（分析化学专业论文）cu增强农药甲萘威及其水解产物对dna损伤的研究.pdf

摘要 本文对离体条件下农药甲萘威及其代谢产物对d n a 分子的潜在的损伤，特别越在向c u 作为筵存污染物时这种损伤能力髂加强避行了研究。蓠先研究了农药甲蔡威在永环境中的降解 栈漤避载，跌磊绘出嚣维鞭静窳解瓠理，结聚表鳞：擎萘藏静农解进程符合一缀最应方程，其 承解受p 艇篷、湿度、承囊秘浓度的影噙。其中p 辩擅鼹滠发对甲綦麟水辫戆影嚷非常大。在茁 常的环境条 牛( 水的蹦值为7 ，湿度3 0 c ) ，甲蒺威缀褰翳水解，箕半襄糍强有犬终1 2 0 h 。说 明甲蒺威在水环境中很容翁降解。在自然的水环境中受无机离予、腐殖黢和微生物等的作阕， 使它产生比较复杂的水解产物，有特进一步去研究；然后利用荧光光谱和紫外光谱研究c u 2 + 参 与下对甲萘成和它的主要水解产物l - 萘酚与c td n a 之间的相蕊作用。结果袭明，甲蔡威本身 就可与c t d n a 产生相互作用形成d n a 加合物，在c u 2 + 参与下使得甲萘威与c t d n a 佧用增强， 结合位煮数n 都奢缀大程魔的增拥。1 萘酚本身不髓等c td n a 产生相互作用，但在c u ”参与下 l ，蒙酪与e td n a 产生相蔓作鲻，甏显寄可能是发生r 诧学爱巍；当甥凝黢魄泳辩甲萘威霸l - 蒺酸对质粒d n a 蜩r 3 2 2 的损揍进簿实验，发现单独螅甲恭藏秘1 - 蒺酚罄不毙黠p b r 3 2 2d n a 产生损伤，但加入锔离子以后甲蒸威鄹1 萘酚都对p b r 3 2 2 d n a 产生明熙的舞嚣和皈链形式的 损伤，而且l “萘酚的损伤能力强于甲萦威，选表明1 藜酚潜在的遗传毒性强子甲萘威。 关键词 甲萘威，水勰，相互搀用增强，c u 2 + ，d n a 损伤，必谱学 a b s t r a c t s t u d yo nt h ed a m a g eo fc a r b a r y la n di t sh y d r o l y z a t e t o u n o r g a n i z e dd n a ，e s p e c i a l l y e n h a n c e & h ed n ad a m a g ev i ac u 2 + f i r s ts t u d yt h eh y d m l y s i sa n dk i n e t i c so fc a r b a r y la n dm e t a b o l i c w ec h o s ef o u re n v i r o n m e n t a lf a c t o r sw h i c hw e r ep h ，t e m p e r a t u r e ，m a t t e rq u a l i t ya n dc o n c e n t r a t i o n o nt h er e s e a r c h t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t e dt h a tp ha n dt e m p e r a t u r e sw e r et w om a i n i n f l u e n c i n gf a c t o r s t h ea l k a l e s c a n c ea n dh e a t sw i l lu r g et h eh y d r o l y s i so fe a r b a r y l t h eh y d r o l y s i s r a t e so f c a r b a r y li nd i s t i l i e da n dr i v e rw a t e rw e r ea l m o s tt h es a m e ，b u ts l i g h t l yb i g g e ri nd i s t i l l e dw a t e r , a n dt h ed i s t i n c t i o nw a sm o r eb i g g e ri na l k a l e s c e n c ew a t e r , a n dt h ed i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o na l s o i n f l u e n c e dt h eh y d r o l y s i so f c a r b a r y li nw a t e r a tt h en o r m a le n v i r o n m e n tc o n d i t i o n ( p h 7 ，3 0 ) ，t h e c a r b a r y lh y d r o l y z e dv e r ye a s y i l yi nw a t e r , s ot h er e s i d u eo fc a r b a r y li nt h ee n v i r o n m e n t a lw a t e ri s v e r ys m a l l a n di th a sv e r yc o m p l e xh y d r o l y s i sp r o d u c t s a n dt h e nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc a r b a r y lo r i t sh y d r o l y z a t ea n dc u l f t h y m u sd n aw i t hc u pw a ss t u d i e du s i n gf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y ( f s la n d u v c a r b a r y lc a ni n t e r c a l a t ei n t ot w i n - s c r e w ss t r u c t u r eo f c a l f t h y m u sd n a ，f o r m e de td n a - c a r b a r y l a d d u c t s t h u sm a k et h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go fc a r b a r y l i tw a sd i s c o v e r e dt h a tt h e a p p a r e n ta s s o c i a t i o nc o n s t a n t ( k a ) i n c r e a s e si nt h ep r e s e n c eo fc u 2 + , t h eb i n d i n gs i t e s ( n ) o f c a r b a r y lm o l e c u l e so nc td n a h a v eo b v i o u s l yc h a n g e t h e1 - n a p h t h o lc a nn o tf o r m e d d n aa d d u c t sl o n e l y , b u ti th a sas t r o n gi n t e r a c t i o nb e t w e e n1 - n a p h t h o la n dc td n aw i t hc u ” a tt h el a s tu s e sg e le l e c t r o p h o r e s i sm e a s l l r i n gt h ed a m a g eo fp l a s i dd n a t h eg e le l e c t r o p h o r e s l s e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tc a r b a r y la n d1 - n a p h t h o lr e s u l t e di ng r e a t e rc o n v e r s i o no f s u p e r c o i l e dd n a t oo d e nc i r e u l a re v e nd o u b l e s t r a n db r e a k sw i t hc 一+ k e yw o r d s ：c a r b a r y l ，h y d r o l y s i s ，i n t e r a c t i o ne n h a n c e d ，c u 2 十，d n ad a m a g es p e c t r u m 独创性声明 y9 3 8 5 0 7 本入声弱所星交的论文是筏个入在导i 蒂指导下遴行的研究工作及取得的骄究成 果。尽我魇鳃，除了文申特别热以栋注和数落款地方夕 ，论文孛不惫禽其穗人邑缝 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一间工律的同恚对本研究所做的任何薅献均已在论文中 睾了明确约谈甥劳表示了谢意。 碱生签名i 豫 露阏： v 。g 年多焉，7 西 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保整、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印藏扫描 等复稍手段保存、汇编学位论文。两意中颡农盐大学讶戳穗不嚣方式在不同媒俸上 发表、传播学位论文的全部或郝分内容。 ( 保糍的学位论文在解密簸应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 赋避：每6 憨 ? 鼹 蝴谚伊争j p 聪7多瞅捌旅 中鬻农韭大学疆士学短瓷文 第一章前言 i i i i i i 掌墨曼詈鼎躺詈蕙鼎! 鼍鼍邕糕曼曼鼍簟霸邕寰舞兽毫磷 第一章前育 1 i 研究背景及意义 近半个世纪以来，缀济发展迅速，自然资源消耗猛增，工北废气、废水和废渣源源不断地排 入环凌，放射牲甥痿、农药款广泛镬翅，人工会袋熬食菇添艇糊、医莼、纯教燕与耗工瑟翅菇不 断进入日常生活，使人岛环境构成的相互影响的艘体受到生态环境破坏的冲击。在e a 登录的化 学品日程遗i 0 0 0 万静，进入帮境的纯学品霄8 万种上下，弼它们中的大多数未经安全性评价。 正是在这种紧追形势下，环境分析毒蠼学在环境科学、遗传学和毒理学的基础上孕育嚣生。它楚 综台利用多学科的信息丽构成的- - f - j 新兴的交叉学科，主要研究环境污染物的致癌、致突和致畸 终弱及其梭涮方法，荠辩巧壤鞭子鹣毒蛙侉琏l 译侩。它棼键捷生秘学家、耀壤科学家窝纯学家深 入了解环境诱变剂的危害，并提出应对环境中新含成的化学物质进行毒理学检测，发现其对多 数哺乳动秘教癌弱的诱交作用。无论燕鉴定、测试和评价系统，还是致癌梳理研究。选定一个宙 理有效的生物学报标都是十分黄要的。应用分析毒理学方法有可毙为评价环缝因予慰人类豹潜农 致癌作用提供理论依据。然而传统的评价方法和评价指标太多数是以化学物质在环境中残存的浓 度或卷慰生物懿惫性毒羧佟为拯准。餐这些标准京缀丈静犀陵靛，苓靛垒垂浮徐纯学耪袋靛环壤 风险性。特别是遗传毒性。所以找出一个新的指标生物标记物。生物标记物作为一个新的评价的 据标在环境分析毒理学研究中的作用主要可概括为两个方面： ( 1 ) 有助予了解环境诱交裁的作用机制及其与致癌、致峭作用鸵关系。 ( 2 ) 有利于研究、开发新的测试方法，鉴别、评价环境因子和新合成化学品的三致作用，对疾病 作出晕絮诊断，麸两l 委貔窝减少窀 】瓣太类鞫嚣壤翡惫害。 理想的生物标记物成具有特异性和应用性。或许有些生物标记不十分理想，但是它仍寄可黥 具有菜方霭特异散蔚资利用。剩用这魏可鉴定的生物标记物和毒理学研究缩粜来描示化学品接触 的致病病因及疾癃发生发展蛉垒过程。目翦文献中广泛擞及的生物标记大多是关于生毖大分子加 合物的应用。近期研究结果证明：选择大分子加台物( 作为生物有效剂量的测定) 和癌基因活化 ( 幸搴受生浆效应标记) 娟维会的方法翼舂穰强鹣生耪合理 空。d n a 是生裙速转信息的戳俸，所鞋傺 持d n a 的相对稳定性十分燕要，特别是对环境中的化学污染物直接或间接作用于d n a 而引起d n a 损伤，干扰或破塥d n a 的复青4 或修复过程，诱发基因突变或染色体畸变的各个不同阶段或过程 的研究，均枣可畿毒在饕与其相应的蠢代表性豹生物标记物，嚣此囊把d n a 女# 食物鞠d n a 损揍懿产 物为新的生物标记物与其它的犬分子加合物商着很大的优越性，它更巍接、更有效的对化学物质 冬遮祷毒栏避程评徐，氇是当今一令沈较热 j 静研究渫聪， 环境是一个开放的体系，其中存在的污染物不可能只是一种或几种。应该是多种污染物共 存的。所以，这些污染物对人体的毒害应是它们共同作用的结粜，而传统的蒋理学大多都是对 单一蠢害物蔟的独立枫制的磅突，这榉褥出的缕爱戴会蠢一定驰局限性，这撵裁鸯必要对不图 的污染物在建存的情况下的互相作用以及这魑作用对它们毒力的影响进行研究。 1 2 农药酶使用现状和对环境的污染情况 据统 中，链器农作耱的瘸虫蕈害，约有5 0 0 0 0 种囊菡，1 8 0 0 种絷革和1 5 0 0 种线虫，使氆界粮食 减产约5 0 。由予农药的应用大大地减轻了瘸虫草蜜对糗食作物的侵害，农药工业在世界藏弱内 得到了迅速发展。采用化学农药是防治病、虫、草害的重簧措旅。目前世界上生产的农药品种 主要有4 2 0 种，其中1 6 0 种杀虫荆和恭螭规1 6 0 种除草帮，5 0 种恭菌荆，其余是植物生长调节责笱和 驱避帮。经常太茧使麓酶静1 0 0 多种l “。出予农药韵使用髓使靛食的损失减少1 5 左右，并置 对蔬菜、求巢和葵它经济佟貔瓣保护毒不霹耱代数捧豫，掰跌农药= 监麴发艇 常迅速。金世 界每年馊用将避3 0 0 万吨鲍农药h 。 但是，任何攀物都是分为二的，农药的馒媚也毒产生不良副作用的一露。茏其是程大量 不舍理使用或滥用的情况下，商可能造成严踅不照后粜吼有毒是化学农药的基本属性。化学 农药的最终归宿鼹最直接黎露予生态环境。从各种类型的污染物对陆地生态系统影响的面来看， 化学农药是最为宽广的；就各种污染物对陆地生态系统的污染采说，化学农药叉是人为主动而且 是最为誊接静。扩散、残留、富集燕纯攀农药不可避免的环境行为。纯学农药残窜物随着大气 和承躲避魂羧长距离遥移，觚一辨环境夯震扩数到舅一静环境分凄，舞显胃通过食物链彩晌登| 遥 距农药蠖用地点的地区的大郢冀它动物。盎予化学结构、爨然辫鳃等方强戆鞭嚣，位学农药会戮 各种形式残爨于农作物和其它环境耍素中，特别是一些持久性残整晶秘靼使禁用熙经过漫长时 间也难以消失，表明了残留闯题的严重性。有残留，也就有了生物蛮集问题。通过残瞬予农产品影 响人体健康删。 l 。3 在环境中存在的c u 2 + 的来源及其危害 从2 0 世纪3 0 年代以米，王农业迅速发鼹，大量瓣污染谚进入环境，b l 起邵境囊璧严蓬恶 化，尤其是重金属污染极为严羹。其工她来源是工业“三废”，尤其是二【业圬水中含窍丈爨的 c u 2 + ；铜在农业生产中有多种用途，它既是作物的微鬣元素，又是一类杀菌剂。硫酸铜作为配 制波尔多液的原料，悬我国目前年销量最大的杀菌剂品种之一。但铜属于无机元索，长期施用 会积累于土壤中。由于重金属污染的范嗣广，持续时间长，又不易在生物物质循环和能量交换 中分解，在环境中易蓄积，能棱壤俸物强收，且往质稳定，狠雅降解，叉能抑制作物生长发育， 促进早衰，降低产量，著_ l 羲进擐系进入棱携俸，蒋通过食耪链静传递和寓集，虽然铜楚入体静 必嚣擞量元素，但禽量过裹最终会蹙害人体健壤刚。 王4 氨基甲馥甓农药瑰状及其使雕| 箩 带来的环魂蔺蘧 1 垂1 氨基甲酸醣农药的绪音驽、用途 氯基甲酸酯农药是一类重要的农药，在农药市场上和农业生产中具有不可忽视的士呶位。这 萸农药最翠是在z o 往纪5 0 年代出现的，由于活性高散、广谱、对高等动物毒懊低、原料易得、 合成藕单，氨基擎酸酯类农药蹩在农作豹僳护中广泛使用的农药，主要有西维园、涕灭威、呋 嫡丹、畦+ 蝉数、克吾戚、巴沙等。鸯2 0 鏊纪弼年健以来，鞋j l 予裔梳鬣农药受刘禁溺或限翊，戬 及抗有机磷杀虫刘的照虫最转爨益增多，因嚣氨基甲酸醋类农药的藤量逐年增抽，它黥年产量 仅次于有机磷类农药而位居籀= 【7 8 ，q 。氪基甲酸酯农药是含骞氮基甲酸基团的酸类化会甥，属 于尿索的衍生物。氨基甲酸醣类农药的结构特性是食有一个n 一甲基綦团，为自色摄体，难旗子 水，易溶于丙酮、= 氯甲烷、氯仿、乙腈等，在碱性和高温条件下很易被水解。它具有分解快、 残留薪短的特点，邸大多数的氨基甲酸醅荧农药在施用后报短的时问内就可降解成相成的代谢 产穆”q 。它的通式为： 2 串鬻农韭大学硕圭学位论文 第一章自i 言 n 一n ： 闰l _ 1 氨然甲酸辩农药的结构遭式 1 4 2 氨豢甲酸鼯农药酶垒理学及生态学毒性 氮基甲羧酝杀虫裁瓣滠盘动物毒 警多垒甥诧学期药壤掌窝痰理学方嚣熬鼓痊，慧结魏下：1 ) 对皿、脑和肝等组织内胆碱酯酶的抑制；2 ) 导致萁它一些酶的活性的改变；3 ) 使血和组织中 葵酸胺辅酶、r n a 、d n a 和糖螽增赭，组织孵酸过程改变，磷耩的合成和霞谢薄低 4 ) 释致缎 细胞、白细胞、啦红素和5 一羟綦色胺增加，嗜酸性细胞，滋巴细胞减少，缎绷胞翻血浆中k + 禽 量改变；5 ) 使肝脏坏死性改变和代谢能力激变6 ) 萁它作用包括使甲状腺活动增加，肾上 黢重量增魏，低巍钙窝葱瞧镳痰，坎及大熬皮屡瓣珐l 瞧l 霉囊。 氨基甲酸醣农药的致畸、致突变和致癌作用闯题越来越受到国际社会的关注。该类农药对 菜骜韵耪胃表现疆5 致畸饿，其中磷究较多的是西维因的致畸捧掰h 8 。氪基甲酸酯类杀虫剂 审制 神经系统中的乙酞胆碱脂酶的的机制对其它包括人在内的非耳标动物也造成危险。 1 4 3 氨鏊甲馥髓类农药的环境杼为 氮基甲簸酯农药在环境中豹残留时间由一周到数年不等，遮类农药具有较高酌生物学毒性， 尤其是有些氮基甲酸醚农药的水溶性较高，容易对地下农造成污染 o j q 。另外，这类农药的产 量很大，如西维因、呋f 精丹，年产量都在万吨以上，它们对整个生态系统具有很强的短期副作 矮戮及长辩戆滞罄毒害 誊蔫。强姥，寿效滔藩氮豢荦酸懿农莼的嚣凌污染袋为夫粕十分关注静 问题。 1 5 农药在环境中的妇趋 农药可以通过各种途径避入环境，如果进入环境中的农药在数量和速度上超过环境的自净 能力，即超过环境的容爨，最终会导致环境的污染。农蘩不正臻瞧囔灏和藏弱，废奏农药的土 壤堆埋，农药废水处理q a 产生的污泥，以及农药在生产、运输和贮存过程中泄露等是农药污染 环境的主簧途羟必a l ，l 。 农药施用于农田后，除一部分被作物所吸收，其余便以不同途径分配至4 番神环境介厦中。如 飙土壤和水律表面向空气中挥发、在土壤中的吸附、在土壤中的移动以及农药从水体向擞物体 内的寓集等。网对，农麴进入弼：境震会在物理、熊学露豢影蟪”f 发生始解、承辫、微生物降辩 等一系列分解过穰”“。 农药程环壤审豹环壤幸亍为投其迁移转纯看静最终爹j 趋主要国农药豹理纯往质掰决定，其中 影响鼹大的是农药的挥发性( 以2 0 。c 时蒸气压表示) 、水溶鳃度、分配系数( k o c ) 和农药在环境中 的降解代谢性能。蒸气遥与水溶解度雉决定农药分配特镊的主豢参数。蒸气压高的农药挥发性 强，翁扶拳域或土壤自大气中扩数。农药鞠求溶躲度与冀在嚣境孛粪奄穆动瞧、吸辫性、生物富 集性都有一定的相关性。水溶性大的农药在土壤中移动性强，容易从农田进入水体或经淋溶进 入蟪下东孛造戒海染，氇荔技艇物程牧箍；l 起急毪危害。糖反，水溶赣小静农药有较强的土壤 吸附性，不易引起大范嘲的环境污染。但水溶性小，脂溶性强( k 。较大) 的农药易在生物体走载 3 中嘲农业大学硪士学位论文第一章前亩 舅群i ii l ll l l 嘲糍篁鲁鼍 累g | 起授缝危密| 1 蝴 影响农药环境归趋的粥一重要园豢是农药在环境中的稳墩性。环境中的各种物理、化学因 子都是影响其稳定性的要豢。农药在环境中的降嬲性能将童接影响其在嚣种环境介质中的擐终 戳爨承平。衡豢农药降解滩易程度的耩标燕农药的降解半衰麓( 霹t ，辩子土壤中的农药，箕 残留性可根据t - 一太小划分三个等级： 1 2 个月为长残留农药。那些性质稳定，不荔分解澄失又具有一定馒性毒性赡农药品耪，大量使用 后就可麓；| 起塞态环境的污染，其残毒阉题往往较为严重。1 9 8 3 年有机氯农药停用瓣，有机磷、 氨熬甲酸酯类、拟除虫菊酷镩一批取代农药发展根快。一般认为这些农药在环境中降解快、残 蜜裁矮。有枧磷农药魄t m 一般在几周劐足个月，鳃基甲酸醋农药髓n 一般瞧是有足个嚣。僵蜃来 研究发现，这些所谓菲持久性农药在策些环境条彳侉下也会有较长残存期并在动物体内产生蓄积 作用。我国农业部1 9 8 9 年对垒国环境旗爨的调查发现所谓的非持久性农药对农畜产鼎污染问题 宥菠突出，在按食律麴襄经济佟耪孛琢毒捡出p i l ，埘 。因瑟在谬毯莱静农楚瞧污染霹缝鳇黠，必 须综合考虑k o c 、水溶性和警衰期。 1 6 农药的降解及其动力学模型 1 6 1 农药障解的影睛潮索辫茹矧 农药在环境中主要有吸附和降解两种去向，冀中农药的降解又可分为艇物降解和非生物降 解鼹辩方式。褒是、热及谨学强予终蠲下发生懿簿瓣理蒙鸯 生物降薅；瓣在袭攘镌体蠹或徽生 物体内外的降解作用属生物降解。生物降解主要怒微生物降解在农药降解中占据了主导地位。 ( 1 ) 环境因子：农药进入环境后，会受到一些环境融予的作用，如：温度、湿度、ph 慎、含水量、 有瓿覆禽耋、熬瘦及气娱等。一觳来滋在亵疆遵濑、存辊震含爨丰富、埔傣碱性翘潦况下，农餐 易于被降解，残留低。 ( 2 ) 农药本身的阂索：农药的分子结构、农药的使用浓度及农药的用药历史蒋也影响农药的降解 佳能。农药嚣荬在分子臻褥及瑾纯瞧豢方覆不嗣，瓣生耪降耨豹敏感往羞黼疆大。 ( 3 ) 微生物的影响：由于农药降解的主要方式是在徽嫩物的作用下进行，因此微生物对于农药的降 解具霄重大的影响。微生物的种类多榉、数量繁多。有耧于农麴的降解。 1 6 2 镦生麴农农药降解巾簸应霜 微生物是农药转化的重骚因素之一，舷物修复也已被广泛地成用于微生物降解环境中的有毒 成分，藏匿盏；l 怒人们的重横n 礤究表爨：溪瞧微生物主要以转纯靼矿耗嚣嵇方式，通道腿癍或臆 外酶直接作用予阚围环境中的农药。避年来，随着分子生物技术研究的深入发展，微生物的降解作 用亦得到了长足的发展口”。 1 6 。3 癸勰途经每桩理辟鼯6 蕊勰l 农药的代谢方式主要有酶促与非酶促方式，而微生物的降解作用主要悬通过其分泌酶的代谢 来完成，其本质为酶促反成其中包括：( 1 ) 广谱性酶的偶然性代谢；( 2 ) 由基质结构姆农药相似 靛酶进行瓣莛 谢；f 3 ) 由裁矮农药作斑髓滚逶应薅进行魏降勰代谢。另，k 还寄通过州改变、辅 酶或化学产物的降解。 目前对于各种杀虫剂的微生物降瓣途径已比较清楚，其主疆的降解遗径主要有以下几种； ( 1 ) 永解佟矮：程，骰生褥侔爝下，酯毽积酝胺键东瓣液褥农药虢簿，魏马控硫磷、敌稗等。 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 ( 2 ) 脱卤作用：卤代烃类杀虫剂，在脱卤酶的作用下。其取代基上的卤被h 、羧基等取代从而失 去毒性，如d d t 降解变为d d e 日p 属此类反应。 ( 3 ) 氧化作用：微生物通过合成氧化酶，使分子氧进入有机分子，尤其是带有芳香环的有机分子中 插入1 个羟基或形成1 个环氧化物，如多菌灵和2 ，4 一d 。 ( 4 ) 硝基还碾：在微生物的作用下，农药中的一n0 2 转变为nh 2 如2 ，4 - 二硝基酚，其降解产物为 2 一氨基一4 一硝基酚和4 一氨基一2 一硝基酚：对硫磷转为氨基对硫磷。 ( 5 ) 甲基化：有毒酚类加入甲基使其钝化，如五氯酚、四氯酚。 ( 6 ) 去甲基化：含有甲基或其他烃基，与n 、o 、s 相连，脱去这些集团转为无毒，如敌草隆的降 解即脱去两个n 一甲基。 ( 7 ) 去氨基：脱氨无毒，如，醚草通。 ( 8 ) 轭合作用：生物体内的中间代谢产物与异生索进行合成反应。 通常农药的微生物降解并不是以单一方式进行的，它可以在多种不同酶作用下以不同的方式 进行。农药微生物降解途径的明了对于人们对该类问题的深入研究具有重要意义。 1 6 4 农药降解动力学模型口”o l 农药及其他有机化合物的降解动力学建模是生态环境研究的前沿领域之一。目前国内外有关 学者已提出若干数学模型模拟农药降解动态规律。在农药的降解规律研究中，一般都认为，农药 在土壤中、植物上的消失，可用一级反应动力学公式来表示，即在不考虑其它因素的条件下，农药 的消失速度与该农药现存的浓度成正比，即满足微分方程： d y d t = - k y ( k o ) ，y ( o ) = a( 1 ) 式中，y 为农药在t 时刻的浓度，t 为施药时间，k 为农药降解速度常数，a 为浓药在t = o 时的浓 度( 初始浓度) 。 解微分方程( 1 ) 可得： y = a e k t ( 2 ) 对式( 2 ) 中的参数a 与k 的估计方法，一般是先对式( 2 ) 两端取自然对数得： l n y = l n a k t 再在上式中令y = l n y ，a = l n a , b = - k ，x = t ，将式( 2 ) 化为线性模型： y = a 4 - b x 1 7 甲萘威在环境中的代谢研究的现状 e p 萘威是一种用途广、产量大的氨基f p 酸酯杀虫剂。不难想象，甲萘威的代谢作用在氨基 e p 酸酯类杀虫剂代谢研究占有晟大比熏，但这不等于说明甲荣威的代谢归宿问题已经比某些更 新的氨基甲酸酯搞得更为清楚了。事实上甲萘威的的代谢作用极为复杂，在生物化学上遗留的 问题也很多。最先都认为氨基甲酸酯键的水解作用是这类杀虫荆的主要代谢途径。基于这一思 路，过去就过分强调了决定水解作用在氨基甲酸酯的作用机制及杀虫效力上的重要性。认为甲 萘威的代谢作用只是一个简单的水解过程，结果是产生 卜蔡酚、二氧化碳和甲胺p 1 1 。现在已 5 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 知西维因的降解途径中有甲基羟基化，环上羟基化，水解以前或以后的结合的多种作用。 西维因在生物体中发生初级代谢的主要途径可以归纳为下图所示【7 】。 图1 - 2 西维因在生物体中发生初级代谢的主要途径 4 一= 羟基萘 西维因在土壤微生物作用下发生的生物降解，降解的主要过程作如下图假设的途径吼 6 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 4 ，5 一二羟基西维因 o 一羟基苯基丁烯酮酸 | i 哐顶一洲c o o h 驭 c o c o o h o h c h ，c o c o o h 丙酮酸 + c h 0 儿茶酚 水杨酸 水杨醛 图1 - 3 西维困在土壤微生物作用下发生的生物降解途径 c 0 2 由此可见，由于自然界的水中含有很多的微生物和其他的些活性物质，所以西维因在水 环境中会有很复杂的水解代谢过程，而且由于所含的物质不同，是必会同上面两个代谢过程有 所区别的水解代谢过程，这是值得我们去深入研究的。 1 8 以d 姒损伤作为生物标记物的毒理学研究进展 d n a 在遗传信息中起到关键作用，它靠碱基的堆积力和氢键维持着双螺旋结构的稳定 性。一些化学毒物和物理因素能损伤它的结构。d n a 损伤使d n a 复制过程中发生的d n a 突变。 引起d n a 损伤的内源过程有氧化、甲基化、脱氨、脱嘌呤，其中 煽化为d n a 损伤的主要类型。 b f 起d n a 氧化损伤的原因有d n a 的自发性化学变化和理化因索引起的d n a 损伤。通过对dn a 的直接氧化作用，并与之形成加合物，它们可造成dna 的损伤：遭受较严重dna 损伤的细胞易 发生凋亡，修复失败时，损伤轻微的细胞则可能发生与损伤密度和dna 损伤修复能力有关的致 痛性突变。 1 8 1d n a 的组成与结构 d n a 的一级结构： 就是指4 种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该d n a 分子的化学构成。核苷酸序列对d n a 高级结构的形成有很大影响。d n a 不仅具有严格的化学组成，还具有特殊的高级结构，它主要以 有规则的双螺旋形式存在，其基本特点是： 7 中 ；t 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 - i 、d n a 分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。 - 2 、d n a 分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。 3 、两条链上的碱基通过氢键相结合。形成碱基对，它的组成有一定的规律。 这就是嘌呤与嘧啶配对，而且腺嘌呤( a ) 只能与胸腺嘧啶( t ) 配对，鸟嘌呤( g ) 只 能与胞嘧啶( c ) 配对。如一条链上某一碱基是c ，另一条链上与它配对的碱基必定是g 。碱基之 间的这种一一对应的关系叫碱基互补配对原则。组成d n a 分子的碱基虽然只有4 种，它们的配对 方式也只有a 与t ，c 与g 两种，但是，由于碱基可以任何顺序排列，构成了d n a 分子的多样性【3 ”。 d n a 是一种生物大分子，它在传递遗传信息起了主要的作用通常认为d n a 分子是右旋的双 螺旋结构，两条螺旋链之间的距离很小，只有i n m ，但长度至少有1 0 3 n m ，因此d n a 分子常常看成是 线状的或形成封闭的圈其中后者的空间结构非常复杂，人们把这种结构的d n a 分子叫做超螺旋 d n a 分子( s u p e r c o i l e d d n a ) ，大部分的d n a 分子在它生命的某一阶段都能形成这种超螺旋的结 构【3 3 】。 1 8 。2d n a 加合物作为生物标志物的应用 据统计，人类每年合成数以千计的新化合物并排放到环境之中，这些化合物许多具有遗传毒 性。如何对这些化学物质进行监测和评价是一项十分艰难而重要的工作。用检测周围媒体( 大气、 水、土壤等) 中化合物含量水平来评价有毒物和人体健康之间的关系是不够的，因为这种外剂量 的评价方法只能给出生物体可能接受的大概剂量，而不能给出一定的信息来说明生物体对毒物 的吸收、代谢、生物效应等的差异。随着研究的深入，人们提出应用大分子( 蛋白质、r n a 、 d n a ) 自h 合物来研究和评价具有遗传毒性的化学物质致癌风险性。它们不仅能反映化学物质及其 代谢产物在组织或体液中的剂量，而且能够提供实际到达的作用部位或与关键的细胞大分子反 应的确切剂量，其中d n a 加合物由于意义重大而成为多学科如环境科学、预防医学、临床医 学等领域当前的国际研究热点。伴随着分予生物学的发展和仪器分析高新技术的应用，有关 d n a 加合物的分析方法、加合物的结构与功能、加合物与癌基园的关系等新认识越来越多刚。 d n a 是生物体内主要的遗传物质。d n a 加合物就是亲电性的化合物或其代谢产物和生物 体内大分子形成共价相连的化合物，是d n a 化学损伤的最重要和最普遍的形式。d n a 加合物 的形成涉及特定的电学及立体化学因素，d n a 分子中的鸟嘌呤是化学致癌物最易攻击的部位， 但与鸟嘌呤基团上哪个位置发生共价结合及其结合程度则由致癌物的化学性质所决定，一种化 学致癌物通常可以形成多种的d n a 加台物。这种加合物一旦逃避自身的修复，就可能成为致 突、致畸、致癌的最小因子，因此d n a 加含物的形成被认为是致肿瘤过程的一个重要起始阶段 ”。近年来，国外学者对d n a 加合物的研究给予了很大的兴趣与关注，自9 0 年代以来，每年 都有数百篇有关d n a 加合物的研究报道。目前国内也有很多人正在开展这方面工作。 1 8 3d n a 加合物的测定 加合物的测定方法是加合物研究的关键内容，这种测定的难处在于要在大量正常的碱基中 测量到含量极低的发生改变的碱基f 3 6 】。由于d n a 加合物的检测具有如此重要的意义，引起了人 们越来越大的兴趣。一些传统的检测d n a 加合物的技术不断引进、发展，同时不断出现了一些 更新颖、更加灵敏准确的方法。现仅就当前国内外较流行的方法简要介绍和评述： 1 3 2 p 屙标记法 8 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 3 2 p 后标记法是目前世界上越来越流行的分析d n a 加合物的方法。自1 9 8 1 年报道以来，其 方法不断完善和改进，已广泛应用于人类生物监测及化学治疗的评价。目前的操作方法包括以下 几个生化步骤：1 f d n a 酶解成脱氧核苷3 一磷酸( d n p s ) ；2 ，加入核酸酶p h 使正常单核苷酸3 端 去磷酸化，而加合的单核苷酸可抵制这一作用；3 用【3 2 p a t p 和多聚核苷酸酶( t 4 p n k ) 标记加合物 核苷酸以产生脱氧核苷3 ，5 一二磷酸；4 分别经过高分辨率的薄层层析( t l c ) 进行分离分析，使 加合物和正常核酸分离，并用放射自显影制加合物显影图或液闪定量。 2 免疫学方法 7 0 年代中期有几个研究小组独立地建立了检测致癌荆d n a 加合物的放射免疫学方法( r i a ) ， 即使是在当时就认识到利用免疫学方法评价人类接触可疑环境致癌剂的潜力。随后迅速研究出 来了用于检测许多不同的d n a 加合物的抗体。由于能获得识别特异性d n a 加合物的抗体，从而 能了解这些加合物的毒性，致突变性和致癌性。目前最常用的d n a 加合物定量的免疫学方法包 括竞争放射免疫法( r i a ) ，固相竞争或非竞争酶联免疫吸附法( e l i s a ) 和超敏感酶放射免疫法 ( u s e r i - a 、。 3 色谱，质谱法 质谱与毛细管气相色谱的结合是目前灵敏度最高的技术之一。然而多数被修饰的碱基、核 苷、核苷酸用气相色谱分离却难以充分地气化。因此必须获得挥发性和热稳定性较好的衍生物， 最常见的衍生物为三甲基硅化物和甲基化物。疏电子衍生物如三氟乙酰化物、五氟苯基化物以 及乙酰五氟苯基化物已被用于阴离子质谱源的电子俘获，灵敏度达到了1 0 0 4 摩尔。 4 序列测定法 与d n a 相互作用的特异性位点分析是通过改良标准的m a x a m g i l b e r t 化学法和s a n g e r 双 脱氢法d n a 测序技术而得到的。通过这些方法可以容易地获得一些其他方法得不到的信息，如 损伤的分布，配位基的结合，特异性酶促反应以及用各种因素处理d n a 所产生的生物学作用。其 分析的方法分别依靠产生d n a 损伤的因素在d n a 修饰位点引起d n a 断裂的能力或者抑制聚 合酶作用的9 力。 5 碱洗脱法 在化学物和d n a 相互作用的过程中，常常产生一类很重要的d n a 损伤，即d n a 交联。有许 多化学抗癌剂即由于引起这种损伤而产生抗癌作用，如顺铂，丝裂霉素c ，放线菌索d 氮芥等。双 区理论认为致癌剂也可引起d n a 的链间交联。检测d n a d n a 交联的基本方法是碱洗脱法。 为了区分一个化合物产生d n a 损伤是通过链断裂还是通过交联，采用k o h n 的洗脱率原理。其主 要方法是将细胞与化学物一起孵育，然后移去受试物，将细胞悬液用3 0 0 或6 0 0 拉德的x 射线照 射，裂解细胞以释放d n a ，经一定孔径的滤膜过滤，照射的功能是使d n a 链断裂，交联的d n a 因 滞留于滤膜上而洗脱较慢。利用特殊孔径的滤膜可以将d n a d n a 交联、d n a 蛋白质交联与 其他的d n a 损伤区分开来。检测d n a d n a 链间交联和d n a 蛋白质交联的原理不同。 d n a d n a 链间交联的出现，由于形成两条或者多条d n a 链间的交联，使其不能通过滤膜而减慢 了洗脱速率，而d n a 一蛋白质交联则是因为蛋白质在碱性条件下趋于吸附滤膜而降低洗脱速率。 因此可以通过蛋白酶降解蛋白质与滤膜的吸附区别这两种类型的交联。检测d n a d n a 交联时 在裂解液中要加蛋白酶k ，而检测d n a - 蛋白质交联时，裂解液中则不能含有蛋白酶k 3 1 。 9 6 荧光法 原理是通过某些化合物( 特别是多环芳烃) 的d n a 加合物具有荧光的特性来测定，其检测限 为1 个加合物1 1 0 6 8 核苷酸，目前发展的技术有同步荧光色谱法，激发一发射荧光法，低温激光法。荧 光法的优点是不破坏d n a 链就可以测定，另外可以确定加合物的不同立体异构体及d n a 链上的 不同位点上的加合物，也可以研究d n a 加合物形成和切除与时间之间的动态关系。其缺点是所 需d n a 样品量大( 1 0 0 1 0 0 0 u g ) 。而且该法不能检测非荧光化合物的混合物质形成的加合物 3 4 o 7 原子吸收光谱法 主要用于测定金属离子，可用于监测服用抗癌药物的癌症病人的d n a 加合物情况。通过 a a s 法测定和其它方法显示。一些抗癌药物与d n a 共价结合。为了测定癌症病人组织中键合到 d n a 上铂的量，未知样品定量时，必需与标准曲线作对照。另外要获得足够高的灵敏度，必需使用 带z c c m a n 背景校正的a a s i j ”。 其中荧光法由于其操作简便、实验周期短的特点得到了广泛的使用。 目前有关d n a 加合物的检测主要应用于以下几个方面：1 ) 通过对大分子加合物的生物监测 可以对人类接触来自环境和职业性的致癌剂提供更确切的接触评估，从而大大加强了传统的流 行病学研究；2 ) 鉴定引起人类癌症因素，阐明化学致癌的基本机制；3 ) 研究d n a 损伤和修复机理；4 ) 了解化学抗癌药物的作用机理、治疗效果以及药物抗性，指导化学抗癌药物的合成p ”。 1 8 4d n a 的氧化损伤 氧化损伤( o x d a t i v e d a m a g e ) 与衰老、中毒、肿瘤、及某些疾病均有密切关系，现已证实， 氧化损伤导致的脂质过氧化可产生多种自由基，其中活性自由基特别是o h 还可直接攻击d n a ，引 起包括d n a 单链断裂在内的多种d n a 损伤。众所周知，d n a 损伤继而又可诱发细胞突变，未修复 或修复有误的突变最终将导致肿瘤的发生。因此检测组织细胞对氧化损伤的敏感性及损伤后的 修复能力具有重要的意义p 9 a o 川。 d n a 氧化损伤表现形式也是多种多样：d n a 链断裂、碱基的变化( 碱基的脱落、异构互变和 修饰) 、交联( d n a 链内、链问和d n a 与蛋白质之间) 。正是由于d n a 存储着生物体赖以生存 和繁衍的遗传信息，所以维护d n a 分子的完撼性对细胞至关重要1 3 9 , 4 2 。 近年文献研究的内容多数在于外源性，大致可分为以下几类：1 物理因素：如电离辐射、超声波 等。有文献报道，3 2 0 4 0 0 n m 的紫外线引起活性氧自由基如0 2 。、o h 的产生量增加，引起细胞 膜损伤及d n a 损伤，促进皮肤癌前病变和皮肤癌的发生。2 化学因素：有几类化学物质与生物体 内形成多种自由基关系十分密切 4 2 , 4 3 1 。 1 8 4 1 氧化损伤的机理1 4 1 d 4 j 5 l d n a 氧化损伤大多都有自由基的参与或与之有关，生物体内一定的自由基水平是维持正常 生命活动所必须的，自由基与细胞的增殖、分化、凋亡、坏死等多种病理、生理现象密切相关。 正常情况下，机体的氧化与抗氧化处于一种动态的平衡之中，但由于各种原因，如某些外源化含 物、电离辐射或机体自身的抗氧化防御体系受损等，均可使机体的自由基水平明显增高，机体的氧 化与抗氧化失衡，导致机体的氧化应激。过量的自由基特别是活性氧自由基。可以攻击包括d n a 在内的几乎所有的生物分子，产生多种不同的后果( 如肿瘤、畸形及衰老等) 。近年来，自由基学说 1 0 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 成了毒理学领域研究的热点之一。主要原因是自由基在不同部位均可造成氧化性修饰，当自由 基氧化还原反应发生在d n a 上时，d n a 的氧化性损伤会由于d n a 碱基修饰以及随后的进一 步反应造成点突变，以基因表达改变等，从而导致严重病理现象如癌症等疾病发生。 1 8 4 2d n a 的氧化损伤及后果 正常情况下，细胞中的有关酶类和小分子物质的抗氧化效应可拮抗自由基的损伤效应，氧化 损伤与抗氧化防御体系的防御作用处于一种动态的平衡状态之中。机体内一定数量自由基的存 在，是生物机体维持正常生理功能所必需的，只有在自由基过度产生或机体的抗氧化防御体系功 能受损的情况下，过多的自由基才导致机体的氧化应激，自由基攻击靶分子造成组织、器官及各 种生物分子不同程度的损伤1 4 ”j 。 研究表明，自由基对d n a 分子的攻击，可以分为d n a 分子的碱基修饰、d n a 单双链的断裂 等。自由基( 如r o s 中的o h ) 中极为活泼的单电子，容易与亲核性的d n a 分子结合，导致d n a 碱基的修饰改变，胸腺嘧啶的氧化修饰产物有2 0 多种，鸟嘌呤c8 位的氧化( 形成8 - o h d g ) 是最多 见的，d n a 链中8 - o h d g 的存在，可以引起d n a 复制时碱基的错误配对及编码，导致基因突变。 研究表明，r o s 自由基中的o h 和0 2 。等可以引起d n a 链断裂，其中o h 的作用更为突 出，o h 政击d n a 分子的部位可能在核糖的3 和4 碳位，断裂的d n a 链必须不断修复，参与d n a 修复的酶也同时受到自由基的攻击而影响其功能的发挥，因此修复过程可能会出现编码的错误 导致基因突变。同时，链断裂可引起碱基缺失、癌基因活化( 如：r a s 癌基因g c 与1 a 的易位) 和 抑癌基因灭活( 如：抑癌基因p 5 3 的g c 与1 a 的易位) ，最终可导致肿瘤的发生1 4 5 j 6 j ”。 1 8 4 3dna 氧化损伤的易感性及dna 的抗氧化防御体系 研究表明，核内d n a ( n d n a ) 和核外d n a ( 线粒体d n a ，m t d n a ) 对自由基氧化损伤的反应 性不同，m t d n a 易受自由基攻击，原因可能有：m t d n a 没有组蛋白和非组蛋白的保护性结合：m t d n a 的损伤修复能力比nd n a 差；m td n a 与