（生态学专业论文）农杆菌介导的acdc转座系统转化甘蓝型油菜的研究.pdf

中文摘要 删ii ii ii i ll ll ll l lllll y 18 3 3 5 3 9 原创性声明 本人的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的，学位论文没有剽窃、 抄袭等违反学术道德、学术规范的侵权行为，否则，本人愿意承担由此产生的 一切法律责任和法律后果，特此郑重声明。 学位论文作者：铩娟 日期：p 年y 月 e t 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅：本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者：群录蛹日期：7 。i o 年岁月弓j 日 中文摘要 中文摘要 突变体是指某个基因发生变异或某个性状发生可遗传变异的材料，我们可 以利用这些突变材料来分离和鉴定基因的功能油菜是世界上最重要的油料作物 之一，长期以来对其研究的主要目标就是要阐明控制其重要农艺性状的遗传基 础并克隆相关基因。但近年来有关构建油菜突变体库的研究却鲜见报道，这无 疑阻碍了油菜功能基因组学的发展。为开展油菜功能基因组学研究使得大规模 构建油菜突变体库显得日益迫切。白玉米a c d s 转座子系统发现以来，已经被 成功应用于水稻、拟南介、番茄、烟草等多种异源植物进行基因的分离与克隆。 利用d s 因子可以在a c 转座酶的作用下发生跳跃的特性，探索将此系统应用在 油菜中来构建突变体库，为研究油菜基因功能提供研究材料。近十年来，油菜 在转基因方面取得了重大进展，油菜的转基因研究和分子克隆取得了令人瞩目 的成就，使油菜的品质和种质资源得到改良。农杆菌介导法是油菜遗传转化最 常用的方法，它是一种纯生物的天然转基因方法，操作简单，成本低，使它成 为目前应用最广泛的遗传转化方法之一。 本研究利用农杆菌介导法将含有a c 元件的质粒p u b i a c 及含有d s 元件的质 粒p d s b a r l 3 0 0 分别转化甘蓝型油菜中双6 号的子叶柄与下胚轴，经过筛选、生 根、驯化、移栽，分别获得了1 0 株转化a c 的卡那霉素抗性植株和2 8 株转化 d s 的潮霉素抗性植株。p c r 检测发现，在1 0 株a c 转化植株中有1 株为阳性苗， 阳性率为l o ；在2 8 株d s 转化植株中有2 1 株阳性苗，阳性率为7 5 。该结 果为我们下一步构建油菜突变体群体及开展油菜功能基因组学研究将可能开辟 一个新的途径。 关键词：a c d s 转座子：甘蓝型油菜；转化；p c r 鉴定 a b s t r a c t a b s t r a c t m u t a n ti sm a t e r i a lw h i c hi sag e n em u t a u t e do rac h a r a c t e rc a nb eg e n e t i c v a r i a t i o n w ec a nu s et h e s em a t e r i a l st os e p a r a t ea n di d e n t i f yf u n c t i o no fag e n e b r a s s i c an a p u si so n eo ft h em o s ti m p o r t a n to i lc r o p si nt h ew o r l d , o n eo ft h em a i n g o a l si st oc l a r i f i n gt h eg e n e t i cb a s i so fi m p o r t a n ta g r o n o m i ct r a i t s e o n t r o l e da n d c l o n i n gg e n e s c o n s t r u c t i o nm u t a n t sl i b r a r yo fb r a s s i c ar 配l p u sa r e1 皇1 er e p o r t si n r e c e n ty e a r s ，i tu n d o u b t e d l yh i n d e r e dt h ed e v e l o p m e n to fb r a s s i c an a p u sf u n c t i o n a l g e n o m i c s t oc a r r yo u tf u n c t i o n a lg e n o m i c ss t u d i e s o fb r a s s i c an a p u sm a k e s l a r g e - s c a l em u t a n tl i b r a r yc o n s t r u c t i o nb e c o m i n gi n c r e a s i n g l yu r g e n ls i n c et h e m a i z ea c d st r a n s p o s o ns y s t e mw a sf o u n d , i th a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e di nt h e c o n s t r u c t i o no fh e t e r o l o g o u sp l a n t st os e p a r a t ea n di d e n t i f yag e n e ，f o re x a m p l e s ， r i c e 、a r a b i d o p s i s 、t o m a t o 、t o b a c c oa n ds oo n u t i l i z et h ef e a t u r et h a td sf a c t o rc a n b e j u m p u n d e rt h ee f f e c to f a c t a p e s e ，w e c a ne x p l o r et h ea p p l i c a t i o no ft h i ss y s t e mt o b u i l db r a s s i c an a p u sm u t a n tl i b r a r y ，i tc a np r o v i d em a t e r i a lt os t u d yb r a s s i c an a p u s f u n c t i o n a lg e n o m i c s i nt h el a s td e c a d e ，g e n e t i c a l l ym o d i f i e dr a p e s e e da n dm o l e c u l a r c l o n i n gi nt h es i g n i f i c a n tp r o g r e s s ，i ti m p r o v eq u a l i t ya n dg e r m p l a s mr e s o u r c e 3o f b r a s s i c an a p u s 4 9 r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s - m e ：( f i a t e dg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ni st h e m o s tc o m m o nm e t h o dw h i c hi sa p u r en a t u r a lb i o l o g i c a lm e t h o d si nb r a s s i c an a p u s i t ss i m p l e ，l o wc o s t , w h i c hm a k i n gi tt h em o s tw i d e l yu s e dm e t h o d so fg e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n i nt h i ss t u d y ，t h ep l a s m i dp u b i a ci n s e r t e da ea n dp l a s m i dp d s b a r l3 0 0i n s e r t e d d sw e r et r a n s f o r m e di n t oc o t y l e d o n p e t i o l ea n dh y p o c o t y lo fb r a s s i c an a p u sc u l t i v a r z h o n g s h u a n g6b ya g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s - m e d i a t e dm e t h o d , a f t e rs c r e e n i n g , r o o t i n g , a c c l i m a t i o n , t r a n s p l a n t i n gf r o mt h es u r v i v e d1 0a ct r a n s g e n i cp l a n = ，l p o s i t i v et r a n s g e n i ci n d i v i d u a lw 嬲i d e n t i f i e db yp c ra s s a y 、析t hap o s i t i v ef r e q u e n c y o fl0 f r o mt h es u r v i v e d2 8d st r a n s g e n i cp l a n t s ，21 p o s i t i v et r a n s g e n i c i n d i v i d u a l sw e 聆i d e n t i f i e db yp c r 、 ，：i t hap o s i t i v ef i e q u e n c yo f7 5 * , t h i ss t u d y w i l lp r o b a b l ys u p p l yan e wm e t h o df o rt h ec o n s t r u c t i o no fb r a s s i c an a p l l sm u t a n t p l a n t sa n di t sf u n c t i o n a lg e n o m i c sr e s e a r c h n a b s t r a c t k e y w o r d ：a c d st r a n s p o s o mb r a s s i c an a p u s ；t r a n s f o r m a t i o n ；p c ri d e n t i f i c a t i o n i i i 目录 中文摘要 a b s t r a c t 引言 目录 第一章文献综述 ” 第一节a c d s 转座子系统及其在油菜中应用的策略改进”2 1 构建突变体方法 2a c d s 转座子系统概述” 2 2 1a c d s 转座子系统的结构特点3 2 2a c d s 转座子系统在异源植物中的应用4 2 3 转座子标签法“5 2 4a c i d s 转座子系统载体的构建策略6 2 4 1 一元转座子系统6 2 4 2 二元转座子系统”6 2 5a c d s 转座子系统用于构建油菜突变体的策略改进7 2 6 a c , d s 转座子系统在油菜功能基因组研究中的应用前景l l 第二节农杆菌介导的油莱遗传转化 1 农杆菌转化机理及优点 2 转化方法 1 1 1 1 1 3 2 1 原生质体与农杆菌共培养法1 3 目录 2 2 整株感染法l3 2 3 叶盘转化法14 3 根癌农杆菌介导的油菜基因转化研究进展1 4 3 1 转化过程中的影响因素1 4 结语 1 5 第二章农杆菌介导的a c d s 转座子转化甘蓝型油菜及其鉴定1 6 前言16 1 材料和方法e o o o e o q 1 7 1 1 实验材料17 1 1 1 主要仪器设备和材料。1 7 1 1 1 1 设备。l7 1 1 1 2 受体材料17 1 1 1 3 菌株及载体。l7 1 1 2 培养基l8 1 1 3 试剂。1 9 1 1 - 3 1 激素。19 1 1 - 3 2 抗生素。2 0 1 1 3 3 质粒d n a 提取缓冲液2 0 1 1 3 4 植物基因组d n a 提取液2 0 1 2 方法。2 0 1 2 1 初始材料的获得2l 1 2 2 培养条件2l 1 2 3 油菜的遗传转化2l 1 2 3 1 农杆菌的活化：2 l 目录 】2 3 2 农杆菌介导的遗传转化及植株再生。2 j 1 2 3 3 转化苗的生根和移栽。2 2 1 2 3 4a c 转化植株卡那霉素筛选浓度的确定2 2 1 2 3 5d s 转化植株潮霉素筛选浓度的确定2 2 1 2 4 抗性植株的分子生物学检测2 2 1 2 4 1 质粒d n a 的提取2 2 1 2 4 2 植物基因组的提取2 3 1 2 5 转基因植株的p c r 检测2 3 1 2 5 1p c r 反应体系的建立：- 2 3 1 2 5 2 对a c 转化植株进行p c r 检测2 4 1 2 5 3 对d s 转化植株进行p c r 检测”2 4 2 结果与分析” 2 5 2 1 转基因流程“2 5 2 2a c 转化植株卡那霉素筛选浓度的确定2 6 2 3d s 转化植株潮霉素筛选浓度的确定2 7 2 4a c 转化植株筛选2 7 2 5d s 转化植株筛选2 8 2 6 移栽前的驯化2 9 2 7 转基因植株检测3 0 2 7 1a c 转化植株p c r 检测3 0 2 7 2d s 转化植株p c r 检测3 0 3 讨论3 2 3 1 影响甘蓝型油菜中双6 号转化效率的因素3 2 3 1 1 激素配比3 2 3 1 2 菌液浓度3 2 3 1 3 共培养时间3 3 3 1 4 延迟筛选”3 3 目录 3 1 5 褐化和玻璃化3 3 3 2a c d s 转座子系统在油菜中的应用展望3 4 第三章结论与讨论。3 5 l 结论。3 5 2 讨论。3 5 3 未来工作安捧3 6 参考文献。3 7 致谢” 个人简历4 3 引言 引言 目前，已完成全基因组测序的模式植物拟南芥和水稻都已分别建立了大规 模的突变体库1 和小规模的突变体掣4 刀。突变体是指某个基因发生变异或某 个性状发生可遗传变异的材料，我们可以利用这些突变材料来分离和鉴定功能 基因。这些突变体为研究拟南芥、水稻的基因组功能和蛋白组功能提供了很好 的材料。油菜( b r a s s i c an a p u s ) 属十字花科( c r u c i f e r a e ) 芸薹属( b r a s s i c a ) 植物， 是我国乃至世界上重要的油料作物之一，菜籽油是良好的食用油，含有丰富的 脂肪酸和多种维生素。油菜籽榨油后的饼粕富含蛋白质，还含有碳水化合物、 纤维素、矿物质等，是良好的精饲料。近年来有关油菜全基因组测序项目的工 作取得的阶段性进展：2 0 0 9 年1 0 月1 2 日，据从中国农科院油料作物研究所获 悉，由我国科学家领衔的白菜、甘蓝和油菜全基因组测序项目取得了阶段性重 大成果，目前已获得了白菜全基因组的精细图、甘蓝和油菜全基因组的框架图； 2 0 0 9 年1 0 月1 6 日的国际农业生物技术周报刊登了德国拜耳作物科技公司宣布 完成了油菜的完整基因组测序工作。可以预见油菜全基因组测序的完成以及油 菜基因组生物信息学平台的建立，将大大加快油菜功能基因组学的研究进程。 开展油菜功能基因组学研究使得大规模构建油菜突变体库显得日益迫切，其中 一个主要目标就是要阐明控制其重要农艺性状的遗传基础并克隆相关基因。但 目前无论是其大规模突变体库还是小规模突变体库，都未见相关的研究报道。 自玉米a c d s 转座子系统发现以来，已经被成功应用于种异源植物进行基 因的分离与克隆。利用d s 因子可以在a c 转座酶的作用下发生跳跃的特性，探 索将此系统应用在油菜中来构建突变体库，为研究油菜基因功能提供研究材料。 近十年来，油菜在转基因方面取得了重大研究进展，油菜的转基因研究和分子 克隆取得了令人瞩目的成就，使油菜的品质和种质资源得到改良。农杆菌介导 法是油菜遗传转化最常用的方法，它是一种纯生物的天然转基因方法，操作简 单，成本低，使它成为目前应用最广泛的遗传转化方法之一。 本研究利用农杆菌介导法将含有a c 元件的质粒p u b i a c 及含有d s 元件的质 粒p d s b a r l 3 0 0 分别转化甘蓝型油菜中双6 号的子叶柄与下胚轴，探索一套a c o s 转座子系统在油菜中的应用体系，为下一步构建油菜突变体库和开展油菜功能 基因组学开辟一条新途径。 文献综述 第一章文献综述 第一节a c d s 转座子系统及其在油菜中应用的策略改进 构建突变体方法 就目前来讲，构建突变体的方法有很多，有自发突变、物理化学突变、同 源重组、基因沉默、以及插入突变等嗍。方法之多但都有各自的优缺点。自发突 变是长期的自然选择和人工选择的过程中形成的，此种方法构建的突变体库包 含有极为丰富的突变体，但是由于是长期的自然选择和人工选择使突变体的遗 传背景变得异常复杂，给后续研究造成很大的困难。物理、化学诱变虽然可以 得到饱和突变体库，但是由于其诱变过程很难控制，一般一个突变体包含有多 个点突变，所造成的突变表型较为复杂，增加了功能基因鉴定的难度，而且在 克隆基因时要用较复杂的图位克隆法，很难在全基因组测序信息的基础上进行 基因功能的研究。同源重组在酵母和鼠类中应用的较为成功，在植物中应用此 种方法时发现同源重组率比较低1 9 1 ，不适合在植物中应用。基因沉默在用于构建 线虫突变体库中得到了成功应用，但并不适合于植物i l o j 。 近几年来，利用插入突变来构建突变体库的方法得到了广泛应用，与其它 几种方法产生的突变体相比具有很多优点，该方法可以利用已知的转座子序列 为标签，不必预先确定基因型和基因产物即可对未知基因进行研究。t - d n a 、 逆转座子标签和转座子是构建插入突变体库的三种主要方法。目前，利用转座 子插入构建突变的方法被认为是进行大规模基因功能研究的有力工具之一 1 1 1 - 1 3 j ，与另外两种方法相比转座子介导的插入突变的优势表现在：( 1 ) 可通过 转座子的不断跳跃产生新的突变体，相对于较少的转化植株就可以获得整个基 因组的大部分突变体，大大减少了工作量；( 2 ) 可应用于转化效率不高的物种， 可通过常规育种有性杂交的方法不断获得新的突变体；( 3 ) 转座子是一个完整 的元件，便于后期的分子分析；( 4 ) 转座子还可产生回复突变，利于验证所产 生的突变是否由转座子引起以及验证突变基因的功能i l 引。 2a c d s 转座子系统概述 2 文献综述 1 9 4 4 年，美国遗传学家m e c l i n t o e k 在以玉米为材料的遗传学研究中，发现了 可移动的d n a 片段，并将其命名为“转座子 【1 5 】。当时并未被人们接受，直到 1 9 6 7 年在大肠杆菌的半乳糖操纵子研究中发现了可以转移的插入序列这类转座 子以后，转座子理论才被人们重新认识和接受，m e c l i n t o c k 也因此于1 9 8 4 年获得 了诺贝尔奖1 1 6 1 。 转座子可以在转座酶的作用下从基因组的一个位置“跳跃一到另一个位置 或者从一条染色体“跳跃 到另一条染色体。玉米的自主转座子a e ( a c t i v a t o r ) 是 m c c l i n t o c k 在研究玉米染色体重排和断裂时发现的第一个可移动的遗传元件，在 1 9 8 3 年被克斛1 7 1 。a c 因子的长度为4 5 6 3 b p ，末端带有ll b p ( 5 c a a a t g a a a i t r c a t c c c t a 3 ) 不完全的反向重复序列o r s ) ，包含一个占据a c 因子大部分 的单一转录单元，该转录单元由5 个外显子( e x o l - - e x 0 5 ) 组成，编码一个3 5 k b 的 m r n a ，该m r n a 是一个由8 0 7 个氨基酸组成的开放阅读框( o r f ) ，i i p a c 转座 酶( a e t p a s e ) t 1 8 1 。在该开放阅读框前面为装配有几个t a t a 盒的序列，后面是装 配有几个多聚腺苷化位点的序列。几个转录起始位点位于a c 因子5 端的第3 0 2 到 第3 5 7 碱基之间。a c 能在自身转座酶的作用下进行转座，其不断转座使得转基因 植株难以稳定，突变材料不易寻找不利于研究，因此研究者们将具有自主转座 能力的a e 因子加以改造使其只能够合成转座酶，但是缺失转座序列，丧失了自 主转座能力。d s ( d i s s o c i a t i o n ) 元件大d , 0 4 - 4 k b ，通常被认为是a c 因子缺失衍生 而来的，因为其含有a e 因子两端的i r s 序列和完整的转座序列，但缺失或部分缺 失合成转座酶的序列，因此不具有a e 转座酶活性，所以d s 元件单独存在时不能 发生转座，只有同时存在a c 时d s 才能从原位点切离插入到新的位点【1 9 】。据此构 建了a e d s 转座子系统( 图1 1 ) 。 转座子在发生跳跃后重新插入到植物的基因组中，有可能插入到起始位点 相连锁的位置，也有可能插入到不连锁的位置。a c d s 转座子被认为多倾向与连 锁效应。这种倾向在玉米、番茄、烟草、拟南芥中都已有报道，在单子叶植物 的水稻、大麦中也有类似报道1 2 0 。k o l e s n i k 等1 2 1 】研究水稻时发现，平均6 的转 座位点在原初位点附近( 在同一个b a c 克隆) ，1 2 插入t - d n a 内部，1 3 0 o - 2 0 的转座在供体位点附近4 e r a 内，估计不连锁的d s 转座实际占3 1 - 4 2 。k i l n 等圈 在研究水稻是j i t e d s 转座位点分成3 类：( 1 ) 4 8 插入t - d n a 内部：( 2 ) 3 4 与 供体位点在同一染色体：( 3 ) 6 1 2 与供体位点不在同一染色体。如等因j 在研 究拟南芥时发现d s 插入位点倾向于分布在染色体末端而很少在着丝粒附近，并 3 文献综述 且有5 0 d s 转座子位于蛋白编码区。r a i n a 等【2 4 】通过对2 6 0 个独立的单拷贝拟南芥 株系研究发现，4 8 d s 椅子插入到开放阅读框区，说明在拟南芥中d s 因子的跳 跃基因序列没有明显的偏好。 目前，有关a c d s 的转座机制还不是很清楚，普遍认为其属于剪贴( c u t - a n d - p a s t e ) 型，即非复制型，当d s 从原位点切除后插入到一个新的位点时，其结果 是在原来的位置上缺失了d s 因子，而在插入位置上增加了d s 座因子。a c d s 转座 子系统造成的突变机制是当d s 在a c 转座酶的作用下发生转座时，如果d s 插入到 某基因的内部或邻近位点，就破坏了该基因的结构，在后期的转录和翻译时发生 错误造成基因突变。 k 因子矽t _ 兰i r 乒i r 紫_ _枷子秒势弓疋 内含子 歹潦 初级划烈a 翻瞄函圈圈圄_ 圈- i _ 加工后的m 刚a 瞄_ 霸_ 缺失部分 d s 6 孑盔扬隧园i 瞵r 图1 i 玉米a c d s 转座元件示意图1 2 5 l 2 2a c d s 转座子系统在异源植物中的应用 b a k e r 等【2 q 首次将a c d s 转座子系统应用于转基因烟草中，研究发现该系统 在烟草中具有转座活性，这是首次发现转座子在异源植物中具有活性的报道。 此后，a c d s 作为外源转座子系统应用于多种异源植物中，如拟南芥、水稻、番 茄、矮牵牛、亚麻、胡萝卜、莴苣、马铃薯等，并分离克隆了部分功能基因( 见 4 一 文献综述 表1 1 ) 。 表1 1 基于a c d s 转座子系统分离异源植物功能基因 2 3 转座子标签法( t r a n s p o s o nt a g g i n g ) 转座子标签法又称为转座子示踪法，作为生物标签的一种，既无需知道基 因的产物，也无需了解基因的表达特点1 4 2 ，其原理是利用转座子的插入突变表 型，以已知的转座子末端序列为标签，采用分子生物学方法分离克隆转座子旁 侧基因序列的方法。利用转座子标签法分离克隆基因的一般步骤如下：( 1 ) 构建 含转座子质粒载体，为了方便筛选可以除草剂、抗生素等为筛选标记：( 2 ) 通过 转基因方法将质粒载体导入植株基因组中，构建一定规模的转基因再生植株；( 3 ) 基因突变产生植株表型变异，挑选感兴趣的突变植株进行鉴定；( 4 ) 采用分子生 物学的方法鉴定插入拷贝数；( 5 ) 对突变体进行遗传分析，并对突变基因进行克 5 文献综述 隆【4 3 1 。 目前，利用转座子标签法分离克隆基因的方法主要有两种：一种是基于 s o u t h e r n 杂交的方法，另一种是基于p c r 的方法。基于s o u t h e r n 杂交的方法试验 周期长，操作过程比较复杂，选择适宜的限制性内切酶较困难，对于研究插入 有多拷贝转座子的突变体以及数量众多的突变体来说，此种方法并不是一个高 通量的理想方法。随着p c r 技术的发展现在研究者普遍采用p c r 方法扩增转座子 旁侧的宿主基因组序列，并进一步分离目的基因。p c r 方法主要包括反向p c r ( i n v e r s - p c r ) 、接头p c r ( c a s s e t t e - p c r ) 、热不对称交错p c r ( t a i l p c r ) 、半 随机两步p c r ( s t - p c r 法) 哗】，而在植物中应用a c d s 转座子系统分离克隆其旁侧 序列的方法应用最多的是反向p c r 【4 5 4 7 】和热不对称交错p c r 法 4 8 ，例或者将二者 结合使用【矧。 2 4a e 1 ) s 转座子系统载体的构建策略 2 4 1 一元转座子系统 a c 自主转座系统就是a c 因子在自身转座酶的作用下进行转座，以此来构建 突变体库的方法。最初，a c 自主转座子系统是用来分离含内源转座予的植物基 因，后来发现该系统在异源植物中也具有转座活性，而且利用此系统分离克隆异 源植物的的大量基因。但a c 因子在自身转座酶的作用下不断跳跃，造成变异的 不稳定性，从而无法辨别和研究突变体，所以a c 转座系统并没有被广泛应用【2 0 j 。 2 4 2 二元转座系统 二元转座子系统既a c d s 转座子系统，是通过基因工程的方法将a c 转座所必 需的5 和3 末端切除，让其只发挥编码转座酶的作用，而不发生转座。d s 元件含 有转座所必需的末端反向重复序列，而不含有编码转座酶的基因，所以d s 只有 在a c 存在的情况下才能发生转座。 在应用a c d s _ 二元转座子系统时，构建载体的类型有两种：一是将a c 和d s 构建在同一载体中，如i 型载体( 图1 2 ) ，另一种方法是将a c 和d s 分别构建在不 同的载体中( 图1 3 ) ，如i i 型载体。但是在i 类载体中，把a c 和d s 构建在同一载 体中，导致d s 不断转座，突变类型不稳定，而且当d s 再插入附近位点时，a c 和 d s 可能连锁导致选择不到有效突变体，不利于对突变体的检测与研究所以没有 6 文献综述 被广泛应用。 图1 2i 载体示意图【5 0 】 i l 型载体的出现就弥补了i 载体的缺陷，因此被广泛应用。此种载体可以分 别单独转化植株，再将得到的a c 转化植株和d s 转化植株进行有性杂交，d s 就可 以在a c 转座酶的作用下发生转座，以此来构建突变体，最大的好处就是可以人 为控制，只有让a c 和d s 同时存在时，才会发生转座事件。此方法简单易行，减 少了工作量，节省了时间和费用，有利于植物大规模突变体库的构建。此系统 的另一个优点是可以在杂交前选择a c 与d s 起始植株的拷贝数，并且通过杂交获 得大量的转座频率稳定的同义t l 代种子，这样通过较少的起始转化系就能获得 大量的d s 插入突变体。 x l b 亟目r b 图1 3i l 型载体及转座示意图【5 l 】 2 5a e 3 d s 转座子系统用于构建油菜突变体的策略改进 利用a c d s 转座子系统构建油菜突变体虽然较其它方法具有很多优点，但仍 存在不足之处：( 1 ) d s 的转座频率高低直接影响突变体的研究，偏低则得不到 有效的突变体，而且筛选工作量大，偏高则不利于d s 的稳定，d s 不断转座难以 得到稳定的突变体；( 2 ) 油菜是a a c c 型异源四倍体，基因组来源于白菜和甘 蓝，当d s 发生转座时，虽然插入到基因组中，但是一些同源位点可能替代该基 因的功能从而掩盖了突变性状；( 3 ) d s 因子插入内含子或即使插入外显子但未 7 文献综述 改变油菜的基因编码序列时，仍然无法表现出预期的突变性状。因此，采用一 些策略改进就显得尤为重要。主要策略有以下几种： ( 1 ) 采用合适的启动子 a c 转座酶基因表达水平对d s 的转座频率和发生的时间有很大影响。b a n c r o r 等【5 2 】研究发现，d s 转座发生的频率与a c 转座酶的表达存在正比关系。启动子决 定着a c 的转录和表达，不同的启动子所产生的a c 转座酶的量不同，引起d s 转座 的频率也不同。陈游等【4 l 】利用水稻愈伤组织比较t a c 自身启动子、c a m v3 5 s 启动子及u b i 启动子控制下a c 转座酶基因的表达对d s 因子切离频率的影响，结果 表明使用u b i 启动子d s 因子的切离频率最高，达到了7 2 9 。s w i n b u m e 等【5 3 】在拟 南芥研究中发现，启动子与a c 转座酶编码区的嵌合基因表达越强，则d s 因子的 转座频率也越高。b a l l c e l l 等【5 4 】利用热休克启动子同a c 转座酶基因编码区相连， 通过4 2 热诱导，增加了转座酶m r n a 表达的丰度，提高了拟南芥未成熟胚中 d s 因子的切离频率。因此构建多种不同启动子的a c 载体，转化植株后与d s 转化 植株杂交，通过对d s 转座子在油菜体内的活动性能检测，筛选适合于油菜突变 体构建的启动子。 ( 2 ) 基于a c d s 的基因陷阱系统 油菜是异源四倍体，一些同源位点可能会替代发生突变的基因从而掩盖了 突变表型的识别。为了克服这一困难，采用了基因陷阱的方法，使d s 与报告基 因构造在同一载体中，使其同d s 一起转座，当它插入到一个有功能的基因内部 时，该基因的启动子会使g u s 表达，通过g u s 染色可以检测出无明显表型变 化的突变株。目前发展了三种类型的陷阱系统：增强子陷阱、启动子陷阱、基 因陷阱( 图1 4 ) 。基因陷阱常指这三种的统称，它们之间最大的不同是报告基 因重组体的组成和插入位置1 5 5 1 。基因陷阱的最大好处是并不需要产生可见的突 变表型，只需要报告基因的表达来筛选突变体，各种类型的转座子中只有a c d s 转座子系统应用了基因陷阱，并且已经应用于拟南芥、水稻和大麦的相关研究 5 6 - 5 9 1 。 8 文献综述 a b c d - - l _ - 。- k m _ - _ ：j h 图1 4 三种基因陷阱的载体结构及转座机理【6 0 1 g e n o m i cd n a e n h a n c e rt r a p p r o m o t e rt r a p g e r mt r a p ( a ) 基因组d n a 。红色方块代表外显子，黑色线状为内含子。( b ) 增强子陷阱。当带有弱启 动子( t a l a ) 的报告基因插入到基因组d n a 中时，如果恰好插入到某个增强子附近，在该 增强子的作用下，报告基因表达，则可推知插入附近有增强子或有基因( c ) 启动子陷阱。 当无启动子的报告基因插入到基因组的外显子中，如果插入位点附近有基因，在该基因的 启动子的作用下，报告基因就会同基因一同转录产生融合转录物，则报告基因表达。( d ) 基 因陷阱。由一个无启动子的报告基因与一个剪接受体( s a ) 组成( 剪接受体位于报告基因 上游) ，该重组体一旦插入到基因组的内含子中，则转录时剪接受体部位与该基因内含子 一起被切除，产生融合转录物，报告基因表达 9 一 坼 n p 一 _ 甲 n 一 文献综述 ( 3 ) 与c r e l o x 位点特异性重组系统结合使用 a c d s 转座子系统与c r c l o x 位点特异性重组系统结合产生插入突变和特 异染色体区段的缺失，最终引起染色体重排【6 i 6 2 1 。c r e l o x 由两个l o x 位点和 催化它们的重组酶组成，该系统由三个载体组成：t - d n al o x d sl o x 、a c 转 座酶t d n a 和c r e 重组酶t d n a 。t d n al o x d sl o x 中有两个l o x 序列，一 个和d s 相连并能和d s 一起转座称为d sl o x ，另一个位于t - d n a 中称为t - d n a l o x 。d sl o x 能在a c 转座酶的作用下转座到t - d n a 附近，两个l o x 位点之间 就插入了一段染色体片段，l o x 的插入方式决定了重组的结果。当它们与含有 c r e 重组酶的植株杂交时，如果两个l o x 序列方向相同，则它们之间的染色体 区段会被剔除；如果两个l o x 序列方向相反，则它们之间的染色体区段会跳至 旁侧而发生重组，通过对染色体片段剔除或重排的分析可以研究基因组不同染 色体片段的功能。在油菜中我们也可以尝试应用此系统，来提高油菜的突变率 和特异性突变。 仁= i 咔 i 眦n v e r s i o n 8 8 驻 图1 5c 耐l 0 x p 位点特异重组系统的重组模式【6 3 1 ( 4 ) 修饰载体 当a c 和d s 的转化植株在田间进行有性杂交后，就会产生大量的突变体，如 何快速准确的在在众多植株中找到突变体是一个复杂而繁琐的工作，所以我们 要将载体进行修饰。栾维江等【5 1 i 将a c d s 转座子系统应用于水稻构建突变体时， 在含有d s 的载体( 见图1 3 ) 上将b a r 基因构建在d s 元件的旁侧，紧挨d s 的是u b i 启动子，当得到的a c 转化植株和d s 转化植株进行有性杂交时d s 发生转座，b a r 基因就会与u b i 启动子相连，此时b a r 基因表达，发生转座的植株表现出b a s t a 抗性，其后代中可以大规模施用b a s t a 除草剂，具有b a s t a 抗性的植株即为发 l o 文献综述 生转座的植株，这样在苗期就可以鉴定筛选出d s 插入的突变体。报告基因g u s 随同d s 一起转座，当它插入到一个有功能的基因内部时，该基因的启动子会使 g u s 表达，通过g u s 染色可以检测出无明显表型变化的突变株。对于油菜我们 也可以采取类似的方法。 2 6a c d s 转座子系统在油菜功能基因组研究中的应用前景 有关a c d s 转座子系统在油菜功能基因组研究中的应用国内外都有相关 报道，但都还停留在a c 转座酶活性和d s 转座频率研究。如郭学兰等畔j 研究 发现a e 因子在转基因油菜中具有转座活性，b a b w a h 等在油菜中应用a e d s 转座子系统，发现d s 因子确实可以在a c 转座酶的作用下发生转座。有数据表 明( 未公布) 在拟南芥中a c d s 转座子系统具有较高的活性，且d s 在转座酶 的作用下在配子期的转座频率可以达到6 8 蚶6 5 l 。拟南芥和油菜均为十字花科 植物，亲缘关系较近，而且在拟南芥中应用a c d s 转座子系统已经克隆出了 相关基因1 2 7 审z j 。 建立油菜饱和突变体库是油菜功能基因组学研究不可缺少的重要组成部 分。以突变体为材料直接获得突变基因的序列信息并确证基因序列与功能的关 系，是基因克隆及阐明其重要功能的基础和前提。因此，利用a c d s 转座子系统 构建油菜突变体库及研究油菜功能基因组学前景广阔。 第二节农杆菌介导的油菜遗传转化 在植物转基因工程中，油菜是少数几种在转基因研究方面取得较大进展的 作物之一。随着油菜遗传转化的日益成熟，自1 9 8 5 年第一株转基因油菜诞生以 来，转基因油菜的研究近十年来迅速发展。目前，应用于油菜遗传转化的方法 多种多样，其中主要以农杆菌介导的方法为主，此外还有电击法、显微注射法、 基因枪法、真空渗入遗传转化法、p e g 法、花粉管通道法等 e , - c , s l 。 l 农杆菌转化机理及优点 农杆菌介导法是油菜遗传转化最常用的方法。农杆菌是一种普遍存在于土 文献综述 壤中的革兰氏阴性细菌，包括根癌农杆菌( a t u m e f a c i e n s ) 和发根农杆菌( a r h i z o g e n e s ) ，它能在自然条件下趋化性的感染大部分双子叶植物的伤口，导致 受伤部位产生冠瘿瘤和毛发根。根癌农杆菌含有肿瘤诱导质粒( t i ) ，t i 质粒 上有可移动d n a ( t d n a ) ，毒性区( v i r ) ，结合转移区( c o n ) ，和复制 起点区( o r i ) 。t d n a 区在农杆菌侵染植物的伤口时使其携带的基因在植物 中表达。t - d n a 的左边界和右边界是转移识别的唯一信号，两边界之间是生长 素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合成基因，v r i 区编码t - d n a ，加工、转 移及整合的功能蛋白。农杆菌的大略转化过程见图1 5 。因此农杆菌是一种天然 的植物遗传体系旧】。经过人们改造，通过农杆菌感染植物的伤口