：称取黄芩苷置于烧 瓶中，加入蒸馏水和浓硫酸，摇匀，加热回流4h ，抽滤并收集滤液，用1 0 0m l 、5 0m l 、 5 0m l 乙醚萃取三次，合并萃取液，水浴蒸干，即得黄芩素。实验中用四因素三水平 正交试验对水解的溶媒用量、酸用量、制备时间和萃取次数进行了考察，采用聚酰胺 薄膜层析法进行定性检测和高效液相色谱法定量检测。该方法具有工艺相对简单，制 备率高等特点。 1 4 黄芩素的化学修饰 随着中药中微量元素研究的逐渐深入，人们也逐渐意识到中药中的有效成分与微 量元素相互作用的重要性，因为它对于正确理解微量元素及中药有效成份的生理过程 具有重要意义。这种观点正是基于大量业已证明的金属离子是通过金属配合物在生命 体内发生作用而形成的f 3 4 ，3 5 j 。 黄芩素是黄酮类成分，化学结构上具有邻三酚羟基，性质很不稳定，容易被氧化 而由黄色变为绿色而失去生物活性，不能制成相应的制剂，使其临床应用意义不大。 因此，可以通过改变黄芩素的分子结构，通过和金属形成配合物，从而达到提高化学 结构的稳定性，且比天然产物黄芩素具有更好的治疗疾病的效果。很多文献中均提到 黄芩素及其他黄酮类化合物与某些金属形成的配合物具有比原黄酮单体更多的优点， 甚至可以产生新的药理作用【3 昏3 8 】，所以对黄芩素的金属配合物的合成和表征方法的研 究是中药现代化中很重要的一个方面。 黄芩素由于特殊的化学结构使其脂溶性和水溶性均较差，为了提高其生物利用 度，人们利用各种手段提高其脂溶性和水溶性，最常用的方法就是对原物质进行化学 结构改造。研究发现，经改造后的物质不仅生物利用度提高，而且很好的保留原物质 的生物活性，甚至产生新的药效。 4 第一章文献综述 1 4 1 黄芩素金属配合物 近几年，随着配位化学的快速发展，对生物复杂体系研究的深入，以及许多新型 功能材料配合物的陆续合成，人们对含有两个以上金属的桥连配合物，特别是对这些 配合物中金属离子之间的相互作用以及对配体的协同影响的研究日趋重视。黄芩有抑 菌，抗炎，抗变态反应等药理作用。某些微量金属本身有一定的生理活性，而某药物 若转化为金属配合物则有可能增强其疗效，甚至可以产生新的药理作用。因此常以黄 酮类化合物及其衍生物作为配体与金属离子形成配合物，以改善黄酮体的化学性质及 物理性能，提高其利用度。 目前，黄芩的成份中，黄芩素的金属配合物药理研究并不多，但其有用性是显而 易见的。陈力群等人3 7 1 和王玉天【3 8 1 对其合成的黄芩素锌配合物进行了药效研究，具体 如下：取黄芩素锌配合物5 0g ，粉碎，装胶囊2 5 0 粒。每日口服2 3 次，每次3 4 粒，将该药用于治疗高血压1 0 0 例( 4 日为一个疗程，连服3 个疗程) ，有效率9 5 ， 未发现副作用：治疗动脉硬化3 6 例( 1 5 日为一个疗程，连服3 个疗程) ，有效率9 4 ， 未发现副作用；治疗过敏性皮炎3 0 例( 3 日为一个疗程，连服3 个疗程) ，有效率 1 0 0 ，治愈率9 7 ，未发现副作用；治疗咽喉炎8 0 例( 3 日为一个疗程，连服3 个 疗程) ，有效率1 0 0 ，未发现副作用。从临床观察证明，本药疗效显著，无毒副作 用，具有良好的降压，改善动脉血管，抗炎和抗过敏等作用。此外，市场上早在十几 年前已出现了黄芩素铝胶囊，其药性稳定，治愈效果好，是一种常用药。 黄芩素金属配合物的合成是研究黄芩素金属配合的重要方面，目前已有黄芩素 锌、铜配合物和铝胶囊的合成报道。陈力群【3 7 1 报道的黄芩素一锌配合物的合成方法为： ( 1 ) 在黄芩素中，加入黄芩素重量2 0 倍左右的水，使其混悬，再慢慢滴加饱和碳酸 氢钠，使黄芩素全部溶解，得到p h 值为6 5 7 o 的溶液，然后在溶液中滴加饱和锌 盐溶液( 3 2 1 0 0 m 1 ) ，此时产生大量砖红色沉淀，直至滴加最后一滴醋酸锌溶液无 沉淀生成为止，将其在6 0 以下干燥即得到黄芩素锌。( 2 ) 在黄芩素中加入1 0 0 2 0 0 倍黄芩重量的2 0 9 0 甲醇水溶液或纯水溶液，使其溶解，再慢慢滴加等摩尔 的锌盐2 0 9 0 甲醇水溶液或乙醇水溶液，边滴加边搅拌，回流4 0m i n ，产生大量 砖红色沉淀，过滤，收集沉淀物，用蒸馏水洗涤沉淀物直到无锌离子为止，然后在6 0 下干燥即得到黄芩素一锌配合物。 方秋霞等人【3 9 】报道的黄芩素一铜配合物合成方法为：将1m m 0 1 的h 3 l 溶于7 0 m l6 0 的甲醇溶液中，加热搅拌下缓慢滴加含0 5m m 0 1 的c u c l 2 2 h 2 0 的6 0 甲醇 溶液，有棕红色沉淀析出，继续搅拌3h ，趁热过滤，依次用6 0 的甲醇、丙酮洗涤数 次，在5 0 下烘干至恒重，即得产品。 丛培月等人【柏，4 1 】合成了黄芩素一铝( i i i ) ，并制备成胶囊。取黄芩素o 2g ，置坩 埚中，灰化后加硫酸使之湿润，加水约5m l ，水浴加热使其溶解，过滤，取滤液加铝 5 北京化工大学硕士论文 试剂2 滴，水浴中温热，加氨试剂至有氨臭，再滴加碳酸铵试液，即出现红色絮状沉 淀。 此外黄芩素与过渡金属配合物的合成也有报道 4 2 】，国外学者j a n u s zp u s z 【4 3 ，删也报 道了其他黄酮类金属配合物的合成方法。 由以上综述可知，黄芩素金属配合物的合成方法相对较方便，部分配合物也表现 出良好的药效，将是一类很有前途的药物。目前，黄芩素金属配合物的确切分子结构， 配合物在某些方面表现出比黄芩素单体更高的活性，是否源于黄芩素与金属离子产生 的协同作用，还有待于进一步研究。此外，黄芩素配合物的生物药剂学和药代动力学 方面的研究还需开展。 1 4 2 黄芩素的结构修饰 黄芩素是具有明显的抗炎、抗氧化、抗肿瘤等活性的黄酮类化合物，由于黄芩素 分子结构的限制，其脂溶性和水溶性均较差，导致其在临床应用中存在一些弊端，生 物利用度不高。增加黄芩素的脂溶性和水溶性，提高其生物利用度是黄芩素研究的一 个重要方面。有人曾利用物理的方法来改善他们的溶解度。蔡玉珉等【4 5 】用乳糖共研磨 法提高了大豆苷元的溶出度。郑俊民等【4 6 】制备了大豆苷元- p o l o x 锄e r 共沉淀物，可以 显著提高大豆苷元的体外溶出度，具有一定的实用性。刘玉兰等【4 7 】以p v p 作载体将大 豆苷元做成一种新型剂一大豆苷元固体分散物。这些方法都不同程度地解决了一些问 题，但未从根本上解决黄酮体的溶解度问题。 黄酮类化合物具有多个苯环和酚羟基结构，其中a 环的c 6 、c 8 为亲核反应中心， 8 位的亲核活性高于6 位。b 环常含有邻位酚羟基结构，酚羟基是活泼的h 供体。黄 酮及黄酮醇类c 4 位上有一个羰基，羰基可强烈地减少a 环的亲核性质。黄酮体分子 中心的a 、p 不饱和吡喃酮是具有各种生物活性的关键，7 o h 糖苷化和2 ，3 位双键 氢化均易引起黄酮类生物活性的降低，而a 、b 、c 、三环上的各种取代基则决定了 黄酮体特殊的生理功能。这些特殊的结构及不同取代基的相对活性决定了其化学修饰 方法，即可以通过酯化、醚化、酰基化等进行衍生化【4 引。 迄今为止，黄酮类化合物的合成和结构改造工作已取得了很大的进展【4 9 5 0 ，5 1 1 。日 本学者a k 锄a 等【5 2 】在寻找抗乳腺癌的药物时，合成了1 6 种新5 一氨基黄酮衍生物。1 9 9 6 年波兰药用植物研究所改进水飞蓟素( s i l y m 撕n ) 被胃肠道吸收差的缺点，合成了亲 脂性的复合物( s i l i p i d e ) ，其保肝效果优于水飞蓟素。c u s h m a n 等对槲皮素进行化学 结构改造，以槲皮素为先导化合物合成了一系列的黄酮衍生物，经筛选，发现4 氨 基6 羟基黄酮是蛋白酪氨基酸激酶( p t k ) p 5 6 1 c k 的高选择性抑制剂，其作用强度比 槲皮素约高一个数量级【5 3 ，5 4 】；合成的水溶性槲皮素二硫酸酯二钠，有较强的抗血小板 作用【5 5 】。有人以中药广豆根酮( s o p h o r a d i n ) 为先导化合物，合成了一系列衍生物， 发现s o p h a r c o n e 具有比s o p h o r a d 访更好的疗效。 6 第一章文献综述 目前黄酮类化合物化学修饰主要是通过酯化，改变其脂溶性较差的弱点，但反应 选择性差，反应过程中往往结合或屏蔽黄酮类化合物的主要官能团一酚羟基，虽然增 加了其脂溶性，但降低了物质本身的抗氧化效果【5 6 5 引，降低了某些药理活性。近年来 陕西师范大学的张尊听教授在提高黄酮类物质的水溶性方面做了大量的研究工作，他 通过磺化反应合成了数种黄酮类物质的磺酸盐【”啦】，并通过单晶对磺化物质进行了表 征，同时还对部分磺化物质进行了药理活性研究【6 毛川。 尽管如此，黄酮体有效的化学修饰方法的研究还非常欠缺，加强其化学修饰方面 的研究，得到生理活性更强、实用价值更大的化合物，已成为黄酮类化合物研究与利 用的一个重要方向。 1 5 本课题的研究目的和意义 随着中药现代化的进行，中药有效成分的提取、分离、改性及新药效的研究已经 成为该领域不可缺少的重要部分。 天然产物研究中，由于物质种类繁多，物质的纯化一直是一项繁琐的工作。黄芩 素作为黄芩中的主要活性物质，随着研究的深入和拓宽，为得到更精确的实验结果， 对原料纯度的要求亦越来越高。寻找一种简便、可行的工艺制备高纯度黄芩素，对黄 芩素的进一步研究将起到重要推动作用。本文利用黄芩苷与黄芩素结构相似的特点， 通过酸解黄芩苷得到黄芩素，经硅胶柱层析和聚酰胺柱层析，重结晶得到高纯度黄芩 素，整个工艺简单易行，为实验室制备高纯度黄芩素提供了一条途径。 物质与金属配合后除能发挥配体和金属离子本身的药效外，同时也可能产生新的 疗效。中药和金属相结合形成的配合物将是一类很有前途的药物，也是中药现代化进 程中的重要组成部分。黄酮类物质与金属离子的配合一直是中药金属配合物研究的热 点。黄芩素作为黄芩中的重要活性物质，其铝配合物早在上世纪八十年代就被用于临 床，同时其他金属的配合也一直倍受关注。铁、钻、镍作为人体重要元素，对人体机 能的正常运作起着重要作用。本文将黄芩素与铁、钴、镍进行配合反应，得到了三者 的黄芩素金属配合物，并对其进行了表征，研究结果对中药开发具有一定的参考价值， 对新药的制备提供了一种新思路。 黄芩素具有黄酮类物质的特征结构，其水溶性和脂溶性均不理想，在临床应用中 存在生物利用度低、吸收差、显效慢等缺点，一定程度上影响了黄芩素的研究进度。 提高黄芩素的生物利用度，提高其水溶性和脂溶性是研究黄芩素的一个重要课题。为 了提高黄芩素的水溶性，本文利用磺化反应成功的合成了黄芩素一3 ，7 一二磺酸钠， 明显的提高了黄芩素的水溶性，对其抗羟基自由基活性研究发现活性理想。磺化产物 的成功合成对黄芩素及其他黄酮类物质水溶性的改进提供了借鉴，具有广泛的应用价 值。 7 北京化工大学硕士论文 1 6 本课题研究的主要思路 以天然有机化合物为先导，利用半合成法对其进行结构修饰和改性是发现新疗效 成分和新药开发的一个重要途径，黄芩素作为中药黄芩中的主要有效成分，具有多种 药理活性，对其制备和结构修饰也是中药现代化的重要研究内容。 本课题研究的总体思路为：( 1 ) 高纯度黄芩素的制备。利用黄芩苷在强酸、加热 条件下不稳定易水解生成黄芩素和葡萄糖醛酸的性质，建立了由黄芩制备高纯度黄芩 素的方法，即先从黄芩中提取黄芩苷，经水解黄芩苷得到黄芩素粗品，再经硅胶和聚 酰胺柱层析纯化，得高纯黄芩素，该方法简便可行。( 2 ) 黄芩素的化学结构修饰。对 从黄芩中提取制备的黄芩素进行化学修饰，首先合成了黄芩素与f e 、c o 、n i 三种金 属的配合物。在配合物合成中，用正交实验确定合成配合物的最佳条件，并采用红外、 紫外、热重和差热等分析方法对最佳条件下的配合产物进行表征。( 3 ) 为了改进黄芩 素的水溶性，我们利用磺化反应，对黄芩素进行磺化处理，得到了水溶性较好的黄芩 素磺化物，即黄芩素一37 ，7 一二磺酸钠。为了了解磺化产物的药理活性，比较了磺化 产物与黄芩素和黄芩苷的抗羟基自由基活性。 本课题对高纯度黄芩素的制备、化学修饰及药理活性评价进行了系统研究，为开 发生物利用度更高的黄芩素药物提供了方法，研究结果具有一定的理论意义与实际应 用价值。 8 第二章高纯度黄芩素的制备研究 第二章高纯度黄芩素的制备研究 黄芩素是中药黄芩的有效成份之一，具有抗h i v 【1 4 】，抗肿瘤【2 0 1 ，抗氧化和清除自 由基等【6 5 】药理活性。黄芩中黄芩素的含量只有0 0 4 0 2 8 【2 9 】，其制备难度较大，目 前报道的有酶解法等【3 0 3 1 1 。随着黄芩素研究的深入和拓宽，为得到更精确的实验结果， 对原料纯度的要求也越来越高。寻找一种简便、可行的工艺制备高纯度黄芩素对黄芩 素的进一步研究将起到重要推动作用。黄芩苷是黄芩中含量较高的主要有效成份，药 典规定其在黄芩中的含量不得低于9 【l 】。研究发现黄芩苷在抑制h i v - 1 活性及细胞 毒性【3 】，清除自由基和抗氧化性【4 ，6 6 】等方面的活性均弱于黄芩素。药物代谢研究也表 明，黄芩苷在消化道内很难被直接吸收，而黄芩素吸收较快，生物利用度优于黄芩 苷【6 7 1 。本文利用黄芩苷在强酸、加热条件下不稳定易水解生成黄芩素和葡萄糖醛酸的 性质，建立了由黄芩制备高纯度黄芩素的方法，即先从黄芩中提取黄芩苷，经水解黄 芩苷得到黄芩素粗品，再经硅胶和聚酰胺柱层析纯化，得高纯黄芩素。所述方法为高 纯度黄芩素的制备提供了一条简便可行的途径。 黄芩素( b a i c a l e i n ) ，分子式为c 1 5 h l 0 0 5 ，分子量2 7 0 ，结构式为： 黄芩苷( b a i c a l i n ) ，分子式为c 2 l h l 8 0 l l ，分子量为4 4 6 ，结构式为： 2 1 实验部分 2 1 1 主要仪器与试剂 烈坂r a r 3 7 0 傅立叶变换红外光谱仪( 美国n i c o l e t 公司) u 3 0 1 0 紫外可见分光光度计( 日本h i t a c h i 公司) 9 北京化工大学硕士论文 a u 6 0 0 核磁共振光谱仪( 德国b m l ( e r 公司) l c 1 1 0 0 系列液相色谱仪( 美国a g i e m 公司) a b 2 0 4 悄型电子天平( 瑞士m e m e r 公司) 电动搅拌器( 杭州仪表电器厂) s h z - 型循环水真空泵( 上海亚荣生化仪器厂) c s 5 0 1 - s p 超级数显恒温器( 重庆四达实验仪器厂) d z f 3 型真空干燥箱( 上海福玛实验设各有限公司) 黄芩( 购于北京中医药大学国医堂，产自内蒙古) 黄芩苷和黄芩素标准品( 中国药品生物制品鉴定所) 薄层色谱硅胶预制板( 中国烟台化学工业研究所) 柱层析硅胶( g f 2 5 4 6 0 型，中国青岛海洋化工集团公司) 柱层析聚酰胺( 1 0 0 2 0 0 目，浙江台州路桥四甲生化塑料厂) h p l c 用甲醇为色谱纯，磷酸为优级纯，其他试剂均为分析纯，水为去离子水 2 1 2 实验方法 2 1 2 1 黄芩苷的提取 称取已干燥黄芩粉末l o og ，依次用1 0 倍和8 倍量的水煎煮2 次，每次1h ，过 滤，合并滤液。滤液用h c l 调节p h 至i 2 ，于3 5 3k 下保温静置o 5h ，离心收集 沉淀。沉淀中加入适量水，充分搅拌，用4 0 n a o h 调p h 至7 ，过滤，收集滤液。 滤液用h c l 调节p h 至1 2 ，于3 5 3 k 下保温o 5h ，离心收集沉淀，将沉淀分别用去 离子水、5 0 乙醇、9 5 乙醇洗涤。沉淀于3 3 3k 真空干燥2 4h ，得黄芩苷样品。 2 1 2 2 黄芩苷的水解 称取所制黄芩苷2g 于2 5 0m l 圆底烧瓶中，加入2 0 盐酸水溶液1 0 0 向，于3 7 3 k 水浴中，在搅拌下反应1 5h ，t l c 跟踪反应进程( 展开剂为乙酸乙酯：丁酮：乙酸： 水= 1 0 ：7 ：5 ：3 ) 。反应结束，将反应液倾入3 0 0m l 去离子水中，黄芩素立即析出，然 后于砂心漏斗减压抽滤，用去离子水洗至中性，常温真空干燥2 4h ，得黄芩素粗品。 2 1 2 3 黄芩素的提纯 将黄芩素粗品5 0 0m g 溶于少量甲醇中，与1 6g 硅胶混匀，于通风厨中挥去溶剂。 将干燥的黄芩素硅胶混合物加入硅胶柱上部( 柱高4 0c m ，体积约5 0m 1 ) ，用石油醚 一乙酸乙酯一乙酸( 5 ：3 ：o 1 ，v v ) 淋洗，台并相同组分，旋蒸回收溶剂。称取经 硅胶柱提纯的黄芩素8 7m g ，用少量甲醇溶解并与少量聚酰胺混匀，干燥后加入聚酰 胺柱上部( 柱高2 5c m ，体积约3 0 “) ，依次用不同体积比的乙醇一水溶液淋洗： 3 ：1 0 ，1 0 0 叫：4 ：1 0 ，5 0m l ；5 ：1 0 ，5 0m l ；6 ：1 0 ，1 0 0m 1 ；合并相同组分，挥去溶剂 i o 第二章高纯度黄芩素的制各研究 后，再用乙醇一水重结晶，得黄芩素纯品。 2 1 2 4 黄芩素的鉴定 将提纯后的黄芩素与黄芩素标准品分别进行紫外、红外、核磁和高效液相色谱分 析；用紫外、红外和核磁共振光谱法表征其结构，用高效液相色谱法鉴定其纯度。液 相色谱条件为：d i 锄o n s i lt mc 1 8 柱( 1 5 0 4 6i i 姐) ，流动相为甲醇( a ) 与0 3 磷酸( b ) 混合溶剂，采用梯度洗脱( o 7m m ，a ：4 0 5 ，b ：6 0 9 5 ；7 1 0m i n ， a ：5 ，b ：9 5 ) ，流速为1 0m l m i n 。采用紫外检测器，检测波长为2 7 5i 1 1 ，样品 浓度为1 5 2p 咖l ，标准品浓度为2 8 4 肛咖l 。 2 2 结果与讨论 2 2 1 黄芩苷的表征 将经酸沉碱溶法制得的黄芩苷进行红外光谱分析( k b r 压片) ，如图2 1 所示。 图中，3 5 5 2 、3 4 8 8 和3 3 9 3c m d 为黄芩苷分子5 、6 位羟基及糖醛酸上羟基的伸缩振动 峰，1 7 2 6c m 1 为糖醛酸的羰基伸缩振动峰，1 6 5 9c m 1 为黄芩苷分子4 位羰基的伸缩 振动峰，1 6 0 8 、1 5 7 2 和1 4 9 3c m 1 为黄芩苷骨架碳碳双键伸缩振动峰；通过与黄芩苷 标准品的红外谱图对照【6 引，两者完全一致，证明提取后的产物为目标物黄芩苷。采用 高效液相色谱法对所制黄芩苷进行分析( 见图2 2 ) ，色谱条件同黄芩素的定量分析， 测得其纯度约为9 2 ( n = 3 ) 。实验中，由1 0 0g 黄芩提取到的黄芩苷为4 5 4g ，按照 药典规定的黄芩中黄芩苷的含量不低于9 计算，本实验黄芩苷的提取率约为5 0 4 4 。 3 0 0 02 0 0 0 w _ v e l e n g t h ( c m 。1 ) 图2 1 黄芩苷的红外光谱 f i g u r e2 一l t h ef t - i rs p e c t n j n lo fb a i c a l i n 1 l 北京化工大学硕士论文 b a i c a i i n 一一 o246 8 r e 协n t i o nt i m ei m i n l 图2 - 2 黄芩苷的船l c 谱图 f i g u r e2 2 t h eh p l cc h r o m a t o g 姗o f b a i c a l i n 2 2 2 黄芩苷水解条件的优化 由黄芩制取黄芩素的关键环节是黄芩苷的水解，本文分别采用盐酸、硫酸和磷酸 为催化剂进行黄芩苷水解，在其他条件相同情况下，t l c 跟踪反应至完全，3 0 磷酸 需4 天以上，3 0 硫酸需7 5h ，而2 0 盐酸只需1 5h ，故本文选择盐酸为黄芩苷水 解的催化剂。为找到最佳的水解工艺条件，我们采用l 9 ( 3 4 ) 正交实验表对黄芩苷的 水解条件进行优化，正交试验因素与水平的选择，如表2 1 所示。 表2 1 因素水平表 1 a b i e2 1f a c t o rl e v e it a b l e 1 2 第二章高纯度黄芩素的制各研究 采用l 9 ( 3 4 ) 正交实验表对黄芩苷水解条件进行了优化，实验结果如表2 2 所示。 表2 2l 9 ( 3 4 ) 正交试验表及实验结果 i a b l e2 2t h ea r r a n g e m e n ta n da n a l y s i so fl 9 ( 3 4 ) o r t h o g o n a le x p e r i m e n t 将表2 2 的实验结果进行方差分析( 见表2 3 ，表2 4 ) ，发现黄芩苷水解过程中 温度和酸浓度是影响反应时间的主要因素。由于采用的是完全反应形式，所以各条件 下的反应产率都比较理想。综合考虑反应时间与产率两项评价指标，可得到黄芩苷的 最佳水解条件为：盐酸浓度为2 0 ，黄芩苷在2 0 盐酸水溶液中的浓度为2 ( m ) ， 反应温度为3 7 3k ，反应时间为1 5h 。在此最佳条件下按实验方法进行4 次平行实验， 实验结果如表2 5 所示。 北京化工大学硕士论文 表2 - 3 反应时间的方差分析结果 t a b l e2 3t h er e s u l to f ft e s tf o rr e a c t i o nt i m e 表2 5 最佳条件下的实验结果 t a b l e2 5t h ee x p e r i m e n t a lr e s u i t si nt 1 1 eo p t i m u mc o n d i t i o i l s 由表2 5 的实验结果可见，在所选最佳条件下测得黄芩苷的水解产率为8 9 8 6 ， r s d 为4 3 8 ( n = 4 ) 。由此可见，黄芩苷经酸水解制备黄芩素是可行的，在反应过 程中黄芩素是相对稳定的，诸多文献都报道了黄芩素的不稳定性。由黄芩素的结构可 知，黄芩素的不稳定主要是因为结构中的酚羟基不稳定所致，酚羟基在碱性溶液中不 稳定，但酸性溶液中呈稳定状态，固本文采用的酸水解不会对黄芩素造成明显损失， 也不会对黄芩素的结构造成破坏，这一点可从我们对产物的光谱表征结果得以证实。 1 4 第二章高纯度黄芩素的制备研究 另外，从姚亚红【6 9 1 和赵春颖【3 3 】两篇文献也可以得到佐证，文献中都论及了温度、光和 p h 对黄芩素稳定性的影响，结论为：光照和p h 对黄芩素的稳定性影响较大，所以在 黄芩素制备、分离操作过程中，以及黄芩素制剂的储存中j 越尽量避光；在酸性条件下， 加热对黄芩素的稳定性影响较小；在碱性条件下，黄芩素的稳定性较差，因此，在黄 芩素的制备过程中应避免使用碱性溶剂。 2 2 3 黄芩素的纯化与鉴定 在硅胶柱层析分离纯化过程中，共收集到四个组分，其中第三个为主要组分，因 其他三个组分含量都很低，故未对其进行表征，推断这三个组分可能是黄芩苷中所带 杂质( 见黄芩苷色谱图，图2 2 ) 及水解反应的副产物。将分离