（分析化学专业论文）核酸的电、磁纯化新方法及其在微流控芯片中的应用研究.pdf

摘要 摘要 微全分析系统( u t a s ) 具备在芯片实验室上实现分析过程集成化、自动化 和缩微化的特点，熊够极大地减少试剂的消耗量、缩短分析时闯、提高分析检 测效率。因此，在疾病诊断、生化分析、临床检测等领域获得了普遍关注。通 过不周功能芯片的使用，达到分析全过程多种功能的集成，是实现微全分析系 统集成他的有效途径之一。针对复杂生化样品体系，样品预处理是实现整个鼙 t a s 分析的前提，而目前样品预处理技术正成为l i t a s 向集成化、高效率、 连续化发展必须突破的瓶颈之。 在基因分析和疾病检测中，常常需要进行d n a 提取、d n a 扩增和d n a 分 离检测等步骤，其中d n a 的提取是决定基因分析成败与质量的关键步骤。传 统的核酸提取方法具有操作繁琐，难以自动化等缺点。固液双相分离富集是一 种既可实现待测物的浓缩富集又能够去除杂质组分干扰的样品预处理技术，而 且它比较容易与微流控芯片系统结合实现在线预处理。 本论文发展了两种可用于捕获浓缩生物样品中d n a 的固液双相分离富集 方法一电渗析分离富集与磁珠法国相萃取，并把两种方法集成至微流控芯片 中，实现生物样品的在线预处理，芯片易与其他芯片联用。论文共分为四章。 第一章为绪论，首先总结了d n a 提取的般过程与几种传统的d n a 提取 方法；然后介绍了膜分离技术尤其是电渗析技术及其在生物分离领域的应用； 接着概述了磁性复合纳米颗粒的制备方法及其在d n a 萃取中的应用；最后， 论述膜分离技术与固相萃取技术在样品预处理微流控芯片中的集成和应用。 第二章构建一个可用于浓缩生物大分子( d n a ) 的电渗析装置。基于电渗析 技术，利用阳离子交换膜在电场中对负电性物质的截留特性，在流路死体积中 捕获并浓缩负电性物质。以阴性染料达旦黄作为探讨富集概理麴模型化合物， 研究了负电性物质在装置中的运动特点，并初步优化实验条件。生物大分子样 品的实验结果表明：本装置在低电压条件下成功地实现无损伤捕获浓缩d n a 分子，单体系的天一d 融实验回收率约4 7 ，浓缩液可直接用予p c r 实验；装置 具备较好的分离效能：从d n a 一血红蛋白的混合体系中选择性地捕获浓缩d n a ， 揍要 去除绝大部分的蛋白质，浓缩液可直接用于p c r 实验；从全血破碎液中成功地 萃取出基因组d n a ，：次浓缩液可阕予p c r 实验。本电渗析装置适用于分离具 备不同电性的生物大分子，如等电点不同的蛋白质或核酸，实验操作自动简便， 使用简单的有机试剂：也可用于一般的无机离予和生物小分子的纯化与预寓集 以降低瓣仪器的检测限要求；微型化可与微流控芯片联用或集成于芯片上，在 生物样品的捕获、脱盐和分离等预处理过程中有很大的应用空间。 第三章发展了可控表面电性的超顺磁氨基化s i o z f e 3 0 4 复合纳米颗粒 ( a m i n o s i m n p s ) 用于核酸的分离纯化。采用水热法制备超顺磁的f e 3 0 4 纳米粒 子，通过s e b i 、t e m 、x r d 和m p m s 超导量子干涉磁强计对其进行表征；运用s t s b e r 法对f e 3 0 4 纳米粒子进行包覆得到粒径约3 0 0 n m ，具有核壳结构的s i 0 2 f e 3 0 4 复合 纳米颗粒；基于硅烷试剂的永解，利用3 一氨焉基三乙氧基硅烷积阿醛) 对s 童0 2 f e 3 0 4 复含纳米颗粒进行氨基化表面改性，得至u a m i n o s i m n p s 。借助z e t a 电位 研究磁珠的表面电性，发现氨基化磁珠的表面电性对溶液的州敏感，通过研究磁 珠在萃取d n a 体系中的电性，提出磁珠与d n a 分子结合的机理。利用该磁珠成功地 从全血中萃取得到基因组d n a ，实验仅使用简单的、不对p c r 产生干扰和抑制的试 剂，萃取效率约7 0 0 , 6 ，洗提液可直接用于p c r 试验。本磁珠除了具有超顺磁性、分 散性好等优点之外，其表面电性可通过调节溶液的p 得到控制、磁珠与d n a 分 子作用时，吸附和脱附速率快。这些优势使其成为一种良好的固定相，在d n a 萃取等生物分离过程、在样品预处理芯片中具有广阔的应用前景。 第四章制作了两个基于固液双相分离富集技术的样品预处理芯片。其一把 第二章基于电渗析技术的装置微型化并集成至微流控芯片中。以p m m a 为材料， 用激光刻蚀沟道，制作一个“三明治”式的分离浓缩芯片，阳离子膜依靠机械 力固定予两层芯片间。在线观测达筐黄在芯片上的富集特性；以花菁类染料 ( g e n e - f i n d e r ) 为荧光指示剂，在线监测d n a 在该芯片中的富集特性。利用单体 系d n a 与d 凇一血红蛋囱混合体系研究芯片的浓缩和分离效能，结采表明：该芯 片能够无损伤地捕获浓缩单体系与混合物体系中的d n a ，浓缩液可直接供给p c r 试验；在全血中基因组的提取实验中，该芯片能够捕获浓缩裂解液中的基因组 d n a ，但是纯度较低。芯片窦动纯糕度高，试莉用量少等特点使具有与其他芯片 联用的潜力，如与p c r 芯片联用，用于分离p c r 产物中的蛋囱质；或与其他萃 摘要 取芯片联用用于提取液的脱盐，浓缩等处理。 另芯片基予第三章表面电性可控的氨基化磁珠技术，磁珠作为园定相填 充于d n a 萃取芯片中，借助外磁场固定于微通道中。芯片成功地从全血裂解液 中萃取得到基因组d n a ，洗提液可直接用于p c r 实验。与传统的固相萃取芯片相 毙，磁珠芯片制作工艺要求低，磁珠填充与去除方便，试剂用量少、洗提液可 直接用于进一步的生物分析等优势使该芯片具有与细胞破碎芯片、p c r 芯片等 联用的发展前景。 本论文发展的两种固液双褶分离富集方法；把电渗析技术溺于生物大分子 的分离浓缩，并集成至微流控芯片，有效地实现在线富集与分离；制备表面电 性可控的m n p s 作为固定相用于核酸萃取，在芯片上实现d n a 在线纯化与浓缩。 在样品的预处理领域具有较大的应用空间。 关键词：d n a 萃取，电渗析，氨基化磁珠，固相萃取，微流控芯片 a b s t r a c t m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y t i c a ls y s t e m ( i x - t a s ) h a st h eg r e a tp o t e n t i a lt or e a l i z e a n a l y t i cp r o c e s si n t e g r a t i o n , a u t o m a t i z a t i o na n dm i n i m i z a t i o no nc h i p ，i tc a l lg r e a t l y r e d u c er e a g e n tv o l u m e ，s h o r t e na n a l y s i st i m ea n di m p r o v et e s t i n ge f f i c i e n c y , w h i c h e a l l l si t sp o p u l a r i t yi nt h ef i e l d so fd i s e a s ed i a g n o s e s ，b i o c h e m i c a la n a l y s i s ，c l i n i ct e s t a n ds oo n o n eo fe f f e c t i v ea p p r o a c h e st or e a l i z ei n t e g r a t i o ni su s i n gc h i p sw i n l d i f f e r e n tf u n c t i o nt oc o n s t i t u t et h ew h o l ea n a l y s i sp r o c e s s f o rp - t a sa n a l y s i s ， s a m p l ep r e t r e a t m e n ti so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ts t e pa n da c t u a l l yh a sb e c o m ea b o a l e n e c kt h a tm u s tb ea d d r e s s e df o ri t - t a s a t y p i c a lg e n ea n a l y s i sa n dd e s e a s ed e t e c t i o nu s u a l l yi n v o l v e sd n a e x t r a c t i o n ， d n a - a m p l i f i c a t i o na n dd n a s e p a r a t i o n e x t r a c t i n gd n a f r o ms a m p l ei st h ef i r s t a n dm o s ti m p o r t a n ts t e pf o rg e n ea n a l y s i s t r a d i t i o n a la p p r o a c ho fd n a - e x t r a c t i o n s u f f e r sd i s a v a n t a g e ss u c ha si m c o m p a c t i b l et op c r ，t e d i o u sa n dl a b o u r s s o l i d l i q u i d p h a s es e p a r a t i o na n de n r i c h m e n ti s as a m p l ep r e t r e a t i o nt e c h n o l o g yw h i c hc a nn o t o n l yr e m o v ei m p u r i t yb u ta l s oc o n c e n t r a t et a r g e ts u b s t a n c e m o r ei m p o r t a n t l y , i tc a l l b ee a s y l yu s e di nm i c r o f l u i d i cc h i pt oa c t u r i z eo nl i n ep r e t r e a t i o n t h i st h e s i sd e v e l o p e dt w ok i n d so fs o l i d l i q u i dp h a s es e p e r a t i o na n de n r i c h r m e n t w h i c hc a nb eu s et oc a p t u r ea n dc o n c e n t r a t ed n a o n ew a sb a s e do ne l e c t r o d i a l y s i s a n dt h eo t h e rb a s e do ns o l i d - p h a s ee x t r a c t i o nw i t hm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ( m n p s ) b o t hm o t h o d sw e r ed e m o n s t r a t ei t s u s e f u l n e e so nm i c r o c h i pf o ro n c h i p d n ae x t r a c t i o n t h et h e s i sc o n s i s t so ff o u rc h a p t e r s i nc h a p t e ro n e ，f i r s t l y ，s e v e r a lw a y sa n dt h eg e n e r a lp r o c e s so fd n ae x t r a c t i o n w e r er e v i e w e d t h e n , m e m b r a n es e p a r a t i o nt e c h n i q u ee s p e c i a l l yt h ee l e c t r o d i a l y s i s a n di t sa p p l i c a t i o ni nb i o c h e m c a ls e p a r a t i o nf i e l dw a si n t r o d u c e d n e x t l y , t h e p r e p a r a t i o no fn a n o p a t i c l e sa n dm a g n e t i cn a n o p a t i c l e sw e r ed i s c u s s e d ，s p et e c h n i q u e e s p e c i a l l y t h a tb a s e do nm n p s ，a n di t s a p p l i c a t i o ni nd n ae x t r a c t i o nw a s s u m m e r i z e d a n df i n a l l y , av a r i e t yo fd n ae x t r a c t i o nt e c h n i q u e si n c l u d i n gs p e ， a b s t r a c t m e m b r a n es e p a r a t i o nf o rm i c r o f l u i d i ca p p l i c a t i o n sw e r ec o m p a r e d i nt h es e c o n dc h a p t e r , ad e v i c eb a s e do ne l e c t r o d i a l y s i sf o rs e p a r a t i n ga n d e n r i c h i n g d n aw a sd e v e l o p e d i tu t i l i z e d c o m p r e h e n s i v e l yc a t i o n - e x c h a n g e m e m b r a n e sp r o p e r t yo ft r a p p i n g e l e c t r o n e g a t i v es u b s t a n c ei nc o n s t a n t c u r r e n t e l e c t r i cf i e l da n dd e a dv o l u m ei nf l o wp a t h a sam o d e lc o m p o u n d ，t i t a ny e l l o ww a s u s e dt os t u d yt h ee n r i c h m e n tm e c h a n i s m ，m o v e m e n tf e a t u r eo ft h ee l e c t r o n e g a t i v e a n do p t i m i z ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l to fc a p t u r i n ga n d e n r i c h i n gb i o m a c r o m o l e c u l ei n d i c a t e dt h a tt h ed e v i c ec o u l db eu s e dt oc a p t u r ea n d e n r i c hd n a n o n d e s t r u c t i v e l y t h er e c o v e r yo fl - d n a i ns i n g l es y s t e mw a sa b o u t 4 7 ，a n de x t r a c t i o np r o d u c tc a nb eu s e dd i r e c t l yt op o l y m e rc h a i nr e a c t i o n ( p c r ) w i t h o u ta n yi n h i b i t i o ne f f e c t i o n t h ed e v i c ec a na l s oc a p t u r e 久, - d n as e l e c t i v e l yf o r p c ra m p l i c t i o n ，f r o mm i x t u r eo fa , - d n aa n dh e m o g l o b i nw h i c hw e r eo fd i f f e r e n t e l e c t r i cp r o p e r t y o nt h eb a s i so fa b o v ew o r k ，w ef u r t h e ru s e dt h ed e v i c et oe x t r a c t g e n e n o m i cd n a f r o mw h o l eb l o o da n dd i r e c tp c r e x p e r i m e n t t h ed e v i c ew a sa b l e t os e p a r a t eb i o m a c r o m o l e c u l eo fd i f f e r e n te l e c t r i c p r o p e r t y , s u c ha sp r o t e i n s 、析t l l d i f f e r e n tp k aa n dn u c l e i ca c i d ，i tc a na l s ob eu s e df o rp u r i n ga n de n r i c h i n ga m i n o a c i da n do t h e rm i c o m o l e c u l e s t h ea d v a n t a g e so fs i m p l i c i t y ,a u t o m a t i o n , l o w c o n s u m p t i o no fr e a g e n tm a d ei tw i nl a r g es p a c eo fa p p l i c a t i o n i nt h ef i e l d so f e x t r a c t i o n ，d e s a l t i n ga n dp u r i f i c a t i o na n do t h e rp r e t r e a t i o np r o c e s s i th a dp o t e n t i a lt o b em i n i a t u r i z e da n di n t e g r a t e do nm i c r o c h i p t h et h i r dc h a p t e ro ft h et h e s i sd e v e l o p e dac h a r g es w i t c h i n gd n at e c h n o l o g y u s i n gs u p e r p a r a m a g n e t i ca m i n o s i 0 2 f e 3 0 4c o m p l e xn a n o p a t i c l e s ( a m i n o s i 一一一一 m n p s ) s u p e r p a r a m a g n e t i cf e 3 0 4n a n o p a t i c l e sw a sp r e p a r e db yh y d r o t h e r m a l m e t h o da n dc h a r a c t e r i z e db ys e m ，t e m ，x r da n dm p m s s t 6 b e rm e t h o dw a s a d o p t e dt oc o a tf e 3 0 4n a n o p a t i c l e sa n ds i 0 2 f e 3 0 4c o m p l e xn a n o p a t i c l e s 、析t l l c o r e s h e l ls t u c t u r ea n ds i z eo f a b o u t3 0 0 n t ow a sa c q u i r e d a p t e sw a su s e dt om o d i f y t h es u r f a c eo fs i 0 2 ：f e 3 0 4c o m p l e xn a n o p a t i c l ew i t ha m i n og r o u p s z e t ap o t e n t i a l m e a s u r e m e n tw a s p e r f o r m e d t o s t u d y t h es u r f a c ee l e c t r i c p r o p e r t y o f a m i n o - m n p s t h ez e t ap o t e n t i a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h es u r f a c ee l e c t r i cp r o p e r t yo f a m i n o - m n p sw a ss e n s t i v et op ho ft h es y s t e ma n dt h em e c h e n i s mo fa m i n o - m n p s a b s t r a c t b i n d i n gd n a w a si n v e s t i g a t e d g e n e n o m i cd n aw a se x t r a c t e df r o mw h o l eb l o o d , u s i n gl i t t l er e a g e n t ，t h ee x t r a c t i o nr a t ew a sa b o u t7 0 ，a n dt h ee l u t i o nc o u l db eu s e d f o rp c rd i r e c t l y e x c e p to fb e i n gs u p e r p a r a m a g e t i ca n dw a t e r - d i s p e r s i b l e ，b e a d s o w n e di t sp r o p e r t yo fe l e c t r i cp r o p e r t yc o u l db ec o n t r o l e db yc h a n g i n gp ho fs o l u t i o n , s h o r tt i m eo f b i n d i n ga n dd e s o r p t i o n t h e s em a d ei tb eag o o ds o l i dp h a s ef o rs p ei n d n ae x t r a c t i o na n do t h e rb i o s e p a r a t i o n , a l s oi nc h i p sf o rp r e t r e a t m e n t 。 i nt h ef o 矗hc h a p t e r , t w om i c r o f l u i d i cc h i p sf o rd n a s a m p l ep r e t r e a t m e n tb a s e d o nt h et e c h n i q u eo fs o l i d * l i q u i dp h a s es e p a r a t i o na n de n r i c h m e n tw e r ef a b r i c a t e d w e m i n i a t u r i z e da n di n t e g r a t e dt h ed e v i c eb a s e do ne l e c t r o d i a l y s i si n c h a p t e r 2t o m i c r o c h i p ac h i p 、析t l ls a n d w i c hs t r u c t u r ef o rs e p a r a t i o nw a sf a b r i c a t e dw h o s e m i c r o c h a n n a lw a se t c h e do np m m ab yl a s e ra b l a t i o n , t h ec a t i o n - e x c h a n g em e m b r a n e w a ss a n d w i t c h e db ys c r e w s t i t a ny e l l o ww a su s e dt oo b s e r v ei t se n r i c h m e n tp r o p e r t y o nl i n e c o m b i n i n g 诵氇g e n e f i n d e r ( ag e n ed y e ) ，d n aw a so b s e r v e do nl i n eb y f u o r e s c e n tm i c r o s c o p e l - d n aa n dm i x t u r eo f 九- d n aa n dh e m o g l o b i nw e r eb o t l l a p p l i e dt os t u d yt h ee f f e c to fe n r i c h m e n ta n ds e p a r a t i o n ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e c h i pc o u l dn o to n l yc a p t u r ea n de n r i c hd n a i np u r eb u f f e rb u ta l s os e p a r a t ed n a f r o mm i x t u r e ，b o l hc o n c e n t r a t i o nc a l lb ed i r e c t l yu s e df o rp c r t h o u g h 谢ml o w p u r i t y , t h ec h i ph a de x t r a c t e dg e n o m i cd n af r o mw h o l eb l o o ds u c c e s s f u l l y a u t o m a t i o n , l i t t l ec o m s u m p t i o no fr e a g e n te a r n e di tc o n v e n i e n c et oc o u p l e dw i 饿 o t h e rc h i p ss u c ha sp c r c h i po ro t h e rc h i p sf o re x t r a c t i o n b a s e do nc h a r g es w i t h i n ga m i n o m n p st e c h n i q u e ，a m i n o m n p sw a sf i l l e d i n t ot h em i c r o c h a n n e le t c h e db yl a s e ri np m m aa n df i x e db ym a g n e t g e n o m i cd n a w a se x t r a c t e df r o mw h o l eb l o o d 诹mt h ee l u t i o nc o u l db eu s e df o rp c rd i r e c t l y w i t h t h es i m p l em a n u f a c t u r ep r o c e s s ，c o n v e n i e n c et of i l la n dr e m o v e ，l i t t l ec o m s u m p t i o n o f r e a g e n ta n d t h ed i r e c tu s i n gf o rp c r e l u t i o n ，t h ec h i pw a se a s yt oc o u p l ew i t ho t h e r c h i p ss u c ha st h o s ef o rc e l ld i s c r u p t i o no rp c r t h et w om e t h o d so fs e r a p a t i o na n de n r i c h m e n ti nt h i st h e s i sh a da ne x t e n s i v e s p a c eo fa p p l i c a t i o ni np r e t r e a t m e n t e l e c t r o d i a l y s i sw a sa p p l i e dt os e p a r a t ea n d c o n c e n t r a t eb i o m a c r o m o l e c u l ea n di n t e g r a t e di n t om i c r o f l u i d i c c h i pt or e a l i z e a b s t r a c t e n r i c h m e n ta n ds e p a r a t i o no n l i n e c h a r g es w i t c h i n gm n p sw a sp r e p a r e dt oe x t r a c t d n aa n du s e di nm i c r o f l u i d i cc h i pt oa c t u a l i z ep u r i f i c a t i o na n de n r i c h m e n to nl i n e k e yw o r d s ：d n ae x t r a c t i o n ，e l e c t r o d i a l y s i s ，a m i n o m n p s ，s p e ，m i c r o f l u i d i cc h i p 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为() 课题( 组) 的研究成果，获得() 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在() 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) ： 年胃习 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 () 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“”或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人： 年月日 第一章前言 第一章前言 1 1 脱氧核糖核酸的提取过程 脱氧核糖核酸( d n a 】分子是具有双螺旋结构的，如图1 i 所示，左图为核酸 的双螺旋结构，双链由核苷酸组成；如图1 1 中右图所示，核苷酸由一个碱基， 一个五碳糖和磷酸基构成，双链的内层是通过氢键结合一起的碱基对，外侧是磷 酸基吐d n a 分子的特殊结构决定了它的性质：水溶性；等电点较低( 4 0 _ 4 5 ) 1 2 l ； 超长链生物分子，在提取过程中容易受到外界的影响而发生断裂或解链p 】。因此， 为提取完整的目标产物，必须选择合适提取方法。 图11d n a 分子双链结构示意图 2 1 世纪，人类基因组研究取得巨大成就，基因组测序工作提前完成，生物 技术从此进入新的基因时代。随着2 0 0 4 年初第一个基因治疗药物获得生产批文 1 4 】，基因治疗【5 j 进入新的发展时期。基因治疗药物的主体是目的基因的载体，包 括病毒载体( 如腺病毒、逆转录病毒) 和非病毒载体( 如质粒d n a ) ，其相对分子质 量和尺寸均大于蛋白质，属于超太生物分子，其大规模的分离纯化为生物分离工 程的发展提出新的挑战网。 在对基因的研究过程中，首先要把带有目的基因的d n a 从生物样品中提取 出来，再对提取物做进一步的研究。从生物样品中提取核酸与纯化是分子生物学 第一章前言 与临床医学等生命科学研究领域中的一项基本技术的【6 j 。核酸在细胞中总是与各 种蛋白质结合在一起的，核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生 物大分子物质分开，在分离核酸时应保证核酸分子一级结构的完整性同时排除其 他分子污染【7 1 。随着分子生物学技术广泛应用于生物学、医学及其相关领域，核 酸的分离与纯化技术也得到进一步发展，各种新方法、经完善后的传统经典方法 以及商品试剂方法的不断出现，极大地推动了分子生物学的发展。 1 1 1d n a 提取前的预处理 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他 生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤【6 ，8 】。每一步骤又可由多种不同 的方法单独或联合实现。 1 细胞裂解 核酸主要存在于与细胞核中，要获得核酸必须破坏细胞壁和细胞膜以增大通 透性使核酸释放出来。破碎方法大致分为两种：物理作用和化学作用【9 】。 物理作用：主要基于对样品的挤压和剪切作用，包括低渗裂解、高压匀浆、 超声裂解、冻融裂解( 如喷雾撞击破碎) 和颗粒破碎( 珠磨) 等方法。这些物理方法 利用机械力( 压缩力和剪切力) 使细胞破碎，处理量大，效率高，避免引入大量的有 机试剂，但也存在本身难以克服的缺点，如低渗裂解耗时，超声、冻融和匀浆法 由于机械力作用，可能导致核酸链的断裂，破坏目标产物的一级结构，因而不适 用于长链核酸的分离。有报道【8 】超声裂解法提取的核酸片段长度从在5 0 0 b p - - 2 0 k b p 之间，而颗粒匀浆法提取的核酸一般小于1 0 k b 。 化学作用：利用化学试剂或酶改变或破坏细胞壁和细胞膜的结构，破坏细胞 壁和膜，增大胞内物质的溶解速率，在渗透压作用下释放胞内物质。主要通过加 入表面活性剂( i ns d s 、t r i t o nx 2 1 0 0 、t w e e n2 0 、n p 2 4 0 、c t a b 、c h e l e x 2 1 0 0 等) 处理细胞，以增大细胞壁或细胞膜的通透性或加入强离子剂( 如异硫氰酸胍、 盐酸胍、肌酸胍) 破坏氢键作用，降低胞内产物之间的作用，使其容易释放1 6 j 。在 一定的p h 环境下，表面活性剂或强离子剂还可使部分蛋白质和多糖沉淀。p h 环 境由加入的强碱( n a o h ) 或缓冲液( t e 、s t e ) 等提供，改变p h 值可改变蛋白质的 荷电性质，使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的相互作用力降低而易于溶 2 第章前言 解，从而提高目标产物的溶解度。缓冲液中的一些金属离子螯合剂( e d t a 等) 还 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子( m g2 + 、c a ：3 ，从而抑制核酸酶的活性， 保护核酸不被降解。 化学破碎比物理破碎方法速度慢，效率低，且引入化学和生化试剂形成新的 污染，影响后续的分析，但是化学破碎的方法选择性高，且条件较温和，目标产 物不容易断裂降解。因此在小规模的提取上受到青睐。 2 酶处理 酶作用主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶( 如蛋白酶k 、植物蛋白酶或链酶蛋 白酶) 使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸 的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖n 乙酰葡糖胺和n 乙酰胞壁 酸残1 3 ( 1 ，4 ) 基间的键水解。蛋白酶k 能催化水解多种多肽键，且在6 5 及 有e d t a 、尿素( 1 - - 4 m o l l ) 和去污剂0 5 s d s 或1 t r i t o nx 2 1 0 0 存在时仍保 留酶活性，有利于提高核酸的提取效率。如在裂解液中加入蛋白酶( 蛋白酶k 或 链酶蛋白酶) 可以降解蛋白质，灭活核酸酶( d n a s e 和r n a s e ) t 6 , 9 】。 1 1 2 核酸与杂质分离的传统方法 核酸与其他生物大分子物质的分离是核酸提取实验中的核心步骤。在分子生 物学发展的过程中，各种萃取技术被广泛研究，传统的方法主要有以下两种： 1 酚一氯仿抽提法 传统的d n a 提取技术为有机溶剂法，如酚氯仿法，主要根据核酸在不同溶剂 中的溶解性差异实现核酸的分离。细胞裂解后离心，分离含核酸的水相，加入等体 积的萃取剂( 酚：氯仿：异戊醇体积比为2 5 ：2 4 ：l 的混合液) 。两相经漩涡振荡混 匀( 适用于分离小分子量核酸) 或简单颠倒混匀( 适用于分离高分子量核酸) 后离心 分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。酚是一种有机溶 剂，预先要用s t e 缓冲液饱和，因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚 也易氧化发黄，而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联；故在 制备酚饱和液时要加入8 羟基喹咛，以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪，使更多蛋白 质变性，从而提高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。 核酸盐可被一些有机溶剂沉淀，通过沉淀可浓缩核酸，改变核酸溶解缓冲液 3 第一章前言 的种类以及去除某些杂质分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在 含核酸的水相中加入p h5 o 5 5 ，终浓度为0 3m o l l 的n a o a e 或k o a c 后， 钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷，在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然 后加入2 - - 2 5 倍体积的乙醇，经一定时间的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他 的一些有机溶剂( 异丙醇、聚乙二醇等) 和盐类( 1 0 0 m o l l 醋酸铵、8 0 m o l l 的氯 化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等) 也用于核酸的沉淀。不同的离子对一些酶有 抑制作用或可影响核酸的沉淀和溶解，在实际使用时应予以选择。经离心收集， 核酸沉淀用7 0 的乙醇漂洗以除去多余的盐分，即可获得纯化的核酸【l 3 1 。 2 密度梯度离心法 密度梯度离心也用于核酸的分离和分析。双链d n a 、单链d n a 、r n a 和蛋白 质具有不同的密度，因而可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带该法 适用于大量核酸样本的制备【l ，其中氯化铯一溴化乙锭梯度平衡离心法被认为是 纯化大量质粒d n a 的首选方法。氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质，梯度 液中的溴化乙锭与核酸结合，离心后形成的核酸区带经紫外灯照射，产生荧光而 被检测，用注射针头穿刺回收后，通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的 核酸【l o l 。 传统方法对设备要求简单，但是存在着有机溶剂毒性大、重复性劳动多、难 以实现微型化、自动化操作等缺点。固液双相分离富集是一种既可实现待测物的 浓缩富集又能够去除杂质组分干扰的样品预处理技术，基于固液双相相互作用主 要有过滤、膜分离、固相萃取等。下文主要介绍膜分离与与固相萃取技术及其在 核酸纯化领域的应用。 1 2 膜分离与电渗析技术及其在生物分离中的应用 1 2 1 膜分离技术及其应用 膜分离技术是利用天然或人- i - n 备的、具有选择透过性的膜，以外界能量或 化学位差为推动力。对双组分或多组分的溶质和溶剂进行分离、分级、提纯和浓 缩的方法。膜分离具有省能、高效简单、易操作、易于自动化等优势，可以替代 传统的某些分离技术( 如蒸发，萃取，结晶等) ，被公认为2 0 世纪末至2 l 世纪中期 4 第一章前言 最有发展前景的高新技术之一【1 2 1 3 1 。 膜具有选择透过性，当膜的两侧存在某种推动力( 如压力差，浓度差，电位 差等) ，原料侧组分选择性地透过膜从而达到分离的目的。不同的膜过程使用的 膜不同，推动力不同，其传递机理也不同。各种膜分离方式的传质驱动力和主要 应用如表1 1 f 1 3 】。 表1 1 主要的膜过滤方法及其对应的驱动力与应用领域 透析过程中