（植物病理学专业论文）欧文氏杆菌铁代谢相关基因生物信息学分析.pdf

摘要 铁是所有细菌活细胞代谢必要的微量营养元素。研究发现，铁不仅影响病原菌的生 长，还与病原菌的致病性密切相关，它调控着许多致病基因的表达。本文通过实验证明 了铁与植物病原细菌e r w i n i ac a r o t o v o r av a e c a r o t o v o r a ( 简称e c c ) 和e r w i n i ac a r o t o v o r a s u b s d a t r o s e p t i c a ( e c a ) 的生长与致病性的关系，利用生物信息学方法查找和分析了e c a 中与铁代谢相关的基因。 为了研究铁与植物病原细菌e c c 和e c a 的生长与致病性的关系，本实验采用生物学 测定和分子检测相结合的试验方法，用不同浓度的f e 3 + 分别处理各供试菌株，测定了 e c c 和e c a 的生长与致病性。结果表明，在一定浓度下，f e 3 + 对e c c 和e c a 的各菌株生 长及致病性均有促进作用，其中，o 1 1 m m o l l 的f e 3 + 对其生长和致病性促进作用明显。 利用n c b 班 l a s t2 2 1 3 ，d n a m a n ，d n a s t a r 和t r e e v i e w 等软件对e c a 基因组中 与铁代谢相关的基因进行生物信息学分析，共查询到了7 0 个与铁代谢相关的基因。其 中，有5 0 个基因为已知功能基因，2 0 个为推测功能基因。在获得的7 0 个基因中，1 2 个参与铁载体合成，2 7 个与f e ”吸收有关基因，3 个与f e 2 + 吸收有关，1 0 个与亚铁血红 素吸收有关，1 个编码贮铁蛋白的基因，7 个与铁吸收调控有关，还有1 1 个基因可能与 铁代谢有关。 采用序列相似性分析，找到了6 个与序r 功能相近的基因，其中有一个编码依赖锌 的阻遏物基因z u r 。利用f u r - b o x 的1 9 b p 的回文序列( g a r a a t g a l a a t c a l 飞虹c ) 在 这7 0 个基因中共找到了2 6 个推测的f u v b o x 。 通过对与铁代谢相关基因构建系统进化树，发现除4 个推测功能的基因外，其余6 6 个基因在亲缘关系上与其功能分类基本吻合。 关键词：欧文氏软腐菌；铁代谢相关基因；铁载体；铁调控蛋白；生物信息学分析 b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i so fi r o nu p t a k e r e l a t e dg e n ei ne r w i n i a a u t h o r ：l i ut i n g - h u i s u p e r v i s o r ：d o n g3 i n g a o m a j o r ：p l a n tp a t h o l o g y a b s t r a c t i r o ni st h en e c e s s a r ym i c r o n u t r i e n tf o rc e l l u l a rm e t a b o l i s mu s e db ya l m o s ta l ib a c t e r i a i th a sb e e nf o u n dt h a ti r o nh a se f f e c tn o to n l yo nt h eg r o w t h ，b u ta l s oo nt h ep a t h o g e n i c i t y o fm ep a t h o g e n s i tr e g u l a t e se x p r e s s i o no fp a t h o g e n i cg e n e s i nt h i sp a p e r , t h er e s u l t s h o w e dt h a ti r o ni sr e l a t i v et ot h eg r o w t ha n dp a t h o g e n c i t yo ft h ep a t h o g e ne r w i n i a c a r o t o v o r av a r c a r o t o v o r aa n de r w i n i ac a r o t o v o r as u b s p a t r o s e p t i c a a n dt h e nt h e r e l a t e dg e n e st oi r o nm e t a b o l i s ma r ef o u n da n da n a l y z e db yb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d b i o l o g i c a la n dm o l e c u l a rd e t e c t i v em e t h o d sa r eu s e dt o d i s c l o s et h er e l a t i o n s h i p b e t w e e ni r o na n dt h ep a t h o g e no fe e ca n de c a as e r i a lo fc o n c e n t r a t i o no ff e r r i ca r e s p r a y e do nt h es t r a i n sd e t e c t e dt od i s c l o s et h ee f f e c to nt h eg r o w t ha n dp a t h e g e n c i t y t h e r e s u l ts h o w e dt h ec o n c e n t r a t i o no f f e 3 +c a n p r o m o t e t h e g r o w t h a n d p a t h o g e n c i t y ，e s p e c i a l l yt h ec o n c e n t r a t i o no f0 1 1m m o l l ，w h i l et h eh i 【g hc o n c e n t r a t i o n o fi r o nh a sn e g a t i v ee f f e c to nt h ep a t h o g e n s ，e c ca n de c a t h r o u g hs o f t w a r e si n c l u d i n gn c b i b l a s t2 2 13 ，d n a m a n ，d n a s t a r ，t r e e v i e we t a l ，a n a l y z i n gg e n e st h a tr e l a t e dt oi r o nm e t a b o l i s mi ne c ag e n o m e ，7 0r a l a t i v eg e n e st o i r o nm e m b o l i s ma r ef o u n d a m o n gt h e7 0g e n e s ，5 0a r ef u n c t i o n a l l yk n o w n ，2 0g e n e sa r e p u t a t i v ef u n c t i o n 2 7g e n e sa r er e l a t i v et of e r r i ci r o nu p t a k e ，3g e n e sa r er e l a t i v et of e r r o u s i r o nu p t a k e ，l0g e n e sr e l a t i v et oh e i n eu p t a k e ，lg e n et oi r o ns t o r a g ep r o t e i n ，7g e n e sa r e r e l a t i v et oi r o nr e s p o n s i v e r e g u l a t o r s ，11g e n e sa r ep r o b a b l yr e l a t i v et o o t h e ri r o n m e t a b o l i s m t h r o u g ha n a l y s i so fs e q u e n c es i m i l i a r i t y ，i th a sb e e nf o u n dt h a tt h e r ei sag e n e e n c o d i n gar e p r e s s o rt h a ti sd e p e n d e n to nz u rg e n ei ns i xg e n e st h a ta r es i m i l a rt o 如rg e n e 1 9 b pp a l i n d r o m i cs e q u e n c e ( g a t a a t g a t a a t c a t t a t c ) o f f u rb o xi su s e dt oa m p l i f yi n 7 0g e n e s ，t h er e s u l ti n d i c a t e st h a t2 6o f7 0g e n e sp r o b o b l yh a v e f u rb o x p h y l o g e n e t i ct r e eo fr e l a t i v eg e n e st oi r o nm e t a b o l i s ms h o w st h a t ，e x c e p tf o r4g e n e s ， o t h e r6 6g e n e sa r eb a s i c a l l yc o n s i s t a n ti nf u n c t i o n a lc l a s s i f i c a t i o n k e yw o r d s ：e r w i n i a ；i r o nu p t a k e - r e l a t e dg e n e ；s i d e r o p h o r e ；f u r ；b i o i n f o r m a t i c s e c a a b c f u r d n t p e b p c r r p m c d s d h b m s d n b d s b p i s d d p s 缩写词表 e r w i n i ac a r o t o v o r av a r c a r o t o v o r a e r w i n i ac a r o t o r o r as u b s p a t r o s e p t i c a a t p b i n d i n gc a s s e t t e f e r r i cu p t a k er e g u l a t o r d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e s e t h i d i u mb r o m i d e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e c o d i n gs e q u e n c e 2 , 3 一d i h y d r o x y b e n z o i ca c i d m e m b r a n e - s p a n n i n gd o m a i n n u c l e o t i d e b i n d i n gd o m a i n s o l u t e b i n d i n gp r o t e i n i r o n r e g u l a t e ds u r f a c ed e t e r m i n a n t s d n a p r o t e c t i n gu n d e rs t a r v e dc o n d i t i o n s 胡萝h 软腐欧文氏菌胡萝 h 软腐病变种 胡萝卜软腐欧文氏菌马铃 薯黑胫病亚种 a t p 结合盒 铁吸收调节蛋白 脱氧核苷三磷酸 溴化乙锭 聚合酶链式反应 每分钟转数 编码序列 2 ，3 二羟基苯甲酸 跨膜域 核苷结合域 溶解物结合蛋白 调节铁的表面决定因素 缺铁条件下d n a 保护蛋白 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文楚本人在导师指导一f 进行的硪究工作及取得的 研究成果。獬我所知，除了文中特别加以标淀和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发投或撰写过的研究成果，也不包含为获褥塑业壅些是堂或其他 教育机构的学位或诚书丽使弼过的材料。与我一同工作的同志对本研究所徽的任 何贡献均已猩论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：茜f 邑搀签字r 潮：a 年月 孑同 学位论文版权使用授权书 本学链论文终蠢完全了瓣基垄壅些叁茎蠢关 栗罄、镬露掌经论文静麓 定，有权保斟并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅翻偌阕。本人授权鎏些塞望盘茎霹娃将擎住论文熬全郝袋部分蠹套编入骞关 数据库进行检索，可以采用影印、缩即或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 缳密约学位论文在鼹褰磊逶璀本授权书) 学位论文俸辔签名：却邑搀 签字翻甥：尊零胃l 售爱 学位论文作者毕业后去向： 工俸荦位： 遥溅逑蛙： 导；摹签名； 杉争 签字日期：捌年月曩 电话： 爨缡： 酸文氐较寝壤铰代涛裰芙萋闲生耪信意学分雾亍 1 引言 铁对于凡乎新有的生命有税椿来说都慧一释强需元素，在，圭物的代谢过程中起麓 重要作用。作为细胞色素、铁氧化还原蛋白、固氮酶、核糖核苷酸还原酶等细胞物质 戆缝残残努哆铁在釜耱髂海参与分予氧戆铸存窝运输、碳靛弱纯、嚣熬垒貔国定秘 同化、过氧化物的分解、核糖核苷酸的还原以及与电子传递有关的其它重要代谢过稷 1 2 1 。农微生携缨魅中，铁是多秘酶敬辕基或激滔裁，翅鳃腿毯素、缎躯色素爨鼗酶、 过氧化氢酶、铁氧还缀白及铁硫蛋白酶等都需要铁作为活性旗p j 。 铁在生耀条件下的溶解度很低，根难被嫩物所吸收。研究发现，铁在微，生物中的 代i 鸯 系统包括铁载体的生物合成系统、f e 弘的碾收与转运系统、f d + 的吸收系统、溉 铁血红素的吸收系统、贮铁鬣白和其他铁吸收系统以及铁吸收调节系统。微艇物在长 期懿遴纯：l 妻耩中获褥了趸戳难溶性铁鹃活稳、设狡鞫运输鹣特殊辊露l 潮，浚保证铁静 有效吸收。微生物的铁载体( s i d c r o p h o r e ) 是在低铁环境下细黼和真菌合成的一类具有 高度专牲瓣祗分予麓的铁繁会剡，其生物会残受绸藏悫铰浓度麴调节玲叫。微生物 在分泌铁载体的过程中同时含成铁载体相应的膜受体蛋白，在质膜上结合铁裁体，然 后把铁载体吸收到细胞内，提供微生物本身对铁莺葵的嚣求”1 。谗多致病麓常常遴 过它们合成的铁载体络合宿主体液中铁结合濒自上的铁，然尉通过特异性的细胞膜受 体把铁吸收到细胞内以满足这些致病菌生长对铁的需求【9 1 。 1 1 微生物中铁的吸收 通常，细菌可以通过5 种调节方式来维掩细胞内的铁稳态【9 他】。第一，以高亲和 力的铁运输系统从环境中以各种形式来获耿铁；第二，在飕内大量沉积铁，当步 界铁 供应不是霹，可作为一个铁瘁供细菌涮甭；第三，利精氧化滋原胁迫抵抗系统，如铁 诱导的活性氧的降解、氧化还原胁迫诱导损伤的修复；第四，在缺铁条件下，通过降 诋会铁蛋蠡豹表达寒羧鞠铁静瀵耗；筹五，女h 强铁静歪谲节系统，蔽瓣铁静珂瘸弼状 况来调节铁平衡机制的表达。 对予细菌躲铁伐滤，以大肠枉鏊骚究戆竣为瀵楚。骚突发褒，基予e , c o l i 生长条 件的不同，每个细胞的铁含量在1 0 5 10 6 个腺子之问，其它细菌也发现有相似的铁水 平i 。在低铁环境下它可以通过降低p h 值j | 乏提高铁的溶解憾、还原瘫铁到溶解性更 好的溉铁形式以及产生高铁搿予螫合荆作为溶解剂等方式获得铁。 环境中的低铁信号是控制细菌毒力的决定性因素，不同的细菌常利用特殊的机制 麸宿主体肉墩毅铁盼撼l 。如l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s 通遥表面铁还原酶，有翡缩菡弼通 过溶m 索( h a e m o l y s i n s ) 和细胞毒素( c y t o t o x i n s ) ，n e i s s e r i a 属和b a c t e r i o d e s 属的细 菌是逶过转铁器自特努性蛋黩骆柬啜牧铁戆，还有绞缀莹是透过受铬余导系统，懿 y e r s i n i ap e s t i s 通过吸收血红索( h a e m ) ，hi n f l u e n z a e 和& a u r e u s 通过从转铁蛋白 河北农、i k 人学颂十学能论文 ( t r a n s f e r r i n ) 中吸收铁。 受体介导的铁吸收依赖于细菌受体与宿主铁结合摄自的直接接触；涉及特异性的 受体一鬣臼相互作用；铁离子从结台蛋白上转移到受体上，这个过程需要能量：然后 通：i 童一个周质结合脂蛋白转移到一个内在膜蛋白上l 挎。2 2 】，图l 为受体介导的铁吸收 税测酶模式。 固i 一种骚体彳r 导的铁暇收机制 f i g 1f e r r i cu p t a k em e c h a n i s mm e d i a t e d 蛳r e c e p t o r 缺铁条件下，微生物一般依赖予其囊身分泌鼹铁螯合粼采溶解、运输环境中的难 溶性铁。在自然条件下最重要的蝥台剂就是微生物会贼的数量太枣珏秘类繁多熟铁羧 体。几乎所有的微生物均能运输其它细菌和真菌合成的铁载体，从馘使其在自然条l 粤 下生长时更好地竞争铁。既然铁载体般具有极性，那么其分泌过程可能需要特异的 运输蛋裔。研究寝翻，在大肠秆菌中，肠菌素的分泌是妇e n t s 蛋自来介导的f 2 。 1 。l 。1 铁载体 铁载体怒一种螫合剂，可以与铁形成非骺稳定的化合物。n e i l a n d s 【9 1 把铁载钵憋 特性归纳如t ：( i ) 分子量低( 5 0 0 1 0 0 0 d a ) ；( i i ) 具有特异性；( i i i ) 铁载体的生物合成受 溶液中铁浓度的调节；( i v ) 反应的平橡常数约为1 0 5 0 或更高。 涂极个掰缨蘩辨，凡乎所有的好氧和兼往厌氧微生物都能够大艇合成铁载体【朝， 蠢对攘甥彝藻类在缺铁条件游毽能产生铁载体t 2 4 甾 。其中研究眈较深入鼠最其代表髋 的有2 葶申：一辨是从e s c h e r i c h i ac o l i 分离得到的c a t e c h o l 类麓的肠菌素 ( e n t e m b a c t i n ) ”“，另一葶中是出s t r e p t o m y c e sp i t o s u sf 2 8 】产生鹊h y d r o x a m a t e 类登静去 铁敏b ( 见圈2 ) 。焱铁载体中通常存在蹲秽络合铁灼功能基团：，l 萘黔f e a t e e h 0 1 ) 和 2 欧文氏软腐菌铁代谢相关基因生物信息学分析 异羟肟酸0 a y d r o x a m a t e ) 2 4 , 2 9 - 3 1 。其它基团如羟酸、羧酸和2 一羟基苯唑啉等也存在于某 些铁载体结构中【2 9 1 。铁载体合成的一些前体物包括柠檬酸、氨基酸、二羟基苯和n 一 乙酰一n 羟基鸟氨酸p “。 细菌合成并分泌到胞外具有高亲和力的铁载体，在运输铁之前必需先溶解铁j ， 革兰氏阴性菌通过特异的外膜受体蛋白来吸收f e ”铁载体复合物，在吸收过程中， 由质膜电势驱动，t o n b e x b b - e x b d 能量转换系统介导。外周胞质结合蛋白把载有铁 的铁载体从外膜受体运送到质 图2 铁载体基本结构及其示倒 f i g 2s t r u c t u r ea n dd e m o n s t r a t i o no f s i d e r o p h o r e s 膜的a b c ( a t p b i n d i n gc a s s e r e ) 蛋白受体。然后，a b c 蛋白受体再把f e ”一铁载体转 送到胞质中。铁载体复合物在胞质中可以通过还原而解离，释放出铁离子，而铁载体 部分在胞质中被降解，部分被输送到胞外重新利用。许多细菌( 如革兰氏阳性菌) 没 有外膜系统，因此，它们在运输f e ”铁载体复合物时既不需要外膜受体，也不需要 t o n b e x b b - e x b d 系统，而是利用依赖结合蛋白的a b c 透性酶来进行f e 3 + 一铁载体的 转运，使f e ”一铁载体通过细胞膜，所利用的透性酶类似于革兰氏阴性菌的透性酶 ( k o s t e r , 2 0 0 1 ) p ，铁离子的释放与革兰氏阴性菌的相同。 e c o l i 铁运输系统是由对无机铁的低亲和力系统和至少3 种铁胁迫诱导的高亲和 力运输系统组成。由于其系统的复杂性和代表性，使其可作为普通模型来描述微生物 运输铁的机制。ec o l i 合成的铁载体包括肠菌素( 儿茶酚) 和异羟肟酸，其运输包括 两套独立的系统，一种用来运输肠菌素，另一种运输异羟肟酸和真菌分泌的铁载体， 包括粪生素( c o p r o g e n ) 、红酵母酸( r h o d o t o r u l i ca c i d ) 等 3 4 - 3 5 】。 研究表明，铁载体运输系统需要数个基因调控，所有这些产物受铁吸收调节蛋白 ( f u r ：f e r r i cu p t a k er e g u l a t o r ) 的调控【2 。6 j ，仅肠菌素合成运输系统就需要1 6 个基因， 其中7 个用于肠菌素合成，8 个用于肠菌素跨膜运输，另外1 个用于在质膜上把铁离 、一， g ； 尺鼬r 獬舌锨黼 鹭 舛岛 分 河北农业大学硕士学位论文 子从铁铁载体复台物中移走。异羟肟酸类铁载体的运输需要2 个质膜蛋白f h u b 和 f h u c ，一个外周胞质膜蛋白f h u d 和受体骺白，除用于肠菌素合成和运输的基因存在 予质粒上驭矫，所有这些疆自的编码基因均存在于染色体上f 3 “。研究表明，铁- 肠菌 素、铁异羟弱黢、铁柠檬酸帮v b l 2 的运输系统需要t o n b ，e x b b 和e x b d 的参与。 对钤膜运竣蛋囊懿遴一步醣究表疆，有许多离度专一性匏外膜漫体蛋囱存在，如 f e p a 、i u t 、f h u a 、f h 娆，f h u f 积f e c a 3 4 , 3 叭。f e 3 + 铁载体运输送入辩周藤震之艏， 需要相应的质膜蛋自包括f e p b 、f e p c 、f e p d 、f 印g 、f e c b 、f e c c 、f e e d 、f e e e 、 f h u b 、f h u c 和f h u d 等。 1 1 2f e 抖铁载体受体 在擎兰氏阴性慧中，铁载体悫细慰内逡竣蛇营要象传是嚣要外貘受傣器自，辨膜 受体蛋白对同源的f e ”一铁载体具有高度特异性。此外，夕 膜蛋皂受体还能增麴t 铁载体的吸收率，使细菌更有效的从环境中摄取f e 3 + 铁载体复合物，这是由步 膜受 体对相腹的铁载体复合物的高亲和力( k a o 1 1 0 0 n m ) 决定的【5 ，3 9 1 。所有已知的外膜铁 载俸受体蛋白都是有相互关系韵，迄今为止，人们融经了解了至少3 种外膜铁载体受 体蛋自( f e p a ，f e c a 帮f h u a ) 静晶体缩构 4 0 - 4 2 ，外膜铁载体受体般是在缺铁或铁 极少豹熔况下遗过诱导才可以产生，透常奁铁含量足够对不存在，这种调节的一个重 要暇因瓤能是防止噬毽体、大嬲蘧素露抗生素把羚貘受俸当作进入绍藤的一个位煮。 细菌通常具有多个外膜受体，每个受体为缨莹提供不同螅铁载体( 受体县鸯特舞性) 。 e , c o l i k - 1 2 菌株至少有6 种外膜受体，能够与8 种铁载体复会物结会，其中4 耪铁钱 体复合物( c o p r o g e n ，f e r r i c h r o m e ，f e r r i o x a m i n ea n dr h o d o t o r u l i ea c i d ) 是外源性的( 由 其拖微生物产生) ，只有肠菌素怒内源性的。e c o l i 还具有二柠檬酸铁的外膜受体蛋自， 绳够剩孀二柠檬羧铁作为铁源踯】。 1 1 3t o n b e a b b * e x b d 复金体 尽管铁载体与外膜受体的结合与其它因素没有关系，但是f e 3 + _ 铁裁体通过终膜 受钵蛋崮的运输是需要能羹的，所需的能量由细胞膜的电化学梯度来提供，由 翔珏磐- e x b b - e x b d 能蓬传导蛋自复合体传递 4 “鄹。虽然在许多革兰氏阴性菌中都发现 t o n b - e x b b e x b d 蛋整数存在，餐只有对最c o l i 韵转运系统研究的较为深入。在鼠c d 盯 中，能量传导过程需要t o n b 和多 骥受体惩豹壹接接触。在t o n b 依赖的井膜受体蛋 白n 末端的保守的7 个筑水氨基骏片段( 称为t o a b 鑫) 黠于t o n b 舟导静f e 3 + _ 铰载体 的吸收是必需的1 4 6 】，这个区域的取代可使楣| 陂的受体失去转运熊力，这釉影响霹戳遗 过利用带有t 0 n b 基因的质敉转化t o n b 缺陷型菌株进行功能互宰p ，表明t o n b 鑫结 构城可能定位于硒质中，并照自然地与t o n b 蛋臼发生相互作用。但是，外膜受体的 葵它嚣域也会与孙n 酪发生稻互作用f 4 7 4 9 。e x b b 和e x b d 是完整的质膜蛋白，而2 3 9 令氨基酸残基翡t o n b 是藤震蛋裔，并置通过其疏水n 末端结构域锚定在质膜上。研 4 敞文较勰茁铣 毽谢稿笑基| 蜀生物信息学分析 究发现3 种礞自在体外形成一个复合体，对相应亚单位水平的定量分析表明t o n b e x b b ：e x b d 麴毙馕为l ：7 ：2 【5 。l i a ，4f 一+ 暇收系统一慷b c ( a t p - b i n d i n gc a s s e 艋) 系绫 a b c ( a t pb i n d i n gc a s s e t t e ) ，即a t p 转运酶，在原核生物和真核生物中黄遍存在。 a b c 系统燕一种细薤铁暖收系统，该系统藏赖结奁蛋自，对铁其有特异饺。卦膜受 体蛋白或铁载体对该系统不是必需的 3 3 1 。一个典型的a b c 转运系统包括两个疏水区 ( 踌膜域，m s d ) j 珏两个亲z k 区域( 棱苷络台域，n b d ) 。每个斌农区包括6 个薄 膜结构，除了有一个保守的亲水片断外几乎没有别的序列保守性，而n b d 定位于膜 内懊4 ，与a t p 水解楣偶联，为运输过程提供自2 量，n b d 具帑商度保守的短痒列。此 外，在细菌中，还需要一个高亲和力的阐质溶解物结合蛋白( s b p ) 。在革兰氏阴性 细菌中s b p 是可溶的，在革兰氏阳性菌中s b p 通过一个n 米端疏水油脂结台到膜上。 1 1 5f e 2 + 吸收系统一f e o 系统 f e o 系统是大多数细菌都存在的一种铁转运系统，与依赖铁载体吸收铁的系统截 然不同，在f e o 系统中被转运的是f e 2 + 丽不是f e “。箍一个细菌f e 2 + 运输系统是在大 肠秆菌中发现的，出f e o a b 基因编弼，该基因在厌氧条件下被诱导表达，有铁存在的 情况下抑制其表达，太多数一d 占基因是单独存在的，但是这鹾个菇固在许多细菌中 都是僚守盼。 1 + 2 铁吸收调节蛋皇一f w 1 , 2 1f u r 蛋白一依赖铁的调节子 j 1 乎所有的好氧细菌和真菌均有相应的基因，能够在铁胁迫条件下诱导产生相应 的台藏及吸收系统，毡括微生物铁载体受体，膜上麴载体、还暴酶、与铁载体豹生物 合成和降解有关的酶以及调控蛋白等 i , 3 4 , 5 1 】。 囤3f u r 介导的基胃阻遢示意图 f i g 3s c h e m a t i c d i 8 9 r a r a o f f u r - m e d i a , t e d # ee p r e $ s i o n ( s i m o ne t a l 2 0 0 3 ) 河北农业大学硕十学位论文 细菌通常根据胞内铁的有效浓度来调节它们的铁代谢( 图3 ) 。拄ec o l i 和许多其 它纲菌中，这种调节由f u r 蛋囱( f e r r i c u p t a k er e g u l a t o r ) 介导1 5 射。f u r 蛋白控制着 置c o i l 中约多稀依赖铰的箍困的表达i 站搿l 。f u r 蛋自足由1 7 k d a 旺单位组成的二聚 体，每令亚基可鞋结合个f e 2 + ，当与f e 2 + 稽互作用时，可懿阻j 螽转录，而潞” 姣芝时蝮可导致解聚遏。茭宅帮f 矿毒艺合徐耀鼹的并能在钵井与f u r 蛋自结合撙酌金 属离子( 如c 0 2 + 积m n 2 + ) 在缨菠体内的浓度缀抵，因北不足以与f u r 蛋鑫发：生玺瑾 性的相关作用。与盒属离予结会可使f u r 蛋白对d n a 结会袋点麴亲秘力增热t 0 0 0 倍。研究表明，f u r 蛋白可以结合m 红索，但其生理意义尚不渡楚 5 5 1 。f u r 蛋囱亚单 位由2 个结构域组成；n 端d n a 结合结构域和c 沭端富禽组氨酸残基的缩构域，c 宋端结构域的功髓可能是连接共效疵物f e 2 + 和介导f u r 二聚体的形成 5 丁】。f e 2 + f u r 复合锈遴常结合在被抑制基因扁动子的3 5 和1 0 位点之间，最初发现f u r 结合位点与 基甄豹f u r - b o x 的1 9 轴疆文序列穗一致l 躅： g a t a t g a t ( 氛提、酲褪气l i ：瓮 i _ 一 在ec o l i 染色体的任何位置都没有发现这秘严掺的序列，f u r 结合俊点霹能只氍配一 致序捌的1 1 1 1 9 碱基，如t o n b 5 9 1 。 每个ec o l i 细胞中f u r 骚自的含量非常丰富，f u r 对f e 2 + 的柒和力约为1 0 t a m o l l 粥，这与细稔内游离f 浓淡相吻合l 艚l 。f u r 对f e 2 十的亲和力可能随游离f 矿浓度的 生理挫波动逡行调整，稀缅耱和糟铁的形式是f c 2 + 丽不怒f 0 3 + ，同时细胞溶质环境又 是提慰还原性麴，嚣姥，般试为& p 跫细胞中游离铁的生理存在形式。 1 2 2 弦基因的调节 置c o i l 中庙r 是双顺反予皿4 f u ，操纵子的下游基因，这种排列方式也在尉e 撕i e l l a p n e u m o n i a e , 羟筘u e n z a e 和rp e s t i s 等其它细菌中发现 6 1 1 剃基豳对f l d a - f u r 操纵 予是必需豹，弦赵基嚣编码一种能佼簸震中游离淼的铁维持还原态的黄素氧化还原蛋 皇( f l a v o d o x i n ) ，必f u r 蛋基提供f e 2 + 起重要 睾翔。潜存在j 建氧纯物介警的氧纯胁迫 时，s o x r s 系统可诱导f l d a - 如f 操纵子l o 倍波达【6 1 ，另外，f u r 基因含青其鑫身窟动 予，在存在由过氧化氨引起的氧化胁迫时，o x y r 可诱导f u r 綦因l o 倍表达，徨楚f u r 的数量似乎只能增加2 倍。在氧化胁迫时细菌通过f u r 数量上的增加来增加姻您震鲶 f e ”结合髋力、抑制铁的运输以及诱导铁储藏系统的表达等，这些影响衣氧化胁迫对 可降糕细胞质中游离铁离子酌浓度，有助于对抗还原态铁的凑性。 旷基因还可以通 过位予f l 凇- f u r ，鏊函淘隔区豹f u rb o x 迸行微弱的自我调节i 翻，此外，已经报邋，i 圹 基因的表达逐受c a m p 受俸蛋自( c r p ) 瀚控涮辫l 。 6 氅壅垂整盥釜璧垡塑塑茎董疆尘望堡塞笠篓篓 1 。2 3f u r 控制铁的消耗 对f u r 诱导含铁蛋白基因袭达的观察表明，些需铁蛋自的合成与铁的有效性相 逶含 6 3 - 6 4 。在缺少足够熬铁与鬟铁蛋自缝会对，该辍联露 羹逶蕊减少甏铰蛋白躲生成 从而避免浪费。另外，非必需的需铁反应的负调节会增加其它疑重要反应( 如d n a 合成) 的铁供应，从嬲使有效铁自够惩有效地被列用。支持这令枫制的证搀楚在大 肠秆菌f u r 突变株中，铁浓度降低7 0 左右，其中约5 0 的降低是由予铁储存缀自的 缺乏，但是剩余的2 0 降低推测是由于细胞内含铁蛋囱的水平较低m j 。这种根据铁 豹有效髓调整辩铁蛋舀表达豹戆力霹躲释在阪铁生长瓣微生物蘑 霹施够忍受低于纲 胞铁浓度1 0 倍的环境”。 缅麓往软腐瘸是一种危害寄主范豳广，分稚广泛豹植物病密，在缎界范围内广泛 发生。细菌性软腐病菌在适宜条件下能够侵染多种植物，如大田粮食作物、蔬菜、观 黉疆耪、药爱 纛臻、果本及食愆蘧等，劳造成严重经济援失。缨蓉往软藏病由敬文氏 杆菌属( e r w i n i a ) 细菌引起，主要是胡萝h 软腐欧文氏菌胡萝b 软腐亚种e 删i n i a c a r o t o v o r as u b s p c a r o t o v o r a ( 麓髂e c c ) ，嘏梦 、较艨欧文炙蓉黑骚露耪e r w i n i a c a r o t o v o r as u b s p , a t r o s e p t i c a ( ( 简称e c a ) 及菊欧氏菌e r w i n i a c h r y s a n t h e m i ( 简称e c h ) 。 欧美各黧对软腐细菌的研究极为重视。我国，对大自巢、马铃藉、水糕、君子兰、仙 a 掌等多种软潞性细菌瘸害的发生、分布及有关的生物学特性进行了系统研究鄹】，但 是在细菌的致病过程中，铁的作用报道甚少。 因此，研究铁在植物软腐瘸菌代谢中的作用，为认识细菌侵染植物的致病机理、 防治植物细菌性病害奠定了基础。 近馨采，随着生物信息学瀚发展，剿瘸鬟三物信息学方法研究生命虢象与机制已成 为新的研究热点。软腐瘸菌 e r w i n i ac a r o t o v o r as u b s p a t r o s e p h c as c r l l 0 4 3 的全基因 缀序到蠢公| 蠢 6 6 l ，梵本文载礤究提供了蓬论及数摇来源。 本文将在上述基础上，将生物测定与分子检测相结合验证f e 3 + 对e c c 和e t a 的生长 及致病性的影噙，并运用生物绩息学方法找出巍基因缀中与铁代澎毒关夔基霆序残， 并进行棚关分析，为控制软腐瘸的发生提供理论依据。 7 2 。l 枣砉料 2 1 。1 供试蘸株 2 材瓣等方法 耨萝 软藤敬文氏越黼梦卜软腐瘸变稀e r w i n i ac a r o t o v o r av a r c a r o t o v o r a ( 简称 e c e ) ； 胡萝卜软建欧文氏萤码铃薯瓣胫瘸竣穆e r w i n i ac ( g r o t o v o r as u b s p a t r o s e p t i c a ( 麓 袱e e a ) 。 详见旋l ： 袭1 馘株泉源 t a b l e ls o u r c o f b a c t e r i a 菌株编号来源 e c e - i 母 e c e - i - 3 e c m l 墙 e c 扣i - l e c c - 2 - l e c c 2 - 2 e c c 2 3 涎j 农攮大学粪蕾瓣豢实验宽 河j 0 农蛰走学粪茁辩索安验室 游l e 农鼗犬学寞蘧毒豢实验室 河北敏业j i ：= 学冀莲姑素实验室 中因农业辨学虢土壤肥料研究所孛霹农业微生魉蘩靴探簸警趱中心 中霍农业科学豌檀缳所球棱鸯h 蔼组 中国农业料学虢拯僳所冰核细菌组 2 。1 2 供瀵糠糖材料 鸟斑6 8 4 ( 红玻) 马铃薯出涎北农业大学粪猿毒寨实验室提供 2 。1 。3 镤莲壤葬基 试骏避耀孛眉副趣掰鸯玻琏器髓珐援6m o t lh c i 漫滋过援，然羼楚黢蒸承滓浇3 遍，祛除容器上附辫的痰爨铁，避鳃其鼹实验警| 越瓣于扰。试验遥程中掰肖试箭旋培 养熬均以灭藏双蒸水配测。 a c v p ( 结龋紫榘胶酸靛) 墙弊基 在5 0 0 m l 煮沸的蒸馏水中： 0 0 7 5 终菇綮承溶滚1 0m l1 m o t ln a o h4 5m l 1 0 c a c l 2 2 h 2 0 ( 新鲜溶液) 3 0m l 琼胶2 o g n a n 0 3 t , 0 9 蒙暴腔酸镳9 0 9 按上述酝方依次糖入麓速搅搀嚣内先戳速搅捧，待聚浆胶酸钠加入后辩高速搅拌 1 5 s ，然簸分装三焦魏( 每糕1 5 0m l ) 中予1 2 t 。c 炎蘧3 0 r a i n ，趁热蘧| 藏乎投。 凌于 3 欧文氏软腐凶铁代谢相关基闳生物信息学分析 聚果胶酸钠极易凝固，而且加热也不易溶解，所以必须趁热倒成平板) 。 b n a ( 营养琼胶) 培养基 牛肉膏3 0g葡萄糖5 0 l o 0g 蛋白胨2 5 5 0g琼胶l7 0 , - + 2 0 0g 蒸馏水1 0 0 0 m l 将上述培养基用酸度计调节到p h 值为7 4 。1 2 1 ，灭菌3 0 m i n 。灭菌处理后 由于加热后p h 值下降0 2 个单位，所以使用时p h 值保持在7 2 左右。 c 细菌( l b ) 培养基 牛肉膏5 0g 蛋白胨1 0 0g 蒸馏水1 0 0 0 m l 氯化钠5 0g 琼脂粉1 5 0g 将上述培养基用酸度计调节到p h 7 0 7 2 ，1 2 l ，灭菌3 0 m i n 。 d y s 培养液 n h 4 h 2 p 0 4o 5g k 2 h p 0 40 5g m g s 0 4 。7 h 2 00 2g n a c i5 0g 酵母膏5 og 蒸馏水1 0 0 0 m l 1 2 1 ，灭菌3 0 m i n 。 2 1 4 试验药品和溶液的配制 ( 1 ) 马铃薯营养液配方： a 大量元素： k n 0 31 2 6 2 5g ，m g s 0 4 7 h 2 01 2 3 2 5g ，加水到2 5 0 0m l ，配 成1 0 0 的母液i 。 b c a f n 0 3 ) 2 4 h 2 01 1 8g 加水至2 5 0 0m l ，配成1 0 0 的母液i i 。 c 微量元素( 母液1 1 1 ) ：1 0 0 0 的母液 h 3 8 0 44 3 4 0m g ，m n c l 2 。4 h 2 02 7 7 2m g ，c u s 0 4 5 h 2 01 2 5 m g ， z n s 0 4 。7 h 2 02 8 7 5m g ，n a 2 m 0 0 4 5 h 2 07 2 6m g ，n a c l5 8 5m g ，c o d 2 5 h 2 0 2 3 8 m g 加水到1 0 0 0 m l 。 d k h 2 p 0 48 5g 加水至2 5 0 0m l ，配成1 0 0 的母液i v 。 工作培养液： 母液i ，母激i i ，母液i v 各1 0 0m 1 母液i 【i1 0m l o 培养液 9 河北农业人学顺一 “学能论文 ( 2 ) f e c l 3 贮液 1 0m m o l lf e c l3 贮液、1 0m m o l lf e c l 3 贮波、1 0 0m m o l lf e c l 3 贮波： 戳主3 种浓度的溶液依次分剐称淑f e c i3 6 i - 1 2 0 ，o 1 3 5g ，1 3 5g ，1 3 5g ， 转入5 0 0m l 眷量瓶中，薅j 适麓磺蒸水溶解，j s j t x4 1 7g l 的1 2m o l lh c i ( 终浓 度1 0m m o l lh c i ) ，鼹双蒸承定容至5 0 0m l 。并根据实验需要避行适当稀释后 使用。 ( 3 ) 0 8 5 生理盐水 1 2 1 ，灭越3 0 m i n 。 ( 4 ) t e 缓冲液1 0 m m o l l i r i s 。h c i ( p h 8 0 ) ，lm m o l l e d t a ( d h 8 o ) ( 5 ) 试验药品 1 0 s d s ，蛋白酶k ，琼脂耱，e b t a q 酶、d n t p , d n am a r k e r 购自宝生物( 大连) 工程有限公司，r n a s e a ， 溶蘩酶赡是上海华荧生物公司，其余药晶为舀产分析纯；所稍p c r 弓i 物由上海 尘王公司合成。 2 1 5 主要仪器和设备 p c 服务器( i b ms e r v e rx s e r i e s8 6 4 8 ) m i l i qb i o c e l 怒缝承器 洁净工作台 p c r 仪 核酸电泳仪 凝胶图像分析系统 台式离心机# h e r a e u sb i o f u g e 和a n k et g l ，1 6 b 主要应用软件：d n a m a n ，d n a s s t a r 、t r e e v i e w 2 。2 方法 2 2 1 菌种活化 将e e c i _ o 、e c c 。1 _ 3 、e t a 一1 - 0 、e c a - 1 1 、e c c 2 1 、e c c 2 2 、e