（发育生物学专业论文）肝癌细胞中stat3的功能初步研究.pdf

y8 0 2 0 7 幺 学位论文独创性声明 本人郑重声硬： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声昵并表示 了谢意。 作者签名：捣i ! 氢盘 日 期：2 1 1 堑笠目9 d 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索：有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：生西幽燃 日 期：匹堡羔朗且 硕士学位论文摘要 摘要 肝癌是我国高发性恶性肿瘤，分布广，转移率高，其发生的分子机制尚不 是很明确。目前，从信号传导途径来研究与治疗癌症已成为癌症治疗的新兴领域。 细胞因子通过与细胞上的特异性受体相结合，激发一系列的信号传导途径，并引 起下游相关基因的表达，从而影睛细胞乃至组织的生物学功麓效应。现有研究揭 示，许多癌症的发生与细胞内相关信号途径的异常激活或者失活相关。 s t a t ( s i g n a lt r a n s d u c e ra n da c t i v a t o ro ft r a n s c r i p t i o n ) 是存在于细胞 质中的一类潜在的信号转导与转录激活因子。作为信号转导与转录激活因子，这 类蛋白在细胞信号传递中起着承上启下的作用，在细胞的生长、存活、增殖和分 化中起着非常重要的作用。研究表明，s t a t 3 的持续激活与许多肿瘤和癌症相关， 如黑色素瘤、骨髓瘤、急慢性白血病、头颈癌、乳腺癌、前列腺癌、小细胞癌等。 本文选取了信号转导和转录激活因子s t a t 3 为研究对象，研究了肝癌细胞 e l 一7 4 0 2 中s t a t 3 的异常活化及其对细胞迁移的作用，并研究了肝癌细胞h e p g 2 中s t a t 3 途径与w n t 信号途径中b - c a t e n i n 的相互关系以及尝试用s t a t 3r n a 干扰方法研究s t a t 3 的功能，试图在细胞水平上研究寻找治疗肝癌的方法。 1 成功构建了绿色荧光蛋白( g f p ) 标记的s t a t 3 野生型( w t ) 突变 体( c y f ) 融合质粒，将其转入细胞，以荧光素酶报告系统验证了融合蛋白的活性； 通过测定绿色荧光为标记的细胞迁移距离的方法证实，过表达野生型s t a t 3 对肝 癌细胞系b e l 一7 4 0 2 细胞迁移有促进作用，而突变体s t a t 3 能够降低癌细胞的迁 移。 2 利用细胞的免疫组化双色染色和蛋白免疫沉淀的方法证实s t a t 3 与 且- c a t e n i n 可以形成复合物，随着细胞密度的增加，s t a t 3 与野生型b c a t e n i n 形成的复合物含量减少。但利用荧光素酶活性分析方法发现s t a t 3 对p c a t e n i n 转录激话活性没有明显的影响。实验表明，s t a t 3 信号途径与b c a t e n i n 信号 途径之阆很有可能存在着一定的内在联系。 3 用腺病毒载体构建了可持续表达s t a t 3r n a i 双链r n a 短片段的腺病 毒a d e a s y h 1 一s t a t 3 i ，以w e s t e r nb l o t t i n g 来研究它的r n a 抑制效果，试图以基 硕士学位论文 摘要 因敲除方式来研究由s t a t 3 异常表达引起的肝癌的基因治疗新方法。 关键词肝癌信号转导和转录激活因予s t a t 3 b e l - 7 4 0 2 迁移 b c a t e n i n 腺病毒载体 r n a i a b s t r a c t h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ( h c c ) i st h em a j o rp r i m a r ym a li g n a n tt u m o r i nt h eh u m a nl i v e r b u t t h em o l e c u l a rc h a n g e s l e a d i n gt ol i v e rc e l l t r a n s f o r m a t i o nr e m a i nl a r g e l yu n k n o w n c y t o k i n e se v o k eas e r i e so fs i g n a l p a t h w a y st h r o u g hb i n d i n gt ot h e i rr e c e p t o r s a n dt h e ya l s oa c t i v a t et h e e x p r e s s i o n o fs o m ed o w n - s t r e a mg e n e s c o n s e q u e n t l y ，s o m eb i o l o g i c a l f u n c t i o n a le f f e c t sa p p e a r m a n yr e s e a r c h e sr e v e a lt h a t t h e r ea r e r e l a t i o n sb e t w e e nc a n c e r sa n da b e r r a n ta c t i v a t i o no ri n a c t i v a t i o no f s i g n a lp a t h w a y si nc e l l s s t a t ( s i g n a lt r a n s d u c e r a n da c t i v a t o ro ft r a n s c r i p t i o n ) p r o t e i n s t r a n s d u c es i g n a l sf o rv a r i e t i e so fc y t o k i n e s t h e yp l a yi m p o r t a n tr o l e s i nc e l lg r o w t h ，l i v i n g ，p r o l i f e r a t i o n ，d i f f e r e n t i a t i o n ，a n t i a p o p t o t i c a n dt r a n s f o r m a t i o n c o n s t i t u t i v e l ya c t i v a t e ds t a t 3i sf o u n di nm a n y c a n c e r s ，i n c l u d i n gm e l a n o m a ，b r e a s tc a n c e r ，h e a da n dn e c kc a n c e r ，i m p l y i n g t h ec r i t i c a lr o l eo fs t a t 3i nt u m o r g e n e s i s t ou n d e r s t a n dt h ee f f e c t so fs t a t 3 ，w es t u d i e dt h ea b e r r a n ta c t i v a t i o n o fs t a t 3i nb e l - 7 4 0 2c e l ll i n ea n dt h ei n f l u e n c eo nt h em i g r a t i o no fc e l l s ， s o m er e l a t i o n sb e t w e e ns t a t 3a n dp c a t e n i n ，a l s ot h ei n f l u e n c eo fs t a t 3 r n ai n t e r f e r e n c e 。s oa st ot r yt os e a r c ht h ew a yt ot r e a tt h eh c c w es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dt h ef u s i o ng e n e s o fs t a t 3 ( w i l d t y p e m u t a n t ) a n d6 f pt os t u d yt h ef u n c t i o no fc o n s t i t u t i v e l ya c t i v a t e d s t a t 3i nb e l - 7 4 0 2c e l l b ym e a s u r i n gt h em i g r a t i o no ft h ec e l l sl a b e l e d 2 硕士学位论文 摘要 b yg f p s t a t 3 ( w t c y f ) ，w ep r o v e dt h a to v e r e x p r e s s i o no fs t a t 3 ( w t ) c o u l d a u g m e n tt h em i g r a t i o no f b e l - 7 4 0 2c e l l s ，w h i l es t a t 3 ( c y f ) c o u l dd e c r e a s e t h em i g r a t i o n w ed e m o n s t r a t e dt h a te n d o g e n o u sb c a t e n i nc o u l d c o i m m u n o p r e c i p i t a t ew i t he n d o g e n o u ss t a t 3i nh e p g 2c e l ll i n e ，a n dt h e i m m u n o p r e c i p i r a t i o n w a sd o w n r e g u l a t e dw i t ht h ei n c r e a s eo fc e l l d e n s i t y s o ，t h e r ew o u l db ec e r t a i nc r o s s t a l kb e t w e e ns t a t 3p a t h w a ya n d 骱盯p a t h w a y b u tn os y n e r g i z e da c t i v a t i o no ft h et w op a t h w a y sw a s d e t e c t e d a tt h es a m et i m e ，w ec o n s t r u c t e dt h er e c o m b i n a n t a d e n o v i r u s a d e a s - y - h l s t a t 3 iw h i c hc o u l dc o n s t i t u t i v e l ye x p r e s ss h o r t d o u b l e s t r a n d e dp o l y n u c l e o t i d e sf o rs t a t 3r n ai n t e r f e r e n c e t h e e f f i c i e n c yw a sd e t e c t e dv i aw e s t e r nb l o t t i n g a st h ea i mo ft h e e x p e r i m e n t s ，w et r i e dt of i n dn e wg e n et h e r a p ym e t h o d sf o r1i v e rc a n c e r b yg e n ek n o c k - o u t k e yw o r d sh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ( h c c ) s t a t 3 ( s i g n a lt r a n s d u c e r a n da c t i v a t o ro ft r a n s c r i p t i o n ) b e l 一7 4 0 2m i g r a t i o n b c a t e n i na d e n o v i r u ss y s t e m r n a i 3 硕士学位论文第一章综述 第一章综述 第一节s t a t 结构与功能研究进展 s t a t ( s i g n a lt r a n s d u c e ra n da c t i v a t o ro ft r a n s c r i p t i o n ) 为一类存在 于胞浆中的信号转导和转录激活因子。1 9 9 1 年，f u 等从复合物i s g f 3 中纯化鉴 定出第一个s t a t 蛋白s t a t l 。其后，s t a t 蛋白家族相继被克隆出来。目前， s t a t 家族共有7 个成员被发现，包括s t a t i ，s t a t 2 ，s t a t 3 ，s t a t 4 ，s t a t 5q ， s t a t 5b 和s t a t 6 。人的s t a t 家族的定位见表l l 。 f a m i l yc h r o m o s o m a l c y t o i d n e p h o s p h o d b t i o n n u m b e t l o c a l i z a t i o n a c d v a t i o n s i t e s t a t l 2 q 1 2 - 3 3 i f n s , i l - 6 1 1 r r 7 0 1 s e r 7 2 7 s t a t 212 q13 14 , 1 i f n s t y r 6 8 9 t y r 7 0 5 ，s e r 7 2 7 s t a t 4 2 q l 2 - 3 3i l - 12 , 1 f nt y r 7 2 2 , s e r 7 2 2 s t a t 5 a17 q 11 , 2 2 2p r l , g h ，e p ot y r 6 9 4 , s e r 7 2 6 s t a t s b17 q 11 , 2 - 2 2p r l ，g 心e p ot y r 6 9 4 , s e r 7 31 s t a t 612 q 13 - 14 ，1i m i l - 1 3 t y r 6 4 1 表卜1 人的s t a t 家族的定位及磷酸化位点。1 1 s t a t 蛋白家族成员结构 1 1s t a t 蛋白家族成员结构 4 硕士学位论文 第一章综述 s t a t 家族成员编码基因在染色体上紧密连锁，这些基因在小鼠中的遗传定 位是：s t a t l 和s t h t 4 在1 号染色体上，s t a t 2 和s t a t 6 在l o 号染色体上，s t a r 3 ， s t a t 5 和s t a t 5b 在1 l 号染色体上0 1 。s t a t 蛋白成员起始7 0 0 氨基酸内，有 2 8 - 4 0 的氨基酸序列是一致的，7 0 0 个氨基酸之后的序列变化较大。 s t a t 蛋白有几个保守的结构和功能域： a 氨基端结构域( a m i n o - t e r m i n a ld o m a i n ) ，具有高度的保守性，s t a r 蛋 白的二聚体通过此结构域形成四聚体，增强s t a t 与启动子d n a 的结合能 力“同 b ，螺旋结构域( c o i l e d - c o i ld o m a i n ) ，从约1 3 0 位氨基酸残基开始，由一 段螺旋组成，主要参与s t a t 蛋白与其他蛋白相互作用“3 。 c d n a 结合区( d n ab i n d i n gd o m a i n ) ，约位于第4 0 0 5 0 0 位氨基酸间，高 度保守，主要是与目的基因的启动子结合，启动目的基因转录。多数s t a t 的d n a 结合序列是t t g n n n c a a ，其中s t a t l 、8 t a t 3 和s t a t 4 核心序列为 t t c c ( c g ) g g a a o 。”。 d s h 2 功能区( s r ch o m o l o g y 2d o m a i n ) 位于s t a t 第6 0 0 7 0 0 位氨基酸之 间，高度同源，是一个潜在的磷酸化酪氨酸激活区，主要功能：1 动员 s t a t 参与形成受体复合物：2 介导j a k - s t a t 相互作用：3 介导一个s t a t 蛋白中的s h 2 结构域与另一个s t a t 蛋白中磷酸化的酪氨酸相互作用形成 二聚体，从而引起s t a t 蛋白的入核发挥功能4 1 。 e s h 3 功能区，位于5 0 0 - 6 0 0 位氨基酸之间，参与某些信号途径中的蛋白质 一蛋白质相互作用。 f t y r 位点，s t a t 蛋白的t y r 残基磷酸化与蛋白和d n a 结合活性高度相关。 s t a t 3 中t y r 残基磷酸化位点在t y r - 7 0 5 ，其他s t a t 蛋白分子具有类似位 点( 表1 - 1 ) 。s t a t 分子中的t y r 残基被j a k 或其他途径磷酸化后，可与 其它s t a t 分子中s h 2 功能域结合，形成二聚体入核发挥转录调控作用。 单一的s t a t 并不能发挥调控作用。s t a t 蛋自分子间除能形成同源二聚体 外，还能形成异源二聚体。 g 羧基端区域，也是转录活化区( t r a n s a c t i v a t i o nd o m a i n ) ，高度变异， 有的s t a t 蛋白转录激活功能于此区域有关，如s t a t ib 虽然在羧基端比 s t a t ia 只少3 8 个氨基酸，也可以被磷酸化并结合d n a ，但不具有激活基 s 硕士学位论文第一章综述 因转录功能嘲。s t a t i 与s t a t 3 的s e r 一7 2 7 的磷酸忧修饰作用能提高s t a t 的转录活化能力“”。 1 2s t a t 蛋白活化因子 s t a t 家族的活化依赖于各自分子内的t y r 残基的磷酸化。促使s t a t 蛋白活 化的因子包括( a ) 细胞园子，如i f n 、i l 、l i f 、催乳素等，与其受体结合后激 活j a k ( j a n u sp r o t e i n t y r o s i n ek i n a s e ) ，由j a k 磷酸化s t a t 中的t y r ，这是s t a t 的主要活化方式；( b ) 一些具有酪氨酸蛋白激酶活性的生长因子，如e g r 、p d g f 、 c s f - i 等，直接磷酸化s t a t ；( c ) 与g 蛋白偶联的血管紧张素受体，可能通过g 蛋白使s t a t 磷酸化1 。不同s t a t 一般具有不同的活化因子，s t a t i 主要由i f n d 、b 、y ，e g f 活化；s t a t 2 主要由i f n - q 、b 活化：s t a t 3 主要由 i l 一6 ，l i f ，c n t f ，o m ，c t 一1 ，g - c s f ，i l 1 0 ，l e p t i n ，e g f 活化s t a t 4 主要由i l 一1 2 活 化；s t a t 5 主要由p r o l a c t i n ，g h ，i l - 3 ，i l 一2 ，e p o ，i l 一5 ，g m - c s f 活化；s t a t 6 由 活化因子主要包括i l 一4 ，i l 1 3 。 2 。s t a t 的生物学功能 2 is t a t 的信号转导 在细胞因子作用下。受体形成同源或异源二聚体，使结合其上的j a k 积聚， 相邻近的j a k 相互交换磷酸根而活化，活化的弘k 引起胞浆区远膜端的酪氨酸磷 酸化。活化的受体或j a k 募集s t a t ，使s t a t 酪氨酸磷酸化而活化。同源或异源 的两分子s t a t 通过磷酸化酪氨酸与s h 2 功能区相互作用形成同源或异源二聚体， 二聚体迅速入核与d n a 相结合，启动相应基因表达0 2 1 如图卜1 所示： 6 硬士学位论文 第一章综述 图i - is t a t 信号途径的活化( 摘自a k i r asc 1 3 ) j a k 在s t a t 的激活中具有重要的作用，因此此信号通路被称为j a k - s t a t s 信号通路。一般来说，这种激活是瞬时的，一些细胞因子诱导的蛋白如s 0 c s 、 c l s j a b 或s s i 能通过直接结合到j a k 上来干扰s t a t 的信号转导“”而s t a t 蛋白 抑制剂p i a s ( p r o t e i ni n h i b i t i o n so fa c t i v a t e ds t a t s ) 与s t a t 直接结后抑 制s t a t 与d n a 的结合“4 2 2s t a t 蛋白功能及与肿瘤发生的关系 s t a t 作为一种重要的转录调节子，参与正常细胞对各种细胞因子的反应， 并介导多种生物学功能。目前研究揭示，s t a t 主要参与机体免疫应答和细胞增 殖与细胞转化的调控“”。不同的s t a t 基因敲除老鼠充分体现了s t a t 的重要性。 s t a t i 基因敲除小鼠没有发育上缺陷，但能引起细胞对i f nq 、i f ny 无反应，导 致小鼠对病毒和细菌先天性易感“8 ”1 。s t a t 2 基因敲除小鼠具有与s t a t i 敲除小 鼠类似的表型，没有i f nd 、i f nb 的反应。“2 “。s t a t 3 的敲除引起早期胚胎发 育的死亡”1 。s t a t 4 基因敲除小鼠的i l 一1 2 介导的淋巴细胞增殖、n k 细胞的细胞 毒反应缺失“3 “1 。s t a t 5 a 基因敲除破坏了小鼠的乳腺发育和泌乳功能“。s t a t 5 b 基因敲除小鼠出现肝脏中基因表达的性别二态性汹1 。s t a t 6 基因敲除小鼠丧失了 7 硕士学位论文 第一章综述 i l 1 4 介导的b 细胞增殖和成熟反应，同时t 细胞反应缓慢、分化受阻_ ”1 目前，在很多肿瘤和癌细胞中都发现有持续激活的s t a t 蛋白。进一步研究 表明，s t a t 蛋白能提高m c l - 1 ，b c l x 等抗调亡基因及c y c l i nd 1 2 、c - m y c 等细 胞周期调节蛋白的表达，促进了细胞的增殖和转化】“ 2 3 s t a t 信号途径与m a p k 信号途径 s t a t ( s t a t i 、3 、4 ) 在c 末端第7 2 7 位有一保守的丝氨酸残綦，被m a p k 磷酸 化后，能激活转录。m a p k 是r a s 途径的下游信号分子，具有丝氨酸苏氨酸蛋白 激酶活性，可激活c - f o s 、c - j u n 等转录因子，从而激活下游基因转录。在经i 型i f n 刺激过的细胞中，m a p k 与i n f r n 链相互作用而被活化，随之与s t a t i 相结合并促进其活性。当m a p k 的作用被阻断时，s t a t 促进基因转录的活性降低。 表明仅有的j a k 不足以最大限度激活s t a t 的转录活性，s t a t 可能还是m a p k 的 天然底物1 。d e c k e r 等。”研究s t a t 3 信号途径的调控中发现，e g f 激活e g f 受 体，e g f 受体通过r a c l 使m e k k l 活化，活化的m e k k i 进一步激活s r c 和j a k 活 化，j a k 又使s t a t 3 t y r - 7 0 5 磷酸化。i e k k l 也可激活下游e r k 和j n k ，而m e k k l 、 e r k 和j n k 均可使s 似t 3 s e r - 7 2 7 磷酸化，这样s t a t 3 的t y r 和s e r 残基均被磷 酸化。上述研究表明细胞中存在着m a p k - s t a t 这一信号传导的旁路或调节方式。 3 s t a t 3 的结构和功能 1 9 9 4 年，z h o n g 等以i s g f 3 ( i n t e r f e r o n s t i m u l a t e dg e n ef a c t o r3 ) 亚单 位p 9 1 8 4 ( s t a t l ) 基因中保受的s h 2 功能域d n a 为探针，在小鼠胸腺c d n a 文库 中筛选得到s t a t 3 ，并且n o r t h e r n 杂交的结果也表明，s t a t 3 在脑、心脏、肝脏、 睾丸、和胸腺中都有高水平表达。同时期，另有三个研究小组也分别克隆到s t a t 3 命名为a p r f ( a c u t ep h a s er e s p o n s ef a c t o r ) 。这四个研究小组研究表明s t a t 3 能被i l 一6 、e g f 、p d g f 、i f na 、i f ny 、e p o 、c s f ( c o l o n y s t i m u l a t e df a c t o r ) 、 o m 、l i f 等许多因子所激活“。 3 1s t a t 3 的结构 现在动物和人中发现有同一基因编码的三种天然的s t a t 3 异构体一s t a t 3 、s t a t 3b 和s t a t 3y 。s t a t 3a 蛋白由7 5 0 7 9 5 个氨基酸组成，分子量约为 8 硕士学位论文 第一章综述 8 9 9 2 k d ，结构上也主要有d n a 结合域、 ( t r a n s a c t i v a t i o nd o m a i n s t a d ) 蚓。 s h 3 功能域、s h 2 功能域和转录活化区 s t a t 3b 是1 9 9 5 年从鼠成纤维细胞c d n a 文库中克隆出来的，蛋白分子量约8 0 - 8 4 k d 。s t a t 3b 的c d n a 3 端较s t a t 3q 少 5 0 个核苷酸，其蛋白c 一末端的5 5 个氨基酸残基被7 个独特的氨基酸残基所取代， 因而缺乏位于第7 2 7 个氨基酸处的丝氢酸磷酸化位电( s e r 一7 2 7 ) 。s t a t 3a 和 s t a t 3b 共存于各种类型的细胞中，但在大多数细胞中s t a t 3a 的浓度均高于 s t a t 3b 。在s t a t 3 介导的转录中，s t a t 30 是种很强的显性的转录抑制因子。 s t a t 3y 是s t a t 3a 的限制性蛋白永解产物，分子薰约7 2 k d ，它不具有s t a t 3q 末 端的t a d ，是s t a t 3q 的种显性阴性异构体”1 。 3 2s t a 他的功能 s t a t 3 在多种细胞和组织中表达，在早期胚胎发育和骨髓细胞的分化中发挥 着不可缺少的重要作用“1 ，参与细胞生长、分化、恶性转化及凋亡抑制等生理 功能。 i l - 6 家族因子是s t a t 3 信号通路的主要活化因子。但一些生长因子如e g f 、 p d g f 也能通过各自受体激活s t a t 3 信号通路。i g f 也可以通过激活j a k l 和j a i ( 2 的激酶活性从而活化s t a t 3 信号通路”“。l e p t i n 通过其受体上s e r 一1 3 8 磷酸化 来激活s t a t 3 信号通路。此外，v s r c ，v s i s ，v f p s ，v r o s ，i g f i r ， c e y k v - e y k 等原癌蛋白也可激活s t a t 3 信号途径。 在中枢神经系统疾病、肿瘤、心血管系统疾病等多种疾病中发现s t a t 3 表达 及活化异常“”。取自人类的癌标本( 如：多发性骨髓瘤、淋巴瘤、乳腺瘤、头颈 部上皮细胞瘤、黑色素瘤和前列腺癌等) 和源于肿瘤的细胞株中多数都有组成性 活化的s t a t 蛋白，其中以s t a t 3 最为常见。分子生物学和病理学研究工具在疾 病相关模型中的应用，证实s t a t 3 是癌症发生的原因之一，s t a t 3 的组成性活性 对细胞的恶性转化是必需的。而且，s t a t 3 的组成性活性常伴随着c y c l i n d l 、 c - m y c 和b c i - x l 的表达上调1 。b r o m b e r g 等“”用半胱氨酸取代两个残基：6 6 1 位的丙氨酸和6 6 3 位的天冬氨酸，这两个残基能使s t a t 3 单体形成二聚体，使得 s t a t 3 在细胞中具有了持续性活性，并促使细胞向癌细胞的方向转化，接种到裸 鼠上也引起了肿瘤的形成。说明s t a t 3 具有原癌基因的性质。 9 硕士学位论文 第一章综述 3 3 s t a t 3 的基因治疗 已有研究发现许多源自人的癌标本和癌细胞株中都有组成性的s t a t 3 蛋白。 而在s t a t 3 持续活化的多发性骨髓瘤中，多发性骨髓瘤细胞依赖于i l - 6 信号通 路进行生长和存活，但阻断i l 6 的正常信号通路后，从而引起了s t a t 3 活性的 降低，抑制了细胞的增殖。a g 4 9 0 作为一种酪氨酸激酶抑制齐j ，可以选择性她抑 制y a k 酶的激酶活性而不影响i l 一1 2 的信号通路，从而引起肿瘤细胞的凋亡呻1 。 这些研究成果表明，j a k - s t a t 通路的一些抑制因子可以用来对j a k s t a t 通路激 活引起的肿瘤进行治疗。另一些针对e g f 受体和s r c 家族激酶的抑制因子，也通 过类似的机制对s t a t 3 信号通路进行抑制，从而抑制肿瘤细胞的增长删另一些 研究表明，利用合成的s t a t 3 d n a 结合位点的反义寡聚核糖核营酸来抑制s t a t 3 结合d n a 的能力，从而达到抑制s t a r 3 信号通路的目的“，或针对s t a t 3 s h 2 结 构于合成相应的蛋白短肽，起到抑制s t a t 3 s t a t 3 同源二聚体形成，从而达到抑 制s t a t 3 活性的日的嘞1 。 1 0 硬士学位论文第一章综述 第二节腺病毒载体的应用 腺病毒( a d e n o v i r u s ，a d ) 是一群分布广泛的呼吸道病毒，在许多哺乳动物 和禽类中都能发现其踪迹。自r o w e 。3 1 等人1 9 5 3 年从小儿扁桃体组织培养物中第 一次分离到腺病毒后，至今已获得1 0 0 种以上不同血清型的腺病毒，其中5 0 种 和人类有关。腺病毒最初的分类是根据其不同的血凝特性和对有免疫能力的啮齿 动物的致瘤性( 如a d l 2 、a d l 8 、a d 3 1 在啮齿类动物中可诱发肿瘤“”，而a d 2 和 a d s 则基本上无致瘤性) ，近年来d n a 的同源性也作为种分类的标准。由于某 些血清型的腺病毒能够引起实验动物肿瘤及体外细胞的转化，并且其生活周期利 用了细胞的许多机制，使人们对腺病毒投入了大量的研究关注。因此腺病毒对于 研究真核细胞d n a 复制、转录，r n a 剪接加工，蛋白质合成，以及细胞转化作用 都曾是很好的材料瀚。 腺病毒毒粒是二十面体的无包膜双链d n a 病毒，直径7 0 9 0 0 m 。哺乳动物腺 病毒基因组为双链线状d n a 分子，长约3 6 k b 。 自1 9 9 0 年美国科学家在世界上首次成功地实施了基因治疗以来，基因治疗 技术得到了长足发展，人们构建了一系列高效的转基因载体，腺病毒载体系统就 是新近发展起来的一种病毒载体，以其简便、高效、安全等显著特点而日益受到 人们的青睐。总结起来，腺病毒载体主要具有如下优点。”： ( a ) 腺病毒颗粒比较稳定，病毒基因组重排频率低。 ( b ) 腺病毒基因组相对易于用重组d n a 技术操作，且插入外源基因的病毒基 因组在复制传代中一般保持不变。 ( c ) 腺病毒基因组较大，插入大片段外源基因的潜力大。 ( d ) 腺病毒能感染的宿主细胞范围较广，既可感染分裂细胞，又可感染非分 裂细胞。具备向多种体细胞转移基因的能力。 ( e ) 安全性较好。在人类的肿瘤细胞中，尚未发现有腺病毒的整合，未发现 它与恶性肿瘤的发生有直接的关系。 ( f ) 细胞及动物实验表明，腺病毒载体较易将外源基因直接转运到靶细胞 中，并且在细胞中表达目的蛋白水平较高。 h e 等( 1 9 9 8 ) 提出了一种产生重组腺病毒的简便方法旧1 。将外源d n a 克隆 硕士学位论文 第一章综述 到一个穿梭质粒p a d t r a c k - c w v 中，该质粒载有腺病毒基因的一段同源序列作为 与腺病毒基因组进行重组的同源臂，其中还插入了g f p 表达单位和k a n a m y c i n 抗挂基因；将其线性亿后与一个腺病毒基因缀质粒如p a d e a s y - 1 共同转化感受态 细菌b j 5 1 8 3 ，两者在细菌中发生同源重组，用k a n a m y c i n 筛选出重组质粒并酶 切装定。将该重组质粒线性化后转染2 9 3 a 缎胞或9 1 1 缅您，用g f p 豹表达监溺 转染效率和病毒的产生。多数情况下，转染后至2 周时用普通显微镜也不容易观 察到明显的空斑c p e ( 细腿坏死效应) 。但用g f p 作为标记基困，在荧光显微镜下 常常能观察到病毒蚀斑。用反复冻融法制备细胞裂解液，在细胞上传代培养以扩 增其中的重组腺病毒。这种方法重组效率高，在转染真核细胞前已完成对病毒载 体的鉴定工作，因而避免了反复鉴定及纯化的麻烦，大大缩短生产病毒载体的时 间8 。本实验正是利用该法制备重组腺病毒载体。 尽管腺病毒存在免疫原毪较强的缺点，但它应用于肿瘤萋因治疗仍有其良好 前景，特别是在肿瘤细胞中选择性复制腺病毒的构建，无疑为病毒治疗肿瘤提供 了一条崭薪的思路。当然，由于肿瘤的发生机制滏未彻底阐明，丽基困治疗酌某 些关键性理论闯题和技术难关也有待解决，肿瘤的基因治疗离临床应用还有一定 的距离。如何克服腺病毒的免疫原性，提高其对特定细胞的靶向性，从而保证体 内应用的安全、高效，还存在着许多要解决的问题，但随着分于生物学技术的不 断进步，可以预见，不久的将来，腺病毒载体一定会在遗传病、病毒病和肿瘤等 人类重大疾病的基因治疗方面发挥其应有的作用。 参考文献 1 ，f ux y ，s c h i n d l e rc ，i m p r o t at ，e ta 1 ，t h ep r o t e i n so fi s g 卜3 ，t h e i n t e r f e r o na l p h a - i n d u c e dt r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t o r ，d e f i n eag e n e f a m i l yi n v o l v e di ns i g n a lt r a n s d u c t i o n p r o cn a t la c a ds c iusa ， 1 9 9 2 ，8 9 ( 1 6 ) ：7 8 4 0 7 8 4 3 2 ，c a l ov ，m i g l i a v a c c am ，b a z a nv ，e ta 1 ，s t a tp r o t e i n ：f r o mn o r m a l c o n t r o lo fc e l l u l a re v e n t st ot u m o r i g e n e s i s jc e l lp h y s i o l ，2 0 0 3 ， 1 9 7 ( 2 ) ：1 5 7 - 1 6 8 3 c o p e l a n dn g ，g i l b e r td j ，s c h i n d l e rc ，e ta 1 ，d i s t r i b u t i o n o ft h e m a m m a l i a ns t a rg e n ef a m i l yi nm o u s ec h r o m o s o m e s g e n o m i c s ，1 9 9 5 ， 1 2 硕士学位论文 第一章综述 2 9 ( 1 ) ：2 2 6 2 2 8 4 v i n k e m e i e ru ，c o h e ns l ，m o a r e f ii ，e ta 1 ，d n ab i n g d i n go fi nv i t r o a c t i v a t e ds t a t la l p h a ，s t a t lb e t aa n dt r u n c a t e ds t a t l ：i n t e r a c t i o n b e t w e e nn h 2 一t e r m i n a ld o m a i n ss t a b i l i z e sb i n d i n go ft w od i m m e r st o t a n d e md n as i t e s e m b oj ，1 9 9 6 ，1 5 ( 2 0 ) ：5 6 1 6 5 6 2 6 5 x ux ， s u ny l a n dh o e yt ， c o o p e r a t i v e d n a b i n d i n ga n d s e q u e n c e 。s e l e c t i v er e c o g n it i o nc o n f e r r e db yt h es t a ta m i n o 。t e r m i n a l d o m a i n s c i e n c e ，1 9 9 6 ，2 7 3 ( 5 2 7 6 ) ：7 9 4 7 9 7 6 b e c k e rs ，g r o n e rba n dm u l l e rc w ，t h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo ft h e s t a t 3 b e t ah o m o d i m e rb o u n dt od n a n a t u r e ，1 9 9 8 ，3 9 4 ( 6 6 8 9 ) ：1 4 5 1 5 1 7 h o r v a t hc m ，w e nza n dd a r n e l lj e ，j r ，as t a tp r o t e i nd o m a i nt h a t d e t e r m i n e sd n as e q u e n c er e c o g n i t i o ns u g g e s t san o v e ld n a b i n d i n g d o m a i n g e n e sd e v ，1 9 9 5 ，9 ( 8 ) ：9 8 4 9 9 4 g 。l h l ej n s t a t s ：s i g n a lt r a n s d u c e r sa n da c t i v a t o r so ft r a n s c r i p t i o n c e l l ，1 9 9 6 ，8 4 ：3 3 1 3 3 4 9 s a d o w k i ，h b ，k s h u a i ，j e d a r n e l l e ta 1 ac o m m o nn u c l e a rs i g n a l t r a n s d u c t i o np a t h w a ya c t i v a t e db yg r o w t hf a c t o ra n dc y t o k i n er e c e p t o r s s c i e n c e ，1 9 9 3 ，2 6 1 ：1 7 3 9 1 7 4 7 1 0 z i l o n g ，w ，z z h o n g a n d j e d a r n e l i m a x i m a la c t i v a t i o no f t r a n s c r i p t i o nb ys t a t ia n ds t a t 3r e q u i r e sb o t ht y r o s i n ea n ds e r i n e p h o s p h o r y l a t i o n c e l l ，1 9 9 5 ，8 2 ：2 4 1 2 5 0 1 1 h o e y ，t ，m j g r u s b y s t a t sa sm e d i a t o r so fc y t o k i n e i n d u c e dr e s p o n s e a d vi m m u n o l ，t 9 9 8 ，7 1 ：1 4 5 1 6 0 1 2 c h a k r a b o r t y ，a ，d j t w e a r d y s t a t 3a