（植物病理学专业论文）嗜热毛壳菌热稳定糖化酶纯化及其编码基因的克隆与表达.pdf

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v a l a s p s e r - 7 f y r - i l e g l u a r g - o l u - t h r - p r o i l e a l a - t r p a s n ，与n e u r o s p o r ac r s s a ，h u m i c o l ag r & e a 和t h i e l a v i a t e r r e s t r i s 糖化酶的n 一端氨基酸序列有较高的同源性。 根据ct h e r m o p h i l u m 热稳定糖化酶的n 端氨基酸序列和同源保守序列设计简并引 物，通过r t - p c r 及快速扩增e d n a 末端( r a c e ) 的方法，克隆了该糖化酶的编码基 嗜热毛壳菌热稳定糖化酶纯化及其编码基因的克隆与表达 因加，全长c d n a 为2 0 1 6 b p ，包含一个由5 9 9 个氨基酸组成的开放阅读框。该基因已 在g e n b a n k 中注册，登录号为d q l 0 4 6 0 9 。 由核苷酸序列推导的相应氨基酸序列n 端前3 0 个氨基酸为信号肽序列，完全去除 信号肽后，n 端氨基酸序列与测定的纯酶n 端序列完全一致。比较糖化酶的催化区序列， 发现与1 5 家族糖化酶的同源性很高，在催化区中有五个基序p y f y - w - r d a a l 、 w g p q r d g p 、d w e e v 、a v g - y - e d 和l w y a 非常保守。这些保守基序与糖基水解 酶( g l y e o s y lh y d r o l a s e s ) 1 5 家族催化活性有关。 g t a 基因和酵母分泌型表达载体p p i c 9 k 双酶切后体外连接，构建酵母重组表达载 体p p i c 9 k g l a 并测序，保证正确的阅读框。将重组表达质粒p p i c 9 k g l a 和p p i c 9 k 空 质粒分别用限制性内切酶s a ci ( 位于5 a o x l 区内) 线性化后，采用电击法转化p i c h i a p a s t o r i sg s l l 5 酵母感受态细胞，于m d m m 平板上筛选h i s + m u t + 表型的酵母转化子。 经过p c r 检测及g 4 1 8 抗性筛选多拷贝整合子，进行甲醇诱导培养。通过检测各转化子 每隔2 4 h 的蛋白表达情况来筛选高效表达目的糖化酶的工程菌株。筛选到表达酶活性最 高的菌株g s g l a 一2 2 ，甲醇诱导6 d 酶活性达到最高，达1 6 7 3u m l ，酶蛋白表达量为 o 8 6m d r n l 。检测目的蛋白的表达量及遗传稳定性，并测定表达糖化酶的酶学性质。 酵母工程菌株g s g l a 2 2 在y p d 平板上划线，连续传代1 0 次后，p c r 检测呈阳 性，重组糖化酶的表达量基本保持稳定。表达糖化酶g l a 的最适反应温度和p h 分别为 6 5 和4 5 5 0 ，该酶在6 0 以下稳定：6 5 的半衰期为4 0 m i r a 在p h 值为2 5 7 0 之 间表达糖化酶保持稳定的酶活性；f e 2 + 、m 矿+ 、c a 2 + 、k + 、n a + 对酶有激活作用，一些重 金属离子a g + 、h 9 2 + 对酶有显著的抑制作用。 c t h e r m o p h i l u m 糖化酶能在毕赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白，而且表达 产物同样具有原始菌株ct h e r m o p h i l u m 糖化酶的优良特性，这就预示了表达糖化酶在制 糖工业和生物学领域的广阔应用前景。因此，期望能对该基因进行改造，或进一步优化 表达条件，获得真正有工业应用价值的酵母工程菌株。 关键词：嗜热毛壳菌，热稳定糖化酶，纯化，e d n a 克隆，表达 坐查查些查兰蔓主堂篁堡苎 p u r i f i c a t i o no ft h e r m o s t a b l eg l u c o a m y l a s ef r o m c h a e t o m i u mt h e r m o p h i l u ma n dc l o n i n ga n de x p r e s s i o no f t h ee n c o d i n gg e n e a b s t r a c t g l u c o a m y l a s ei s a l l e x o - a c t i n ge n z y m et h a tr e l l l o v e st h eg l u c o s eu n i t e sf r o mt h e n o n r e d u c i n ge n d so f a m y l o s e a m y l o p e c t i na n dg l y c o g e nb yh y d r o l y z i n gd 一1 ，4l i n k a g e si na c o n s e c u t i v em a r i n e r p r o d u c i n g d g l u c o s ea st h es o l ep r o d u c t i ta l s oh y d r o l y s e sa 一1 6a n dt h e r a r ea 1 3l i n k a g e sa l t h o u g ha tam u c hs l o w e rr a t e g l u c o a m y l a s e sa r ea l li m p o r t a n tg r o u po f e n z y m e si ns t a r c h - p r o c e s s i n g i ti ss e c o n dt op r o t e a s ei nw o r l d w i d ed i s t r i b u t i o na n ds a l e s a m o n gi n d u s t r i a le n z y m e s g l u c o a m y l a s e sf i n dm a n ya p p l i c a t i o n si ni n d u s t r y t h i se n z y m ei s u s e di nd e x t r o s ep r o d u c t i o n ，i nt h eb a k i n gi n d u s t r y , i nt h eb r e w i n go fl o wc a l o r i eb e e ra n di n w h o l eg r a i nh y d r o l y s i sf o rt h ea l c o h o li n d u s t r y t h ep r i m a r yc o m m e r c i a la p p l i c a t i o r fo f g l u c o a m y l a s e si st h ep r o d u c t i o no fg l u c o s es y r u p sf r o ms t a r c h an u m b e ro fg l u c o a m y l a s e s f r o mc u l t u r e so fv a r i o u sm i c r o o r g a n i s m s ，i n c l u d i n ga s p e r g i l l u s ，r h i z o p u s ，s a c c h a r o m y c e s s p i e c e sh a v eb e e ns c r e e n e df o rp o t e n t i a li n d u s t r i a la p p l i c a t i o n i nr e c e n ty e a r sg l u c o a m y l a s e s f r o mt h e r m o p h i l i c f u n g i ，w h i c ha r ee x p e c t e dt ob et h e r m o s t a b l e ，h a v ea r o u s e di n c r e a s i n g a t t e n t i o na m o n gr e s e a r c h e r s a m o n ga l lt h eg l u c o a r n y l a s e s o n l y f e wt h e r m o s t a b l e g l u c o a m y l a s e sh a v eb e e nd e s c r i b e d ，i n c l u d i n gt h ee n z y m e so fm y r o t h e c i u m ，a s p e r g i l l u s f u m i g a t u s ，h u m i c o l ag r i s e a ，h u m i c o l ag r i s e av a r t h e r m o i d e aa n dt h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u s ct h e r m o p h i l u r ni saw i d e l yd i s t r i b u t e ds o i l i n h i b i t i n gf u n g u so fc o n s i d e r a b l ei n t e r e s t p r o d u c e ro ft h e r m o s t a b l ee n z y m e s ，i n c l u d i n gc e l l u c o s e ，e n d o c e l l u l a s e ，x y l a n a s e ，l a c c a s e w h i c hh a v eb e e np u r i f i e da n dw e l ls t u d i e d h o w e v e r , g l u c o a m y l s ef r o mt h eg e n u sc t h e r m o p h i l u mh a sn o ty e tb e e ns t u d i e d d a r i n gg r o w t hi nan e d i u mc o n t a i n i n gs o l u b l es t a r c h ， c t h e r m o p h i l u ma l s op r o d u c e dg l u e o a m y l a s e t h ee n z y m ew a sp u r i f i e df r o mt h ec u l t u r e f i l t r a t eo ft h es t r a i nb yf r a c t i o n a la m m o n i u ms u l p h a t ep r e c i p i t a t i o n ，d e a e - s e p h a r o s e c h r o m a t o g r a p h ya n dp h e n y l s e p h a r o s ec h r o m a t o g r a p h y t h ep u r i f i e de n z y m ew a ss h o w nt o b eh o m o g e n e o u sb ys d s - p a g e ，a n dt h em o l e c u l a rw e i g h tw a se s t i m a t e dt ob e6 4 k d a t h eo p t i m u mp ha n dt e m p e r a t u r eo b t a i n e df o rt h ep u r i f i e de n z y m ew a s4 0a n d6 5 。c 嗜热毛壳苗热稳定糖化酶纯化及其编码基因的克隆与表达 t h ep hs t a b i l i t i e sw e r ek e p ti nt h er a n g e3 5 8 0 ，a n dt h ee n z y m ew a sa b l et or e t a i n7 0 o f t h ef u l la c t i v i t y , w h e nt h ee n z y m ew a si n c u b a t e di nt h eb u f f e rp h3 t h ee n z y m ew a s r e l a t i v e l ys t a b l ea t5 0o c t h eh a l f - l i f ew a s6 0m i nu n d e ri n c u b a t i o na t6 5o c a n dt h ee n z y m e a c t i v i t yk e p t6 0 a f t e r3 0m i ni n c u b a t i o na t7 0o c d i f f e r e n tm e t a li o n ss h o w e dd i f f e r e n t e f f e c t so nt h eg l u c o a m y l a s ea c t i v i t y c a 2 + ，m 矿+ ，n a + ，a n dk + e n h a n c e dt h ee n z y m ea c t i v i t y ， w h e r e a sf e 2 + ，a 矿，a n dh 9 2 + c a u s eo b v i o u si n h i b i t i o n t h ev m a xa n dk mv a l u e so f g l u c o a m y l a s eo ns o l u b l es t a r c hw e r e15 6 8m g m l m i na n d2 6m g m l r e s p e c t i v e l y t h ef i r s t1 5a n l i n oa c i d sf r o mt h en - t e r m i n a io f t h eg l aw e r ea v d s y i e r e t p i a w n t h es e q u e n c es h o w e dac e r t a i ns i m i l a r i t yw i ms o m eo t h e rf i m g a lg l u c o a r n y l a s e ss u c ha st h o s e f r o mn e u r o s p o r ac r a s s a ，h u m i c o l ag r i s e aa n dt h i e l a v i at e r r e s t r i s d e g e n e r a t ep r i m e r sb a s e do nt h en t e r m i n a ls e q u e n c e so fp u r i f i e dg l aa n dt h e c o n s e r v e dd o m a i no fo t h e rr e p o r t e dg l u c o a m y l a s e s ，a n dae d n af r a g m e n te n c o d i n gt h e g l u c o a m y l a s eg e n ew a so b t a i n e dt h r o u g hr t - p c r t h er a c ew a su s e dt og e n e r a t e f u l l - l e n g t he d n a c l o n e s t h et h e g l ag e n ec o n t a i n e da no r fo f17 9 7 b pe n c o d i n g5 9 9a m i n o a c i d s t h eg e n eg l ah a sb e e nr e g i s t e r e di ng e n b a n kw i ma c c e s s i o nn u m b e rd q10 4 6 0 9 t h ef i r s t3 0a m i n oa c i d sw e r ep r e s u m e dt ob eas i g n a lp e p t i d e t h ea m i n o - a c i d s s e q u e n c ef r o m31t o4 5c o r r e s p o n d e dt ot h en t e r m i n a ls e q u e n c eo ft h ep u r i f i e dp r o t e i n t h e a l i g n m e n tr e s u l t so fp u t a t i v ea m i n oa c i d ss e q u e n c es h o w e dt h ec a t a l y t i cd o m a i no fg l dw a s h i g hh o m o l o g yw i t ht h ec a t a l y t i cd o m a i n so f t h eo t h e rg l u c o a m y l a s e so fg l y c o s y lh y d r o l a s e f a m i l y15 ，c o n t a i n e d5c o n s e r v e dm o t i f sr e l a t e dw i t hc a t a l y t i ca c t i v i t yo fg l u c o a m y l a s e s t h eg l ag e n ea n de x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 kw e r ed i g e s t e dw i t hs n a bia n dn o ti ，a n d l i g a t i o nw a sc a r r i e do u ti nv i t r o t h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dp p i c 9 k g l aw a s c o n s t r u c t e da n ds e q u e n c e dt oc o n f i r mt h ec o r r e c tr e a d i n gf r a m e t h ec o n s t r u c tp l a s m i d p p i c 9 k g l aw a sl i n e a r i z e dw i t h ar e s t r i c t i o ne n z y m es a c l ( i n s e r t i o na t5 a o a q ) ，a n d t r a n s f o r m e dp i c h i ap a s t o r i sg s115c o m p e t e n tc e l lb ye l e c t r o p o r a t i o nm e t h o d s ，a n ds c r e e n e d f o rh i s + m u t + t r a n s f o r m a n t s0 n a n dm m p l a t e s t h ep a r e n tv e c t o rw a sl i n e a r i z e dw i t ht h e s a n l er e s t r i c t i o ne n z y m ea n dt r a n s f o r m e dg s l1 5a sac o n t r 0 1 p c ra n a l y s i so fp p a s t o r i s i n t e g r a n t sa n dg 4 1 8s c r e e n i n gd e t e r m i n e dt h em u l t i c o p yi n t e g r a n t st oi n d u c eb ym e t h a n 0 1 t h e s ei n t e g r a n t sw e r eu s e dt oa n a l y z ee x p r e s s i o nl e v e l se v e r y2 4h o u r so fi n t e r e s tp r o t e i na n d d e t e r m i n e dt h ee n g i n e e r i n gs t r a i n sw i t hh i g he x p r e s s i o nl e v e l ，n a m e da sg s - g l a 一2 2 t h e g e n e t i ca n dg l u c o a m y l a s ee x p r e s s i o ns t a b i l i t yo fr e c o m b i n a n t 尸p a s t o r i sg s - g l a 2 2w e r e t e s t e da n dc h a r a c t e r i z e d 4 坐堡查、业盔兰竖主兰堡鲨苎 s t r e a kf o rs i n g l ec o l o n i e so fh i s + t r a n s f o r m a n tg s g l a 2 2o i ly p dp l a t ef o r 10 g e n e r a t i o n s ，p c ra n a l y s i ss h o w e dt h ei n t e r e s tg e n ew a si n t e g r a t e di n 户p a s t o r i sg e n o m e ，a n d t h ee x p r e s s i o nl e v e lw a sa l s ok e p ts t a b l e t h ee x p r e s s i o ng l u c o a m y l a s ee x h i b i t e do p t i m u m c a t a l y t i ca c t i v i t ya tp h4 5 - 5 0a n d6 5 c t h ee n z y m ew a ss t a b l ea t6 0 。c m 9 2 + ，c a 2 + ，f e 2 + ， k + ，n a + e n h a n c e dt h ee n z y m ea c t i v i t y ，w h e r e a sa 矿，h 9 2 + c a u s e do b v i o u si n h i b i t i o n t h ec t h e r m o p h i l u mg l u c o a m y l a s ew a ss e c r e t e di n t ot h ec u l t u r em e d i u m b yt h ey e a s tp p a s t o r i s i na f u n c t i o n a l l ya e t i v i v yf o r m ，a n ds o m es p e c i f i cp r o p e r t i e so fe x p r e s s e d g l u c o a m y l a s ew a sm es a m ea st h o s eo ft h en a t i v es t r a i nct h e r m o p h i l u mi ti m p l i e dt h e e x p r e s s e dg l u c o a m y l a s ec o u l db ew i d e l ya p p l i e di nt h ei n d u s t r ym a db i o l o g i c a lf i e l d s t h e r e f o r e ，w eh o p et or e c o n s t r u c tt h eg l dg e n eo ro p t i m i z et h ee x p r e s s i o nc o n d i t i o nt oo b t a i n t h ey e a s te n g i n e e r i n gs t r a i n ss u i t a b l ef o ri n d u s t r i a la p p l i c a t i o n k 码7 w o 。d 8 ：c h a e t o m i u mt h e r m o p h i l u m ；t h e r m o s t a b l eg l u c o a m y l a s e ；p u r i f i c a t i o n ；e d n a c l o n e ；e x p r e s s i o n 5 嗜热毛壳苗热稳定糖化酶纯化及其编码基因的克隆与表达 d e a e d n s p c r k d a p a g e d e p c e d l a s d s t e m e d t l c t r i s x g a l j p t g r n a s e e b a m p o d d n t p b p p b s t e 爿鲫 m d m m y n b d i e t h y l a m i n o e t h y l 3 ，5 - d i n i t r os a l i c y l i ca c i d p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n k i l o d a l t o n p o l y a c r y l a m i d eg e le c t r o p h o r e s i s d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t e t r a m e t h y le t h y l e n ed i a m i n e t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y t r i sd r o x y m e t h ya m i n o m e t h a n e 5 - b r o m o 一4 - c h l o r o 一3 一i n d o l y l b d g a l a c t o s i d e i s o p r o p y l t h i o b d g a l a c t o s i d e r i b o u n c l e a s e e t h i d i u mb r o m i d e a m p i c i l l i n o p t i c a l d e n s i t y d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s h a t e b a s ep a i r s p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e t r i s e d t ab u f f e r a l c o h o lo x i d a s eg e n e m i n i m a ld e x t r o s e m i n i m a lm e t h a n o l y e a s tn i t r o g e nb a s e 二乙基氨基乙基 3 ，5 - 二硝基水杨酸 聚合酶链反应 千道尔顿 聚丙烯酰胺凝胶电泳 焦炭酸二乙脂 已二胺四乙酸 十二烷基硫酸钠 四甲基乙二胺 薄层层析 三羟甲基氨基甲烷 5 溴一4 氯3 一吲哚一b d 一半乳糖苷 异丙基硫代一b d 半乳糖苷 核糖核酸酶 溴化乙锭 氨卞青霉素 光密度 脱氧核苷三磷酸 碱基对 磷酸盐缓冲液 t r i s e d t a 缓冲液 醇氧化酶基因 最低葡萄糖培养基 最低甲醇培养基 无氨基酸酵母氮源 6 山东农业大学博士学位论文 引言 第一章文献综述 淀粉是绿色植物果实、种子、块茎、块根的主要成分，是空气中二氧化碳和水经光 合作用合成的产物，是地球上最丰富的贮藏性多糖。作为太阳能的贮存形式之一，淀粉 一直是人类和多数动物的主要能量来源，自然界的淀粉资源丰富，年复一年可以再生， 是取之不尽、用之不竭的天然资源。在自然界中大部分微生物多以葡萄糖、麦芽糖等单 糖或低聚糖为最适底物，故随着微生物工业的快速发展，它的研究也得到了蓬勃的发展， 科学技术的发展使人们逐渐发掘出了淀粉在多个工业领域的用途，丰富的资源和低廉的 成本使淀粉工业蓬勃发展起来。然而大多数的天然淀粉都不具备有效地被利用的性能， 因此有必要利用物理、化学或生物方法处理改变天然淀粉的性质，增加某些功能性质或 引进新的特性，使其适应现代化工业新技术、新工艺要求。 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，淀粉酶可以将自然界中广泛存在的淀粉转化 为单糖或低聚糖等可发酵性糖，是一类用途十分广泛的酶，在食品工业、纺织工业和医 药工业都经常使用。淀粉酶主要可以分为四大类： ( 1 ) a 一淀粉酶：它以糖原或淀粉为底物，从分子内部切开醢一1 4 一葡萄糖糖苷键，酶作 用后可使糊化淀粉的粘度迅速下降，变成液化淀粉，水解成糊精、少量的葡萄糖和麦芽 糖，产物的末端残基碳原子构型为o 【构型，故称a 一淀粉酶。淀粉酶不能切开支链淀粉分 支点的a 一1 6 一糖苷键，也不能切开0 【1 6 一糖苷键附近的一1 4 一糖苷键，底物分子越多，水 解度越低。 ( z ) b 一淀粉酶：是一种外切型淀粉酶，从底物非还原性末端顺次水解每相隔一个的 a 1 4 糖苷键，切下的是麦芽糖单位，它广泛存在于大麦、小麦、。甘薯等高等植物及一 些微生物中。 ( 3 ) 葡萄糖淀粉酶：又称糖化酶，从淀粉分子的非还原性末端开始，逐次切下一个 个葡萄糖。它不仅能水解a 1 4 一糖苷键，而且能水解a 1 6 一糖苷键和a 1 3 糖苷键，只是 水解后两者的速度较前者要慢得多，因此，葡萄糖淀粉酶作用于直链淀粉和支链淀粉时， 能将它们全部水解为葡萄糖，它从底物非还原性末端顺次水解n 一1 4 糖苷键和分支的 1 6 糖苷键，生成葡萄糖。 ( 4 ) 解枝酶或异淀粉酶：只水解糖原或支链淀粉分枝点一1 6 一糖苷键，切下整个侧枝。 嗜热毛壳苗热稳定糖化酶纯化及其编码基因的克隆与表达 糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶 g l u c o a m y l a s e ，系统名为淀粉一1 4 - 葡聚糖葡萄糖水解 酶，a i 4 - g l u c a n g l u c o h y d r o l a s e ( e c 3 2 1 _ 3 ) 】，是一种具有外切活性的酶，它能把淀粉、 糊精、糖原等从非还原性末端水解1 4 葡萄糖苷键，而得到终产物b d 葡萄糖，也能 缓慢水解a 一1 6 葡萄糖苷键，转化为葡萄糖，是淀粉转化为葡萄糖过程中的主要酶类之 一，糖化酶具有重要商业价值，它已在酿造、食品、医学等工业和农业领域中得到广泛 应用。可用于生产白酒、黄酒、酒精、醋、啤酒、乳酸钙、柠檬酸、味精等作糖化剂： 用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵：与木质素 酶、纤维素酶、果胶酶等菌种共同作用，可将秸杆等农业废弃物转变为家畜可利用的饲 料；也可用于分解低聚糖：还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之，凡对淀粉、糊精、 低聚糖进行酶水解的工业上，都可适用。尽管糖化酶对u i 6 糖苷键的活性只有1 4 一 糖苷键的o 2 ，这足以在工业糖化过程中影响产量。这一特性及在其它方面的需求产 生现在研究人员对糖化酶的目标特定的蛋白质工程研究。 随着各种新技术的发展和应用，人们对糖化酶的研究取得了很大进展，有些糖化酶 已被分离纯化并对其性质进行了研究，糖化酶基因也已被克隆和表达，各种来源和性质 不同的糖化酶基因还在不断地被克隆出来，并从分子水平探索了糖化酶分子的结构和功 能，为构建高效表达菌株以满足工业生产需要奠定了基础。 1 糖化酶的产生 糖化酶分布很广，植物，动物，微生物中都存在，在工业中应用的糖化酶主要从曲 霉属( a s p e r g i l l u s ) 、根霉属( r h i z o p u s ) 等丝状真菌和酵母属( s a c c h a r m y c e s ) 中获得， 从细菌中也分离得到热稳定的糖化酶，人的唾液，动物的胰腺中也含有糖化酶，已报道 的产糖化酶真菌微生物有2 3 个属3 5 个种；细菌有3 属3 种( 见表1 - 1 ) 。但目前工业 化生产的酶制剂多来自于曲霉和根霉( 张娥李聪，1 9 9 6 ) ，这些酶被食品和药物管理 中心认定为是安全的。 2 糖化酶的分子结构 糖化酶组成了糖苷水解酶家族1 5 ，是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的 一条肽链的酸性糖蛋白，分子量在6 0 ，0 0 0 1 0 0 ，0 0 0 间，通常碳水化合物含量4 一18 。 但s a c c h a r m y c e sd i a s t a t i c u s 糖化酶碳水化合物含量高达8 0 。糖化酶中糖与蛋白质的连 接方式有n 和0 连接两种。其分子结构中糖残基的排列在其热稳定性和酸碱稳定性上 坐查查些查兰堕主兰堡堕兰 一 有着特殊的意义。 表1 - 1 产糖化酶菌株 t a b l e l 一1 t h es t r a i n sw h i c hp r o d u c eg l u c o a m y l a s e s 种名组分构成 种名 组分构成 来自于丝状真菌，酵母，真细菌，古细菌的至少2 3 种主要结构已了解清楚，糖化 酶通常作为研究糖苷水解酶的原型。 2 1 糖化酶蛋白亚家族 根据结构相似性，c o u t i n h o 和r i l l y ( 1 9 9 4 ) 将糖化酶划分为5 个亚家族n 其中一 嗜热毛壳菌热稳定糖化酶纯化及其编码基因的克隆与表达 个亚家族的糖化酶来源于细菌c l o s t r i d i u m 。另外有两个亚家族分别包括来自于酵母 s a c c h a r o m y c o p s i s 和s a c c h a r o m y c e s 的糖化酶，还有两个亚家族来源于丝状真菌，其中 一个包括a s p e r g i l l u s ，h u m i c o l a ，n e u r o s p o r a 和h u m i c o n i s ，另一个仅仅包括了r h i z o p u s 。 七种真菌糖化酶均含有淀粉结合区和与催化区连接的o 一糖苷键( w i l l i a m s o ne ta 1 ， 1 9 9 2 ) 。一般酵母的糖化酶只含有催化区，但却在s a c c h a r o m y c e sd i a s t a t i c u s 具有o 糖苷 键区域( y a m a s h i t a , 1 9 8 9 ) 。c l o s t r i d i u mg 0 0 0 5 糖化酶n 末端在蛋白酶解，释放酶分子 之前将酶分子锚定在细胞膜上起作用( o h n i s h ie la 1 ，1 9 9 1 ) 。c o u t i n h o 和r e i l l y ( 1 9 9 4 ) 利用疏水性聚类分析阐明了糖化酶的结构相似性，他们认为这些比对序列在蛋白质工程 中模型构建和修饰中可以适合特殊需要。 2 2 催化区 a s p e r g i l l u sa w a m o r iv a ex 1 0 0 糖化酶的催化区( c d ) 包含有1 3 个一螺旋，其中的1 2 个a 一螺旋形成一个( o j a ) s 一桶状折叠。在这个折叠中，6 个a 一螺旋在外，6 个a 一螺旋在内 部共同围绕漏斗形的活性位点，6 个高度保守的a a 片段( c o u t i n h o & r e i l l y , 1 9 9 4 ； c o m i n h o & r e i l l y , 1 9 9 7 ) 构成活性位点，连接内部n 末端和吐螺旋c 末端外端( a l e s h i n e t a l ，1 9 9 2 ；h a r r i se t a l ，1 9 9 3 ；a l e s h i ne t a l ，1 9 9 4 ；a l e s h i n ，f i r s o v & h o n z a l k o ，1 9 9 4 ) 0 这 个催化位点包括位于口袋状结构末端的g l u l7 9 和g l u 4 0 0 ( s i e r k se ta 1 ，1 9 9 0 ；s v e n s s o ne t 口，1 9 9 0 ；h a r r i se la 1 ，1 9 9 3 ；f r a n d s e ne ta l ，1 9 9 4 ) 。a a w a m o r iv a t x 1 0 0 ，a n i g e r 和 f i b u l i g e r a 糖化酶的催化区具有相似的折叠结构。而s f i b u l i g e r a 的糖化酶基因具有1 4 个 a 一螺旋，其中的1 2 个形成与a a w a m o r iv i l e x 1 0 0 和a n g e r 糖化酶催化区相同结构的 ( 0 , 0 , ) 6 - 桶状折叠( s e v e i ke ta 1 ，1 9 9 8 ) 。这几种糖化酶最显著的差异是sf i b u l i g e r a 的糖 化酶缺乏淀粉结合区( s b d ) ( h o s t i n o v a ，b a l a n o v a & g a s p e r i k ，1 9 9 1 ；c o m