（药剂学专业论文）新型ph敏感水凝胶应用于蛋白类药物口服给药的研究.pdf

摘要 本文采用氯乙酸法，使壳聚糖羧甲基化，得到在中性水溶液中较易溶解的羧 甲基壳聚糖。通过聚乙二醇单甲醚醛与羧甲基壳聚糖形成西佛碱，而后对其进行 还原得到聚乙二醇接枝的羧甲基壳聚糖。本文对各步合成出的产物进行了f t i r 和1 h - n m r 的结构表征，并对产物的合成过程进行了优化，通过电位滴定法对 羧甲基壳聚糖的取代度进行了测定，发现随着取代度的增大水溶性增强。 采用钙交联的方式，选用生物相容性材料壳聚糖衍生物和海藻酸钠作为组成 半互贯凝胶网络的骨架，将亲水性聚乙二醇( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，p e g ) 以物理混合 和化学接枝两种方式引入到凝胶网络结构中，采用搅拌滴加方式，将载体材料的 混合溶液滴加到磁力搅拌下的氯化钙溶液中，从而得到空白凝胶小球，并通过体 外试验对空白凝胶小球的溶胀性能进行了测定。用原位包合的方法将蛋白质类模 型药物牛血清白蛋i 刍( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) 包载于凝胶中，制备出粒径在 2 0 m m 3 0 m m 之间的载药凝胶小球。通过紫外分光光度法、差式扫描量热法、 荧光标记法等手段对凝胶包载的药物形态、分布进行了研究。发现药物可以均匀 分布在凝胶网络结构之中，且仍保持药物的结晶状态，初步证明了载入凝胶中的 蛋白质形态没有发生变化。药物体外溶出试验表明，通过改变载体骨架的组成可 以提高载药量( 最高可达1 4 7 2 ) 和包封率( 最高可达9 2 0 7 ) ，同时可以控制药物 的释放，使得药物在酸中的释放量相对较低( 2 0 ) ，而在碱中的释放量明显提高 ( 8 0 ) 。这一结果表明，这种新型的p h 敏感水凝胶适合作为蛋白药物的肠道靶 向给药的载体。 关键词： p h 敏感水凝胶，羧甲基壳聚糖，海藻酸钠，聚乙二醇，口服药物传 递系统 a b s t r a c t n ，o - c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n ( n o c c ) w h i c h i sm o r es o l u b l ei nt h en e u t r a lm e d i a w a ss y n t h e s i z e db yc a r b o x y m e t h y l i z i n gc h i t o s a nb yu s i n gt h em o n o c h l o r o a c e t i ca c i d n m p o l y e t h y l e n e - g l y c o l - e t h e r - a l d e h y d e ( m p e g - c h o ) g r a f t e dn o c cw a ss y n t h e 。 s i z e db yt w os t e p s ：t h em p e g - c h oa n dn o c cr e a c t e dt o g e t h e rt of o r mt h es c h i f f s b a s ew h i c hw a sd e o x i d i z e ds e q u e n t l y t h es t r u c t u r e so ft h ep r o d u c t sw e r ec h a r a c t e 。 r i z e db yf t i ra n d1 h - n m ra n dt h es y n t h e s i sp r o c e s sw a so p t i m i z e d t h ed e g r e eo f n o c cs u b s t i t u t i o n ( d s ) w a sc a l c u l a t e db yp o t e n t i o m e t r i ct i t r a t i o n t h es o l u b i l i t yo f n o c cw a si n v e s t i g a t e dt ob eb e t t e rt h a nt h a to fc h i t o s a nw h e nd sw a si n c r e a s e d c h i t o s a nd e r i v a t i o na n da l g i n a t ew e r ec h o s e na st h e c a n d i d a t e st oc o n s t r u c tt h e m a t r i xo ft h es e m i - i n t e r p e n e t r a t i n gp o l y m e r i cn e t w o r k ( s e m i - i p n ) d u et ot h e i re x c e 。 l l e n tp r o p e r t i e ss u c ha sb i o c o m p a t i b i l i t y , p h - s e n s i t i v i t y p e gw a sa d d e di nt h e h y d r o g e ls y s t e m si nt w om a n n e r s ( b ym i x i n gt h ep e g t ot h eh y d r o g e lo rg r a f t i n gt h e m p e g c h ot on o c c ) b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a sam o d e lo fp r o t e i nd r u g s w a se n c a p s u l a t e di nt h eh y d r o g e ln e t w o r kb yi ns i t u f a b r i c a t i o n t h ed i a m e t e ro ft h e p r e p a r e dd r u g 1 0 a d e db e a d sw a s2 0m m t o3 0m m t h ed r u gw a sp r o v e dt ob e s u c c e s s f u l l ye n c a p s u l a t e da n du n i f o r m l yd i s t r i b u t e di nt h ec r o s s l i n k e dn e t w o r k sb y e m p l o y i n gf l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p ea n dd i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t e r y ( d s c ) t h ed r u ga s s o c i a t i o ne f f i c i e n c y ( 9 0 0 7 ) a n dt h ed r u gl o a d i n gc a p a c i t y ( 1 4 7 2 ) c a n b el a r g e l yi n c r e a s e db yv a r y i n gt h ec o m p o s i t i o no ft h eh y d r o g e l s t h ec u m u l a t i v e d r u gr e l e a s ew a sa l s oi n v e s t i g a t e d t h ea m o u n to fb s ar e l e a s e da tp hi 2w a s r e l a t i v e l yl o w ( 2 0 ) ，w h i l et h a tr e l e a s e d a tp h 7 4i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ( 8 0 ) t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h en o v e lp h s e n s i t i v eh y d r o g e lc o u l db e as u i t a b l e p o l y m e r i c c a r r i e rf o rs i t e - s p e c i f i cp r o t e i nd r u gd e l i v e r yi nt h ei n t e s t i n e k e y w o r d s ：p h s e n s i t i v eh y d r o g e l ，n ，o - c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n ( n o c c ) ， a l g i n a t e ，p o l y e t h y l e n eg l y c o l ( p e g ) ，o r a ld r u gd e l i v e r y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者躲商彩钞签字日期：川年6 月弓日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 签字臼期：吕年 私抄 二日 ， 导师签名： 签字日期：驴年6 月专日 落阳 第一章文献综述 第一章文献综述弟一早义陬碌尬 1 1 水凝胶应用于蛋白类药物的口服给药 1 1 1 概况 与小分子药物相比，蛋白质类药物在较低的浓度下有较高的专属性和活性， 这一特点使其在人类疾病的治疗中不可或缺。近来，f d a 批准通过了三十余种 d n a 重组的蛋白质衍生物，其中包括：红细胞生成素、促滤泡素、干扰素，还 有更多的蛋白重组产物正在研究开发中【l 】。 在蛋白类药物的制剂过程中，我们首先要克服的就是蛋白质的物理和化学不 稳定性。蛋白质的不稳定性使其不能像小分子药物那样应用传统的口服方式进行 给药，而要通过注射进入人体 2 】。蛋白质的不稳定性主要表现在以下几个方面： 在胃中酸性环境下的催化降解，胃肠道中各种酶的催化降解，对于胃粘膜的渗透 性较低，转运中吸收屏障以及在肝脏中的首过代谢【3 】。为了成功制得可以用来v i 服的蛋白类药物，我们必须对其进行保护，避免它被胃中的复杂环境所破坏。对 于口服蛋白类药物的制剂，必须考虑到胃肠道内p h 的变化，是从胃中的酸性环 境( p h1 2 ) 至t j 肠道中的微碱性环境( p h7 4 ) t 4 1 。 在蛋白类药物的口服传递的研究中，水凝胶越来越受到重视。凝胶是一种特 殊的分散体系，其中胶体颗粒或高聚物分子互相联结，形成空间网状结构，在网 状结构的空隙中充满了液体( 在干凝胶的分散介质也可以是气体) 。高分子凝胶 由三维高分子网络与溶剂组成，网络交联结构使其不溶解而保持一定的形状，因 凝胶结构中含有亲溶剂基团，使之可吸收溶剂溶胀而达到平衡体积。凝胶可根据 溶剂种类分为水凝胶和有机凝胶，由于组成绝大多数生物体内的各种组织的天然 凝胶都是水凝胶，因此水凝胶是最重要的一种凝胶。 水凝胶是一类有亲水性天然或合成的均聚物或共聚物形成的交联网络结构， 通过离子键、共价键及次价键，如范德华力和氢键等进行交联，它是一种类似于 生物组织的高分子材料，具有良好的生物相容性，不影响生命体的代谢过程，且 代谢产物可以通过水凝胶排出，水凝胶具有一些独特的物理化学性质，如具有交 联网络结构，能吸收其自身几十至几千倍质量的水发生溶胀而不溶解，发生连续 或不连续的体积相变等，因此被广泛的应用在工业、农业、生物和材料等领域。 水凝胶按其高分子网络结构的交联方法分为化学凝胶和物理凝胶等。化学交 第一章文献综述 联剂的引入可能会带来一定的毒性( 来自于残留的交联剂) 或者其与药物发生我 们不希望看到的化学反应【5 】。因此，在应用诸如海藻酸作为载体材料包载药物时， 常采用物理方法将药物与海藻酸混合分散并将其在有c a 2 + 存在的溶液中交联【3 ， 6 】 o p h 敏感性水凝胶除具有一般水凝胶共同拥有的性能外，p h 的变化对其溶胀 性能也会有显著的影响。其在胃中的溶胀率很小，因此药物的释放量也就会受到 限制。当其进入肠道以后，随着p h 的升高，溶胀程度也相应增大。一些拥有酸 性和碱性基团的合成或天然的聚合物已经被开发应用于构建p h 敏感性水凝胶 p j 。海藻酸和壳聚糖是天然存在的生物聚合物，已经广泛应用在食品及制药工业 中。下面将从来源、物理化学性质、凝胶形成机理、结构的化学修饰等方面介绍 这两种天然聚合物在蛋白类药物口服给药应用中的优势所在。 1 1 2 海藻酸 1 1 2 1 来源 市售的海藻酸一般提取自褐藻，海藻酸一般以多种阳离子盐的混合物形式存 在在海水里，如：镁盐、钡盐、钠盐等。 1 1 2 2 化学结构 海藻酸是水溶性线性多聚糖，是由聚p l ，4 甘露糖醛酸( g 段区) 与聚a - 1 ，4 一l 一 古洛糖醛酸( m 段区) 结合的线性高聚物，分子量约为2 4 1 0 5 。因为单体的特殊 形状和在聚合物结构中的联接方式，g 段区，m 段区和交互区的几何形状有很大 不同。m 区是直线形的，而如果g 区并肩排列，则会形成一个钻石状的空洞， 这个洞的大小正好可以容纳c a 2 + 离子，从而通过离子键作用力使海藻酸交联成凝 胶。这一结构的单体组成、各部分所占比例以及整个聚合物的分子量都会影响海 藻酸的物理性质。 1 1 2 3 凝胶的形成 海藻盐的凝胶化可以应用无毒的试剂，在一个非常温和的环境下进行。海藻 酸最重要的性质是其可以与二价阳离子反应形成凝胶。通过将与药物混合的海藻 酸钠滴入二价陌离子的溶液中，可以形成包载药物的海藻酸微球。一价离子和 m 9 2 + 离子不引起交联反应f8 1 。聚合物的凝胶化主要是通过二价钙离子交换出古洛 糖醛酸中的钠离子而完成的。二价阳离子与a 古洛糖醛酸结合，每一个单元大概 由2 0 个单体组成，而每一个海藻酸二聚体与多个链段结合，最后就形成了凝胶 2 第一章文献综述 网状结构【9 j 。因此，海藻酸与钙离子的反应即：古洛糖醛酸( 即g 段) 在钙离子的 作用下的交联反应，这种胶体像固体一样具有一定的形状。系统中钙离子的含量 可以决定这种交联或凝胶化是暂时性的还是永久性的。钙离子含量低，形成暂时 的交联，得到高粘性和触变性的溶液；钙离子含量高，则可形成永久性的交联。 大量研究表明，化学结构、分子大小、凝胶形成的动力学因素以及阳离子的作用 都会影响到凝胶的功能和性质，其中包括：多孔性、溶胀性、稳定性、生物降解 性、胶体强度以及凝胶的免疫学特性和生物相容性。 1 1 2 4 海藻酸作为口服给药载体的优良特性 生物相容性：海藻酸作为增稠剂、乳化剂和稳定剂被广泛应用在食品生产中。 海藻酸被f d a 承认为安全的化合物。海藻酸口服不像静脉注射那样会引起免疫 反应，其口服无毒且可以被生物降解【l0 1 。虽然海藻酸的生物相容性已经得到广泛 论证，仍有文献报道了一些相反的结论，静脉注射海藻酸可能引起异质反应和机 体组织的纤维化】。另外一些报道则称，植入体内的海藻酸只会引发很小的免疫 反应1 1 2 1 。经检测，纯化后的海藻酸被植入动物腹腔后的三个星期内没有发现免疫 反应i l3 1 。因而，我们可以认为市售的海藻酸被静脉注射以后所引起的免疫反应可 能是由于其中含有的部分有毒杂质所引发的。 生物黏附性：粘膜黏附性药物传递系统通过延长药物在活性部位或吸收部位 的滞留时间来提高药效。海藻酸的粘膜黏附性有利于其作为粘膜组织给药的载 体，如：胃肠道i l 引。有报道称，带电荷的聚合物可以作为良好的粘膜黏附载体i l5 | 。 电荷密度的增加可以提高黏附性。也有报道指出，聚阴离子聚合物比聚阳离子聚 合物和非离子聚合物具有更好的粘膜黏附性1 1 引。海藻酸是具有羧酸根基团的聚阴 离子聚合物，因此，其具有很好的粘膜黏附性。由于海藻酸对于粘膜组织的黏附， 蛋白质类药物的转运时间延长了，与此同时药物被定位在吸收部位的表面，这就 大大提高了药物的生物利用度和药物的作用效果。 p h 敏感性：在p h 较低的溶液中，大分子从海藻酸中释放的量会明显减少， 这一特点使其可以作为口服传递系统的载体材料f l6 i 。从理论上讲，在低p h 下( 胃 环境中) ，海藻酸结构会收缩，包裹在其中的药物不能释放出来【1 7 j 。在胃液中， 水化的海藻酸转化为多孔的、不溶的海藻酸壳。当进入较高p h 的肠道中，这个 海藻酸壳就会转化为可溶的粘性的层状结构。海藻酸的这种p h 响应性使其可以 作为药物控制释放的载体。然而，海藻酸骨架在较高p h 范围内的快速溶解可能 会引起蛋白质类药物的突释，蛋白质类药物就会被各种肠道内的酶水解。因此， 为了将海藻酸应用到蛋白类药物的控释给药系统，我们还必须对其进行一些物理 的或化学改性。 第一章文献综述 较为温和的交联环境：海藻酸的凝胶化可以与无毒的试剂在一个十分温和的 环境下进行。海藻酸最重要的特点就是其可以与二价阳离子作用形成凝胶。例如： 海藻酸可以与c a 2 + 交联形成网状结构，并且这个网状结构可以运载蛋白质。 1 1 2 5 海藻酸应用的局限性 虽然钙交联海藻酸的制备方法简单，条件温和，但却存在着一个十分突出的 缺点，就是在制备过程中药物会从海藻酸的凝胶球体中渗漏出来【i 引。因此，为了 将海藻酸应用到药物的传递系统，很多人对其进行了更进一步的研究。例如：以 乙醛作为交联剂，使海藻酸钠单独发生交酬1 9 】或将海藻酸钠与卵白蛋白或明胶发 生交联1 2 0 ，并将制得的交联凝胶微球应用到实际生产中。交联的海藻酸对于药物 有更好的包载能力并且表现出更好的药物控制释放能力。据报道，戊二醇中的两 个醛基通过化学键能够与两分子的海藻酸中的羟基发生反应从而使海藻酸交联 成凝胶i 坶j 。 为了克服海藻酸结构中网孔较大以及其在较高的p h 环境下物理稳定性较差 的缺点，研究人员开发了很多方法，对海藻酸水凝胶的结构进行修饰和改进，使 它更加适合作为蛋白类药物的载体材料。 1 1 2 6 海藻酸的改性 1 1 2 6 1 共价化学修饰 海藻酸的粘膜黏附性可以通过与半胱氨酸的共价结合而有所提高f 2 1 | ，是l 半胱氨酸以共价键与海藻酸相连接，以碳化二亚胺为介导完成的。硫醇化的聚合 物与富含半胱氨酸的粘液糖蛋白相互作用，从而在粘膜黏附性聚合物与粘液层之 间形成二硫键。除了改善黏附性以外，溶胀性和粘合性也同样得到了增强。海藻 酸作为多种剂型的赋形剂，如：骨架片剂和微粒，使药物传递系统的稳定性得到 改善，并延长了药物在粘膜组织的滞留时间【2 。另外，海藻酸的生物降解程度也 与硫醇化作用的程度有关。 通过长链烷基与多聚糖骨架通过酯功能基共价结合，在水溶液中形成坚固的 水凝胶，从而制得海藻酸钠的两亲性衍生物【2 2 1 。另外，海藻酸微粒可以通过将疏 水的海藻酸分散在氯化钠溶液中制备得到。这一过程是在水性介质中进行的，不 需要任何激烈的反应条件，也不需要附加任何其它反应物。已有报道，将诸如， 牛血清白蛋白、人的血红蛋白和免疫蛋白尿素酶作为模型药物包载在上述载体 中，并进行药物释放研究。在大多数情况下，包封率可达到7 0 一1 0 0 ，而控制 释放效果也很好。尽管水凝胶中存在大量的孔隙，但因为蛋白质与水凝胶之间的 疏水相互作用，蛋白类药物仍然可以大量保留在其间。随着脂肪酶等酶类对酯共 4 第一章文献综述 价键的水解，水凝胶中的蛋白质也随之释放出来了。 1 1 2 6 2 聚合电解质络合物 带有相反电荷的两种聚合物的混合水溶液成为聚合电解质络合物。海藻酸与 其它聚合物形成聚合电解质络合物以后，会改变其凝胶结构中孔隙的大小以及网 络结构的复杂性。有报道称，海藻酸与果胶【1 8 】、壳聚糖【2 3 】、乙基纤维素1 2 4 1 和丙 烯酸树脂【2 4 ，2 5 】等聚合物的混合物可以解决药物在制备过程中的渗漏问题。 目前，海藻酸与壳聚糖的聚合电解质络合物作为蛋白类药物口服给药的载体 的研究越来越受到制剂工作者的关注阢2 7 , 2 引。由于这种聚合电解质络合物具有 p h 敏感性，因而可以开发其作为蛋白类及肽类药物v 1 服给药的载体【2 6 | 。有很多 因素会影响到其作为药物载体的性质，其中包括：海藻酸的组成、分子量以及壳 聚糖的脱乙酰度【2 9 1 。有报道，壳聚糖与海藻酸的结合程度可以通过降低壳聚糖的 数均分子量以及增大海藻酸凝胶的孔隙率而有明显提耐2 9 1 。 1 1 3 壳聚糖 1 1 3 1 来源 壳聚糖( c h i t o s a n ，( 1 ，4 ) - 2 一脱氧1 3d 葡聚糖) 是甲壳素( c h i t i n ，( 1 ，4 ) 一2 一乙酰氨基 2 脱氧1 3 - d 葡聚糖) 部分脱乙酰化的产物。 甲壳素广泛存在于蟹、虾以及藻类、真菌等低等动植物中，含量极其丰富， 自然界每年产量约在1 0 0 亿吨，是仅次于纤维素的第二大多糖。 1 1 3 2 化学结构 壳聚糖是由葡萄糖结构单元组成的直链多糖，此多糖中含有数千个乙酰己糖 胺残基，因此在分子间形成很强的氢键，导致其不溶于水和普通有机溶剂，这就 大大限制了其应用范围。壳聚糖是自然界唯一的一种碱性多糖，它一般是白色无 定、半透明、略有珍珠光泽的固体。壳聚糖可溶于大多数稀酸，如：盐酸、醋酸、 苯甲酸溶液，且溶于酸后分子中氨基可与质子结合，使自身带上正电荷。 1 1 3 3 壳聚糖作为口服给药载体的优良特性 生物相容性和生物可降解性：壳聚糖在食品工业中应用广泛。壳聚糖作为非 药物产品的成分，胆固醇抑制剂以及纤体处方的非药物成分在世界范围内得到了 广泛的应用3 0 1 。有报道，由于壳聚糖中具有大量的n h 3 + ，使得其在肠道中可以 包埋大量的油脂【3 l 】。另有报道，在生物医学领域的研究中发现，壳聚糖具有很高 的生物相容性【3 2 1 。还有报道称，壳聚糖可以被人体中的多种酶，特别是溶解酵素 第一章文献综述 代谢，所以认为它是可以被生物降解的p 引。 粘膜黏附性：壳聚糖是生物黏附材料，它对胃粘膜有生物黏附作用。因此， 它可作为药物的定位释放载体，与此同时，通过应用壳聚糖可以延长药物在作用 或吸收部位的滞留时间。这也就是说，壳聚糖对于胃肠道，如：胃【3 4 】、小肠【3 5 】、 口腔粘膜1 3 引，的靶向定位给药具有一定的价值。在膨胀状态下，即使是在与酶的 作用物反复接触的情况下，壳聚糖仍具有很好的黏附性。这是因为，通过水合作 用可以增大壳聚糖的生物黏附性，在水分子的存在下，氢键和离子间的作用力会 有所增大。其机制是：在壳聚糖的n h 3 + 和粘膜层的负离子之间存在离子间作用 力，即：分子之间的静电作用【3 川。这种相互作用在酸性和弱酸性的p h 条件下比 较强，这时，壳聚糖的电荷密度较高【3 5 1 。有报道，当壳聚糖的交联密度较小而自 由n h 3 + 较多时，壳聚糖微球对于肠道的黏附能力较划”】。 p h 敏感性：壳聚糖的这一性质来源于它结构中大量存在的n h 3 + 。其在低p h 溶液中溶解，在高p h 溶液中不溶。这种p h 敏感性的机理是在较低的p h 环境 下，壳聚糖中的氨基基团会发生质子化而生成n h 3 + ，这使得壳聚糖链段中产生 了电荷之间的排斥力，n h 3 + 质子和进入凝胶的水中带有的反离子会发生扩散， 从而使得结构中的次级作用力瓦解【3 引。这一性质，使得壳聚糖可以运载化学药物 进入胃中，因而它成为了被广泛应用的骨架材料。但作为蛋白质药物的载体，载 体材料需将药物运载到肠道，壳聚糖的这一性质则使其在这方面的应用受到了限 制。因为，壳聚糖骨架在胃中就会被溶解，蛋白类药物便释放出来，释放出的蛋 白质则会在酸性环境下降解。为了解决这一问题，研究人员作了很多尝试，为的 就是改善壳聚糖在胃中的稳定性，并且将其应用于蛋白类药物肠道给药。 凝胶化条件温和：水凝胶的制备和药物的包载可以在相对温和的条件下进 行。混有预包载药物的壳聚糖溶液可以在交联剂的作用下形成凝胶。常见的交联 剂是三聚磷酸盐。它是无毒的聚阴离子，可与壳聚糖通过静电力形成离子交联的 网状结构。它可以应用在壳聚糖小球和微球的制备中，因为它具有快速的交联能 力1 3 9 。共价交联的壳聚糖可以通过与多种化学试剂作用得到。交联反应增强了壳 聚糖的化学和机械性能，使它形成更加稳定的网状结构。因此，它可以在较高的 p h 下控制蛋白类药物的释放，而不会因为其在胃中的酸性环境下溶解而使药物 发生突释。最常用的交联剂是二醛类的，如：乙二醛【4 0 】和戊二醛。醛基可以 与壳聚糖中的氨基通过西佛碱反应形成亚胺键。二醛则可以在水性溶液的温和的 条件下与壳聚糖反应，使其发生交联，而不需要用到还原剂作为辅助m 】。 易于化学修饰：壳聚糖的一个重要性质就是容易对其进行化学修饰。这得益 于它结构中的自由氨基的存在，使聚合物的反应能力得以提高。因此，可以通过 壳聚糖中的氨基与其它物质反应，从而对其进行化学修饰。这一性质使得研究者 6 第一章文献综述 可以通过简单的化学反应来提高壳聚糖的化学和机械性能。 1 1 3 4 壳聚糖应用的局限性 壳聚糖作为蛋白类药物的载体最主要的局限性就是其在胃中较低的p h 环境 下很容易被溶解破坏。然而，壳聚糖的优良性质，如：吸收促进作用和粘膜黏附 性在p h 较低的环境下仍然存在。这是因为作为弱碱，壳聚糖需要酸性环境使它 结构中的葡氨基可以转化成带正电荷的水可溶性形式f 4 2 1 。在小肠中，壳聚糖的溶 解性很差，这也就影响了它的黏附性和吸收促进作用，而小肠正是药物吸收的主 要部位。因此，为了使其成为口服蛋白类药物的骨架载体，就必须对其进行必要 的修饰与改性。一些壳聚糖的衍生物则可以克服壳聚糖的这一不足，在较高的 p h 环境下仍然具有很好的性能。 1 1 3 5 壳聚糖的改性 由于壳聚糖的亲水性和在酸性溶剂中的溶解性，壳聚糖对于药物的控制释放 还存在着一些不足。因此，需要将其交联成凝胶后应用于药物传递系统。为了改 善壳聚糖作为药物载体的性质，人们对其改性方法进行了研究。通过简单的共价 键的连接对聚合物进行化学修饰，其物理化学性质可以发生变化，使壳聚糖更加 适合作为口服药物传递系统的载体。 1 1 3 5 1 共价化学修饰 硫醇化壳聚糖：该反应主要发生在壳聚糖的氨基上，目前，只成功合成了四 种壳聚糖的硫醇化产物。它们是壳聚糖的巯基乙酸化合物【4 3 1 、壳聚糖半胱氨酸 结合物【4 4 1 、壳聚糖4 硫化丁基淀粉溶素结合物( 壳聚糖t b a ) 4 5 1 以及最近合成出 来的壳聚糖硫化乙基脒( t e a ) 的衍生物【4 6 1 。硫醇化可以提高壳聚糖的粘膜黏附性 和渗透促进作用。 三甲基化壳聚糖：该反应是对壳聚糖的还原反应。由于其在中性和碱性环境 中可溶，它可以作为肽类药物肠内给药的载体材料。三甲基化的壳聚糖与壳聚糖 的盐相比生物黏附能力有所降低【4 7 1 。但其对肽类药物具有很好地吸收促进作用。 羧甲基化的壳聚糖：通过壳聚糖的羧甲基化反应，可以制备出同时具有阴、 阳两种离子的羧甲基化壳聚糖。随着壳聚糖脱乙酰度或取代度的提高，羧甲基化 壳聚糖的水凝胶的带电性可以从两性变化为阳离子性或阴离子性。因此，羧甲基 化壳聚糖凝胶的p h 敏感性可以通过一些参数来调节，如：脱乙酰、取代度，从 而可以制备出适合于不同要求的药物传递系统。另外，羧甲基化的壳聚糖也可以 作为肠粘膜的渗透促进剂【4 8 1 。 7 第一章文献综述 1 1 3 5 2 聚合电解质络合物 壳聚糖海藻酸络合物：壳聚糖海藻酸络合物作为一种p h 敏感性水凝胶， 已经被开发应用于蛋白类药物的口服传递系统中【27 1 。壳聚糖海藻酸络合物在蛋 白类药物口服给药的研究中有很重要的研究价值。海藻酸在较低的p h 下会收缩 而在高p h 的环境下会溶解，这和壳聚糖正相反。因此，单独应用这两种聚合物 的任何一种都存在着一定的局限性。这样，海藻酸和壳聚糖的聚合电解质络合物 就因为它特有的优势而被广泛关注【4 9 1 。在二者的混合物中，海藻酸中的羧基和壳 聚糖中的氨基通过离子间作用力从而形成了聚合电解质络合物。这种络合物减小 了海藻酸的空隙率，也改善了药物的包封率【5 0 】。二者的结合，同样改变了它们在 单独应用时的p h 敏感性，通过改变制备方法，可以得到更加理想的释药性能。 壳聚糖果胶络合物：果胶是一种阴离子型的聚合物。果胶易与像壳聚糖这 样的阳离子性聚合物作用形成凝胶层。已有一些文献报道了壳聚糖果胶作为载 体骨架的制备及体外检测【5 。 壳聚糖胶原络合物：胶原与壳聚糖也可以形成聚电解质络合物，报道说， 在水中，胶原和壳聚糖之间存在着两种相互作用【5 2 】。其中，一种是由于结构上的 反离子的存在，二者之间会存在静电力。另外，由于壳聚糖的大量存在，很容易 形成氢键型络合物。壳聚糖胶原络合物具有生物相容性和生物可降解性。其作 为一种具有良好性能的生物材料，在药物传递系统和其它的生物医药领域有很好 的应用前景。 1 2 聚乙二醇( p e g ) 1 2 。1 聚乙二醇的优异性能 聚乙二醇( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，p e g ) 是由环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成聚 合而得到的一类低分子量的具有油水两亲性的聚醚。它既有良好的水溶性，也能 溶于氯仿、乙醇、二氯甲烷、d m f 等有机溶剂。由于p e g 具有生物相容性好、 低毒、非免疫原性等优异性能，p e g 已经得到了f d a 的认可，而且被中、美、 英等国家的药典收载作为药用辅料。聚乙二醇可以通过肾排出体外，在体内不会 积累。此外，它具有一定的化学惰性，但在端羟基活化后又易于和蛋白质等物质 进行键合，键合后，p e g 可将其许多优异性能赋予被修饰的物质，比如能够增 大药物的相对分子质量( m ) ，减少肾消除，延长药物的半衰期，增大药物的水溶 性，并且p e g 链包裹在药物表面，能够遮蔽药物的抗原决定簇，降低药物的免 疫原性等。聚乙二醇在体循环中的优点还有能防止与血液接触时血小板在材料表 第一章文献综述 面的沉积，有效延长被修饰物在体内的半衰期，提高药物的传递效果。p e g 在 例如片剂、胶囊剂、注射剂、软膏剂、栓剂、滴丸剂等传统剂型中均有应用。从 上个世纪9 0 年代开始，p e g 在新型药物制剂中的应用的研究越来越多。 1 2 2 聚乙二醇在新型药物制剂中的应用 1 2 2 1 聚乙二醇修饰蛋白质类大分子药物 蛋白质类大分子药物诸如酶、细胞因子等现在已经成为医药产品中的重要组 成部分，在临床上的应用越来越广泛，但这类药物稳定性差，血浆半衰期短，具 有免疫原性，因此在生产和使用方面受到极大的限制。1 9 7 7 年，a b u c h o w s k i t 5 3 】 等人用聚乙二醇修饰牛血清蛋白和过氧化氢酶，发现被修饰后的大分子的免疫原 性大大降低，体内循环时间明显延长。19 9 1 年p e g 修饰的腺苷脱氨基酶( p e g a d a ) n 4 城为通过美国f d a 认证的第一种修饰蛋白，它用于治疗因腺苷脱氨基酶 缺乏引起的严重综合免疫缺陷症。此后陆续有p e g 干扰素、p e g g s f 、p e g 生 长抑素经f d a 批准上市。目前处于临床前研究的p e g 修饰的蛋白药物有几十种， 如超氧化物歧化酶( 即将上市) 、白介素2 ( i i 期) 、水蛭素( 期) 、抗t n f a 抗体 片段( 期) 、牛血红蛋白( i 期) 、抗p d g f 抗体片段( i i 期) 等。使用p e g 来修饰多 肽( 包括蛋白质) 、核酸和多糖等生物分子以提高它们的临床和生物学性能的重要 手段将会得到更加广泛的研究和应用。 1 2 2 2 聚乙二醇修饰小分子药物 虽然最初p e g 主要用于修饰蛋白质类大分子药物，但是许多小分子药物也逐 渐采用p e g 修饰技术，并取得了一定进展。目前p e g 修饰的小分子药物以抗肿瘤 药物居多，如喜树碱、紫杉醇、阿霉素、阿糖胞苷等。紫杉醇是一种优良的抗肿 瘤药物，尤其对于卵巢癌疗效显著，但由于它极难溶于水和毒性大而限制了其在 临床上的应用。g r e e n w a l d 等【5 5 】发现用p e g 修饰过的紫杉醇可以提高原药的水溶 性，延长其在体内的半衰期，还可以减小紫杉醇的毒副作用，并证明可用作前药。 p e g 修饰后的喜树碱毒性大大降低，而且疗效显著增强。 1 2 2 3 聚乙二醇修饰脂质体 脂质体是一种类似生物膜结构的双分子层微小囊泡。它作为一种新型药物载 体具有很多优点，如靶向性、缓释性、降低药物毒性、提高药物稳定性等。未经 修饰的脂质体大部分运转至肝脏和脾脏等单核吞噬细胞系统丰富的部位，少量被 肺、骨髓及肾摄取；肝细胞膜受体对直接暴露于表面的磷脂负电基进行识别，因 9 第一章文献综述 而脂质体首先被肝枯否细胞吞噬。这些因素综合使传统脂质体的半衰期仅十几分 钟。如果用p e g 修饰脂质体，则能够降低脂质体被吞噬细胞吞噬的可能性，延 长其在循环系统的滞留时间，因而有利于肝脾以外的组织器官的靶向作用。1 9 9 0 年k l i b a n o v 掣5 6 j 用聚乙二醇一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺( p o l y e t h y l e n eg l y c o i d i s t e a r o y l p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ，p e g d s p e ) 对脂质体膜进行改性修饰，研制出一种长循 环脂质体，不但提高了对靶向组织的选择性，而且能够逃避网状内皮系统的捕获， 被称为“隐形脂质体”( s t e a l t hl i p o s o m e s ，s - l i p o s o m e s ) 。目前，p e g 修饰的阿霉素脂 质体在国外已经批准上市，与原型药物相比，降低了心脏毒性，增强了病人的耐 受性，在体内更好地发挥了控释和靶向药物的作用。 1 2 2 4 聚乙二醇用作固体分散体的载体 p e g 不仅可用作注射用的复合溶剂、软膏基质、栓剂基质、助悬剂、增塑 剂等，还可用作固体分散体的载体，制备一些难溶性药物的低共熔物以加速药物 的溶解和吸收。肖玉秀等【57 】利用熔融法制备的以p e g 2 0 0 0 为载体的阿司匹林一 p e g2 0 0 0 ( 1 ：9 ) 固体分散体，其药物溶出速度显著高于原料药及物理混合物。刘善 奎掣5 8 j 以p e g 6 0 0 0 和i i 号丙烯酸树脂为混合载体，用溶剂法制备成盐酸尼卡地 平肠溶缓释固体分散体，利用差热分析和x 射线粉未衍射证实药物以分子状态 分散于载体中，该肠溶缓释固体分散体性质稳定，可显著提高药物在人工肠液中 的溶出速度。孙淑英等1 5 9 】用熔融法或溶剂法将硝苯地平与p e g 固体先制成固体 分散物，再与亲水性高分子材料羟丙甲纤维素等制成缓释片剂，通过释放度与稳 定性实验，表明该缓释片不仅能达到缓释目的，而且具有良好的稳定性。 1 3 本课题研究的目的及意义 目前，用海藻酸和壳聚糖的聚合电解质络合物作为药物微囊化的载体，用于 蛋白质类药物的控制释放是一个热点。壳聚糖海藻酸的络合物，作为p h 敏感的 水凝胶，已经被开发应用于肽类和蛋白质类药物的口服给药。另外，也有报道， 改性的壳聚糖，例如：羧甲基壳聚糖，羧苯基壳聚糖、n 烷基壳聚糖以及接枝后 的壳聚糖，与海藻酸进行交联，形成p h 敏感的水凝胶作为肽类以及蛋白类药物 的控释载体。 本课题将以n ，o 羧甲基化的壳聚糖接枝p e g ，并以钙离子为交联剂，将其 与海藻酸交联形成具有p h 敏感性的半互换贯网络结构，包载蛋白质类药物，模 型药物选用牛血清白蛋白。聚乙二醇( p e g ) 水溶性及生物相容性好，在体内能溶 于组织液中，能被机体迅速排出体外而不产生毒副作用，并得到美国f d a 的认 l o 第一章文献综述 可。n ，0 羧甲基化的壳聚糖是水溶性的壳聚糖衍生物，不仅保留了壳聚糖的p h 敏感性，而且可以溶于水性介质，避免酸性环境对蛋白质类药物的破坏。另外， 半互贯网络的形成，减小了上面提及的钙离子与海藻酸之间过大的离子间作用 力，从而，提高了药物在碱性介质中的释放量，同时，减少了对蛋白质形态的挤 压变形的可能性。因此，这种新型的p h 敏感的水凝胶有望给蛋白类药物的口服 给药提供一个新途径。 第二章载体材料的合成与凝胶小球的制备 2 1 引言 第二章载体材料的合成与凝胶小球的制备 本章以改性的壳聚糖，即：羧甲基化的壳聚糖为主链，与聚乙二醇单甲醚醛 接枝共聚，而后在钙离子的作用下与海藻酸钠进行物理交联。通过改变载体材料 的种类和各部分的投料比，得到一系列具有不同p h 敏感性的半互贯凝胶网络结 构。 2 2 试剂与仪器 2 2 1 试剂 1 2 第二章载体材料的合成与凝胶小球的制备 f d 1 型真空冷冻干燥机 d f 10 1s 集热式恒温加热磁力搅拌器 k q 2 2 0 0 b 超声波清洗器 s h b 型循环水式多用真空泵 电热真空干燥箱 电热鼓风干燥箱 r e 5 2 a 旋转蒸发器 酸度计 a l 2 0 4 电子天平 可调式移液器 北京博医康实验仪器有限公司 巩义市英峪予华仪器厂 巩义市英峪予华仪器厂 郑州长城科工贸有限公司 天津市天宇实验仪器有限公司 天津市天宇实验仪器有限公司 上海亚荣盛华仪器厂 上海理达仪器厂 m e t t l e r - t o l e d og r o u p 热电( 上海) 仪器有限公司 2 3n _ m p e g 接枝的羧甲基壳聚糖的合成 本节采用两种路径对目标产物进行合成，即：一种是先将壳聚糖羧甲基化然 后对其进行n m p e g 醛的接枝；另一种方法是先合成n m p e g 化的壳聚糖然后 对其进行羧甲基化。通过对两种方法所得产物的分析，最终确定合成路线。 2 3 1 第一种合成路线 2 3 1 1 聚乙二醇单甲醚( m p e g ) 的醛化 1o gm p e g ( m n = 2 0 0 0 ) 置于1o o m l 圆底烧瓶中，用3 0 m l 二甲基亚砜( d m s o ) 溶解，抽真空，充氮气，反复操作三次，然后将重蒸过的乙酸酐( 乙酸酐与m p e g 物质的量之比为1 0 ：1 ) 通过注射器加入到反应瓶中，室温下磁力搅拌2 4 小时后， 将反应混合液滴到冷的无水乙醚中沉淀，将沉淀减压过滤，用无水乙醚洗涤三次， 得到的白色粉末状产物聚乙二醇单甲醚醛( m p e g c h o ) ，常温下真空干燥2 4 小 时后，放入样品瓶中密封备用。 第二章载体材料的合成与凝胶小球的制备 2 3 1 2 羧甲基壳聚糖( n o c c ) 的合成 称取壳聚糖( 黏均分子量4 8 ，0 0 0 ，脱乙酰度= 8 0 5 8 ) 粉末3 9 ，混悬于4 5 m l 异丙醇溶液中，并在2 5 0 m l 三口瓶中搅拌，温度为室温。将18 7 5 m ln a o h 水 溶液( 1 0 t o o l l ) 分成五份，在2 5 m i n 内分次加入到烧瓶中。再搅拌3 0 m i n ，每隔 l m i n 向烧瓶中加入3 6 9 氯乙酸，共加5 次，总共1 8 9 。然后，在6 0 下搅拌反 应物3 h 。减压过滤，过滤所得固体用甲醇洗净，在6 0 的干燥箱内干燥至恒重。 2 3 1 3n 1 i i p e g 接枝的羧甲基壳聚糖的合成 称取1 0 0 0 0 9 羧甲基壳聚糖( 6 m m o l 壳聚糖单糖残基) ，在4 0 m l2 的乙酸与 甲醇的混合溶液( 体积比为3 ：1 ) 中充分溶胀，将m p e g c h o ( 5 5 4 9 ，2 7 9 m m o l ，约 1 7 8 m m o l 醛基) 溶于甲醇中，滴加到羧甲基壳聚糖的甲醇溶液中，氮气保护下室 温磁力搅拌2 4 小时后，滴加k b i - t 4 的甲醇悬浮液，继续磁力搅拌2 4 小时后，减 压旋蒸除去甲醇，将剩余的物质用蒸馏水溶解后透析7 天，将透析袋里的液体 l0 0 0 0r p m 离心3 0 分钟，上清液和沉淀分别冷冻干燥，上清液干燥得到的产品就 是n m p e g 接枝的羧甲基壳聚糖。 2 3 2 第二种合成路线 2 3 2 1n 1 1 1 p e g 化壳聚糖的合成 称取0 7 5 0 0 9 壳聚糖( 4 5 m m o l ，黏均分子量为4 8 ，0 0 0 d a ，脱乙酰度= 8 0 5 8 ) ， 在4 0 m l2 的乙酸与甲醇的混合溶液( 体积比为1 ：1 ) 中充分溶胀，将一定量的 m p e g c h o ( 5 5 4 9 ，2 7 9 m m o l ，约1 7 8 m m o l 醛基) 溶于甲醇中，滴加到壳聚糖的乙 酸甲醇溶液中，氮气保护下室温磁力搅拌2 4 小时后，用1 m o l l 的n a o h 溶液 调p h 值至6 5 ，继续搅拌1 小时后滴加k b h 4 的甲醇悬浮液，继续磁力搅拌2 4 小时后，减压旋蒸除去甲醇，将剩余的物质用蒸馏水溶解后透析7 天，将透析袋 里的液体1 0 0 0 0r p m 离心3 0 分钟，上清液和沉淀分别冷冻干燥，上清液干燥得 到的产品就是n m p e g 化壳聚糖。 2 3 2 2n 1 | i p e g 化壳聚