（微生物学专业论文）拟南芥成膜素相关蛋白（phrip1）在植物细胞板形成中的功能研究.pdf

塑成膜紊相关蛋白( p h f 口1 ) 功能的研究 缩略语 娜 k a n s p e c r e f g m x 如d 胱 u g n c a l s l p h r i p l r a n 2 缩略语表 英文名 中文名 知n p l i c n l i n氨苄青霉素 k a n a m y c i ns u l f a t e硫酸卡那霉素 s p e c 缸m y c m壮观霉素 v , t f a m p m利福平 g e 啦衄y 豳s u l f a t e硫酸庆大霉素 孓b l 咖4 d l l 0 帕- 3 - 缸d o i y l - b 孓溴4 氯3 吲i 桀晷d - n 翻l a c q 伊柚0 s i d c半乳糖核苷 瓤i 觚瑚却h 。唧矗函l c 坶o d 嗽灿嚏i d c4 6 - 二脒基二苯基吲哚 奴弘0 p y n h b $ d 伊l a 瞰d d c异丙基硫代每n 半乳糖苷 酗c p 啦磁妯a p 出碱基对，千碱基对 d 啪b i e 豳珂l e d h 2 0 双蒸水 n 嬲扣d e j g i a m 砘姻啦妯日把脱氧核糖核苷酸混合物 面c g i 锄i d e 劬9 h i 妯劬e核糖核苷酸混合物 il i d 妇im e d i u m i b 培养基 m缸i昭分子量标准 0 洳l d e 璐i t y 光密度 孙吗出畦cb u 疵l ds a l i n e磷酸盐缓冲液 r 嗍衄麟枷p 0 蜘嘲戤c b a 蛔l c a d i o n 反转录聚合酶链式反应 s o d i i 蛆d o d c c j f i s i 雌h 蜊y a c 聊锄i d c十二烷基磺酸钠- 聚丙烯 鲥c l c 曲哑蜮凝胶电泳 f l i n e s o 咖i s 0 衄晖y 孤a l e异硫氰酸荧光素 u d p 毋啪h a 璐丘勰u d p 葡萄糖基转移酶1 c a l l o s es ”t h a s e胼胝质合成酶 曲i a 罢m 删“m 既a c 6 n g p f o t e 缸1成膜素相关蛋白1 r a n 2s m a l lr a sg t p - b i n d i n gn u c l e a rp r o t e i nr a n 2 小g t p 结合蛋白 7 咖哪蛐一一一璩m嚼一一 华中农业大学博士学位论文 缩略语英文名 n p k l n e c i e e s - a 耐砷眈割p i 嬲“0 c 删p o 妇妊喊1 n a c k l 2 n p l ( 1 哪垃缸g 妇i e 洲丑雕，i e i n l n q k li 啦o t i a n a k i n a s e n e x t t o n l m a p k m 洳萨m 幽_ 锄e dp l 哪e 缸蜘蹴 k r p s 虹瞻面h e l 砷。dp t 蛐 a i p a k r p 垅a 瑁啊d o p s j s 母嘲掣p l 鹅瞬蜘埘 k i n e s i n - r e l a t e dp r o t e i n1 2 中文名 核成膜体定位蛋白激酶1 n p k l 激活激酶蛋白1 烟草n p k l 下游激酶i 促分裂原活化蛋白激酶 驱动蛋白k r p $ 拟南芥成膜体相关 驱动蛋白1 2 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 豫毫一 如需保密，解密时间 矽9 年多月膨日 是否保密 声蹦诵嚣高冀 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均己在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：乃笠安时间：唧年岁月j 占 日 学位论文使用授权书 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 糊黼馘：乃杰发撇名：旅多醐 签名日期：伽7 年乡月f 占日签名日期：乃司年厂月，g 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 拟南芥成膜素相关蛋白a p h f 口1 ) 功能的研究 中文摘要 植物细胞有丝分裂后期由高尔基体衍生而来的泡囊沿着成膜体微管向赤道板 移动，到达赤道板整齐排列，与成膜体微管共同形成桶状成膜体。在赤道板上成 膜素缠绕在泡囊外，将泡囊挤压成哑铃型( 、1 ) ，同型、1 r y 融合形成膜结构状 细胞板细胞板的形成是一个连续的膜融合过程，随着细胞板离心生长，膜融合 发生在延伸细胞板的生长边缘，到达母细胞壁并与母细胞壁融合形成新生细胞壁， 将母细胞分裂成2 个子细胞。细胞板形成与生长影响细胞的分裂，与植物细胞的 周期循环、组织器官发育、形态构建等息息相关 植物动力蛋白一成膜素存在于成膜体中，在细胞板形成的早期泡囊融合中发 挥重要作用。成膜素相关蛋白( p h 吨卿p l 吲缸锄锄嘶g p i o 蝴l ，p h r i p l ) 是从拟南 芥c d n a 文库中分离出来的与成膜素相互作用的蛋白，在细胞分裂后期与成膜素 共同定位于细胞板上该蛋白结构中有1 个富含赖氨酸的核定位结构域、2 个r n a 结合位点和3 个锌指结构，是一个新型的r n a 结合蛋白 我们推测p h r i p l 的潜在功能；在植物细胞分裂前( 问期) ，p h r l p l 可能结合参 与细胞板形成的某种重要基因的m r n a ，调节该基因的转录后的表达，为细胞后 期分裂作准备；在细胞分裂后期，p h r i p l 可能结合该基因产物或其它蛋白，共同 调节或促进成膜素起始复合物的形成，激发细胞板形成和延伸的早期泡囊融合 为探索p h r i p l 在细胞板形成中的作用，本文从以下5 个方面对p h r i p l 的潜在功能 进行了研究。 1 、利用酵母双杂交技术研究与p h r l p l 相互作用的靶蛋白 用p h r i p l 作诱饵，通过酵母双杂交( l i a c - s s d n a - p e g 酵母高效转化) 方法 筛选拟南芥a d c d n a 文库，经l e u 营养缺陷型初筛获得1 9 2 5 个克隆，x - g a l 显 色复筛得到1 8 1 个克隆，酵母菌落p c r 检测获得9 0 个克隆，抽提质粒经酶切、 p c r 鉴定得到6 8 个质粒，再经回复验证获得6 0 个阳性质粒，核苷酸测序结果分 析，获得4 6 个与p h r 口1 相互作用的蛋白质的编码基因。选择其中4 个基因进行克 隆表达，纯化其蛋白，经体外蛋白质与蛋白质相互作用研究，证实4 个靶蛋白均 能与p h r 坤1 具有相互作用；经蛋白质结构分析和功能预测，确定3 y 基因编码的 小g t p 结合蛋白r a n 2 ( r a s r e l a t e dn u c l e a rp r o t e i n ) 作为研究的靶蛋白。 华中农业大学博士学位论文 2 、利用亲和吸附法研究与p h r i p l 相互作用的m r n a 利用与g s tb e a d s 结合的g s t - p h r l p l 融合蛋白吸附拟南芥总r n a ，提取结合 的r n a ，测定0 d 2 6 0 值，经r t - p c r 鉴定p h r l p l 特异结合的m r n a 。将被特异结 合基因克隆到p t y b 2 ( 含1 7 启动子) 载体上，在体外转录m r n a 并用【d 3 2 p 】r u t p 标记探针，经紫外交联、r n a 凝胶电泳迁移试验( 删s a ) 研究p h r i p l 结合特 异r i g a 的能力。结果表明p h r i p l 能特异性结合r a n 2 m r n a 。 3 、小g t p 结合蛋白r a n 2 的g t p a s e 活性、表达谱及亚细胞定位分析 r a n 2 基因结构分析显示，r a n 2 含有5 个外显子和4 个内含子，其c d n a 编码 约2 4k d 蛋白，该蛋白含有2 2 1 氨基酸。在大肠杆菌中表达、纯化r a n 2 蛋白，用 钼铁盐法测定其g t p a s e 活性。结果表明r a n 2 具有固有的g t p 酶活性。r t - p c r 和w e s t e r nb l o t 分析结果表明，r a n 2 - m r n a 在拟南芥根、茎、叶、花中均表达； r a n 2 蛋白存在存在植物可溶性部分中。荧光抗体定位结果表明，r a n 2 参与细胞有 丝分裂的各个过程，在细胞有丝分裂间期，r a n 2 主要定位于核膜上，前期分散于 细胞质中，后期定位于赤道板和纺锤体上，末期又回到子细胞核膜上。 4 、不同植物r a n 2 基因的克隆及同源性分析 从洋葱、大蒜发芽根和油菜幼苗中抽提r n a ，用拟南芥r a n 2 引物和r t - p c r 方法克隆r a n 2 基因，测序比对分析结果表明：拟南芥r a n 2 基因与洋葱、大蒜和 油菜r a n 2 的核苷酸序列同源性分别为9 9 7 0 、1 0 0 、8 9 9 4 ；氨基酸序列同 源性分别为9 9 1 0 、1 0 0 、9 6 3 8 ( 除了大蒜r a n 2c 末端缺少一个天冬氨酸d 外) 。这些结果表明r a n 2 在植物进化中高度保守。 5 、p h r l p l 突变体分析及，矗，口1 、r a n 2 基因超表达和r n a i 载体的构建 栽培拟南芥丹，口1 ( t - d n a ) 突变体与野生型，观察其表型并进行分子生物 学分析。结果显示，p h r i p l 突变体与野生型在表型上没有明显差异。r t - p c r 检测 珊r 口1 m r n a 均为阳性。在植物可溶性蛋白中，利用p h r l p l 抗体进行w e s t e r n b l o t 分析均未检测到p h r i p l 。p h r i p l 是一种膜相关蛋白，与细胞的膜成分紧密结合不 易被浸提出来。t - d n a 插入的p h r i p l 突变体仍可转录其m r n a ，说明该突变体以 非纯合体存在( p h r l p l 为植物必需基因，如果形成纯合体，植株则不能存活) 。为 了进一步研究p h r i p l 和r a n 2 基因在植物细胞板形成过程中的作用，本研究构建 了超表达载体p b i - p h r i p l 和p b i - r a n 2 ，r n a i 干扰载体h e l l s g a t e 2 - p h r l p l 和 2 拟南芥成膜素相关蛋白o 恤砰1 恸能的研究 h e l l s g a t e 2 - r a n 2 ，g f p 融合蛋白表达载体p m o n - g f p - p h r i p l ；进行了拟南芥遗传 转化，收获了t 0 种子，其表型正在观察中 关键词：细胞板形成；成膜素；成膜素相关蛋白1 ( p h d 畔1 ) ：小g 3 t 结合蛋白r a n 2 ； 拟南芥 华中农业大学博士学位论文 a b s t r a c t d u r i n ga n a p h a s e i n p l a n tc e l l s , g o l g i - d e r i v e d v e s i c l e st r a v e l a l o n g t h e p h r a g m o p l a s tm l e r o t u b u l e st o w a r da n dr e a c ht h ee q u a t o r i a lr e g i o no ft h ec e l l t h e y g r a d u a l l ya l i g ni n t ot h ec y l i n d e r - l i k eo rb a r r e l - l i k ep h r a g m o p l a s lp b r a g m o p l a s b i n - h e l i c a la r r a y sw m pa r o u n da n ds q u e e z ev e s i c l e si n t ot h ed u m b b e l l s h a p e dv e s i c l e t u b u l e - v e s i c l e ( v t v ) s t r u c t u r e so nt h ee q u a t o r i a lp l a n e t h ev t v sf u s ew i t he a c ho t h e r a n dc o n s o l i d a t ei n t ot h em e m b r a n e l i k es t r u c t u r ec e l lp l a t e t h e r e f o r e , m e m b r a n ef u s i o n d u r i n gc e l lp l a t ef o r m a t i o ni sac o n t i n u o u sp r o c e s s a st h ec e l lp l a t eg r o w sc e n t r i f u g a l l y ， m e m b r a n ef u s i o ne v e n t s 似：c i i re x c l u s i v e l ya tt h eg r o w i n gm a r g i no ft h eo u t w a r d l y e x p a n d i n gc e l lp l a t eu n t i lr e a c ha n df u s ew i t ht h ep a r e n tc e l lw a l li n t ot h eu e w c e l lw a l l d i v i d i n gt h ep a r e n ti n t ot w od a u g h t e rc e l l s t h ef o r m a t i o na n de x p a n s i o no fc e l lp l a t e a r er e q u i r e df o rc y t o k i n e s i si np l a n tc e l l sa n dc l o s e l yr e l a t e dt op l a n tc y t o k i n e t i cc y c l e ， o r g a n e l l ed i f f e r e n t i a t i o na n dm o r p h o i o g i ca r c h i t e c t u r e a p l a n td y n a m i n l i k ep r o t e i n - - p h r o g m o p l a s t i ni np h r o g m o p l a s tp l a y sap i v o tr o l e i ne a r l ym e m b r a n ef u s i o ne v e n td u r i n gc e l lp l a t ef o r m a t i o n p l 姻掣p i 罄血面血翱曲g i x o t e i n l ( p h r l p l ) i s o l a t e df r o ma r a b i d o p s i sa d - c d n al i b r a r yh a sb e e ns t u d i e da n d i n d i c a t e dt h a tt h i sp r o t e i ni n t e r a c t e dw i t hp b r o g m o p l a s t i na n dc o - l o c a l i z e dw i t ht h e p h r a g m o p l a s t i na tt h ec e l lp l a t ed u r i n gc y t o k l n e s i s p h r i p lc o n t a i n sal y s i n er i c hr e g i o n , t w or n a - b i n d i n gd o m a i n sa n dt h r e ec o c - t y p ez i n c - f i n g e r sa n di tm a yb ean o v e l r n a b i n d i n gp r o t e i n w ep r e s u m et h a tp h r i p lm a ym e d i a t et h ee x p r e s s i o no fp o s t - t r a n s c r i p t i o no ft h e t a r g e tm r n a w h o s ep r o t e i np l a y sak e yr o l ei nt h ef o r m a t i o no fc e l lp l a t eo rc y t o k i n e s i s b yp h r l p li n t e r a c t i n gw i t ht a r g e t m r n ad u r i n gi n t e r p h a s e ；d u r i n ga n a p h a s e , p h r l p l m a yi n t e r a c tw i t ht h ep r o t e i nf r o mt a r g e tm r n ao ro t h e rp r o t e i n st oc o - m e d i a t eo r f a c i l i t a t et h ei n i t i a t i o no fp h r a m o p l a s t i nc o m p l e xw h i c ht r i g g e r sa ne a r l yv e s i c l e sf u s i o n e v e n ta tt h ef o r m a t i o na n de x p a n d i n gc e l lp l a t e t os t u d yt h ef u n c t i o no fp b r w la tt h e f o r m a t i o no fc e l lp l a t e ，t h ek e yr e s u l t sf r o mt h i sr e s e a r c ha r es u m m a r i z e da sb e l o w 1 ，p h r l p li n t e r a c t i n gw i t ho t h e rp r o t e i n sb yy e a s t - t w oh y b r i ds y s t e m u s i n g 肼，坤1 a sb a i t , 4 6g e n e sw e r ei s o l a t e df r o ma d - c d n al i b r a r yo f a r a b i d o p s i st h a l i a n ab yy e a s tt w oh y b r i ds c r e e n i n g f o u rg e n e so ft h e m w e r ee x p r e s s e d r e s p e c t i v e l yi ne c o l ie r 2 5 6 6a n dp u r i f i e dp r o t e i n sc o u l db ei n t e r a c t e dw i t hp h r i p li na 4 拟南芥成膜素相关蛋白0 盹r 口1 ) 功能的研究 p r o t e i n - p r o t e i nb i n d i n ga s s a y 飙v i t r o r a n 2s m a l lg t pb i n d i n gp r o t e i nb y3 3 # c l o n e e n c o d i n g i sd e t e r m i n e da st h et a r g e tp r o t e i nt os t u d yb yt h ea n a l y s i so f p r o t e i nb l a s t 2 ，p h r i p li n t e r a c t i n g r i mr n a b ya f f i n i t ya d s o r p t i o n t h et o t a lr n a w a si s o l a t e df r o ms e e d l i n go f a r a b i d o p s l st h a 矗a n aa n db o u n dw i t h g s p p h r 球1b e a d s t h e n , t h eb e a d sw c 圮w a s h e do u tf r e er n af o rs c v 锄ll i m e s 1 1 地 s p e 瑚cb o u n dr n a sw e r ee x t r a c t e df m m g s t p h r i p lb e a d sa n dm e a s u r e do d 拍ob y s p e c t r o p h o t o m e t e r a n d a n a l y z e d w i t h r t - p c r u s i n g f i v e p a i r s o f p r i m e r s t h e c d n a o f t h es p e c m cm r n a b o u n dt og s t - p b r l p lw a sc l o n e di n t ot h ep t y b 2 p l a s m i da n d c o n t r o l l e d u n d e r t 7 - p r o m o t e r m m r n a p r o b e w a s t r a n s c r i b e d w i t h 【o ，。p 】r u t p l a b e l 加v t r oa n di n c u b a t e dw i t hg s t - p b r l p lf u s i o np r o t e i nb yu v - c r o s sl i n k i n ga n d r n a e l e c t m p h o r e t i cm o b n i t ys h i f ta s s a y s ( r e m s a ) t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h e p h r i p lc o u l ds p e c i f i c a l l yb i n dt or a n 2 - m r n a 3 ，p a m 2g t p a s ea c t i v i t y , i t se x p r e s s i o na n ds u b c e n i l a rl o c a l i z a t i o ni np h n t a n a l y s i so fg e n es t r u c t u r es h o w e dt h a tr a n 2w a sc o n s i s t e do ff i v ee x o i 塔a n df o u r i n t r o n s , a n di t sf u l l - l e n g t hc d n ae n c o d e s2 4k dp r o t e i nw i t h2 2 1a m i n oa c i d s r a n 2 p r o t e i ne x p r e s s e da n dp u r i f i e df r o mec o w a sd e t e r m i n e da c t i v i t yo fg t p a s eb y ( n h 4 ) e m 0 0 4 - f e s 0 4a s s a ya n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a ti th a di n t r i n s i ca c t i v i t yo fg t p a s e t h er a n 2w a sa he x p r e s s e di nr o o t , s t e m , f l o w e ra n dl e a fo f a r a b i d o p s i sb yr t - p c r a n a l y s i s t h er e s u l t so f 如a m u n o f l u o r c s c c n c cl o c a l i z a t i o no fr a n 2s h o w e dt h a tr a n 2w a s i n v o l v e di ne a c hp h a s ed u r i n gp l a n tm i t o s i s , a n dm a i n l yl o c a l i z e do nt h en u c l e u s m e m b r a n ea ti n t e r p h a s e ，a n dd i s p e r s e di nt h ec y t o p l a s mi np a t c h e sf r o mp 鹏p r o p h a s et o p r o m e t a p h a s e , a n do nt h ee q u a t o r i a lp t a n e ( c e l tp h t 0a n dt h es p i n d l ea ta n a p h a s e ，a n d r e l o c a t e do nt h en e w l yf o r m i n gd a u g h t e rn u c l e u sm e m b r a n e sa tt e l o p h a s e 4 ，c l o n i n ga n dh o m o l o g o u sa n a i y s bo f r a n 2g e n ef r o md i f f e r e n tp l a n t s 1 h ct o t a ir n a sw e i s o l a t e df r o ma i u mc e p a a l u ms a t i v u ma n db r a s s i c a 用秘a n dt h ef u l l l e n g t hc d n a s o fr a n 2w a sg e n e r a t e db yr t - p c rw i t hp r i m e r so f a t r a n 2 a f t e rs e q u e n c i n g , r a n 2g e n e sf r o md i f f e r e n tp l a n t sw e r ec o m p a r e de a c ho t h e r b yd n a m a n t h e r e s u l ts h o w e dt h a tr a n 2h o m o l o g o u sw i t hn n c l e o t i d es e q u e n c e sw a s r e s p e c t i v e l y9 9 7 0 ，1 0 0 ，8 9 9 4 a n dw i t ha m i n oa c i ds e q u e n c e sw a sr e s p e c t i v e l y 9 9 1 0 ，1 0 0 ，9 6 3 8 b e t w e e na r a b i d o p s i st h a l i a n aa n da l l i u mc e p a ，a l l i u m s a t i v u m ，b r a s s i c an a p u sb yb l a s t na n db l a s t p ，e x c e p tl a c ko fa s p ( d ) c - t e r m i n a l 5 华中农业大学博士学位论文 i na l l i u ms a t i v u m t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tr a n 2i sh i i g hc o n s e r v e di np l a n t e v o l u t i o n s ，a n a l y s i so fp h r l p lm u t a n ta n dc o n s t r u c t i o no fn i r i p l ，r a n 2o v e r e x p r e s s i o nv e c t o ra n d r n a iv e c t o ra n dg f pv e c t o r0 f 孙d p l a f t e ro b s e r v a t i o no f p h e n o t y p e sa n da n a l y s i s o fp h r i p lm u t a n ta n dw i l d a r a b i d o p s i st h a f f a n ab yr t - p c ra n dw e s t e r nb l o r , t h er e s u l t ss h o w e dt h a t1 1 0o b v i o u s d i f f e r e n c ew a so b s e r v e di np h e n o t y p e sa n dr t - p c rp r o d u c t so fp h r l p lw c r fp o s i t i v e b e t w e e n 丹，口1m u t a n ta n dw i l d - t y p ei nt h i s s t u d y p h r l p lw a sn o td e t e c t e d i n d i s s o l v a b l ep r o t e i no fs e e d l i n go fa r a b i d o p s i sb yw e s t e r nb l o t t h e s er e s u l t ss u g g e s t t h a tp h r l p li sa l li n d i s s o l v a b l ea s s o c i a t e dm e m b r a n ep r o t e i na n dn ol o s so ff u n c t i o ni n p h r i p lm u t a n t ( t - d n a ) , a n di t sm u t a n tm a yn o te x i s ti np u r i f i e dh o m o l o g o u s t o f u r t h e rs t u d yt h er u n i o no f p h r l p la n dr 口砣g e n e si nc e l lp l a t ef o r m a t i o ni np l a n t , t h e p l a s m i d so fp b i - p h r i p l ，p b i - r a n 2f o ro v e r - e x p r e s s i o ni np l a n ta n dr n a ir e c o m b i n a n t p l a s m i d sh e l l s g a t e 2 - p h r l p la n dh e l l s g a t e 2 - r a n 2f o rg e n es i l e n c ea tm r n a l e v e la n d g f pf u s i o np l a s m i dp m o n - g f p - p h r l p l f o rl o c a l i z a t i o ni nl i v i n gc e l l sw e l cc o n s t r u c t e d , i n h e d t a b l yt r a n s f e r r e di n t o a r a b i d o p s i st og a i nt h c i rt o s e e d s n o wt h ep h e n o t y p e sa n d f u n c t i o n so f t o a l eb e i n gs t u d i e d k e yw o r d s ：f o r m a t i o n o fc e l l p l a t e ；p h r a g m o p l a s t i n ；啦睁叫罄血商衄内田n g p f o 痂1 0 h 璎1 ) ；r a n 2s m a l lr a sg t p - b i n d i n gp r o t e i n ；a r a b i d o p s i st h a l a n a 6 篓塑至堕壁耋塑苎星鱼g 璺婴! 邈壁堕塑塞 第一章文献综述 植物细胞不同于动物细胞的显著特征之一是具有细胞壁( c e l lw a l l ) 结构。细 胞壁位于植物细胞的外层，具有维持细胞形状、控制细胞生长、参与物质运输、 保护细胞和感受环境信号等多种功能。新生细胞壁来源于细胞分裂后期所形成的 细胞板，而细胞板形成则初始于由高尔基体衍生的泡囊融合而来的成膜体 ( p h r a g m o p l a s t ) 中心，并以离散方式扩充而抵达母细胞壁( v e r m a ，2 0 0 1 ：s e g u i s i m a r r oc ia l ，2 0 0 4 ) 随后组成细胞板的主要成份胼胝质被纤维素所替代，形成 新的细胞壁。细胞板的正常形成和成熟与植物的细胞周期循环、组织结构、器官 发育、形态建成密切相关。n a c k i a t n a c k l a t n a c k 2 为调节细胞板生长延伸的动 力蛋白，这类基因功能缺失，细胞板发育畸形，植株表型出现明显的缺陷，如生 长迟钝，产生多核和细胞壁发育不全的细胞( n i s h i h a m ae ta 1 ，2 0 0 2 ) ，花蕾败育 或无花蕾发育，植物生长最终停止等，如图1 1 因此，在分子水平上研究细胞板的形成过程及其与细胞有丝分裂的联系，将 为阐明植物的细胞周期循环、组织结构、器官发育、形态建成机制提供科学依据。 1 1 细胞板形成及模型 1 1 1 早期的细胞板形成模型 早在1 9 2 0 年s a i b e y 等就开始研究高等植物细胞板的形成，到1 9 6 8 年h c p l c r 和j a c k s o n 用电子显微镜观察绣球百合( h a e m a n t h u sk a t h e r i n a e ) 胚乳切片早期细 胞板的形成( 如图1 2 ) 。在细胞分裂后期和早末期阶段，细胞中出现大量微管，首 先发生在纺锤体区带的边缘，通常与残存的纺锤体微管相连，形成类似板状物， 板状物可同时发生在2 处或多处，随后向细胞中心移动，大团微管定向聚积在赤道 上( 成膜体) ，此时纺锤体结构已消失。 将显微镜倍数放大进一步观察分析，成膜体微管直径为2 0 0 - 2 4 0a ，由7 根 或7 根以上微管组成束，邻近微管相互交织连接，微管束之间有宽的间隙，一些 不透明的、不定形物质似乎粘附在微管壁上。每束微管紧紧地包裹成板状，出现 在细胞中的许多处( 图1 2 a ) ，载着泡囊逐渐向赤道板移动( 图1 2b ) ，直至排列 在赤道板上形成平行面( 图1 2c ) 。泡囊聚集、融合在细胞板上的微管束之间( 图 1 2b ，c ，d ) ，许多泡囊聚集、融合在2 个子细胞之问形成一个连续的分离带， 9 华中农业大学博士学位论文 此时的微管以一定数量消褪和延伸，观察不到早期明显的微管束( 此时成板状) 。 h e p l e r 和j a c k s o n ( 1 9 6 8 ) 还观察到成膜体微管与纺锤体微管结构一致，成膜 体微管是泡囊移动的动力和通道( e s a ua n dg i l l ，1 9 6 5 ；h c p l e ra n dn e w c o m b ，1 9 6 7 ； p i c k e t t - h e a p sa n dn o r t h c o t e ，1 9 6 6 a ，b ；p o b e r t s ，1 9 7 4 ) 同时提出在成膜体微管 束之间几乎粘附于管壁上或交联于微管上的不透明无定形物质可能对泡囊的聚积 融合起重要作用。 图1 1 烟耸n a c k i n a c k 2 和拟南芥a t n a c k i 突变体表型 n 蛋1 1p h e n o t y p e so fn c 0 6 a n ab e n t h a m i a n a 儿4 a 日， h c 融a n da r a b i d o p s i s t h a l i a n a a t n a 疆fm u t a n t ( 来自n i s h i h a m ae ta 1 ，2 0 0 2 ) ，( f r o mn i s h i h a m ae ta 1 。2 0 0 2 ) al e a v e so f1 - m o n t h - o l dp l a n t so fn i c o t i a n ab e n t h a m i a n aw e r ei n o c u l a t e dw i t h p v x - n a c k i n a c k 2o rp v x - g f pr n ab yv i g s ( v i r u s - i n d u c e dg e n e - s i l e n c i n g ) ba t a r a c 尉m u t a n tb yt - d n ai n s e r t i o n a r a b i d o p s i st h a l i a n a 1 0 图1 2 早期细胞板形成图( 来自h e p l e r 和j i c k s o n ，1 9 6 8 ) _ l i g 1 2e a r l ys t a g e so fc e u - p l a t ef o r m a t i o n ( f r o mh e p l e ra n dj a c k s o n , 1 9 6 8 ) 1 1 2 中期的细胞板形成发育模型 高等植物胞质分裂时形成的成膜体由微管、微纤丝和膜质体3 种主要成分组 成( s c h o p 盯a n dh e p l e r ，1 9 9 1 ) 。在分裂后期，来自高尔基体的泡囊聚集在染色体 分开的赤道板上，泡囊融合产生膜状结构形成二裂体和分枝体( h e p l e ra n d n e w c o m b ，1 9 6 7 ：j o n e sa n dp a y n e 。1 9 7 8 ：h e p l e r ，1 9 8 2 ) 以及迟后期泡囊聚集成 。岛”( c r o n s h a wa n de s a u ，1 9 6 8 ：h e p l 盯a n db o n s i g n o r e ，1 9 9 0 ) ，随后泡囊融合 产生盘状细胞板，逐渐离心扩散至细胞壁这些学者用化学固定方法处理材料样 品研究成膜体和细胞板得到比较一致的结果。考虑到化学方法固定时间长，易使 敏感的细胞内膜产生泡囊化( m e r s e ya n dm c c a y , 1 9 7 8 ：m a n d e l k o w e ta 1 ，1 9 8 6 ) ， 在细胞板上泡囊融合出现分枝体和星形状( h e p l e r ，1 9 8 2 ) ，可能因化学固定剂戊 二醛人为因素诱导所致。s a m u e l s 等( 1 9 9 5 ) 采用高压冷冻低温固定法( j o n e s ， 1 9 8 4 ；d a h la n ds t a e h e l i n ，1 9 8 9 ；k i s se ta 1 ，1 9 9 0 ； s t a e h e l i ne ta 1 ，1 9 9 0 ) 和冷 冻低温替代法( h y d e e ta 1 ，1 9 9 1 ) 固定这些流动的精细膜结构材料，使用电子显 微镜观察烟草根尖细胞和同步培养的悬浮烟草( b y - 2 ) 细胞，研究细胞板的形成 与发育，提出了细胞板形成发育的新模型，如图1 3 。s a m u e l s 将细胞板形成发育 分为5 个主要阶段： ( 1 ) 由高尔基体衍生而来的泡囊沿着成膜体微管转移并到达细胞的等分区一 赤道板上，如图1 3 a ( 2 ) 单个泡囊形成哑铃状( v e s i c l e t u b u l e - v e s i c l ev ) 并相互融合成管状泡 囊网( t u b u l o v e s i c u l a rn e t w o r kt v n ) ，如图1 3b ： ( 3 ) 管状泡囊网相互连接、膨胀形成富含胼胝质的光滑薄孔网板