（分析化学专业论文）金纳米粒子标记结合表面增强拉曼法对蛋白质的检测.pdf

摘要 目前，生命科学研究已经进入单分子、单细胞阶段，即分子或细胞水平上研究生命 活动规律，疾病的发生与发展，药物与机体的相互作用等。表面增强拉曼( s e r s ) 技术 是拉曼散射光与金属纳米粒子发生表面等离子共振而产生的拉曼增强现象，因具有高检 测灵敏度已经成为生命分析及单分子研究重要手段。本论文以表面增强拉曼的方法为检 测手段，金纳米粒子为基底，研发了新型的蛋白质检测方法。 首先，通过调节反应初始混合物中还原剂以及配体稳定剂与氯金酸的比例，选择 性的可控合成了1 3 姗及3 0 n m 金纳米粒子，作为表面增强拉曼反应的基底。 其次，我们研发了一种在溶液中以金纳米粒子为基底结合s e r s 光谱分析的方法， 实现简单且高灵敏度的用于蛋白质间相互作用的检测的方法。实验结果表明，这种方法 对蛋白质的检测具有较低检测限和相对较大的线性响应范围，此方法对溶液中i g g 的识 别最低浓度为ln g m l 。 最后，我们研发了一种在生物芯片上，以金纳米粒子为探针，利用s e r s 光谱对蛋白 质问的反应和多肽进行检测的高灵敏度，高选择性的检测方法。实验结果表明，这种方 法对于多肽及蛋白质问的相互作用的检测具有很低的检测限和较大的线性响应范围。在 这种新型光谱分析方法中，芯片上多肽样品点的最低检测限为1 0 坛，在蛋白质问相互 作用体系中，对溶液中蛋白质( i g g ) 的检测浓度为0 1 烬m l ，对芯片上蛋白质样品 ( p r o t e i na ) 的最低检测限为1 0 0f g 。 关键词：金纳米粒子；多肽，蛋白质问相互作用；表面增强拉曼；生物芯片 a b s t r a c t b e n e f i t 丘- 0 mt h ee x t r e m e l y1 1 i 曲e n h a i l c 锄e n te 仃e c t 撕s i n gf r o mm ep r o x i i l l i 够o f n 趾o s 仇l c t i l r e dm e t a ls l l r f a c e s ，s 删ee i l l l a n c e dr 锄a ns c 甜e r i n g ( s e r s ) h a sb e e ne x p l o i t e d i l lm 舡巧s t i l d i e st oo b s e r v et r a c e 锄o u n t so f b i 0 1 0 9 i c a l l yr e l e v a n tm o l e c u l e s h 1m i sp 印e r ，w e d e v e l o p e d a1 1 i g h l ys e n s i t i v ea n ds e l e c t i v e 硒s a yb a s e do ns e r sf o rd e t e c t i o no f p t e i n - p t e i ni n t e r a c t i o i l s f i r s t l y ，g o l dr 埘1 0 p a r t i c l e sw i t l ld i f r e r e n ts i z e s ( 13o r3 0n m ) w e r ep r 印a r e db yv a r ) ，i l l g t h er a t i oo fg o l dt or e d u c i i l gr e a g e n to rc a p p i n g1 i g a n d t h e a s - p r e p a r e d13 i 皿a r l d3 0 i l i ng o l d n a n o p a n i c l e sw e r eu s e da ss u b s n 锨e so f s e r s s e c o n d l y ，as e i l s i t i v es p e c 仃o s c o p i ca u s s a yb 嬲e do ns e r su s i n gg o l dn a n o p a r t i c l e s 邪 s u b s 觚t e sh a sb e e nd e v e l o p e df o rr 印i dd e t e c t i o np r o t e i n p r o t e i n i n t e r a c t i o n s h i g m y s e l e c t i v er e c o g i l i t i o no fi g gd o w nt 0ln g 越i ns o l u t i o ni sd 锄o n s 协a t e d m r d l y ，w ed e v e l o p e dan o v e l1 1 1 i c r o a r r a yb 嬲e ds e r s 嬲s a yf o rd e t e c t i o no fp 印t i d ea l l d p r o t e i i li n t e r a c t i o nb y 撇l l i l l e n to fg o l dn a n o p a r t i c l e sf o l l o w e db ys i l v e rd e p o s i t i o nf 0 r s i 印a le r l h a i l c e m e m h 1t h i sn e ws p e c 仃o s c o p i c 嬲s a y ，p 印t i d ei sd e t e c t e dd o w nt 0al i i i l i to f1o 龟o nm ei i l i c r o a r r a ys p o t s a n dr e c o g m t i o no fs t a 】帕a r dp r o t e i i l s ( p r o t e i na a 1 1 di g g ) d o w nt o 0 1 啪lf o rp r o t e i i l si ns o l u t i o na n dl o o 垮f o rp r o t e i i l so nt h ei n i c r o a m 拶s p o t sa r ea l s o d e m o n s t r a t e d k e yw o r d s ： g 0 1 dn 锄o p a n i c l e s ，p 印t i d e ，p r o t e i i l - p r o t e i l li n t e r a c t i o n s ，s e r s ，m i c r 0 觚叫 i i 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所 取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：兰窒沿篷日期：d 趟16 ，l 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学 位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全 文数据库( 中国科学技术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版 发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：懿 日 期：出逝。6 。i _ 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名： 日 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 表面增强拉曼散射的机理及应用 1 1 1 表面增强拉曼散射概述 1 9 2 8 年，印度物理学家r a n l a n 首先从实验观察到单色入射光投射到物质中后会产生 散射，通过对散射光进行光谱分析，发现散射光除了含有与入射光具有相同频率的光 r a y l e i g n 散射外，还包含有与入射光频率不同的光。以后人们将这种散射光与入射 光频率不同的现象称为拉曼散射。在散射光中，r a y l e i g n 散射的强度大约只有入射光的 1 0 一，而拉曼散射的强度只有r a y l e i g n 散射强度的1 0 1 0 咱。因此正常拉曼效应本质上 是一个弱的效应，理想的高效率光源是得到拉曼散射的关键。二十世纪六十年代激光的 发明，人们可以极大的提高单位面积内的光通量，从而使拉曼光谱变成了研究分子结构 和各种物质微观结构的重要工具。对于体相样品来说，高能量密度的激光光源以及采样 较多的分子数，使得人们很容易获得拉曼光谱图。但对于研究表面的分子来说，拉曼光 谱的灵敏度还不能满足人们的要求。这主要是由于在表面的物质往往是单分子层，甚至 是亚单分子层，采样的分子数目很少，不能获得足够的拉曼强度。 1 9 7 4 年，f l e i s c h m a n 等人首次对电化学银电极表面的吸附的吡啶分子的拉曼散射 进行了测量，获得了吡啶分子的增强拉曼信号，但他们以为增强起因于电极表面积的大 幅度增加，导致吸附样品分子的数目增加所致。1 9 7 7 年，v a nd u g n e 瞄。和c r e i g h t o n 啼1 的独立研究表明，粗糙银电极的表面积只不过增加了1 0 倍，这样大的增强不能仅以表 面积的增加来解释。而吸附在银电极表面吡啶的拉曼散射比正常拉曼散射强度增强 1 0 5 1 0 6 倍，这种非同寻常的拉曼散射称为“表面增强拉曼散射( s u r f a c er 硼a n s c a t t e r i n g ) ，简称s e r s 。 研究发现，除了粗糙的银电极表面具有增强效应外，利用化学沉积法制得的“银 镜 以及利用机械方法制得的粗糙银表面也能产生增强效应h 一3 。受到电磁增强理论模 型的启发，m o s k o v i t s 等预言：在金属溶胶体中也能观察到s e r s 效应。金属胶体是许 多悬浮在液体( 通常是水) 中，大小为几十纳米的金属晶体颗粒组成，是由于水溶液或 非水溶液介质作为还原剂还原可溶性金属盐而获得，金属胶体中其颗粒大部分是球形粒 子，因此可以用理论模型进行很好地描述，还可以把s e r s 信号强度与颗粒大小、形状 等参量联系起来，同时胶体中不存在象其他基底那样的光损伤，因而受到理论和实验工 作者的重视。 经过多年的研究，人们对s e r s 已有了相当的认识并获得以下几点共识h 1 们： ( 1 ) 只限于在少数基体表面上可以产生明显的s e r s 效应。银，金和铜因为有很 大的增强效应而被广泛地用来作为s e r s 的金属基底。锂n ，钠n 刳，钾n 3 1 钔，铝，镍5 1 和铂n 们也有一定的增强作用。另外在某些半导体上，如硫化镉，三氧化钛等表面，也能 1 东北师范大学硕士学位论文 观察到s e r s 效应。 ( 2 ) s e r s 通常只发生在粗糙化的金属表面上，其粗糙度有亚微观( 1 0 一2 0 0 n i l l ) 与微观( 原子尺度) 级。并且，增强因子与表面形貌密切相关，且变化范围很大。 ( 3 ) 许多分子都能产生s e r s ，但主要的先决条件是分子能吸附到金属基底表面。 文献中已报道了几百种化合物的s e r s 光谱，其中大多为杂环化合物。 ( 4 )s e r s 效益按照作用距离，可分为长程性( 分子离开表面数十埃乃至上百埃 仍有增强作用) 和短程型( 分子离开表面数埃增强作用便迅速减弱) 两种类型。s e r s 强度随分子离金属基底表面距离的增加而迅速降低。一般较小分子被吸附到金属表面 时，分子内部所有振动的拉曼信号都能同样的被增强而观察不到距离效应，而较大的生 物分子被吸附到基底表面时，与表面接近的基团显示出强的增强效应，而离表面远的基 团增强效应较小。 ( 5 )与普通拉曼光谱相比，化合物s e r s 光谱大多数谱峰的频率稍有变化，但相 对强度却有很大的差别。 ( 6 ) 拉曼散射的选择定则在s e r s 中被放宽了，普通拉曼光谱中峰的出现完全遵 守拉曼跃迁的选择定则，即仅为红外活性的振动模式不会出现，但对于s e r s 光谱，选 择规律并不太严格，有时在s e r s 光谱中能观察到与仅为红外活性振动模式相应的谱峰。 ( 7 )普通拉曼光谱拉曼强度和激发光频率的四次方成正比，但s e r s 强度却不遵 循这一关系。许多实验证明，s e r s 强度先随激发光频率降低而增强，在达到极大值后， 随激发光频率下降而下降。s e r s 强度和激发光频率的关系与金属基底有关，银基底对不 同频率的激发光都有较好的s e r s 效应，s e r s 强度的极大值在黄光或红光区。而对金和 铜增强基底，使用蓝光时，一般只有很小的s e r s 效应，s e r s 强度最大值相应的激发光 频率要比在银基底上的低。 ( 8 ) 分子的不同振动模式的增强因子不同，并有不同的激发曲线( 指增强极大和 激发频率的关系曲线) ，在电化学s e r s 实验中，增强因子和激发曲线均与施加电势有关。 ( 9 ) 能产生s e r s 的基底表面，同时产生不依吸附分子而变弱的连续背景非弹性 散射谱。 ( 1 0 ) s e r s 基底表面存在特殊活性位点。在单分子层吸附的情况下，s e r s 强度和 覆盖度的关系是非线性的，大部分的增强效应是由一小部分吸附在金属基底表面活性位 点的分子产生的。 ( 1 1 ) 许多化合物有较强的荧光，在测量此类化合物的普通拉曼光谱时，往往受到 很强荧光干扰而不能得到很好的拉曼光谱。但在测量s e r s 时，荧光被淬灭，因而能得 到质量很好的s e r s 光谱。 研究发现，s e r s 效应受分子在表面的取向影响。8 0 年代初，m o s k o v i t s 在电磁理论 的基础上提出了表面选择性定则，该定则指出，激发光与金属等离子体发生相互作用， 加强了粗糙表面的局域电场，从而增强了r 锄a n 散射。由于表面局域电场沿表面法线方 向达到最大值，因此表面选择性定则认为，垂直于基底表面的振动谱能得到很大的增强， 2 东北师范大学硕士学位论文 而平行于基底表面的振动谱带增强较小。大多数吸附分子取向的研究可以以表面选择定 则为基础。 1 1 2 表面增强拉曼散射的机理 s e r s 现象一出现就引起了人们对其增强机理的研究，这种增强效应是不能简单地用 表面积的增加来解释的，因为粗糙化的表面即是不可能百万倍增强的。但是人们也发现， 衬底的表面粗糙度确实对s e r s 是一个不可缺少的条件，粗糙度不好可能观察不到增强拉 曼信号。而有关汞表面上吸附分子s e r s 效应的报道则对上述结论提出挑战，因为液体汞 几乎可以认为是完全光滑的。 目前，一般认为s e r s 增强主要是两种机理的贡献n 7 1 叼：电磁场( e m ) 增强机理主要描 述表面局域光电场增强所导致的分子的拉曼散射截面的显著增大，它不仅与构成表( 界) 面材料的光学性质、表面的形貌和激发光的频率有关，而且与被测分子所处的局域几何 结构有关。由于该机理仅考虑入射光子与金属表面的作用，因此对吸附分子没有选择性： 化学增强机理则主要描述分子、表面和入射光子三者相互作用的类共振增强现象，其中 最重要的贡献是电荷转移( c t ) 机理。自由分子的拉曼强度可由式( 1 ) 得到，而其表面增强 拉曼散射强度一般可用下式来表示： 纛嬲能奄藤赢，叫勰2 一盯 式中y 是拉曼散射光的频率。为描述金属表面入射光与散射光的局域电磁场( 光电 场) ，分别用厶。与氏替代式n ) 中的激发光的功率密度五。它们的平方代表入射光与散射 光在表面位置的强度，其值代表了表面电磁场增强效应啪l 对口，。求和项表示因分子内 及分子与表面的相互作用所引起的光学响应，它代表了化学增强效应。 电磁增强理论有以下几个特点：( a ) 该效应本质上为长程作用，因为可极化金属粒 子的偶极场与到粒子中心距离的三次方成反比关系。( b ) 增强效应一般与吸附分子无关。 ( c ) 增强取决于基底的电子结构与表面粗糙度，因为表面等离子体共振频率取决于这些 因素。化学增强效应也称为电荷转移( c t ) 或短程效应。它与金属及吸附物种的电子结构 有关，可用类共振拉曼机理来解释。化学增强效应只在分子尺度的短程范围内对s e r s 有 贡献。这种机理依赖于吸附位、成键的构型与吸附分子的能级。电荷转移过程对总的s e r s 增强因子的贡献约为1 0 1 0 1 7 2 引。 1 1 3 几种标记方法在免疫分析中的应用 免疫分析是利用抗体( a n t i b o d y ) 与抗原( a n t i g e n ) 的特异性结合作用来选择性 的识别和测定可以作为抗体或抗原的待测物，具有很高的选择性。无论是生物大分子或 有机小分子，都可以通过生物技术获得相应抗体，因此免疫分析技术在药物筛选、临床 诊断、食品控制及环境监测等方面取得了广泛应用。 s e r s 技术在研究生物大分子方面的独特优势有： 3 东北师范大学硕士学位论文 第一，大部分生命现象发生在水溶液中，水是生物样品中的一种主要成分，它 在红外区有强烈的吸收，而水的拉曼光谱信号在一般感兴趣的范围内则 非常微弱，对生物样品振动干扰很少，因而拉曼技术非常适合于水溶液 体系的研究。 第二，生物样品往往有很强的荧光背景，很难得到好的普通拉曼信号，而具有 s e r s 活性的金属基底可以淬灭生物分子荧光，从而使s e r s 信号的信噪 比大大提高。 第三，应用s e r s 技术可以得到比常规拉曼光谱大1 0 6 倍的增强系数，这样就可 以使生物大分子的探测浓度降低到一般生理环境下的浓度，是研究在生 理环境下生物分子结构信息的一种有效方法。 第四，依据s e r s 增强的机理，只有和金属表面发生相互作用的基团才会被增 强，s e r s 对蛋白质大分子的增强具有选择性，只有露在分子的外侧与金 属纳米粒子直接发生作用的基团才会被增强，这些部位通常就是分子中 具有显著生物学特征的部分，比如抗体抗原的活性位置。 g r a b b e 与b u c k 研究小组发现，吸附在银电极表面的人免疫球蛋白分子只有露在外 侧于金属表面直接发生作用的t r p 、c y s 、a s p 、t y r 和g l u 氨基酸残基振动才能被增强， 没有观测到酰氨的骨架振动乜副。这些易于与金属纳米粒子发生作用的氨基酸残基侧链往 往是抗体与抗原相互作用的参与者。1 9 9 8 年，d o u 等人观察到了金胶体表面鼠抗免疫球 蛋白与抗原发生特异性相互作用后的近红外s e r s 光谱变化堙6 1 。 蛋白质都由2 0 种基本氨基酸组成，因此无法根据结构等物理化学性质的变化，有 效地选择性识别和测定待测物，因此，人们利用有特征物理化学性质的标记物，发展了 一系列标记分析方法： ( 1 ) 放射性标记技术 b e r s o n 和y a l o w 在研究胰岛素免疫特性的基础上创立了放射性标记法。它的诞生为 复杂的生物活性物质高选择性超痕量分析( 1 0 1 2 1 0 1 5 m 0 1 几) 开辟了广阔的道路心7 1 ，因 此在生物医学领域内获得了广泛的应用。这种方法虽然灵敏度高，并具有抗原一抗体反 应本身所具有的特异性，但其所用的标记物放射性同位素不断衰变，不能久存，又 对人体及被测生物大分子具有损害。同时，检测用仪器昂贵，维护成本高，操作费时， 结合和游离的抗体分离困难，对临床大批量样品的检测极为不便，因此近十几年来人们 一直在致力于各种非放射性标记物的研究。 ( 2 ) 金标记技术 胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种 新型标记技术。由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，使定位更加准确。 胶体金标记技术诞生于7 0 年代，最初仅用于组织化学与细胞化学的电镜研究中。 早在一个世纪以前，化学家就对胶体金进行了研究，当时只是研究它的结构和金属性质。 在1 9 3 9 年k a u s c h e 和r u s k a 把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察见金 4 东北师范大学硕士学位论文 粒子呈高电子密度汹1 。然而胶体金技术作为标记物应用于免疫组织化学研究是在1 9 3 9 年k a u s c h e 和r u s k a 首先将兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化 学技术检测沙门氏菌的表面抗原【2 9 1 。此后，他们还把胶体金与抗原血清，植物血凝素， 卵白蛋白，人免疫球蛋白轻链、牛血清白蛋白结合应用。1 9 7 4 年r o m a n o 等将胶体金属 标记在马抗人的i g g 上，实现了间接免疫金染色法【3 0 】。1 9 7 2 年b a u e r 等报道凝集素 金复合物的应用【3 l 】。1 9 7 8 年g e o 曲e g a n 等应用免疫金技术检测b 淋巴细胞表面抗原【强】。 随着胶体金技术逐渐完善和成熟，近年来此项技术得到了迅速发展和广泛应用，如：根 据随着金纳米粒子由分散态向聚集态转变，表面等离子共振吸收会发生显著的红移，即 金纳米粒子的特征峰由5 2 0 i l i n 红移至6 0 0 m ，伴随着溶液颜色由红色到紫红色再到蓝 色转化。利用这一原理，m m 血等建立了用巯基化寡核苷酸探针标记纳米金，并检测特 定多核苷酸序列的新方法【3 玉3 4 j ，即：利用纳米金标记的寡聚核苷酸探针和靶序列杂交形 成伸展的金纳米粒子寡聚核苷酸的多聚网络结构，并由此引发粒子光学性质的变化， 产生寡聚苷酸的杂交信号。检测过程中纳米金颗粒用末端带有巯基丙烷( 或巯基己烷) 的 两种不相互补的寡核苷酸探针修饰，当探针与靶序列杂交时，靶片段就会与纳米金颗粒上 的两种寡核苷酸探针互补，金纳米颗粒就会相互联结，形成延伸的网络结构。当纳米粒子 间的距离充分大于其直径时，体系呈红色，间距小于平均粒子直径时有红色到紫红色最后 呈蓝色( f 嘻1 1 ) ，从而，由颜色的变化判断反应的进行。目前它已被应用于医学和生 物学研究的众多领域。 f ? 、- ，“ 式 t a r l i 戳 页f 三r 竺 r 扩垫 刚睢阳删e f 培1 1d e t e c t i o n 两n c i p l e so f t h ed n r n a b y9 0 l dn a l l o p 耐i c l e s ( 3 ) 荧光分析 荧光分析法是将生物反应的特异性和荧光技术的敏感性结合起来的一种方法。荧光 分析法在医学的基础研究及临床诊断中占有重要地位，而性能优良的标记探针的开发则 是发展这一技术的决定性因素。半导体纳米晶具有量子限域效应，其光学性质虽粒子尺 寸变化而变化，同时其发光效率与体相材料相比也有很大的提甜2 “3 5 】，表现出的优异的 光学、电磁学等特性，克服了传统荧光物标记颜色单一，荧光效率差的缺点，采用单一 东北师范大学硕士学位论文 波长激发即可获得多色荧光。1 9 9 8 年a l i v i s a t o s 等首次报道了利用半导体纳米晶替代有 机荧光染料作为生物分子标记物，成功的标记了铁转移蛋白和免疫球蛋白等，显示是了 纳米晶在生物标记检测中的巨大应用潜力 3 6 1 。 ( 4 )免疫检测方法的新发展s e r s 免疫检测 s e r s 免疫检测的基本原理是将特异性的抗体或抗原标记上拉曼活性分子使之成为 特异性试剂，与相应的抗原或抗体结合，形成抗原抗体复合物，利用s e r s 对拉曼活性 分子的增强效应，以拉曼振动光谱为信使，获得样品中抗原或抗体的信息。 与荧光法相比，单一波长的激发光就可以激发不同的拉曼分子，而荧光法则需要用 不同波长的激光来激发不同的分子，并且拉曼特征吸收峰的宽度要小于荧光吸收，但是 其可以选择的检测窗口要远远大于荧光法，因此更适合作多通道检测并提高选择性。 典型的拉曼振动峰半峰宽约为o 5n m ，理论上在2 0 0 0c m 。的拉曼光谱检测范围内， 可选择1 0 0 0 个具有不同拉曼特征振动的分子，即使考虑谱带的重叠，可选范围缩小1 0 倍，仍可标记识别1 0 0 中待检测物【37 j ( 如f i g 1 2 所示) ，利用s e r s 技术进行生物标记 识别引起了人们浓厚的研究兴趣。2 0 0 2 年美国西北大学m i r k i n 研究小组选取了包括罗 丹明6 g 在内的六种拉曼活性的染料分子作为拉曼探针对六种不同的d n a 进行了标记 p 引，f 培1 2 为使用罗丹明6 g 等染料标记的六种不同序列的d n a ，用激光激发而观察 到对应不同的染料的s e r s 特征振动谱线。 缓一- i ；，。，。，。i 。一 ”。”。够i i 焉器翟霖嚣玄怒罴墨鬈黑。彀l ， = t ； 夕；蔓i。，删辩嚣鬈瑟鬟淼黑鬣鬣嚣善羰j s ，2 ，1 一。，。一。hj 4 “j “；i ，” ； ，。 ， 女 。 5 一a g a a g 矗1 玎下t $ g 矗矗t a a 一0 芦滞0 a 0c 1 gg a t0 c a * 3 。 一_ _ 。、 i 一嚣- a 一丁了e t 聊。a 盘c e t t 苘玎g 了a o t o g 二e c t a c g 了- a 矿孓、r 3 ” u ，：u 、 一 j 一。一。t 。- 口 _ _ | ；_ ：二： ；。 。“ 5 0 g 盎g 了矗a 矗 了0 g 一g 卢以0 a ( ；1 硝0 私0 a 艮3 ，j ， 。，二。，e j o 导a 矿o c 下e 鼻彳彳c 能o c l o t t g 彳。声 o r f e 下善a ，s v 4 ， ，一 一 i z 一 ，e j o 导a r o c 下e 鼻彳彳c 能o c l o t 下g 彳。声 o 丁下e 下下a t s l t l 4 霸。一誓j ， ： 翳+ 篓 。 8 一a g 下下g 了a 盎e g g a a g 声r 一g e a a _ a g t a a _ re a g 一3 一 i 班量+ 。 - 臻曩a 下二a e a t r = ；e _ r t 0 下 盘e s t 彳a 彳e 磊了盘0 下e 境。s 落s 。? 一一一、+ 。 缓彩 i ， 嚣。* g 是g a 了张盯鑫”硅鳓计a ? 节g 丁a 赢a gg 叠j ” 荔缓 一j ，叱7 。2 。t。y 弓值f c 了ec e 丁a a t 矗矗c a a tt 弘下盘盘e 解_ 丁e c 强。a 。_ 弋s f 殆q 锯e n o y e m _ f i g 1 2t h es e r ss p e c t r ao f s i xd y e l a b e l e dd n a p r o b e s 1 9 9 0 年，n i 等人以镀金表面为检测载体，用拉曼活性分子苯硫酚( t p ) 和2 巯基 萘( n t ) 对羊抗鼠免疫球蛋白和羊抗兔免疫球蛋白进行标记，利用金纳米粒子在红光 激发下对拉曼活性分子的增强效应，成功地实现了对鼠免疫球蛋白和兔免疫球蛋白的识 6 东北师范大学硕士学位论文 别检测【3 9 】。f i g 1 3 是s e r s 检测结果，可以看到在7 8 5 1 3 姗的激发波长下，分别在含 有鼠免疫球蛋白和兔免疫球蛋白待检物中检测到了相对应标记物n t 在1 3 7 7 c m - 1 、t p 在9 9 9 c m 。1 的s e r s 特征振动，并且在两者的混合物中同时检测倒了两种标记物的s e r s 特征振动。s e r s 标记检测同时具有高敏感性和反应的强特异性，通过s e r s 标记法可 以实现对多种待测物同时检测，在多通道免疫检测领域具有巨大的应用潜力，它的开展 无疑在临床免疫医学诊断领域开辟了一条崭新的途径1 3 l4 。 f 培l - 3s e r ss p e c t r ao fd e t e c t i o ns 锄p l e sc o n 诅i i l i n g ( a ) p b sb u 仃e ，( b ) r a ti g g ( c ) r a b b i ti g g a n d ( d ) a 血x t u r eo fm ti g g 锄dr a b b i ti g gg o l dc o l l o i d sc o n j u g a t e dw i t hn t 9 0 a t 趾t i - r a t i g ga n dg o l dc o l l o i d sc o i 巧u g a t e dw i mt p g o a ta n t i - r a b b i ti g gw e r em 诙e di nal ：1r a t i o 锄d u s e da st 1 1 ed e t e c t i o n r e a g e n t 7 东北师范大学硕士学位论文 1 2 本工作的意义 近年来，s e r s 领域取得了重要研究进展：美国印第安那大学的n i e 等人在单个银纳 米粒子上，观察到高达1 0 1 4 1 0 1 5 的s e r s 增强因子，从而通过s e r s 技术已经可以实现但 分子检测；以具有特征拉曼谱线的分子作为标记物标记生物分子，由于拉曼振动谱带半 峰宽仅约为o 1 n m ，结合s e r s 检测高灵敏度的特点，使s e r s 技术在多通道免疫标记识 别领域表现出巨大的应用价值。 金纳米粒子作为标记物标记抗体和抗原已被广泛应用于医学和生物学研究的众多 领域，由于抗原、抗体这些生物大分子结构的复杂性，抗原、抗体特异性相互作用及其 与金属纳米粒子的作用机理目前还不完全清楚。利用s e r s 技术研究抗原、抗体及其相 互作用后在金属表面的振动结构信息，将对深入了解金属纳米粒子与生物大分子的相互 作用以及抗原、抗体讲的特异性相互作用具有重要的理论和实际意义。同时，将s e r s 活性分子作为标记物应用于抗原、抗体间特异反应的检测具有巨大的应用前景。 基于以上思路，本论文主要进行了以下三个方面的研究工作： ( 1 ) 金纳米粒子的制备 金属纳米粒子是常用的s e r s 增强基底。其中金、银纳米粒子是在s e r s 中被广泛 使用的金属体系。制备单分散的粒径可控的金纳米粒子方法简单，在本论文中，选择制 备1 3 胁或3 0m 的金纳米粒子为s e r s 增强基底。 ( 2 ) 在溶液中s e r s 标记蛋白质检测 在溶液中，利用金纳米粒子的特殊的表面物理和化学性质，在其表面引入特定官能 团( 如生物素b i o t i n 抗原等) ，然后再与经过a n t i b i o t i i l 抗体等修饰的染料或纳米粒子反 应，使其具有拉曼活性，从而通过对拉曼标记分子的s e r s 检测实现对蛋白质( 抗原 抗体) 的检测。 ( 3 ) 在生物芯片上s e r s 标记蛋白质检测 在金纳米粒子表面引入特定官能团( 如生物素b i o t 州抗原等) ，然后再与经过 a 1 1 t i b i o t i 抗体等修饰的染料或纳米粒子反应，形成“拉曼标记免疫金探针”，令其对生物 芯片上的蛋白质( 抗原抗体) 进行识别，从而通过对拉曼标记分子的s e r s 检测实现对 生物芯片上蛋白质( 抗原抗体) 的高灵敏的检测。 东北师范大学硕士学位论文 参考文献 【1 】n e i s c l l i l 1 a 眦m ，h d 豫pj ，m c q l u i l l 距aj 砌m 孤s p e c 觚o f p 徊d 皿ea d s o r b e da ta s i l v e re l e c 们d e 【j 】c h e n lp h y sl e n ，1 9 7 4 ，2 6 ：1 6 3 1 6 6 【2 】j e 孤m 诅i f edl ，d q m erp ，e ta 1 s u r f 沁er 锄粕研 e c 仃o e l e c 自r o c h 锄i 曲哕【j 】je 1 e c 仃o a n a lc h e 弛 1 9 7 7 ，8 4 ：l 一2 0 【3 】a l b r e c h tmg c r e i 酉l t o na n 伽咂1 0 u s l yh l _ t e 嬲er 砌a ns p e c 仃ao fp 如d 址a tas i l v e re l e c 仃0 d e j 】j a mc i 岫s o c ，1 9 7 7 ，9 9 ：5 2 1 5 - 5 2 1 8 4 】m oy ，m o e k ei ，w a c h t e rp s u r 惦ee l l l l 锄c e dr a m 眦s c a 廿髓i i 玛o fp y r i d i i l eo ns i l v c rg l l r f a c eo f d i 岱i r e mr o u g l l n e s s j 】s u r f s c i1 9 8 3 ，1 3 3 ：4 5 2 _ 4 5 5 5 】m oy ，m o e k ei ，w a c i l t e rp mi n n u c eo fs u r f a c er o l 咖e s s0 nm er 锄衄s c a t 矧n go fp 舛d 硫0 n c o p p e f 觚ds i l v e rs u r f a c e j 】s o l i ds t a t ec o i m n 咐1 1 1 9 8 4 ，5 0 ：8 2 9 - 8 31 【6 】m o s k 0 v i t sm s u r 缸es e l e c t i o nm l 髓矗ws u r e 一即l l a n c e dr _ a m a ns p e c 仃o s c o p y ：c a l 砌a t i o i l s 锄d a p p h c a t i o nt o 伦s l l r f 如e - e 1 1 l l 觚c e dr a m 锄s p e 咖m 0 fp h _ 吐m l a z i n e0 ns i l v e r 阴jc h 锄p h y s19 8 4 ，8 8 ： 5 5 2 6 5 5 2 8 【7 】c h a n grl 乞f u r t a kte s u r f a c ee n h a n c e dr a m a ns c a t t e n g j 】，p 1 a n 岫p r e s s ：n e wy o r k ，1 9 8 2 ， 6 5 ：1 0 2 1 0 5 【8 】c a m p i o na ，k a m b b 锄p a t ip s u r f a c ee n h a n c e dr 扰锄s c a t t 舐n g j 】，c h 锄s 0 cl 己e v1 9 9 8 ，2 7 ： 2 4 1 - 2 4 4 9 】薛奇 m 高分子结构研究中的光谱方法，高等教育出版社，北京，1 9 9 3 【1 0 】吴征铠，唐敖庆 m 分子光谱学专论，山东科学技术出版社，济南，1 9 9 9 1 l 】m o s k 硎t sm ，d i l e l l adp s u r f a c ee i l l l 姐c e dr 舭i 觚s c a t t c r 证g j 】，p l e i l l l i i 】p r e s s ：n e wy o r k ，1 9 8 2 ，5 8 ： 1 1 5 1 1 8 1 2 】l l m dpa ，s m a r d z e w s l ( irr m a 虹仅i s o l 撕0 nm a 孕l 鲥cc 面c u l a rd i c h r o i s m ( m c d ) s p e c 仇l mo fn h r a d i c a lp r o d t l c e db yag l o wd i s c h a 曙et e c l l i l i q u e 【j 】，c l l e i np h y s1 e n1 9 8 2 ，8 9 ：5 0 8 - 5 1 2 1 3 】张鹏翔，郭伟力，李秀英，表面增强吼锄效应( s e r s ) j 】，光谱学与光谱分析，1 9 8 7 ，3 ：2 9 9 - 3 0 0 1 4 】z e m 强ej ，s c h a _ t zgc a na c c l l r ：a t ee l e c 仃( 粕a g n 甜ct l l e o 巧s t u d yo fs u r f a c ee n h a n c 锄e mf i a c t o r sf o r s i l v g o l d ，c 叩p 盱，l 砌u i i l s o d i u i i l a 1 1 瑚i 1 砌鸭g a l l i u m ，砌u i i l ，z i i l c ，a n dc a d l l l i u m j 】， jp h y sc h e i i l 1 9 8 7 9 1 ：6 3 4 6 3 6 15 】f 1 e i s c h 觚i 姐m ，t i 姐zq r 觚姗s p e c 廿o s c o p yo fa d s o r 2b 啦so n 血f i l i l le l e c 仃o d e sd e p o s i t e do n s i l v e rs u b s 仃a t e s 【j 】，je l e c 仃o a i l a lc h 豇玛1 9 8 7 ，2 1 7 ：3 9 7 _ 4 l o 16 】勋销s e rw ，r e n o u p 陀za l o c a l - f i e l de n l l a n c e 删m t r o u g h 咖f a c e so fm e t a l s ，s e i n i m e 协l s ，a 1 1 d s 咖i c o n d u c t o 碍w i mn l eu 8 eo fo p t i c a ls e c o n d m 砌o n i cg e 硼0 n j 】，js o l i ds t a t ec o 姗， 1 9 8 2 ， 4 2 ；2 3 1 - 2 3 5 9 东北师范大学硕士学位论文 【1 7 】m o s k 0 v i t sm s u r f a c e - e n t 姗c e ds p e c 仃0 s c o p y j 】，r e vm o dp h y s ，1 9 8 5 ，5 7 ：7 8 3 - 8 2 6 18 o t t oa s u r f a c e - e n l l a n c e dr 硼n a l ls c a t t e r i n g ：c 1 a s s i c a la 1 1 dc h e m i c a lo r i g i i l s l i g 灿s c a l = t 咖i n s o l i d m 】，v o l ，b e r l i n ：s 埘n g e r - v e r l a g ，1 9 8 4 ，2 8 9 _ 4 1 8 1 9 】c 锄p i o na ，k 细n b h 姗p a t ip s u r 矗比ee i l l l a i l c e dr 锄胍s c a t t e 血g j ，c h 锄s o cr e v ，1 9 9 8 ，2 7 ： 2 4 1 2 4 9 【2 0 】b 酞erl ，l ut ，l o m b 砌ijr t e c l l l l i q u e sf o rc h a r a c 矧刎0 n o fe l e 咖d e sa n de l e c 仃o c h 砌c a l p r o c e s s e s m 】n e wy o r k ：j o h nw 岫& s o n s ，1 9 9 1 2 1 l 2 7 7 2 1 】朱自莹，顾仁敖，陆天虹【m 拉曼光谱在化学中的应用，沈阳：东北大学出版社，沈阳，1 9 9 8 2 2 p 醮i n g e rb a d s o r p t i o na te 1 e c 仃o d es u 碓m c e m 】n e wy o r k ：v c h ，1 9 9 2 8 5 3 4 5 2 3 】c o l l s e tj ，a u b a r dj s l l r f a c ee i l l l 柚c e dr a m 觚s c 础g ：n e w 仃e n d s 觚da p p l i c a t i o 璐 j 】jr a m a n s p e c tr o s c ，1 9 9 9 ，2 9 ：8 - 1 2 2 4 】t i a i lzq ，r e l lb p r o g r e s si ns u r f a c er a m 粕s p e c 仃0 s c o p y 【c 】x i 锄：x i a n l 饥u 1 1 i v e r s 埘p r e s s ， 2 0 0 0 2 5 】g r a b b ees ，b u c krp s u r f a c e - e l ：l h a n c e dr 锄锄s p e c 仃o s c o p i ci n v e s t i g a t i o no fh 啪】a n h n n m n o g l o b u l i i lg a d s o r l ) e d0 n